JP5800227B2 - カンゾウ属植物株及びカンゾウ属植物増殖方法 - Google Patents

Description

本発明は、カンゾウ属の植物のうち所定の性質を備えるカンゾウ属植物株、及び、カンゾウ属植物増殖方法などに関連する。より詳細には、親株の植物体が養液栽培を行うことのできる株であり、親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生でき、かつ親株及び再生植物体の根部におけるグリチルリチン含有の割合が両者とも高いカンゾウ属植物株、並びに親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に浸漬した後、該切片を用いて養液栽培を行う手順を少なくとも含むカンゾウ属植物増殖方法などに関連する。

カンゾウ属（甘草属、学名「Glycyrrhiza」、以下同じ）植物は、マメ科の多年草で、中国北部、ロシア南部、中央アジア、地中海地方などの乾燥地帯に主に自生する。例えば、中国北部などに自生するウラルカンゾウ（学名「G. uralensis」、以下同じ）、地中海地方などに広く自生するスペインカンゾウ（学名「G. glabra」、以下同じ）などが広く知られている。

東洋医学（漢方）の分野では、古くから、カンゾウ属植物の根部（ストロンを含む、以下同じ）を乾燥させたものなどが生薬「甘草」として重用されている。甘草の乾燥粉末・エキスなどには、緩和作用・止渇作用があるとされる。そのため、各種の生薬を緩和・調和する目的で、安中散、四君子湯、十全大補湯、人参湯など、多数の漢方方剤に甘草が配合されている。また、甘草には、単独でも、のどの痛みやせきを鎮める効果があるとされ、鎮痛薬・鎮咳薬などとしても用いられている。

甘草の主な薬効成分として、グリチルリチン（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ、Ｃ_４２Ｈ_６２Ｏ_１６、ＣＡＳ番号：１４０５−８６−３、以下同じ）が知られている。グリチルリチンは、トリテルペン配糖体の一つで、カンゾウ属植物の根部などに多く含有する。グリチルリチンは、抗炎症作用を有し、また、強い甘みを有することが知られている。そのため、単独でも、医薬品、化粧品、甘味料などとしても広く用いられている。グリチルリチンは、主に、カンゾウ属植物の根部から抽出・精製することにより、製造されている。

多くの場合、生薬の甘草又はグリチルリチンの原材料に、野生のカンゾウ属植物が収穫され用いられている。一方、カンゾウ属植物の乱獲による環境破壊や資源の枯渇化の問題が顕在化している。そのため、カンゾウ属植物を安定供給するための栽培・増殖方法を確立することが望まれている。

カンゾウ属植物の圃場栽培の場合、グリチルリチン含有の割合の高いカンゾウ属植物を得るためには、数年以上の長い栽培期間を必要とする。また、気候、採集時期、栽培地域、個体間などでのグリチルリチン含有の割合のばらつきが大きく、生薬又はグリチルリチンの原材料に使用できるカンゾウ属植物を安定的に栽培することは難しい。その他、開花・結実しにくいため種子から大量に栽培することが難しい、冬期に地上部が冬枯れするため一年を通じての収穫が難しい、などの問題もある。

そこで、組織培養によるカンゾウ属植物の増殖方法や、養液栽培などの閉鎖系施設栽培によるカンゾウ属植物の栽培方法などが、種々検討されている。

例えば、特許文献１には、カンゾウをカルス化し、たばこ加香用甘草エキスを得る方法が、特許文献２には、カンゾウを養液栽培し、得られたカンゾウの根などからグリチルリチンを採取するグリチルリチンの製造方法が、特許文献３には、培養液のｐＨおよび窒素源組成を調整することによって根部の伸長及びグリチルリチン含量増大を図るカンゾウ属植物の養液栽培方法が、特許文献４には、カンゾウ属植物の腋芽組織を暗黒下で液体培養してストロン様組織を誘導するカンゾウ属植物の組織培養方法が、それぞれ記載されている。

また、非特許文献１には、ロックウールなどを水耕栽培用の支持体として用いて、生長点組織から調製したカンゾウの無菌幼植物を定植し、約６ヵ月間水耕栽培を行った結果、約１５０ｍｇのグリチルリチン生産量が認められたことが記載されている。非特許文献２には、カンゾウの根茎を７ｃｍ長に株分けし、ロックウールに定植し、所定の培養液で約５ヵ月間培養した結果、地下部のグリチルリチン含有率が２．５２％であったことが記載されている。
特開昭５０−１６４４０号公報 特開平１−１０２０９２号公報 特開平６−２０５６１８号公報 特開２００５−１３７２９１号公報 Koji KAKUTANI, "Glycyrrhizin Production ofLicorice by Nutricultures using Several Material"; Bull. Pharm. Res. Technol.Inst. 12, 133-138 (2003) Suguru SATO et al, "The Effects of NutrientSolution Concentration on Inorganic and Glycyrrhizin Contents of Glycyrrhizaglabra Linn."; YAKUGAKU ZASSHI 124 (10) 705-709 (2004)

上述の通り、組織培養によるカンゾウ属植物の増殖方法や、養液栽培などの閉鎖系施設栽培によるカンゾウ属植物の栽培方法が種々検討されている。また、それらの一部では、グリチルリチン含有の割合や含有量が高かった旨の報告もされている。

しかし、グリチルリチン含有量を高く保持した状態でカンゾウ属植物を継代し、短期間で効率的に増殖する技術は確立していない。そのため、現在のところ、カンゾウ属植物の大量生産はほとんど実用化に到っていない。

そこで、本発明は、グリチルリチン含有の割合を高く保持したまま、カンゾウ属植物を継代し増殖しうるカンゾウ属植物株及びカンゾウ属植物増殖方法を提供することなどを目的とする。

本発明者らは、根部（ストロンを含む、本発明において以下同じ）におけるグリチルリチン含有の割合が高く、継代後もグリチルリチン含有の割合が高く保持され、かつ根部又は茎部の切片を養液栽培することにより植物体を再生できるカンゾウ属植物株の選抜・誘導に成功し、また、親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に浸漬した後、該切片を用いて養液栽培を行うことにより、カンゾウ属植物を簡易かつ高効率に増殖できることを新規に見出した。

そこで、本発明では、下記（１）及び（２）の性質を備えるカンゾウ属植物株、及び、親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に浸漬した後、該切片を用いて養液栽培を行う手順を少なくとも含むカンゾウ属植物増殖方法を提供する。
（１）親株の植物体が養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから半年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その植え付けから１年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。
（２）前記親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生でき、かつその再生植物体の植え付けから半年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その再生植物体の植え付けから１年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。

上述の通り、本発明に係るカンゾウ属植物株は、継代後もグリチルリチン含有の割合を高く保持できる。従って、例えば、一つの植物体の根部又は茎部の切片を継代培養して、その植物体から多数の植え付け材料（根部又は茎部の切片）を取得し、それらの切片を、それぞれ養液栽培することにより、グリチルリチン含有の割合の高いカンゾウ属植物体を多数取得できる。これにより、生薬の甘草を多量に調製でき、また、根部などからグリチルリチンを抽出・精製することにより、多量のグリチルリチンを生産できる。

親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片から植物体を再生する際、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液にその切片を浸漬した後、該切片を用いて養液栽培を行うことにより、植物体の再生効率を大幅に向上できる。従って、これによっても、生薬の甘草やグリチルリチンの生産効率を向上できる。

上述の通り、一般的に、カンゾウ属植物は、開花・結実しにくいため種子から大量に栽培することが難しい。それに対し、本発明者らは、養液栽培で短期間に植物体を再生・育成するとともに、それらの植物体を開花・結実させることに成功し、さらに、その結実により得られた種子から植物体を再生することにも成功した。従って、本発明に係るカンゾウ属植物株は、結実する株、さらには、結実により得られた種子から前記植物体を再生できる株であってもよい。

以上の通り、本発明では、高グリチルリチン生産性を維持した状態で、親株から再生植物体を多数取得できる。加えて、親株又はその再生植物体から種子を採取でき、それらの種子からも植物体を再生できる。従って、本発明により、一つの株から多数の高グリチルリチン生産株を比較的短期間で大量に育成・増殖できるという有利性がある。

本発明により、グリチルリチン含有量の高いカンゾウ属植物の増殖を行うことができるため、生薬の甘草又はグリチルリチンの生産効率を向上できる。

＜本発明に係るカンゾウ属植物株について＞
本発明は、少なくとも下記（１）及び（２）の性質を備えるカンゾウ属植物株をすべて包含し、植物体の形態などによって狭く限定されない。例えば、種子、若しくは植物体の一部分などであっても、下記の性質を備えた植物体をそれらから再生できる場合は本発明に広く包含される。
（１）親株の植物体が養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから半年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その植え付けから１年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。
（２）前記親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生でき、かつその再生植物体の植え付けから半年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その再生植物体の植え付けから１年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。

カンゾウ属（学名「Glycyrrhiza」、以下同じ）の植物は、根部にグリチルリチンを少なくとも含有するものであればよい。例えば、ウラルカンゾウ（学名「G. uralensis」）、スペインカンゾウ（学名「G. glabra」）、チョウカカンゾウ（学名「G. inflata」）、学名「G. acanthocarpa」、学名「G. aspera」、学名「G. astragalina」、学名「G. bucharica」、学名「G. echinata」、学名「G. eglandulosa」、学名「G. foetida」、学名「G. foetidissima」、学名「G. gontscharovii」、学名「G. iconica」、学名「G. korshinskyi」、学名「G. lepidota」、学名「G. pallidiflora」、学名「G. squamulosa」、学名「G. triphylla」、学名「G. yunnanensis」、これらカンゾウ属植物の変種などが適用可能であり、ウラルカンゾウ及びスペインカンゾウが好適であり、ウラルカンゾウがより好適である。

本発明のカンゾウ属植物株の親株の植物体は、上述（１）の通り、養液栽培を行うことのできる株である。

親株の植え付け材料は、特に限定されない。例えば、種子から苗を育成し、その苗を養液栽培に供してもよいし、養液栽培・圃場栽培・組織培養などにより得られたカンゾウ属植物株を養液栽培に供してもよいし、それらの株から所定長の根部又は茎部の切片を調製し、その切片を養液栽培に供してもよい。

本発明において、根部は根・ストロンなどを、茎部は茎・頂芽・シュート・節・葉などを広く包含する。根部又は茎部の切片は、二以上の節を含むように２〜２０ｃｍ程度の長さに調製することが好ましい。切片の調製は、例えば、鋏・カッター・メスなど、公知の切断手段などを用いて行うことができる。

例えば、閉鎖温室内に容器を設置し、その中に養液を入れる。親株の植え付け材料を支持体で固定し、支持体ごと容器内に置床し、養液に浸漬させ、養液栽培を行う。

支持体には、公知の材料を用いることができ、特に限定されない。例えば、ロックウール、ハイドロボール、ココピート（ヤシの実の殻を形成するファイバー繊維を堆積・醗酵させた土壌改良剤）・パミスサンド（火山性軽石）・ピートモス・バーミキュライト・パーライトなどの土壌を容器・袋状物などに充填したものなどを用いることができる。

養液には、水、又は、窒素分、リン分、カリウム分、金属成分などの植物の生長に必要な成分を含有する水溶液であればよく、公知のものを用いることができ、特に限定されない。例えば、アンモニア性窒素分、硝酸性窒素分、リン酸分（Ｐ_２Ｏ_５）、カリウム分（Ｋ_２Ｏ）、マグネシウム分（ＭｇＯ）、マンガン分（ＭｎＯ）、ホウ素分（Ｂ_２Ｏ_３）、鉄分（Ｆｅ）、銅分（Ｃｕ）、亜鉛分（Ｚｎ）、モリブデン分（Ｍｏ）などの成分を含むものを用いることができる。

栽培条件なども、公知の知見を採用でき、特に限定されないが、例えば、閉鎖温室内で養液栽培を行うことにより、栽培温度、相対湿度、明期（１日のうち、光の当たっている時間、以下同じ）の長さなどを調整できるという利点がある。これにより、気候の影響などを受けずに栽培でき、また、一年を通じての収穫が可能になる。本発明に係る株は、閉鎖温室内で養液栽培を行っても増殖でき、グリチルリチン含有の割合を高く保持できるという有利性があり、閉鎖温室内での養液栽培に適している。

続いて、本発明のカンゾウ属植物株は、上述（２）の通り、親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生できる。

この再生植物体の植え付け材料には、例えば、親株の植物体から採取した根部又は茎部の切片を用いる。切片の長さ、調製方法などは上記と同様である。

これらの根部又は茎部の切片を、切片調製後、養液栽培へ供する前に、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に速やかに浸漬することが好ましい。切片を調製してから切片を同液に浸漬するまでの時間は、できるだけ短いほうがよい。切片の表面が乾燥する前に浸漬することが好ましく、切片の調製から３０分以内が好適であり、１０分以内がより好適である。切片の浸漬時間は、５分〜４時間が好適であり、２０分〜３時間がより好適であり、３０分〜２時間が最も好適である。また、溶液中の鉄イオン濃度は、例えば、０．０１〜１，０００μＭが好適であり、０．１〜１００μＭが好適であり、１〜１０μＭが最も好適である。鉄イオン濃度は、公知の方法により、測定できる。

二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に切片を浸漬することにより、二価鉄イオンが植物体に素早く吸収され、根の生長などが活性化される。また、二価鉄イオンが植物体の切り口などから浸出する物質と結合して膜状物を形成し、その部分を保護するとともに、水分・養分の吸収を促進する。これにより、切片の生長が促され、植物体が再生しやすくなると推測する。

次に、二価鉄イオン水溶液に浸漬した切片を植え付け、養液栽培を行う。養液栽培の方法・条件などは上記と同様である。

切片を植え付けてから約半月〜３カ月で、植物体はシュートを再生する。本発明に係るカンゾウ属植物株は、植え付け後のシュート再生率が高く、かつ、シュートの生育が良好な株がより好ましい。例えば、切片の植え付けから１カ月以内におけるシュート再生率が３０％以上のものが好適であり、５０％以上がより好適であり、７０％以上が最も好適である。

切片を植え付けてから約１カ月〜８カ月で植物体を再生できる。再生した植物は、すぐに、又は、育成した後、収穫する。収穫時期は、例えば、再生植物体を植え付けてから約４カ月〜４年の間が好適である。グリチルリチンは、主に、根部の短径が１ｍｍ以上の部分やストロンなどに多く含有するため、その部分を採集する。

親株と再生植物体のいずれにおいても、継代により、同株を維持・増殖させてもよい。例えば、無菌条件下で公知の培地に切片を移植して培養し、植物体が生長したら、その植物体から２節以上を含む根部又は茎部の切片を採取し、その切片を前記と同様に移植することにより、継代を行ってもよい。その場合、継代を２〜３カ月ごとに行うことができる。また、例えば、上記と同様の方法で、切片から養液栽培により植物体を再生し、その再生した植物体から２節以上を含む根部又は茎部の切片を採取することにより、継代を行ってもよい。その場合、継代を４〜６カ月ごとに行うことができる。

上述の通り、本発明のカンゾウ属植物株は、継代してもグリチルリチン含有の割合を高く保持でき、１つの切片から多数の植え付け材料を取得することが可能である。従って、親株と再生植物体のいずれの継代を行った場合でも、同一クローン由来の植え付け材料を多数調製できるため、カンゾウ属植物を大量に増殖させることができる。

本発明のカンゾウ属植物株は、上述の通り、親株の植物体と再生植物体のいずれについても、植え付けから半年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、前記切片の植え付けから１年後の根部におけるグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。

グリチルリチン（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ、Ｃ_４２Ｈ_６２Ｏ_１６、ＣＡＳ番号：１４０５−８６−３、以下同じ）は、上述の通り、トリテルペン配糖体の一つであり、カンゾウ属植物の根部（根・ストロンなど）に多く含有する。本発明において、グリチルリチンは、カンゾウ属植物の根部から抽出・精製することにより得ることができるものをすべて包含し、また、グリチルリチンの塩（例えば、グリチルリチン酸２カリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウムなど）、グリチルリチンの代謝物なども広く包含する。

例えば、植物体の植え付けから半年後に形成された植物体の根部におけるグリチルリチン含有の割合は、１．５％以上のものが好適であり、１．６％以上のものがより好適であり、１．９％以上のものが最も好適である。

または、例えば、植物体の植え付けから１年後に形成された植物体の根部におけるグリチルリチン含有の割合は、２．５％以上のものが好適であり、２．７％以上のものがより好適であり、３．０％以上のものが最も好適である。

グリチルリチンの定量は、公知の方法により行うことができる。例えば、植物体の根部全体の乾燥重量を測定し、一方、ＯＤＳカラムを用いて、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー、以下同じ）によりその乾燥試料中におけるグリチルリチン含有の割合を取得できる。また、根部全体の乾燥重量とその乾燥試料中におけるグリチルリチン含有の割合を乗じることにより、株当たりのグリチルリチン含有量を算出できる。

上述の通り、本発明のカンゾウ属植物株は継代してもグリチルリチン含有の割合を高く保持できるため、１つの切片から多数の植え付け材料を取得することが可能であり、グリチルリチンの大量製造に有用である。

その他、本発明のカンゾウ属植物株は、人工的な環境制御により開花する性質、及び、人工受粉などにより結実する性質、さらには、その結実により得られた種子から前記植物体を再生できる性質を備えた株であってもよい。

結実する株である場合、さらには、結実により得られた種子から前記植物体を再生できる株である場合、親株より採取された切片などから、高グリチルリチン生産性を維持した状態で再生植物体を多数取得することに加え、親株又はその再生植物体から種子を採取し、それらの種子からも植物体をさらに再生させることができるため、一つの株から多数の高グリチルリチン生産株を比較的短期間で大量に育成・増殖できる。なお、人工受粉は、公知の方法により行うことができる。

以上のような性質を備えるカンゾウ属植物株として、例えば、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株、Ｇｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のいずれかが挙げられる。本発明者らは、これらの４株を、ブダペスト条約上の国際寄託機関でもある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（所在地：日本国茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター中央第６）に寄託申請したが、保管・分譲などの業務を技術的に遂行することができないことを理由に、２０１０年１０月２２日付で受託を拒否された。そこで、本出願人は、これらの株を、独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部育種生理研究室（所在地：日本国茨城県つくば市八幡台１−２）内において自己寄託し、維持・保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲することを保証する。

＜本発明に係る株の系統間遺伝子識別方法＞
本発明者らは、上述の４株について、ＳＱＳ（スクアレン合成酵素、以下同じ）遺伝子及びＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の部分配列を取得した。従って、これらの配列との相同性を解析することにより、由来の不明な株について、本発明に係る株かどうか、識別できる。

ＳＱＳはカンゾウ属植物のグリチルリチン生合成経路上の酵素の一つである。本発明者らの解析の結果、ＳＱＳ１遺伝子のイントロン１及びＳＱＳ２遺伝子のイントロン１において、顕著な塩基配列の差異が認められた。そこで、この部分の塩基配列の相違を解析することにより、由来の不明な株について、本発明に係る株かどうか、識別できる。

例えば、ＳＱＳ１遺伝子のエキソン１〜エキソン３の部分における塩基配列の相同性が、配列番号１〜３のいずれかの配列と比較して、９０％以上の場合、本発明に係る株である可能性があり、９５％以上の場合、本発明に係る株である可能性が高く、９９％以上の場合、本発明に係る株である可能性が非常に高いと判定できる。同様に、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３の部分における塩基配列の相同性が、配列番号４又は５の配列と比較して、９０％以上の場合、本発明に係る株である可能性があり、９５％以上の場合、本発明に係る株である可能性が高く、９９％以上の場合、本発明に係る株である可能性が非常に高いと判定できる。

ＣＹＰ８８Ｄサブファミリー遺伝子は、マメ科植物に特異的に見出される遺伝子群であり、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子は、カンゾウ属植物のグリチルリチン生合成経路上において、β−アミリン、１１−オキソ−β−アミリン、３０−ヒドロキシ−β−アミリン、又は、１１,３０−ジヒドロキシ−β−アミリンの１１位炭素を酸化する酵素をコードする遺伝子である。本発明者らの解析の結果、特に、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７において、顕著な塩基配列の差異が認められた。そこで、この部分の塩基配列の相違を解析することにより、由来の不明な株について、本発明に係る株かどうか、識別できる。

例えば、ＣＹＰ８８Ｄ６のエキソン６〜エキソン８の部分における塩基配列の相同性が、配列番号１０又は１１の配列と比較して、８５％以上の場合、本発明に係る株である可能性があり、９０％以上の場合、本発明に係る株である可能性が高く、９５％以上の場合、本発明に係る株である可能性が非常に高いと判定できる。

由来な不明な株のそれらの領域における塩基配列は、例えば、公知方法によりゲノムＤＮＡを取得し、そのＤＮＡを鋳型として、設計プライマーを用いて、ＰＣＲ法によりその部分を増幅し、その増幅産物を、公知のシークェンシングベクターにクローニングし、その部分の塩基配列を解析することにより、取得できる。

その他、例えば、上記の部分配列を増幅しうるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下同じ）を行い、増幅産物のサイズや有無を解析することにより、簡易かつ高精度に、由来の不明な株について、本発明に係る株かどうか、識別できる。

また、例えば、本発明に係る株に特異的な配列部分に制限酵素サイトが含まれる場合、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；制限酵素断片長多型、以下同じ）により、簡易かつ高精度に、由来の不明な株について、本発明に係る株かどうか、識別できる。その場合、制限酵素サイトを含む部分配列を増幅しうるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素処理し、増幅産物が切断されるかどうかを解析することにより、行うことができる。

なお、その場合における由来の不明な株の鋳型ＤＮＡの取得も、公知の方法により行うことができる。

＜本発明に係るカンゾウ属植物増殖方法について＞
本発明に係る植物体の増殖方法は、親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に浸漬した後、該切片を用いて養液栽培を行う手順を少なくとも含むものをすべて包含し、他の手順を含むことによって、狭く限定されない。

このカンゾウ属植物増殖方法では、例えば、グリチルリチン含有の割合の高い株を養液栽培又は組織培養などにより、継代する手順（手順１）、継代後の１又は複数の株（親株）から、２節以上を含む根部又は茎部の切片を多数取得する手順（手順２）、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液にその切片を浸漬する手順（手順３）、浸漬した切片を用いて養液栽培を行い、植物体を再生させる手順（手順４）、養液栽培を行った各株を収穫し、根部などを採集する手順（手順５）、の順で行ってもよい。

各手順における手段・条件などは上述のものと同様である。収穫時期は、例えば、再生植物体を植え付けてから約４カ月〜４年の間が好適であり、約４カ月〜1年半の間がより好適である。グリチルリチンは、主に、根部の短径が１ｍｍ以上の部分やストロンなどに多く含有するため、その部分を採集する。

手順３において、切片調製後、養液栽培へ供する前に、親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に浸漬する。上述の通り、切片調製から切片を同液に浸漬するまでの時間は、できるだけ短いほうがよい。切片の表面が乾燥する前に浸漬することが好ましく、切片調製から３０分以内が好適であり、１０分以内がより好適である。切片の浸漬時間は、５分〜４時間が好適であり、２０分〜３時間がより好適であり、３０分〜２時間が最も好適である。また、上述の通り、溶液中の鉄イオン濃度は、例えば、０．０１〜１，０００μＭが好適であり、０．１〜１００μＭが好適であり、１〜１０μＭが最も好適である。

二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に切片を浸漬することにより、切片から高い確率で植物体を再生させることが可能となる。

その他、植物体を育成し、人工的な環境制御により開花させる手順、人工受粉により結実させる手順などを含んでいてもよい。

本発明では、養液栽培を行うことにより、カンゾウ属植物を比較的短期間で再生・育成することができる。加えて、閉鎖温室内又はグロースチャンバー室内で栽培できるため、明期の長さ・温度・相対湿度などを調節できる。これにより、比較的短期間でカンゾウ属植物を開花させることができる。開花への誘導手段は特に限定されないが、例えば、植物体がある程度育成した段階で、明期を８〜１２時間から１４〜１８時間に延長した場合、明期の時間の変更より２〜５か月後に開花させることができる場合がある。

開花した植物体について、人工受粉を行うことにより、結実させることができる。人工受粉の方法は、公知の方法を広く採用できる。

結実により得られた種子を発芽させた後、例えば、その実生から切片を調製し、上記と同様の方法で育成・栽培することにより、複数の個体を再生することができる。種子を発芽させる手段については、公知の方法を採用でき、特に限定されないが、例えば、無菌環境下で播種・培養することにより、発芽・育成効率を高めることができる。

以上の手順でカンゾウ属植物を栽培することにより、同一クローン由来の株を多数栽培できるため、カンゾウ属植物の大量増殖に有用である。また、従来よりも短期間で収穫でき、かつ増殖した全ての株が高いグリチルリチン含有の割合を保持するため、生薬の甘草の生産やグリチルリチンの製造に有効である。その他、これらの手順は、全て閉鎖温室内で行うことができるため、気候の影響などを受けずに栽培でき、また、一年を通じての収穫が可能になるという利点がある。

＜本発明に係るグリチルリチン製造方法について＞
上述の通り、本発明により、グリチルリチン含有の割合が高く保持された同一クローン由来の株を多数栽培できる。従って、それらの植物体から根・ストロンなどを採集し、グリチルリチンを抽出・精製することにより、グリチルリチンを大量製造できる。

グリチルリチンの抽出・精製は、公知の方法を採用できる。例えば、収穫したカンゾウ属植物の根部などを乾燥・粉砕し、その粉状物から水、親水性有機溶媒、それらの混合物などを用いてグリチルリチンなどの成分を抽出し、ＨＰＬＣなどで分離・精製することにより、目的物を取得できる。

実施例１では、ウラルカンゾウＧｕ株を誘導した。

国立医薬品食品衛生研究所北海道薬用植物栽培試験場（現独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター北海道研究部、以下、「北海道研究部」とする。）で圃場栽培されているウラルカンゾウ株（北海道研究部における導入番号：ＨＫ１３９０５）について、２００１年５月に、その１５〜２０ｃｍ長のストロンを、国立医薬品食品衛生研究所筑波薬用植物栽培試験場（現独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部、以下、「筑波研究部」とする。）に導入し（筑波研究部における同株の導入番号：ＴＳ３０１−０７）、筑波研究部圃場に植え付け、約１年間栽培を行った。

２００２年７月に、筑波研究部において、その株の先端の若いシュートを切り取って葉を落とし、約７ｃｍ長の頂芽又は茎の切片を調製した。その植物切片を径９ｃｍのガラスシャーレに入れ、７５％エタノール液を注ぎ、よく振り混ぜながら１分間殺菌した。殺菌後、７５％エタノール液を捨て、滅菌水５０ｍＬを入れ、１分間よく漱いだ。次に、次亜塩素酸ナトリウム殺菌液（有効塩素濃度２％、２μＬ／ｍＬのＴｗｅｅｎ２０を含む）をビーカーに入れ、その植物切片をその中に浸し、１０分間、攪拌しながら殺菌した。殺菌後、滅菌したピンセットを用いて、滅菌した径９ｃｍのガラスシャーレにその植物切片を移し、滅菌水５０ｍＬを入れ、１分間よく漱ぎ、その滅菌水を捨てた。滅菌水による漱ぎ操作を３回繰り返した後、シャーレの一方を高くし、水気を切った。新しい滅菌シャーレにその植物切片を入れ、傷んだ部分を切り取り、約２〜３ｃｍ長の頂芽又は茎の切片を調製した。

径３０ｍｍ、高さ１５ｃｍの培養試験管に培地を入れ、その植物切片を置床し、２３℃、１４時間照明下で培養し、シュートを再生させた。培地には、Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ液体培地に１０ｍｇ／Ｌグルタミンを添加し（以下、「ＷＰＧ液体培地」とする。）、さらにインドール酪酸（ＩＢＡ）１ｍｇ／Ｌとカイネチン（Ｋｉｎ）３ｍｇ／Ｌを添加したものを用いた。支持体にはフロリアライト２２２（植物性繊維とバーミキュライトを主成分とする植物支持体。日清紡績株式会社製。以下同じ）を用いた。

径３０ｍｍ、高さ１５ｃｍの培養試験管に植物ホルモン無添加ＷＰＧ固形培地（ＷＰＧ液体培地を０．２５％ゲルライトで固化したもの。以下、「ＷＰＧ固形培地」とする。なお、「ゲルライト」はＣＰ Ｋｅｌｃｏ ＡｐＳ社の登録商標。以下同じ）を入れ、再生したシュートを切り取って培地に置床し、２３℃、１４時間照明下で培養し、ウラルカンゾウの組織培養体（Ｇｕ株）を得た。

そのウラルカンゾウの組織培養体を、２３℃、１４時間照明下、植物ホルモン無添加ＷＰＧ固形培地で培養した。２〜３カ月ごとに２節を含む茎切片を調製し、無菌条件下で各切片を１本ずつ別の培養試験管に移植し、同じ培地・条件で継代培養した。

継代培養した組織培養体の一つを培養試験管より取り出し、根から固形培地を弱い水流でよく洗い流した。閉鎖温室内に鉢（径１５ｃｍ×高さ３０ｃｍのポリエチレンポット）を置き、その中に培養土を入れ、その植物体を植え付けた。

培養土の組成は、ベラボン（登録商標、株式会社フジック製）：赤玉土：クレハ培養土（商品名、株式会社クレハ製、「クレハ」は登録商標、以下同じ）：堆肥＝５：３：１：１とした。

閉鎖温室内の栽培条件を、温度２０℃、相対湿度６０％（植え付けから８０３日後以降は５０％に変更した。）、明期１６時間（自然光及び早朝・夜間にそれぞれ約２時間ずつ補光照明を使用した（補光照明で明期を調節することについて、以下同じ）。植え付けから８０３日後以降は明期１４時間に変更した。）に設定した。植え付けから約１０日間、透明プラスチック製のコップ容器（容量５００ｍＬ）を、開口部を下向きにして被せ、植物体を馴化させた。自動灌水装置により１日１回灌水を行った。肥料として、ハイポネックス原液６−１０−５（株式会社ハイポネックスジャパン製、「ハイポネックス」は登録商標、以下同じ）の１，０００倍液を１週間に１回散布した。

組織培養体の植え付けからそれぞれ３７０、７２２、１，００９日後に、植物体を収穫し、茎、根（径１ｍｍ以上の部分）、細根（径１ｍｍ未満の部分）に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。

乾燥後、試料を粉末にし、精密に１００ｍｇを秤量し、正確に５０％エタノールを７ｍＬ加え、超音波洗浄機で３０分間、ボルテックスミキサーで１分間処理し、溶出成分を抽出した。その抽出液を遠心分離処理（４，５００ｒｐｍ、３分間）し、ウルトラフリーＭＣ（限外ろ過膜。ミリポア社製）でその上清３００μＬを遠心ろ過処理（１５，０００ｒｐｍ、１分間、２０℃）し、そのろ液をＨＰＬＣに供して、グリチルリチン含有の割合を測定した。

ＨＰＬＣのカラムに、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ（径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ。「ＴＳＫＧＥＬ」は登録商標（以下同じ）、東ソー株式会社製）を用いた。移動相にアセトニトリル：２％酢酸＝２：３の溶液を用いた。流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度２０℃に設定した。定量検出はＵＶ２５４ｎｍで、定性検出（検出ピークの同定）はＵＶ２００〜４００ｎｍで行った。

結果を表１及び表２に示す。

表１は、樹立したウラルカンゾウＧｕ株の植え付けから３７０、７２２、１，００９日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。表２は、対照植物であるウラルカンゾウＧｕＨ株の植え付けから３７２、７２４、１，０１１日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。

なお、対照植物としたウラルカンゾウＧｕＨ株は、北海道研究部において２００３年１０月に採取されたウラルカンゾウの種子（北海道研究部における導入番号：ＨＫ１３９０５、筑波研究部における導入番号：ＴＳ２９１−０４）を精米機で約１０分間処理して表面に傷を付けた後、Ｇｕ株の時と同様に、殺菌後、植物ホルモン無添加ＷＰＧ固形培地に植え付け、２３℃、１４時間照明下で培養し、組織培養体を得て、継代培養した後、閉鎖温室内で鉢に植え付けたものを用いた。

表１及び表２中、「植え付けからの日数」は、閉鎖温室内で鉢に植え付けてからの日数を、「径１ｍｍ以上の根長」は、根の短径が１ｍｍ以上の部分の長さを、「最大根幅」は最も太い部分の根の幅を、「径１ｍｍ以上の根の収量（乾燥重量）」は、根の短径が１ｍｍ以上の部分の乾燥処理後の重量を、「グリチルリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」は根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりのグリチルリチン含有の割合を、「１株当たりの根のグリチルリチンの含有量」は、根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるウラルカンゾウ一株当たりの根のグリチルリチンの含有量を、それぞれ表わす。

表１及び表２に示す通り、ウラルカンゾウＧｕ株では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が１．４１％であり、ウラルカンゾウＧｕＨ株の０．９１％と比較して、顕著に高かった。また、根の収量及びグリチルリチンの含有量も高かった。植え付けから約３年後においても、ウラルカンゾウＧｕ株では、グリチルリチン含有の割合及び含有量が高い状態で維持されていることを確認した。

実施例２では、ウラルカンゾウＧｕ株からのサブクローンの誘導と、そのサブクローンからの植物体の再生を行った。

上述の通り、実施例１において、ウラルカンゾウＧｕ株を継代培養により増殖させた。そのうち５株（Ｇｕ１〜Ｇｕ５）を、さらに同条件下で継代培養し、増殖させた。その結果、Ｇｕ２〜Ｇｕ５の４クローンは培養試験管内で充分に増殖した。そこで、培養植物体クローン（Ｇｕ２〜Ｇｕ５）から、それぞれ、２節を含む茎切片を調製し、サブクローンの誘導を試みた。

１００ｍＬフラスコに培地２０ｍＬを入れ、各切片を１本ずつ植え付け、２０℃、暗所、振とう条件（６０〜８０ｒｐｍ）下で培養し、ストロン様培養物を誘導した。培地には、ＭＳ（「Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ」、以下同じ）液体培地に、６％ショ糖とナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０．０１ｍｇ／Ｌを添加したものを用いた。

その結果、特に、Ｇｕ２株が、７６日間培養後におけるストロン様培養物の形成率が３５．７％、形成したシュートの長さが平均１４．５８ｃｍであり、シュートの生育も良好であった。

そこで、同フラスコ内でＧｕ２株由来のストロン様培養物を増殖させ、２〜３カ月ごとに２節を含む茎切片を調製し、無菌条件下で各切片を１本ずつ別のフラスコに移し、同じ培地・条件で継代培養した。複数回の継代培養の結果、シュート形成率が高く、生育良好なストロン様サブクローン３株（Ｇｕ２−２−１、Ｇｕ２−３−２、Ｇｕ２−５−２）を得た。これらの株からは、植え付け後５６日間で、平均６．０本の植え付け材料（２節を含む茎切片）を得ることができた。

そこで、径４０ｍｍ、高さ１３ｃｍの培養試験管に培地２０ｍＬを入れ、各切片を植え付け、２０℃、１４時間照明下で８３日間培養した。培地には、ＷＰＧ液体培地に、１％ショ糖、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０．１ｍｇ／Ｌ、カイネチン（Ｋｉｎ）０．５ｍｇ／Ｌを添加したものを用いた。支持体にはフロリアライト２２４を用いた。

その結果、ストロン様のサブクローンから植物体を再生できた。植物体再生率は７６％であった。

なお、Ｇｕ２−２−１、Ｇｕ２−３−２の両株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請したが、受託を拒否された。上述の通り、これらの株は、独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部育種生理研究室内において維持・保存されており、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲可能である。

実施例３では、実施例２で再生したサブクローン植物体の養液栽培を試みた。

閉鎖温室内にコンテナ（高さ２０ｃｍ）を設置し、そのコンテナ内に鉢（径１５ｃｍ×高さ３０ｃｍのポリエチレンポット）を置いた。鉢には、その底面にケイ酸塩白土（商品名「ミリオンＡ」、ソフト・シリカ株式会社製、以下同じ）を敷き、その上にハイドロボール中粒（直径約４〜８ｍｍ、有限会社都市園芸研究所製、以下同じ）を鉢の中程まで入れ、ハイドロボール小粒（直径約４ｍｍ以下、有限会社都市園芸研究所製、以下同じ）をその上に積層させた。なお、ハイドロボールは天然の凝灰質頁岩を主成分とする岩石を焼成発泡させたものである（以下同じ）。

この養液栽培装置に、実施例２で再生したＧｕ２−２−１及びＧｕ２−３−２の植物体をそれぞれ植え付け、コンテナ内を肥料養液で満たし、閉鎖温室内でサブクローン植物体の養液栽培を行った。

閉鎖温室内の栽培条件を、温度２０℃、相対湿度６０％（植え付けから１９５日後以降は相対湿度５０％に変更した。）、明期１６時間（植え付けから１９５日後以降は明期１４時間に変更した。）に設定した。肥料養液として、水８Ｌに対し、マツザキ１号（商品名、株式会社マツザキアグリビジネス製、以下同じ）１．５ｇ、マツザキ２号（商品名、株式会社マツザキアグリビジネス製、以下同じ）１．０ｇを溶解したものを、植え付けから３０１日経過後は、マツザキ１号３．０ｇ、マツザキ２号２．０ｇを溶解したものを、それぞれ用いた。

なお、用いたマツザキ１号の成分組成は、全窒素分１０．０％（うち、アンモニア性窒素１．５％、硝酸性窒素８．５％）、リン酸分（Ｐ_２Ｏ_５）８．０％、カリウム分（Ｋ_２Ｏ）２９．０％、マグネシウム分（ＭｇＯ）４．０％、マンガン分（ＭｎＯ）０．１％、ホウ素分（Ｂ_２Ｏ_３）０．１％、鉄分（Ｆｅ）０．１８６％、銅分（Ｃｕ）０．００３６％、亜鉛分（Ｚｎ）０．００６６％、モリブデン分（Ｍｏ）０．００３６％である（以下同じ）。用いたマツザキ２号の成分組成は、硝酸性窒素分１１．０％、石灰分（ＣａＯ）２２．０％である（以下同じ）。

サブクローン植物体（再生植物体）２株の植え付けからそれぞれ４００〜４０１、７３８〜７４０日後に、植物体を収穫し、茎、根（径１ｍｍ以上の部分）、細根（径１ｍｍ未満の部分）、ストロンの各部位に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。

乾燥後、試料を粉末にし、精密に１００ｍｇを秤量し、正確に５０％エタノールを７ｍＬ加え、超音波洗浄機で３０分間、ボルテックスミキサーで１分間処理し、溶出成分を抽出した。その抽出液を遠心分離処理（４，５００ｒｐｍ、３分間）し、ウルトラフリーＭＣ（限外ろ過膜。ミリポア社製）でその上清３００μＬを遠心ろ過処理（１５，０００ｒｐｍ、１分間、２０℃）し、そのろ液をＨＰＬＣに供して、グリチルリチン、リキリチン、リキリチゲニン、イソリキリチン、イソリキリチゲニン、グリシクマリン、及び、グラブリジンの７種の化合物の同時分析を行った。

ＨＰＬＣのカラムに、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ（径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、東ソー株式会社製）を用いた。移動相に、アセトニトリル（溶媒Ａ）と１％酢酸（溶媒Ｂ）を混合して用いた。溶出開始から０〜４２分間は溶媒Ａの混合比率を０〜７０％に直線的に上げ、４２〜４４分間は溶媒Ａの混合比率を７０〜１００％に直線的に上げ、４４〜４５分間は溶媒Ａの混合比率を１００％〜０％に直線的に下げ、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃に設定した。定量検出はＵＶ２５４ｎｍで、定性検出（検出ピークの同定）はＵＶ２００〜４００ｎｍで行った。

結果を表３及び表４に示す。

表３は、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株の植え付けから４０１及び７３８日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。表４は、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株の植え付けから４００及び７４０日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。

表３及び表４中、「植え付けからの日数」、「径１ｍｍ以上の根長」、「最大根幅」、「径１ｍｍ以上の根の収量（乾燥重量）」、「グリチルリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「一株当たりの根のグリチルリチンの含有量」の各項目は、表１及び表２と同様である。同表中、「リキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「イソリキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「グリシクマリン含有の割合（乾燥重量当たり）」は、それぞれ、ＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりの各成分含有の割合を表す。

表３に示す通り、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が３．０６％、約２年後における同成分含有の割合が３．６６％であった。また、表４に示す通り、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が２．９５％、約２年後における同成分含有の割合が５．２２％であった。一株あたりの根のグリチルリチンの含有量も、植え付けから約１年後では、Ｇｕ２−２−１株で４１５．２０ｍｇ、Ｇｕ２−３−２株で６９０．３１ｍｇであり、約２年後では、Ｇｕ２−２−１株で７５３．９２ｍｇ、Ｇｕ２−３−２株で９６５．１４ｍｇであった。

その他、植え付けから約２年後の両株では、グリチルリチン以外の二次代謝物であるリキリチン、イソリキリチン、グリシクマリンの各化合物も検出された。

実施例４では、実施例３で樹立したウラルカンゾウ株を親株とし、そのストロン切片から、養液栽培による植物体の再生を試みた。

実施例３において植え付けから７３８日間養液栽培を行ったＧｕ２−２−１の植物体、及び、同じく７４０日間養液栽培を行ったＧｕ２−３−２の植物体を親株とし、それらの植物体から、それぞれ剪定鋏でストロンを約５ｃｍ長に切断し、それぞれ１株当たり１０〜３１個の２節を含むストロンの切片を得た。

二価鉄イオンを含有する水溶液に、ストロンの切断後速やかにその切片を入れ、２時間以上その中に浸した。二価鉄イオンを含有する水溶液には、植物活力素メネデール（商品名、メネデール株式会社製、日本、「メネデール」は登録商標、以下同じ）の２００倍希釈液を用いた。

閉鎖温室内にトレーを置き、トレー内に水が高さ２ｃｍ以上満たされる状態を維持しつつ適宜灌水し、その中に、ジフィーセブン・水でふくらむタネまき土ポット（径４８ｍｍ、株式会社サカタのタネ製、日本、以下同じ）を設置した。二価鉄イオンを含有する水溶液に浸したストロン切片のうち、１〜２個の芽の形成が認められる切片をその土ポットに一本ずつ挿し、その閉鎖温室内で２７日間養液栽培を行った。

閉鎖温室内の栽培条件を、温度２０℃、相対湿度５０％、明期１４時間に設定した。

その結果、土ポットに切片を挿してから２７日後におけるシュート再生率は、Ｇｕ２−２−１で平均７２．２％、Ｇｕ２−３−２は平均５９．８％であった。また、その後、再生したシュートを養液栽培装置に移植し、肥料養液内で栽培を行った結果、良好に生育した。肥料養液には、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを用いた。なお、シュート再生率は、シュート再生が認められた切片数を供試切片数で除した値である（以下同じ）。

実施例５では、実施例４においてストロン切片から再生した植物体について、養液栽培による育成を試みた。

実施例４で土ポットに挿したＧｕ２−２−１のストロン切片について、土ポットに挿してから１００日間、閉鎖温室内でそのまま養液栽培を行った。閉鎖温室内の栽培条件を、切片を挿してから７０日目までは実施例４と同様に設定した。切片を挿してから７０日以後は、相対湿度を５５％に変更した。

培養土を赤玉土３、堆肥１、クレハ培養土１の混合比で調製し、コイヤーポット（上径８ｃｍ、下径５．５ｃｍ、高さ８ｃｍ、トミタテクノロジー社製）にその培養土を入れた。土ポットに挿してから１００日目に、養液栽培を行った切片を土ポットごと移植し、移植後３１４日間、閉鎖温室内で栽培した。閉鎖温室内の栽培条件を、温度２５℃、相対湿度５５％、明期１４時間に設定した。自動灌水装置により１日１回灌水を行い、肥料としてハイポネックス原液６−１０−５の１，０００倍液を１週間に１回散布した。

グロースチャンバー室（完全人工光室、以下同じ）内にコンテナ（高さ１０ｃｍ）を設置し、そのコンテナ内に鉢（径１５ｃｍ×高さ３０ｃｍのポリエチレンポット）を置いた。鉢には、その底面にケイ酸塩白土を敷き、その上にハイドロボール中粒を鉢の中程まで入れ、ハイドロボール小粒をその上に積層させた。コイヤーポットに移植してから３１４日後に、移植した苗１１株をこの養液栽培装置に植え付け、コンテナ内を肥料養液で満たし、３６３日間、養液栽培を行った。

グロースチャンバー室内の栽培条件を、温度２５℃、相対湿度６０％、養液栽培装置に移植してから１３３日目までは明期１２時間、それ以降は明期１６時間に設定した。肥料養液として、養液栽培装置に移植してから１３５日目までは、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを、それ以降は、水８Ｌに対し、マツザキ１号３．０ｇ、マツザキ２号２．０ｇを溶解したものを、それぞれ用いた。

その結果、コイヤーポットで土耕栽培を行っている間は、地上部・地下部ともほとんど生育が認められなかったのに対し、養液栽培装置に移植した後は、生育が旺盛になった。また、養液栽培装置に移植してから２２４日後頃より開花する株が観察され、全体では、養液栽培装置に移植した１１株のうち、計３株が開花した（開花率２７．３％）。

続いて、養液栽培装置に移植してから３６３日後に、植物体を収穫し、茎、根（径２ｍｍ以上の部分）、細根（径２ｍｍ未満の部分）、ストロンの各部位に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。

乾燥後、試料を実施例３と同様の方法で調製してＨＰＬＣに供し、グリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、及び、グリシクマリンの４種の化合物の同時分析を行った。

ＨＰＬＣのカラムに、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ（径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、東ソー株式会社製）を、ガードカラムに、ＴＳＫｇｕａｒｄｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｖ（径３．２ｍｍ×長さ１５ｍｍ、粒径５μｍ、東ソー株式会社製）を用いた。移動相に、アセトニトリル（溶媒Ａ）と１％酢酸（溶媒Ｂ）を混合して用いた。溶出開始から０〜２１分間は溶媒Ａの混合比率を２０〜７６％に直線的に上げ、２１〜２２分間は溶媒Ａの混合比率を７６〜１００％に直線的に上げ、２２〜２４分間は溶媒Ａの混合比率を１００％にし、２４〜２５分間は溶媒Ａの混合比率を１００％〜２５％に直線的に下げ、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃に設定した。定量検出はＵＶ２５４ｎｍで、定性検出（検出ピークの同定）はＵＶ２００〜４００ｎｍで行った。

結果を表５に示す。

表５は、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株に関し、ストロン切片から再生した植物体について、養液栽培装置への移植（植え付け）から３６３日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。

表５中、「植え付けからの日数」、「径２ｍｍ以上の根長」、「最大根幅」、「径２ｍｍ以上の根の収量（乾燥重量）」、「グリチルリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「一株当たりの根のグリチルリチンの含有量」、「リキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「イソリキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「グリシクマリン含有の割合（乾燥重量当たり）」の各項目は、表３及び表４と同様である。各項目の値は、６株の平均とその標準偏差を表す。

表５に示す通り、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株に関し、ストロン切片から再生した植物体では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が２．７７％であった。

この結果は、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株について、親株の植物体から採取された根部の切片より再生された植物体が、親株同様、養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから１年後における再生植物体の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上であること、即ち、このカンゾウ属植物株が、親株から採取した根部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生できる株であり、親株及びその再生植物体の両者とも養液栽培を行うことができる株であり、かつ、再生植物体においても養液栽培での高グリチルリチン生産性を維持できる株であることを示す。

上述の実施例５において、ウラルカンゾウＧｕ２−２−１株の養液栽培を行うことにより、植え付けから７〜８カ月という短期間で開花させることに成功した。そこで、実施例６では、実施例５において開花した株について、その結実及び実生からの植物体の再生を試みた。

開花した花に綿棒を入れて数回前後に動かし、人工的に受粉させ、人工受粉後もグロースチャンバー室内で育成を継続した。その結果、人工受粉した株では、結実が観察された。結実した株では、莢が完熟した後、種子を採取した。その結果、開花株３株から、計１９個の種子が得られた。得られた種子は冷蔵庫内（４℃）で保管した。

得られた種子のうち１５個をサンドペーパー（Ｇ−Ｐ４０）に挟み、約５０回擦って表面に傷を付けた。その種子をガーゼ袋に包み，７５％エタノールで１分間殺菌し、滅菌水で１回洗浄した。１μＬ／ｍＬのＴｗｅｅｎ２０を含む２％次亜塩素酸ナトリウム液で撹拌しながらその種子を１０分間殺菌し、滅菌水で３回洗浄した。

径２０ｍｍ、高さ９ｃｍの培養試験管内に５ｍＬの固形培地を入れ、殺菌した種子をその試験管内に無菌的に播種し、２３℃、１４時間照明下で培養した。培地には、ショ糖２％を添加し、主要無機塩類濃度を１／２に調製したＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ固形培地（１／２（２）ＭＳ固形培地、２．５ｇ／Ｌゲルライトで固化した。）を用いた。その結果、１種子を除き全て発芽した。播種から１８日後における発芽率は９３．３％であった。

発芽した実生からシュートの先端約１〜２ｃｍを切り取った。径３０ｍｍ、高さ１５ｃｍの培養試験管内に３０ｍＬの固形培地を入れ、その試験管内にその植物切片を植え付け、２３℃、１４時間照明下で培養した。培地には、３％ショ糖添加ＷＰＧ固形培地を用いた。その結果、発根を観察し、養液栽培への植出が可能な状態に植物体を再生させることに成功した。

なお、シュートを切り取った際の残りの実生（胚軸部・子葉・幼根からなる部分）の培養を同培地で継続した結果、子葉の付け根部分に２〜４本のシュートが更に形成された。前記と同様の手順で、そのシュートを切り取り、培養試験管内に植え付け、培養した結果、シュートの先端を切り取って植え付けた場合と同様、発根を観察し、養液栽培への植出が可能な状態に植物体を再生させることに成功した。即ち、前述のシュートと合わせ、１実生より平均３個体を再生できた。

また、実生より得られた培養植物体は増殖効率が高く、ＷＰＧ固形培地下で一か月に約３倍量に増殖した。従って、本株は、グロースチャンバー室内での養液栽培による自己増殖、及び、交配による育種の両方に適した株であると推定する。

実施例７では、ウラルカンゾウを種子から育成し、グリチルリチン含有の割合の高い株の選抜を試みた。

供試材料として、２００５年に採取された北海道研究部産のウラルカンゾウ種子（筑波研究部における導入番号：ＧｕＴＳ７１−０８）を用いた。

シロイヌナズナ用屋内育成・種子回収キットのアラシステム（商品名、株式会社バイオメディカルサイエンス製、日本、以下同じ）を購入し、その土受けバスケットにバーミキュライトを充填した。

供試材料の種子を約１０分間精米機で処理した後、閉鎖温室内で、アラシステムにその種子を播種し、苗を育成した。閉鎖温室内の栽培条件を、温度２０℃、相対湿度５０％、明期１４時間に設定した。

播種から３６日後におけるウラルカンゾウ種子の発芽率は５８．８％であった。

次に、実施例３と同様、閉鎖温室内にコンテナ（高さ１０ｃｍ）を設置し、そのコンテナ内に鉢（径１５ｃｍ×高さ３０ｃｍのポリエチレンポット）を置いた。鉢には、その底面にケイ酸塩白土を敷き、ハイドロボール中粒及びハイドロボール小粒をその上に順に積層させた。

この養液栽培装置に、得られた苗を移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、閉鎖温室内で養液栽培を行った。

閉鎖温室内の栽培条件を、温度２０℃、相対湿度５０％、明期１４時間に設定した。肥料養液として、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを用いた。

苗の移植から１８１、３６４日後に、植物体を収穫し、茎、根（径１ｍｍ以上の部分）、細根（径１ｍｍ未満の部分）に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。また、実施例３などと同様の方法でグリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、グリシクマリンの同時分析を行った。

その結果、苗の移植から１８１日後では、根の短径が１ｍｍ以上の部分の乾燥処理後の重量は平均１．００ｇ、根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりのグリチルリチン含有の割合は平均０．８２％であった。

また、苗の移植から３６４日後では、根の短径が１ｍｍ以上の部分の乾燥処理後の重量は平均１０．８ｇ、根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりのグリチルリチン含有の割合は平均１．５１％、リキリチン含有の割合は０．３６％、イソリキリチン含有の割合は０．０９％、グリシクマリン含有の割合は０．１０％、一株当たりの根のグリチルリチンの含有量は１９２．４９ｍｇであった。但し、個体間のばらつきが大きかった。

実施例８では、実施例７で選抜した種子を用いて、ウラルカンゾウの養液栽培を試みた。

径２０ｍｍ、高さ９ｃｍの培養試験管に５ｍＬの固形培地を入れた。固形培地には、実施例６と同様の１／２（２）ＭＳ固形培地を用いた。

上述のＧｕＴＳ７１−０８の種子を実施例１と同様の方法で殺菌した後、その固形培地に無菌的に播種、２３℃、１４時間照明下で培養し、発芽させた。

次に、閉鎖温室内で、発芽したものを、タネまき土ポット・ジフィーセブン（株式会社サカタのタネ製、日本）に移植し、苗を育成した。閉鎖温室内の栽培条件を、温度２０℃、相対湿度５０％、明期１４時間に設定した。

次に、実施例７と同様の養液栽培装置に、得られた苗のうち２株（ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株）を移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、グロースチャンバー室内で養液栽培を行った。

グロースチャンバー室内の栽培条件を、相対湿度６０％、明期１８時間とし、明条件の際には温度を２５℃に、暗条件の際には温度を１５℃に設定した。肥料養液として、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを、苗を移植してから３９日目以降はその倍の濃度の肥料を、それぞれ用いた。

苗の移植から１２４日後に、それぞれの植物体を収穫し、茎、根（径１ｍｍ以上の部分）、細根（径１ｍｍ未満の部分）に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。また、実施例３などと同様の方法でグリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、グリシクマリンの同時分析を行った。

その結果、植え付けから１２４日後（即ち、植え付けから半年経過する前）におけるＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株では、根の短径が１ｍｍ以上の部分の乾燥処理後の重量は平均７．８ｇ、根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりのグリチルリチン含有の割合は平均２．０７％、リキリチン含有の割合は０．６７％、イソリキリチン含有の割合は０．２１％、グリシクマリン含有の割合は０．１２％、１株当たりの根のグリチルリチンの含有量は１６１．７３ｍｇであった。

また、植え付けから１２４日後（即ち、植え付けから半年経過する前）におけるＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株では、根の短径が１ｍｍ以上の部分の乾燥処理後の重量は平均１６．１ｇ、根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりのグリチルリチン含有の割合は平均１．６０％、リキリチン含有の割合は０．４８％、イソリキリチン含有の割合は０．１６％、グリシクマリン含有の割合は０．２５％、１株当たりの根のグリチルリチンの含有量は２５８．３２ｍｇであった。

なお、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２の両株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託申請したが、受託を拒否された。上述の通り、これらの株は、独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部育種生理研究室内において維持・保存されており、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲可能である。

実施例９では、実施例８で樹立したウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１を親株とし、そのストロン切片から、養液栽培による植物体の再生を試みた。

実施例８において移植から１２４日間養液栽培を行った株より茎の付け根を含む根を養液栽培装置に移植し、さらに３６６日間養液栽培を行ったＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１の植物体を親株とし、その植物体から剪定鋏でストロンを切断し、約５ｃｍ長の切片を得た。

ストロンを切断後、速やかに二価鉄イオンを含有する水溶液にその切片を入れ、３０分間以上その中に浸した。二価鉄イオンを含有する水溶液には、植物活力素メネデールの１００倍希釈液を用いた。

次に、グロースチャンバー室内にトレーを置き、トレー内にメネデールの１００倍希釈液を入れ、ジフィーセブン・水でふくらむタネまき土ポット（径４８ｍｍ）を設置し、切片をその土ポットに一本ずつ挿し、グロースチャンバー室内でメネデール希釈液を与えながら１４日間養液栽培を行った。切片を挿してから９日間、透明プラスチック製のカバーを被せ、高湿度を維持させた。グロースチャンバー室内の栽培条件を、相対湿度６０％、明期１２時間とし、明条件の際には温度を２５℃に、暗条件の際には温度を１５℃に設定した。その結果、切片を挿してから１４日後にシュートが再生した。

ストロン切片から再生したシュートを、それぞれ、実施例５などと同様の養液栽培装置に移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、３２３日間、グロースチャンバー室内で養液栽培を行った。

グロースチャンバー室内の栽培条件を、温度２５℃、相対湿度６０％、養液栽培装置に移植してから７０日目までは明期１２時間、７１日目から２２４日目までは明期１６時間、２２５日目から２５２日目までは明期８時間、それ以降は明期１６時間に設定した。肥料養液として、養液栽培装置に移植してから７５日目までは、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを、それ以降は、水８Ｌに対し、マツザキ１号３．０ｇ、マツザキ２号２．０ｇを溶解したものを、それぞれ用いた。

続いて、養液栽培装置に移植してから３２３日後に、実施例５などと同様、植物体を収穫し、茎、根（径２ｍｍ以上の部分）、細根（径２ｍｍ未満の部分）、ストロンの各部位に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。また、乾燥後、試料を実施例３と同様の方法で調製してＨＰＬＣに供し、グリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、及び、グリシクマリンの４種の化合物の同時分析を行った。ＨＰＬＣのカラム及び溶媒については、実施例５と同じものを用いた。また、設定なども実施例５に準じた。

結果を表６に示す。

表６は、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株に関し、ストロン切片から再生した植物体について、養液栽培装置への移植（植え付け）から３２３日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。

表６中、「植え付けからの日数」、「径２ｍｍ以上の根長」、「最大根幅」、「径２ｍｍ以上の根の収量（乾燥重量）」、「グリチルリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「一株当たりの根のグリチルリチンの含有量」、「リキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「イソリキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「グリシクマリン含有の割合（乾燥重量当たり）」の各項目は、表３〜５と同様である。各項目の値は、４株の平均とその標準偏差を表す。

表６に示す通り、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株に関し、ストロン切片から再生した植物体では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が２．５１％であった。

この結果は、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株についても、親株の植物体から採取された根部の切片より再生された植物体が、親株同様、養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから１年後における再生植物体の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上であること、即ち、このカンゾウ属植物株が、親株から採取した根部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生できる株であり、親株及びその再生植物体の両者とも養液栽培を行うことができる株であり、かつ、再生植物体においても養液栽培での高グリチルリチン生産性を維持できる株であることを示す。

実施例１０では、実施例８で樹立したウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を親株とし、そのストロン切片、及び、茎の付け根を含む根の切片から、養液栽培による植物体の再生を試みた。

実施例８において移植から１２４日間養液栽培を行ったＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２の植物体を親株とし、その植物体から剪定鋏でストロンを約５ｃｍ長に切断し、８８個の切片を得た。また、その植物体から、茎の付け根を含む約５ｃｍ長の根の切片を得た。

ストロン又は茎の付け根を含む根を切断後、速やかに二価鉄イオンを含有する水溶液にその切片を入れ、３０分間以上その中に浸した。二価鉄イオンを含有する水溶液には、植物活力素メネデールの１００倍希釈液を用いた。

次に、ストロン切片については、グロースチャンバー室内にトレーを置き、トレー内にメネデールの１００倍希釈液を入れ、ジフィーセブン・水でふくらむタネまき土ポット（径４８ｍｍ）を設置し、切片をその土ポットに一本ずつ挿し、グロースチャンバー室内でメネデール希釈液を与えながら１４日間養液栽培を行った。切片を挿してから９日間、透明プラスチック製のカバーを被せ、高湿度を維持させた。グロースチャンバー室内の栽培条件を、相対湿度６０％、明期１２時間とし、明条件の際には温度を２５℃に、暗条件の際には温度を１５℃に設定した。

一方、茎の付け根を含む根の切片については、実施例５などと同様の養液栽培装置に切片を移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、グロースチャンバー室（完全人工光室）内で養液栽培を行った。肥料養液には、実施例５などと同様のものを用いた。栽培条件も実施例５と同様に設定した。

その結果、ストロン切片のうち、１〜２個の芽の形成が認められたものと認められなかったもののいずれの場合も、切片を挿してから１４日後におけるシュート再生率は、５３．８〜１００％で、非常に良好であった。また、再生したシュートを、実施例５などと同様の養液栽培装置に移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、閉鎖温室内で養液栽培を行った。肥料養液には、実施例５などと同様のものを用い、栽培条件も実施例５と同様に設定した。その結果、ストロン切片から得られた苗は、その後、良好に生育した。

一方、茎の付け根を含む根の切片の養液栽培を行ったものについても、１４日後にシュートが再生し、その後、良好に生育した。

ストロン切片から得られた各植物体（再生植物体）を養液栽培装置に移植してから１６３日後に、植物体を収穫し、茎、根（径１ｍｍ以上の部分）、細根（径１ｍｍ未満の部分）に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。また、実施例３などと同様の方法でグリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、グリシクマリンの同時分析を行った。

その結果、植え付けから１６３日後（即ち、植え付けから半年経過する前）における再生植物体では、根の短径が１ｍｍ以上の部分の乾燥処理後の重量は平均９．２６ｇ、根の短径が１ｍｍ以上の部分におけるＨＰＬＣの結果による乾燥重量当たりのグリチルリチン含有の割合は平均１．９３％、リキリチン含有の割合は０．６９％、イソリキリチン含有の割合は０．０７％、グリシクマリン含有の割合は０．１３％、一株当たりの根のグリチルリチンの含有量は１７５．２８ｍｇであった。

実施例１１では、実施例１０においてストロン切片から再生させたＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２の苗について、養液栽培による育成を試みた。

実施例１０でジフィーセブン・水でふくらむタネまき土ポットに挿したストロン切片について、切片を挿してから４１日間、引き続き同条件で養液栽培を継続し、苗を育成した後、その苗を、実施例５などと同様の養液栽培装置に移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、３５３日間、グロースチャンバー室内で養液栽培を行った。

グロースチャンバー室内の栽培条件を、養液栽培装置に移植してから２９日間は、相対湿度６０％、明期１６時間とし、明条件の際には温度を２５℃に、暗条件の際には温度を１５℃に、同３０日目〜２０４日目は、温度２５℃、相対湿度６０％、明期１６時間に、同２０５日目〜２３２日目は、温度２５℃、相対湿度６０％、明期８時間に、同２３３日目〜２３６日目は、温度２５℃、相対湿度５５％、明期１６時間に設定した。同２３７日目以降は、閉鎖温室内で、温度２５℃、相対湿度５５％、明期１４時間に設定した。肥料養液として、養液栽培装置に移植してから２８０日目までは、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを、それ以降は、水８Ｌに対し、マツザキ１号３．０ｇ、マツザキ２号２．０ｇを溶解したものを、それぞれ用いた。

続いて、養液栽培装置に移植してから３５３日後に、実施例５などと同様、植物体を収穫し、茎、根（径１ｍｍ以上の部分）、細根（径１ｍｍ未満の部分）、ストロンの各部位に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。また、乾燥後、試料を実施例３などと同様の方法で調製してＨＰＬＣに供し、グリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、及び、グリシクマリンの４種の化合物の同時分析を行った。ＨＰＬＣのカラム及び溶媒については、実施例５と同じものを用いた。また、設定なども実施例５に準じた。

結果を表７に示す。

表７は、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に関し、ストロン切片から再生した植物体について、養液栽培装置への移植（植え付け）から３５３日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。

表７中、「植え付けからの日数」、「径１ｍｍ以上の根長」、「最大根幅」、「径１ｍｍ以上の根の収量（乾燥重量）」、「グリチルリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「一株当たりの根のグリチルリチンの含有量」、「リキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「イソリキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「グリシクマリン含有の割合（乾燥重量当たり）」の各項目は、表３〜６と同様である。各項目の値は、２株の平均値と、測定値と平均値との差を表す。

表７に示す通り、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に関し、ストロン切片から再生した植物体では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が３．０８％であった。

実施例１２では、実施例１０において、茎の付け根を含む根の切片から再生させたＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２の苗について、養液栽培による育成を試みた。

実施例１０において養液栽培装置で再生させた植物体について、切片移植後３６５日間、引き続き同様の方法で養液栽培を行った。

グロースチャンバー室内の栽培条件を、温度２５℃、相対湿度６０％とし、養液栽培装置に移植してから初めの６日間は明期１６時間に、同７日目〜３４日目は明期８時間に、同３５日目〜３８日目は明期１６時間に設定し、同３９日目以降は、閉鎖温室内で、温度２５℃、相対湿度５５％、明期１４時間で養液栽培した。肥料養液として、養液栽培装置に移植してから８１日目までは、水８Ｌに対し、マツザキ１号１．５ｇ、マツザキ２号１．０ｇを溶解したものを、それ以降は、水８Ｌに対し、マツザキ１号３．０ｇ、マツザキ２号２．０ｇを溶解したものを、それぞれ用いた。

続いて、養液栽培装置に移植してから３６５日後に、実施例５などと同様、植物体を収穫し、茎、根（径２ｍｍ以上の部分）、細根（径２ｍｍ未満の部分）、ストロンの各部位に分割し、５０℃で数日間温風乾燥し、乾燥重量を測定した。また、乾燥後、試料を実施例３などと同様の方法で調製してＨＰＬＣに供し、グリチルリチン、リキリチン、イソリキリチン、及び、グリシクマリンの４種の化合物の同時分析を行った。ＨＰＬＣのカラム及び溶媒については、実施例５などと同じものを用いた。また、設定なども実施例５などに準じた。

結果を表８に示す。

表８は、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に関し、茎の付け根を含む根の切片から再生した植物体について、養液栽培装置への移植（植え付け）から３６５日後におけるグリチルリチン含有の割合などを示す表である。

表８中、「植え付けからの日数」、「径２ｍｍ以上の根長」、「最大根幅」、「径２ｍｍ以上の根の収量（乾燥重量）」、「グリチルリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「一株当たりの根のグリチルリチンの含有量」、「リキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「イソリキリチン含有の割合（乾燥重量当たり）」、「グリシクマリン含有の割合（乾燥重量当たり）」の各項目は、表３〜７と同様である。

表８に示す通り、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に関し、茎の付け根を含む根の切片から再生した植物体では、植え付けから約１年後におけるグリチルリチン含有の割合が２．９４％であった。

実施例１１及び本実施例の結果は、ウラルカンゾウＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株についても、親株の植物体から採取された根部の切片より再生された植物体が、親株同様、養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから１年後における再生植物体の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上であること、即ち、このカンゾウ属植物株が、親株から採取した根部の切片を用いて養液栽培を行うことにより植物体を再生できる株であり、親株及びその再生植物体の両者とも養液栽培を行うことができる株であり、かつ、再生植物体においても養液栽培での高グリチルリチン生産性を維持できる株であることを示す。

以上、実施例３〜５及び実施例８〜１２に示す通り、本発明者らは、下記（１）及び（２）の性質を備える複数の新規なカンゾウ属植物株の作出に成功した。
（１）親株の植物体が養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから半年後における親株の根部のグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その植え付けから１年後における親株の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。
（２）親株の植物体から採取された根部の切片を用いて養液栽培を行うことにより再生でき、かつその植え付けから半年後における親株の根部のグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その植え付けから１年後における再生植物体の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。

実施例１３では、実施例８で樹立したウラルカンゾウ株を親株とし、その地上茎（茎又は頂芽）の切片から、養液栽培による植物体の再生を試みた。

実施例８において移植から３６６日間養液栽培を行ったＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１の植物体を親株とし、その植物体から剪定鋏で、節を３つ以上含むように、地上茎を約１０〜１５ｃｍ長に切断し、５１個の切片を得た。葉は全て落とした。調製した切片は、頂芽を含むものが３４個、含まないものが１７個であった。

地上茎を切断後、速やかに二価鉄イオンを含有する水溶液にその切片を入れ、５〜２０分間その中に浸した。二価鉄イオンを含有する水溶液には、植物活力素メネデールの１００倍希釈液を用いた。

アラシステムを用いて、その土受けバスケットにバーミキュライトを充填し、そこに切片を一本ずつ挿した。水受けトレーにメネデールの１００倍希釈液を入れ、土受けバスケットごとその中に浸し、閉鎖温室内で１３日間養液栽培を行った。システム全体を透明プラスチック製のカバーで覆い、高湿度を維持させた。閉鎖温室内の栽培条件を、相対湿度６０％、明期１２時間、温度を２５℃に設定した。

その結果、切片を挿してから１３日後におけるシュート再生率は、平均７２．５％で、良好であった。

再生したシュートのうち、頂芽苗２本と茎苗２本を、それぞれ、実施例７などと同様の養液栽培装置に移植し、コンテナ内を肥料養液で満たし、閉鎖温室内で養液栽培を行った。肥料養液には、実施例７などと同様のものを用い、栽培条件も実施例７などと同様に設定した。その結果、いずれの苗についても、根部の切片から育成した苗と同様、その後、良好に生育した。

実施例１４では、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株におけるＳＱＳ遺伝子の部分配列を取得した。

上述の通り、カンゾウ属植物のグリチルリチン生合成経路上の酵素の一つとして、ＳＱＳが知られている。一般的に、相同酵素をコードする遺伝子のゲノム上におけるエキソン・イントロン構造は植物種間を超えて保存されている傾向がある。そこで、シロイヌナズナのＳＱＳ１遺伝子及びＳＱＳ２遺伝子のゲノムから、ウラルカンゾウにおける構造を予測し、その配列情報に基づき、ウラルカンゾウのＳＱＳ１遺伝子又はＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３を増幅しうるプライマーを設計した。

上述のＧｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株から公知方法によりゲノムＤＮＡを取得し、そのＤＮＡを鋳型として、設計プライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ＳＱＳ１遺伝子又はＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３の領域を増幅した。その増幅産物を、それぞれ、公知のシークェンシングベクターにクローニングし、その領域の塩基配列を解析した。

その結果、Ｇｕ２−３−２株におけるＳＱＳ１遺伝子のエキソン１〜エキソン３の部分配列として配列番号１及び２の配列を、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株におけるＳＱＳ１遺伝子のエキソン１〜エキソン３の部分配列として配列番号２及び３の配列を、それぞれ取得した。なお、両株とも、ＳＱＳ１遺伝子の２種類の配列が検出され、その一方は両株に共通の配列であり、もう一方は、それぞれの株に特異的な配列であった。

また、Ｇｕ２−３−２株におけるＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３の部分配列として配列番号４の配列を、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株におけるＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３の部分配列として配列番号４及び５の配列を、それぞれ取得した。なお、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株では、ＳＱＳ２遺伝子の２種類の配列が検出され、その一方はＧｕ２−３−２株と共通の配列であり、もう一方は、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に特異的な配列であった。

実施例１５では、ＰＣＲ法によりＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を他の株から識別できるかどうか、検討した。

実施例１４における塩基配列解析の結果、Ｇｕ２−３−２株とＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株との間でも、ＳＱＳ１遺伝子のイントロン１及びＳＱＳ２遺伝子のイントロン１において、顕著な塩基配列の差異が認められた。

そこで、ＳＱＳの各塩基配列のうち、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に特異的な配列部位を増幅しうる識別用プライマーセットを２組設計し、そのプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を他の株から識別できるかどうか、検討した。

設計したプライマーセットの配列を、それぞれ、配列番号６〜９に示す。配列番号６と７は、ＳＱＳ１遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットである。配列番号８と９は、ＳＱＳ２遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットである。なお、配列番号６及び８のプライマーがフォワードプライマー、配列番号７及び９のプライマーがリバースプライマーである。

Ｇｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、それらのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により、ＳＱＳ１遺伝子又はＳＱＳ２遺伝子の部分長の増幅を試みた。

ＰＣＲ機器には、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（アプライドバイオシステムズ社製、米国）を、ＰＣＲ酵素にはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製、日本）を、それぞれ用いた。１サンプル当たり、滅菌水７８．５μＬ、１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）８μＬ、フォワードプライマー（１００μＭ）１μＬ、リバースプライマー（１００μＭ）１μＬ、鋳型ゲノムＤＮＡ １μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ０．５μＬ、計１００μＬに調製し、９４℃、５ｍｉｎ→[９４℃、３０ｓｅｃ→５８℃、３０ｓｅｃ→７２℃、１ｍｉｎ]×３０ｃｙｃｌｅ→７２℃、１０ｍｉｎ→４℃、ｆｏｒｅｖｅｒの条件でＰＣＲを行った。

結果を図１に示す。図１はＳＱＳ遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行った際の１％アガロースゲル電気泳動写真である。図１中、左から、レーン１はマーカー、レーン２はＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＱＳ１遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットを用いてＰＣＲ行った際のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を、レーン３はＧｕ２−３−２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＱＳ１遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットを用いてＰＣＲ行った際のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を、レーン４はＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＱＳ２遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットを用いてＰＣＲ行った際のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を、レーン５はＧｕ２−３−２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＱＳ２遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットを用いてＰＣＲ行った際のＰＣＲ産物を電気泳動した結果を、それぞれ表わす。

図１に示す通り、ＳＱＳ１遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットを用いた場合（レーン２及び３参照）、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株では、Ｇｕ２−３−２株と比較し、増幅産物のサイズに違いがあった。

また、ＳＱＳ２遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーのセットを用いた場合（レーン４及び５参照）、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみ、増幅産物が得られた（図中の矢印参照）。

実施例１６では、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株におけるＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の部分配列を取得した。

ＣＹＰ８８Ｄサブファミリー遺伝子に関し、ゲノム情報が公開されているタルウマゴヤシ、ミヤコグサのＣＹＰ８８Ｄ遺伝子を調べた結果、そのエキソン・イントロン構造は広く保存されているという知見を得た。そこで、これらのゲノム情報から、ウラルカンゾウにおけるＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の配列を予測し、その配列情報に基づき、その配列中のエキソン６〜エキソン８を増幅しうるプライマーを設計した。

上述のＧｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株から公知方法によりゲノムＤＮＡを取得し、そのＤＮＡを鋳型として、設計プライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のエキソン６〜エキソン８の領域を増幅した。その増幅産物を、それぞれ、公知のシークェンシングベクターにクローニングし、その領域の塩基配列を解析した。

その結果、Ｇｕ２−３−２株におけるＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のエキソン６〜エキソン８の部分配列として配列番号１０の配列を、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株におけるＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のエキソン６〜エキソン８の部分配列として配列番号１０及び１１の配列を、それぞれ取得した。なお、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株では、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の２種類の配列が検出され、その一方は両株に共通の配列（配列番号１０）であり、もう一方は、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に特異的な配列（配列番号１１）であった。

実施例１７では、ＰＣＲ−ＲＦＬＰにより、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を他の株から識別できるかどうか、検討した。

実施例１６における塩基配列解析の結果、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７において、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に特異的な塩基配列を発見した。この配列部位には制限酵素ＨｉｎｃＩＩの切断サイトが含まれていた。

そこで、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の塩基配列のうち、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株に特異的な配列を含む部分配列を増幅しうる識別用プライマーセットを設計し、そのプライマーを用いて、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を他の株から識別できるかどうか、検討した。

設計したプライマーセットの配列を、それぞれ、配列番号１２及び１３に示す。配列番号１２のプライマーがフォワードプライマー、配列番号１３のプライマーがリバースプライマーである。

Ｇｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、それらのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の部分長の増幅を試みた。

ＰＣＲ機器には、２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製、米国）を、ＰＣＲ酵素にはＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績株式会社製、日本）を、それぞれ用いた。１サンプル当たり、滅菌水３４．５μＬ、１０×ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ（２．０ｍＭ ｅａｃｈ）５μＬ、ＭｇＳＯ_４ ２μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）１μＬ、鋳型ゲノムＤＮＡ １μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ０．５μＬ、計５０μＬに調製し、９４℃、２ｍｉｎ→[９４℃、３０ｓｅｃ→５８℃、３０ｓｅｃ→６８℃、９０ｓｅｃ]×４０ｃｙｃｌｅ→６５℃、５ｍｉｎ→４℃、ｆｏｒｅｖｅｒの条件でＰＣＲを行った。

そのＰＣＲ産物５μＬに制限酵素ＨｉｎｃＩＩを１μＬ加え、３７℃で１．５時間処理した。

結果を図２に示す。図２はＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーと制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を行った際の１％アガロースゲル電気泳動写真である。図２中、左から、レーン１はマーカー、レーン２はＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ行った後、制限酵素処理を行ったものを電気泳動した結果を、レーン３はＧｕ２−３−２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ行った後、制限酵素処理を行ったものを電気泳動した結果を、レーン４はＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ行った後、制限酵素処理を行わずに電気泳動した結果を、レーン５はＧｕ２−３−２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ行った後、制限酵素処理を行わずに電気泳動した結果を、それぞれ表わす。

図２に示す通り、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ行った後、制限酵素処理を行った場合、約６００ｂｐ及び約５００ｂｐの位置に、特異的な制限酵素断片が得られた（図中の矢印参照）。

以上、実施例１４及び実施例１６において、Ｇｕ２−３−２株及びＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株におけるＳＱＳ遺伝子の部分配列とＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の部分配列を取得できた。これらの遺伝子における配列を比較することにより、Ｇｕ２−３−２株又はＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を他の株と識別できる。

また、実施例１５及び本実施例に示す通り、両実施例における方法を単独で若しくは並行して行うことにより、簡易かつ高精度にＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株を他の株から識別できる。

実施例１５において、ＳＱＳ遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行った際の１％アガロースゲル電気泳動写真。 実施例１７において、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子の配列に基づき設計されたプライマーと制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰを行った際の１％アガロースゲル電気泳動写真。

Claims (4)

1. 下記（１）及び（２）の性質を備えるカンゾウ属植物株。
   （１）親株の植物体が養液栽培を行うことのできる株であり、かつその植え付けから半年後における親株の根部のグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その植え付けから１年後における親株の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。
   （２）前記親株の植物体から採取された根部又は茎部の切片を、二価鉄イオンを少なくとも含有する水溶液に浸漬した後、該切片を用いて養液栽培を行うことにより再生でき、かつその植え付けから半年後における再生植物体の根部のグリチルリチン含有の割合が１．５％以上、又は、その植え付けから１年後における再生植物体の根部のグリチルリチン含有の割合が２．５％以上である。
2. 結実する株である請求項１記載のカンゾウ属植物株。
3. 前記結実により得られた種子から前記植物体を再生できる請求項２記載のカンゾウ属植物株。
4. Ｇｕ２−２−１株、Ｇｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株のいずれかのカンゾウ属植物株。