WO2009020231A1 - カンゾウ属植物由来トリテルペン酸化酵素、それをコードする遺伝子およびその利用 - Google Patents

カンゾウ属植物由来トリテルペン酸化酵素、それをコードする遺伝子およびその利用 Download PDF

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WO2009020231A1
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seq
protein
plant
amylin
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PCT/JP2008/064496
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Toshiya Muranaka
Hikaru Seki
Kiyoshi Ohyama
Hiroshi Sudo
Satoru Sawai
Kazuki Saito
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Riken
National University Corporation Chiba University
Tokiwa Phytochemical Co., Ltd.
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    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme that oxidizes a Danmaran series triterpene derived from a licorice plant, a gene encoding the enzyme, and use thereof.
  • the licorice is a perennial herbaceous plant of the legume family. Its roots and roots
  • Glychyrrhiza glabra ⁇ and Glychyrrhiza infla ta The main active ingredient of ⁇ Glychyrrhiza uralensis) Glychyrrhiza glabra ⁇ and Glychyrrhiza infla ta is the triterpene saponin glycyrrhizin. Numerous studies have been conducted on this component from various aspects such as biopharmaceutical studies, pharmacological studies, and breeding studies. However, regarding the biosynthetic pathway of this component, it was completely unknown how it was biosynthesized after the triterpene i3-amylin.
  • 3-Amylin 2 Gene CYP93E (Fig. 1), which encodes an enzyme that hydroxylates position 4, is published in WO Z 2 0 0 5/0 8 0 5 7 2 and Shibuya et al. Ident i icat ion of beta-amyrin ana sophoradiol 24-hydroxylase by expressed sequence tag raining and functional express ion assay. FEBS J. 2006 Mar; 273 (5): 948-59. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to identify a protein having an activity to oxidize a dammarane series triterpene, and a gene encoding the same, and to provide the protein, gene and use thereof.
  • cytochrome P 4 50 gene (hereinafter referred to as P) having a catalytic function of oxidizing the 11-position carbon of dammamarine series triterpenes such as 3-amylin; 4500 genes) was successfully isolated and the present invention was completed.
  • the present invention is summarized as follows.
  • a protein having an activity to oxidize the 11th carbon of the dammarane series triterpene [1] A protein having an activity to oxidize the 11th carbon of the dammarane series triterpene.
  • a gene encoding a protein having an activity to oxidize the 11-position carbon of a dammarane series triterpene [8] The gene according to [7], wherein the dammarane series triterpene is: 3-amylin or 30-hydroxyl i3-amylin.
  • a recombinant vector comprising the gene according to any one of [7] to [12].
  • [2 1] A method for selecting the plant by determining the presence or expression of the gene according to any one of [7] to [12] in a plant, wherein the nucleic acid-containing sample prepared from the plant is The plant selection method comprising detecting or quantifying the gene by performing PCR, RT-PCR or nucleic acid hybridization using the gene or a fragment thereof.
  • Fig. 1A shows the biosynthetic pathway of glycyrrhizin and soyasaponin I
  • Fig. 1B shows the results of gene expression analysis by the RT-PCR method.
  • Figure 2 shows a method for synthesizing triterpenoids.
  • Figure 3 shows the synthesis of triterpenoids.
  • FIG. 4 shows the detection result of the conversion product of] 3-amylin by the protein of the present invention.
  • FIG. 5 shows the results of detection of a 30-hydroxyl; 3-amylin conversion product by the protein of the present invention.
  • Figure 6 shows the measurement results of 11-oxo j3-amylin by NMR.
  • FIG. 7 shows the measurement result of 1 1 ⁇ -hydroxy] 3-amylin by NMR.
  • the protein of the present invention is a triterpene oxidase having an activity of oxidizing the carbon at position 11 of a dammarane series triterpene.
  • a dammarane series triterpene is a compound formed from a dammarene cation (2,3—oxide squalene) closed by a chair-chair-chair-boat (boat-type) conformation. Group, including tetracyclic compounds, pentacyclic compounds and the like. Specifically, Danmaran, Remonoid, Quasinoid, Lupine, Oleanan, U Lusan type triterpenes are mentioned.
  • the dammarane series triterpene is not particularly limited, but is preferably an oleanane type triterpene.
  • oleane-type triterpenes include 3-amylin, oleanolic acid, hederagenin, 1 1 -dexoglycyrrhetinic acid, cameliagenin, sasasapogenol, and psychogenin. 0 —Hydroxy ⁇ —Amiline.
  • the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a licorice plant
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 means, for example, 1 to 10 amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1.
  • 1 to 5 amino acids may be deleted, and 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids may be added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the sequence It means that 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in No. 1 may be substituted with other amino acids.
  • Examples of such amino acid sequences include the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 13 are different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 by 4 and 7 amino acids, respectively.
  • the proteins having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 13 are encoded by genes having the base sequences shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 14 respectively.
  • the “identity” of the “amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90%, More preferably, it is 95% or more.
  • the origin of the protein of the present invention is not particularly limited, but a licorice plant is preferred, and Glychyrrhiza uralensis or Glychyrrhiza glabra 3 ⁇ 4 is more preferred.
  • the licorice plant is a plant classified into the genus licorice, Glychyrrhiza glaora ⁇ Glycnyrrhiza inflata ⁇ Glychyrrhiza uralensis ⁇ Glychyrrhiza aspera ⁇ Glychyrrhiza eurycarpa ⁇ Glychyrrhta pallidiflora, Glychyrrechly Glychyrrhiza aca? IA. caT? a etc. can be illustrated. Among them, Glychyrrhiza glabra ⁇ Glychyrrhiza inflata and Glychyrrhiza uralensis force have been reported to have been produced.
  • the protein of the present invention can be obtained from, for example, a stront or root of a licorice plant using a known method.
  • a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 13 is synthesized by a known chemical synthesis method.
  • a gene encoding the protein to be described later may be obtained and produced by a known gene recombination technique.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. can be obtained, for example, by modifying a gene described below by a technique known in the art.
  • Mutation can be introduced into a gene by, for example, a known method such as the Kunke 1 method or the Gappedduplex method or a method similar thereto, for example, a kit for introducing a mutation using site-directed mutagenesis ( For example, mutation can be introduced using Mutant-K (Takara Shuzo), Mutant-G (Takara Shuzo)), or LAP CR in vitro Mutagenesis series kit (Takara Shuzo).
  • a method of contacting with a mutagen drug, a method of irradiating with ultraviolet rays, and the like can also be used.
  • the protein of the present invention can be used in a method for oxidizing a dammarane series triterpene.
  • the 11-position carbon of one amylin is oxidized.
  • the substance obtained by oxidation include 1 1 -hydroxy-] 3 -amylin, 1 1-oxoamylin, and the like.
  • the protein of the present invention is allowed to act on the substrate, 30-hydroxy] 3-amylin, the carbon at the 11-position of 30-hydroxy / 1 / 3_amylin is oxidized.
  • the substance obtained by oxidation include 1 1 ⁇ , 30-dihydroxy-] 3-amylin, 30-hydroxy-11-oxo-] 3-amylin, and the like.
  • the gene of the present invention encodes a protein having an activity of oxidizing the 11th carbon of the dammarane series triterpene.
  • the present inventors prepared mRNA from strontium of the licorice genus plant, prepared cDNA library, and performed EST analysis. ] It is considered that the P45 gene is involved in the pathway of biosynthesis of glycyrrhizin (also called darlicylic acid) through 3-step oxidation, glycosylation, etc. from amylin. A search was performed on the sequence to narrow down candidate genes. Gene expression analysis was performed on the candidate genes to identify the gene of the present invention (see Examples below).
  • the “base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3” is, for example, 1 to 10 base sequences shown in SEQ ID NO: 3, preferably 1 to 5 bases may be deleted, 1 to 10 bases, preferably 1 to 5 bases may be added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 3 It means that 1 to 10, preferably 1 to 5 bases of the base sequence shown in the above may be substituted with other bases.
  • the “identity” of the “base sequence having 80% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3” is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90%, more preferably 95% or more.
  • An example of such a gene is a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 differs from the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 by 11 bases.
  • a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 derived from Glychyrrhiza ⁇ abra can be mentioned.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 differs from the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 by 14 bases.
  • the “stringent condition” means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not substantially formed.
  • it has 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity with a highly identical nucleic acid, that is, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • One example is a condition in which a complementary strand of DNA consisting of a basic sequence hybridizes and a complementary strand of a nucleic acid with low identity does not hybridize.
  • the sodium salt concentration is 15-750 mM, preferably 50-750 mM, more preferably 300-750 mM, and the temperature is 25-70 ° C. , Preferably 5
  • the conditions for washing the filter after hybridization are usually such that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 m.
  • the gene of the present invention can be isolated from licorice plants using a known method. Using a primer designed based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 14, PCR amplification using a nucleic acid derived from the cDNA library or the genomic DNA library as a cocoon By carrying out, it can be obtained as a nucleic acid fragment.
  • the gene of the present invention can be obtained as a nucleic acid fragment by performing a hybridization using a nucleic acid derived from the above library or the like as a cage and using a fragment that is a part of the gene as a probe.
  • the gene of the present invention may be synthesized by a known nucleic acid sequence synthesis method such as a chemical synthesis method.
  • the sequence can be prepared by introducing a mutation by the method described above.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed by introducing the above gene into an appropriate vector.
  • the type of vector is not particularly limited, p B I system, p PZ
  • P-based, p SMA system, pUC series, p BR system, p B luescript, p KS l , p T ri EX TM system may be used vectors such as.
  • viral vectors such as cauliflower mosaic virus (CaMV), inggen mamosic virus (BGM V), and tobacco mosaic virus (TMV) can also be used.
  • a binary vector such as pBI system may be used.
  • the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or multiple cloning site, and ligated to the vector. Is done.
  • a promoter for example, a promoter, an enhancer, a terminator, a selection marker gene and the like can be linked.
  • a 3-amylin synthase gene may be included.
  • promoters that can operate in bacterial cells include Bacillus stear mouth Thermophilus maltodienic amylase gene, Bacillus licheniformis ⁇ -amylase gene, Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene, Bacillus subtilis al power Li protease gene or Bacillus pumilus-key Shiroshidaze gene promoter or phage lambda P R or P L promoters,, lac of E.coli, such as trp or tac promoter.
  • promoters operable in yeast host cells include a promoter derived from a yeast glycolytic gene, an anorecordone dehydrogenase gene promoter, a TP I 1 promoter, and an ADH 2-4c promoter.
  • promoters operable in fungi include ADH 3 promoter and tpi A promoter.
  • Promoters that can operate in animal cells include SV40 early-mouth motor, SV40 rate promoter, CMV promoter, etc.
  • promoters that can operate in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographer Californ Niki ⁇ Polyhedrosis basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, baculovirus 39K delayed early gene promoter, etc.
  • enhancer examples include an enhancer region including an upstream sequence within the CaMV S promoter, an SV40 enhancer, and a CMV enhancer.
  • Terminators include nopaline synthase (NO S) gene terminator — octopine synthase (OC S) gene terminator, CaMV 35 S terminator, E. coli lipopolyprotein 1 pp 3 ′ terminator, trp operon terminator, a my B terminator, ADH 1 gene terminator, etc.
  • NO S nopaline synthase
  • OC S octopine synthase
  • Selectable marker genes include drug resistance genes (tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, etc.), fluorescence or Luminescent reporter gene (Luciferase, ⁇ Enzyme genes such as one galactosidase, one dalchronitase (GUS), green funoleoresin sense protein (GFP), neomycin phosphotransferase II (NPTI 1), and dihydrofolate reductase.
  • drug resistance genes tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, etc.
  • Fluorescence or Luminescent reporter gene ⁇ Enzyme genes such as one galactosidase, one dalchronitase (GUS),
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing the above gene or recombinant vector into an appropriate host.
  • -Host is not limited as long as the introduced gene can be expressed.
  • Bacteria such as E. coli and Bacillus subtilis, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bombe, Pichia pastoris, Aspergillus, Neurospora, Fusarium It may be a fungus such as Trichoderma, or a monocotyledonous or dicotyledonous plant such as a plant belonging to the legume family or the Brassicaceae family, a plant cell, or an animal cell such as an insect cell such as sf9 or sf21.
  • gene or recombinant vector introduction examples include known methods such as the agrobacterium method, the PEG-phosphoric acid method, the electroporation method, the liposome method, the particle gun method, and the microinjection method.
  • the introduced gene may be integrated into the host genome DNA or may be present as it is contained in the foreign vector.
  • the gene or recombinant vector of the present invention may be introduced into a host by the above-described method, and it may be confirmed whether or not the gene has been incorporated into the host. This confirmation can be made by the PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method, in situ hybridization, etc.
  • a transformant having enhanced expression of the gene of the present invention can be provided by introducing the gene or recombinant vector of the present invention into an expressible state. Therefore, according to the present invention, a transformant in which the production amount of glycyrrhizin is increased by enhancing the expression of the gene of the present invention can also be provided.
  • a “plant” includes a plant body, a plant organ, a plant tissue, a plant cell, a cultured product thereof, and a seed, and a “transformed plant” is a transformed plant produced by genetic manipulation. Including products and their progeny.
  • Transformation targets include plant bodies, plant tissues (eg epidermis, phloem, parenchyma, xylem, vascular bundles, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.)) or plant cells However, it is not particularly limited.
  • Tumor tissue, shoots, hairy roots, etc. obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used appropriately by using conventionally known plant tissue culture methods.
  • the plant can be regenerated by administration of various concentrations of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.).
  • plant regeneration is performed after differentiating roots on a medium containing a suitable kind of auxin and cytokinin, and then transplanting to a medium rich in cytokinin to differentiate the shout. This is done by transplanting to a soil that does not contain hormones.
  • the transformant which suppressed the expression of the gene of this invention can be provided.
  • Such a transformant can be used, for example, for research on elucidation of the glycyrrhizin biosynthetic pathway.
  • Suppression of the expression of the gene of the present invention includes suppression of transcription of the gene and suppression of translation into protein, and includes not only complete termination of gene expression but also decrease of expression.
  • By artificially or naturally mutating or destroying genes, or by using various genetic engineering methods such as RNA interference methods, antisense methods, ribozyme methods, co-suppression methods, methods of controlling transcription factors, etc. Gene expression can be disabled or suppressed.
  • the protein of the present invention can be produced by culturing or growing the host in an appropriate medium under conditions that allow expression of the introduced gene, depending on the host.
  • the medium is, for example, LB medium, M9 medium, YPD medium, YPG medium, YPM medium, YPDMM medium,
  • SMM medium etc.
  • carbon sources eg glucose, glycerin, mannitol, fructose, ratatoose, etc.
  • nitrogen sources eg inorganic nitrogen such as ammonium sulfate, ammonium chloride, casein degradation products, yeast extraction
  • Organic nitrogen sources such as polypeptone, bacto tripton, beef extract
  • inorganic salts eg, sodium diphosphate
  • a dammarane series triterpene preferably an oleanane-type triterpene, more preferably j3-amylin, which is a substrate for the protein of the present invention, may be added to the medium.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as they are appropriate for gene expression, but are usually cultured at 10 to 45 ° C for several hours to several hundred hours with aeration and agitation as necessary.
  • the protein accumulated in the culture can be extracted by a known method and purified as necessary.
  • a known method for example, solvent extraction method, salting-out method, solvent precipitation method, dialysis method, ultrafiltration method, gel electrophoresis method, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, etc.
  • the protein of the present invention can be obtained.
  • a dammarane series triterpene such as J3-amylin as a substrate of the protein of the present invention is added to the medium and the transformant is cultured, a derivative in which the carbon at position 11 of the dammarane series triterpene is oxidized. It is possible to obtain.
  • the protein of the present invention When growing a transformed plant or the like to produce the protein of the present invention, the protein of the present invention may be extracted from the regenerated plant or the like by the above-mentioned known method and purified as necessary.
  • the protein of the present invention In the case of the licorice plant, the protein of the present invention is abundant in strons and roots, and the above derivatives or glycyrrhizin produced via the glycyrrhizin biosynthetic pathway can be collected from strons and roots. is there.
  • a nucleic acid-containing sample of a plant can be prepared by a known method such as phenol extraction method, phenol / chloroform extraction method, CTAB method or the like. Presence or absence or expression of the gene of the present invention is determined by PCR (polymerase chain reaction) method, R It can be detected or quantified using the T-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) method or the nucleic acid hybridization method. Examples of nucleic acid hybridization methods include DNA-DNA hybridization, DNA-RNA hybridization or RNA-RNA hybridization.
  • the primer or probe used in the PCR method, RT-PCR method or nucleic acid hybridization should be designed using a gene having any of the nucleotide sequences shown in (d) to (g) above or a fragment thereof. Good.
  • fragment refers to a continuous base sequence of at least 10 bases, 15 bases, 20 bases, 25 bases, 30 bases, 50 bases, 100 bases, or 150 bases in the above base sequence. Refers to the fragment.
  • the size of the primer or probe used in the present invention is not particularly limited, but in the case of a primer, it is usually about 15 to about 50 bases in length, preferably about 17 to about 30 bases in length.
  • a probe in Northern hybridization, at least about 10 base lengths to full length, preferably about 15 base lengths to full length, more preferably about 30 base lengths to full length, more preferably about 50 base lengths.
  • the DNA microarray uses a probe having a length of about 10 to about 50 bases, preferably about 15 to about 30 bases, more preferably about 20 to about 25 bases. It is not limited to these. In general, the longer the probe, the better the hybridization efficiency and the higher the sensitivity.
  • Probes on the solid phase are usually spotted with a solution of 0.1 l w g to 0.5 g.
  • Examples of the primer and the probe are not particularly limited, and examples thereof include SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • PCR conditions include, for example, denaturation of DNA at 94-95 ° C for 5 seconds to 5 minutes.
  • an extension reaction can be performed at 68 to 72 ° C for 30 seconds to 10 minutes.
  • the PCR product can be detected using, for example, agarose electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, dot hybridization, and the like.
  • the RT-PCR method using an internal standard substance can be cited as a method for quantifying the expression level of the gene of the present invention by the PCR method. (Refer to the forefront of the PCR method (1996) Sekiya, Fujinaga, Kyoritsu publication) ). Housekeeping genes are often used as internal standards to be used. This method gives a relative result when the target mRNA level is higher or lower than the internal standard sample. During the PCR reaction for one sample, sample the reaction solution every few cycles to quantify the amount of PCR product and plot it on a graph.
  • the expression level of the gene of the invention can be quantified by the real-time quantitative PCR method.
  • PCR reaction is performed using a temperature cycler equipped with a device that detects fluorescence intensity in a reaction system in which PCR products are specifically fluorescently labeled
  • the amount of product in the reaction can be measured in real time without the need for sampling.
  • the results can be monitored with a computer, and the results can be analyzed with a computer.
  • Methods for labeling PCR products include a method using a fluorescently labeled probe and a method using a reagent that specifically binds to double-stranded DNA.
  • the probe is accelerated by the 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity of Taq polymerase and becomes fluorescent.
  • the amount of fluorescence reflects the amount of PCR product. Since the PCR reaction the number of cycles when you reach the detection limit (C T) and the initial ⁇ amount is inversely related, initial ⁇ by measuring C T in real time measurement The amount is quantified. By measuring prepare a calibration curve C T using known amounts of ⁇ several stages, it is possible to calculate the absolute value of the initial ⁇ amount of an unknown sample. For example, M-ML V RTase, Ex Script RTase (Takara Bio) or Super Script II RT (GIB CO BRL) can be used as the reverse transcriptase used in RT_PCR .
  • nucleic acid hybridization When nucleic acid hybridization is performed, it may be labeled with a probe or nucleic acid in a sample, and isotope (for example, 32 P, 33 P, 35 S) or fluorescence (fluoresamine and derivatives thereof, rhodamine and derivatives thereof) , FI TC, C y 3 and C y 5) can be labeled and is not particularly limited.
  • isotope for example, 32 P, 33 P, 35 S
  • fluorescence fluoresamine and derivatives thereof, rhodamine and derivatives thereof
  • Hybridization is preferably performed under the above stringent conditions.
  • the Northern hybridization method is generally used for the detection and quantification of RNA sequences. RNA samples obtained from plants by known methods are separated by size analysis by agarose gel electrophoresis, and then RNA is transferred to nylon or nitrocellulose membrane to label the gene of the present invention with cDNA or its fragments. Hybridization is performed as a probe, and the gene of the present invention is detected and quantified.
  • cDNA encoding the gene of the present invention, its sense strand or antisense strand, or a fragment thereof is immobilized on a glass or filter array as a probe.
  • a reverse transcription reaction is performed on the RNA obtained by a known method, and Cy 3 -dUTP, Cy 5 -dUTP and the like are incorporated to obtain rabenoleic cDNA.
  • Hybridization between the immobilized probe on the array and the label DNA cDNA is performed to detect and quantify the gene of the present invention. This allows selection and screening of plants with a high content of darityllytin.
  • RNA extraction reagent RNAW IZ TM (Ambion) was used to prepare total RNA according to the attached protocol.
  • MRNA was prepared from the total RNA thus obtained, and cDNA was synthesized by the vector caving method (Kato, S. et al., DNA Res., 12, 53-62, 2005).
  • the c DNA fragment plasmid vector p GCAPzf3 (Tsugane, T. et al ., Plant Biotechnology., 22, 161-165, 2005) incorporated into, was constructed c DNA library.
  • RNA was prepared using the RNA extraction reagent Trizol (Invitrogen) and the energy ram RNasey (Quiagen) according to the attached protocol.
  • MRNA was prepared from the total RNA obtained, and the oligocap method (Murayama, K. et al., Gene, 138, 171-174, 1994, and Suzuki, Y. et al., Gene, 200, 149- 156) was used for cDNA synthesis.
  • the DNA fragment was incorporated into the plasmid vector pCMVFL3 to construct a cDNA library.
  • E. coli strains DH12S (Invitrogen) or DH10BT1 phage resistant (Invitrogen) were transformed with the same cDNA library obtained in Example 1, and the resulting single colonies of about 30 and 0.00 were obtained. 3 8 Picked up on 4 plates. The colony PCR was used to amplify the DNA for the sequencing reaction, and purification by ethanol precipitation was performed. Using a BigDye ver3.1 from Applied Biosystems, a sequencing reaction was carried out from the 5th and 5th ends of each cDNA fragment. After purification by ethanol precipitation, the polynucleotide sequence was analyzed using 3730x1 DNA Analyzer from Applied Biosystems. Example 4
  • Escherichia coli strain DH5a was transformed with the cDNA library obtained in Example 2, and the obtained single colonies of about 26,000 were picked up on 3 84 plates.
  • the DNA that was converted into the sequence reaction type was amplified with colony PCR, and purified by ethanol precipitation. Using this as a saddle, a sequencing reaction was performed from the 5 'end of each cDNA fragment using BigDye ver3.1 from Applied Biosystems. After purification by ethanol precipitation, the polynucleotide sequence was analyzed using 3730x1 DNA Analyzer from Applied Biosystems.
  • Example 6 About 30,00,0 EST data obtained from RIKEN (Example 3) and about 2,6,00,00 obtained from NE DO (New Energy and Industrial Technology Development Organization) EST data (Example 4) was integrated into one data set and clustered using the PHRAP program (http://www.phrap.org). As a result, 1 0, 3 7 2 unique containers were obtained.
  • Example 6
  • NC BI National Center for Biotechnology Information; database based on BLASTX search (Altschul) , SF et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997), and a container having high homology to known P450 monooxygenase registered in the database was selected. Plasmid DNA was prepared from multiple EST clones constituting the selected container and determined to retain the longest 5 'terminal region, and each cloned cDNA fragment (36 cells) was prepared. ) Was determined.
  • each P 45 50 molecular species was selected as Glychyrrhiza "/? Which organ was expressed was examined by RT-PCR method.
  • Total RNA was prepared from a total of four different plant tissues, a subterranean tissue with high accumulation of glycyrrhizin (hyperids and strons) and an aerial tissue (leaves and stems) in which no dalicyl lithin was detected.
  • glycyrrhizin hypererids and strons
  • aerial tissue leaves and stems
  • Sense primers and antisense primers that specifically anneal to each P 4 50 gene are designed, and 2 ⁇ 1 of each of the four first strand cDNAs is used as a cage, and TaKaRa Ex Taq TM DNA polymerase (Takara Shuzo) is used.
  • the PCR was performed from 25 to 30 cycles.
  • the obtained PCR fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis (Fig. 1), and amplification of the PCR fragment was observed only when the first strand derived from root and stront cDNA was used.
  • Molecular species were selected. Among these, the following examples are described for the P 45 50 molecular species (i) and (ii) (corresponding to the band of the arrow in the electrophoretic diagram of FIG. 1) in which the enzyme activity for oxidizing the triterpene was observed.
  • Example 7 Glychyrrhiza uralensis prepared in Example 7 (D-stront-derived first strand cDNA is in a saddle type, and the positions corresponding to the N-terminal and C-terminal of the polypeptides of P450 molecules (i) and (ii))
  • the oligo DNA was used as a primer (SEQ ID NO: 5 and 6), and the annealing temperature was 55 ° (de ?? 1 ⁇ (30 cycles, using Stratagene Pfu_Turbo DNA Polymerase).
  • the primer has 4 bases (cacc) added to the 5 'end, but is required for cloning into the pENTR TM / D_T0P0® entry — vector (Invitrogen).
  • the DNA fragment amplified by R is cloned into the pENTR / D-T0P0 entry vector.
  • the polynucleotide sequences of the 6 independent clones obtained were determined.
  • the two types of polynucleotide sequences thus obtained are SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and the polypeptide sequences deduced from each are SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 3 and the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 4 are 26, 1 63, 1 9 7, 294, 480, 59 1, 900, 945, 1 089, 1 3 73, 1 434th 1 1 The place is different.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 differ in the four amino acids at positions 9, 55, 66, and 458.
  • Plasmids (entry clones) having the polynucleotides shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 respectively prepared in Example 8 and the destination vector pDEST TM 8 (Invitrogen) were mixed, and base sequence-specific recombination
  • a construct for insect cell expression was prepared by transferring the DNA fragment shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 into the pDEST TM 8 vector by reaction (GATEWAY TM aiL xa iR reaction).
  • Escherichia coli strain DHlOBac (Invitrogen) was transformed with the obtained construct by the calcium chloride method. From the obtained colonies, Bacraid DNA (primary recombinant baculovirus) was prepared according to the attached protocol.
  • Insect cell culture solution 5 Oml obtained in Example 10 was centrifuged at 2,330 and 4 ° C. for 5 minutes to collect insect cells. Insect cells are washed three times with ice-cold phosphate buffer and then suspended in 5 ml of 5 OmM monopotassium phosphate buffer (pH 7.2, containing 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% Glycerol). It became cloudy. Cells were ultrasonically disrupted using BRANSON S0NIFER 250 (BRANSON), and then centrifuged at 2, 330 and 4 ° C for 20 minutes.
  • BRANSON S0NIFER 250 BRANSON
  • the triterpenoid used for the activity test using the microsomal fraction was synthesized by the method shown in Figs.
  • Oleanolic acid (manufactured by SIGMA) was reacted with trimethylsilyldiazomethane to protect the rubonic acid as a methyl ester and the hydroxyl group as a tert-butyldimethylsilyl group.
  • the methyl ester was reduced to the alcohol, and the mesyl chloride was reacted to form a mesyl ester, which was then led to the methyl by a reductive substitution reaction.
  • This methyl body was deprotected to obtain / 3_amylin.
  • the structure was confirmed by analyzing 1 H-NMR and 13 C-N MR spectra. 2) 1 1-Oxoso] 3-Amylin
  • Glycyrrhetinic acid (manufactured by SIGMA) was reacted with zinc and hydrochloric acid to reduce the 11-position carbonyl group to obtain 11-deoxoglycyrrhetinic acid.
  • the structure was confirmed by analyzing the 1 H- NMR and 1 3 C_NMR spectrum.
  • 30-Hydroxy_ Protects the hydroxyl group of 3-amylin as a tetrahydrobiranyl group, and acts on ruthenium chloride and tert-butyl hydroperoxide to convert 1-methylene carbon to a carbonyl group for deprotection 30 —Hydroxy— 1 1-oxo 1] 3-Amylin was obtained. The structure was confirmed by analyzing 1 H-NMR and 13 C-NMR spectra.
  • Example 1 Mikuguchisome fraction 50 // 1 obtained in 1 and 25 ⁇ 1 of 1M monopotassium phosphate buffer ( ⁇ ⁇ 7.2), 1 ⁇ 1 (final concentration 0.1 unit Zm 1) Refined Arabidopsis p450 reductase (Mizutani, M. and Ohta, D., Plant Physiol. 116, 357-367, 1998), 25 // 1 (final concentration 1 mM) NADPH, 5 a 1 (final concentration)
  • reaction substrate monoamylin or 30-hydroxyl] 3-amylin
  • Example 13 The reaction solution obtained in Example 13 was extracted with ethyl acetate, and after removing the solvent in the ethyl acetate section, N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide was added and heated at 80 ° C for 30 minutes. Then, it was derivatized into a trimethylsilyl ether and used as a sample for GC-MS analysis.
  • the conversion product was analyzed using Automass (JE0L) -6890N (Agilent technologies) for GC_MS and HP-5 column (J & W Scientific; 0.32 mm x 30 m; 0.25 mm film thickness) for the column. The identity of the converted product was determined by comparing the retention time of the GC and the MS spectrum using the triterpenoid prepared in Example 12 as a sample.
  • FIG. 4 shows the results using the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the dotted arrow in the total ion chromatogram is] 3-amylin, the double-lined arrow is 1 1-oxo-; Phosphorus, triplet arrow indicates 1 1 ct-hydroxyl- ⁇ -amylin.
  • Fig. 5 shows the results using the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the dotted arrow in the total ion chromatogram is 3 0—hydroxyl
  • the double arrow is 30 —hydroxyl 1 1 oxo 1/3 amylin
  • the triple arrow is 1 1 ⁇ , 3O-dihydroxy_] 3-amylin.
  • LjCPR LjCPR introduction plasmid
  • ACTAGTGGATCATCCCCACGCGCCCTGTAG (SEQ ID NO: 1 2) using KOD-Plus- (Toyobo) 94 ° C 2 minutes, then 94 ° C 20 seconds, 55 ° C 40 seconds, 68 ° C 1 minute 30 seconds PCR reaction consisting of 20 cycles was carried out. The mixture was further incubated at 68 ° C for 2 minutes. In-Fusion Dry-Down PCR Binding was performed using Cloning Kit (Clontech) to obtain Miyakogusa OSC 1 yeast expression vector pYES3- ADH-0SC1.
  • the yeast cell expression construct was prepared by transferring the DNA fragment shown in SEQ ID NO: 3 to pYES-DEST TM 52 by GATEWAY TM a L x ai R reaction).
  • the gene shown in SEQ ID NO: 3 cloned into pENTER-D-TOPO is incorporated into the yeast expression vector pYES-DEST52 (Invitrogen) using Gateway LR Clonase I IEnzyme Mix (Invitrogen), and the gene shown in SEQ ID NO: 3
  • the yeast expression vector of PDEST52-GuCYP88 was obtained.
  • Yeast strain BJ2168 (Nibonbon Gene) MATa pre 1-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3 ⁇ 52 gal2) was prepared using Frozen— EZ Yeast Transformat ion II (Zymo Research) pYES3-ADH-0SC1, pESC- LEU_LjCPR PDEST52_GuCYP88 and pYES2 (Invitrogen).
  • Yeast holding all three vectors is 10 O m 1 SC-Trp / Leu / Ura medium 28 ° C,
  • the cells were cultured at 1 3 5 rpm for 2 days.
  • the cultured yeast was collected by centrifuging at 300 g for 10 minutes, and galactose (2 O mg Zm 1), hemin chloride (13 ⁇ g /
  • Example 14 In the same manner as described in Example 14, the ethyl acetate group was dried and removed from the solvent, N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide was added, and the mixture was heated at 80 ° C for 30 minutes. It was derivatized to trimethylsilyl ether and used as a sample for GC-MS analysis. The identity of the converted product was determined by comparing the retention time of the GC and the MS spectrum using the triterpenoid prepared in Example 12 as a sample.
  • polypeptide encoded by the gene of the present invention is a triterpene oxidase that oxidizes the 11-position of jS-amylin and converts it into a hydroxyl group and a carbonyl group even in yeast.
  • Example 1 Yeast holding all three vectors pYES3_ADH-0SCl, pESC-LEU_LjCPR, and pDEST52-GuCYP88 prepared in 8 was added to 4 OO ml of SC-Trp / Leu / Ura medium (6 tubes, total 2.4 L). ) For 2 days at 28 ° C and 125 rpm. The cultured yeast was collected by centrifugation at 300 g for 10 minutes, and galactose (2 OngZm 1) and chlorinated hemin (l S ⁇ gZm l) were added.
  • the suspension was suspended in SC-Trp / Leu / Ura-Darcose medium (6 tubes, 2.4 L in total) and cultured at 28 ° C, 125 rpm for 2 days. Bacteria were collected by centrifugation and freeze-dried. 10 Om 1 Kuroguchi form was added to the lyophilized bacteria and mixed, and then the Kuroguchi form extract was recovered. This operation Repeated 3 times. The black mouth form extract was concentrated under reduced pressure. The extract was fractionated by silica gel chromatography. For silica gel, use Wako gel C-300 (Wako Pure Chemical Industries) with a size of 2.8 X 40 cm.
  • Example 1 Yeast carrying all three vectors PYES3-ADH-0SC1, pESC-LEU-LjCPR, and pDEST52-GuCYP88 prepared in 8 was added to 400 ml of S C_T rp / L eu / U ra medium (1 Incubated at 28 ° C and 1 2 5 rpm for 2 days. The cultured yeast was collected by centrifuging for 300 minutes for 10 minutes, and then 40 ml of SC_Trp containing galactose (20 mgm 1) and hemi-chloride (13 ⁇ 1) was added. Suspend in / Leu / Ura-glucose medium (1 2 bottles, total 4.8 L). C, cultured at 125 rpm for 2 days.
  • Bacteria were collected by centrifugation and freeze-dried. To the freeze-dried bacterium, 100 ml of ethyl acetate was added and mixed, and then the ethyl acetate extract was recovered. This operation was repeated three times. The ethyl acetate extract was concentrated under reduced pressure. The extract was fractionated by silica gel chromatography. Use silica gel Wako gel C-200 (Wako Pure Chemical Industries) at a size of 2.8 X 40 cm, flow hexane: ethyl acetate (1: 1), and elute the eluate by 7 ml each. Fractionated.
  • Example 22 Each plant transformation construct obtained in Example 22 was introduced into Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) strain. Known methods using agrobacterium holding each plant transformation construct.
  • transformed seeds of white nuna (Ecotype Co 1-0) were obtained. After sterilizing the surface of the obtained transformed seed with ethanol, 5 Omg / 1 kanamycin and
  • Glycyrrhizin is produced in the same way as Glycyrrhiza glabra and Glycyrrhiza uralensis, which is one of the licorice fit.
  • Glycyrrhiza glabra a homologous gene presumed to have a function equivalent to the genes represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 was isolated by RT-PCR.
  • cDNA was isolated from strons of Glycyrrhiza glabra distributed from the National Institute of Biomedical Innovation, Medicinal Plant Resource Research Center, and Hokkaido Research Department (Hokkaido Nayoro). Polynucleotide sequences were determined for the 6 independent clones obtained. The sequence thus obtained is SEQ ID NO: 14 and the polypeptide sequence deduced therefrom is SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 13 had 98.6% identity to the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the present invention it is possible to provide a protein that oxidizes the carbon at position 11 of a dammarane series triterpene, and a gene that encodes the protein.
  • the protein can be applied to glycyrrhizin synthesis, It becomes possible to increase the production amount of glycyrrhizin by introducing the gene and highly expressing it.
  • the present invention can be applied to elucidation of the biosynthetic pathway of 0-amylin to glycyrrhizin.
  • the amount of glycyrrhizin produced by licorice plants can be increased.
  • it can be applied to industrial production of glycyrrhizin.

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Abstract

本発明は、ダンマラン系列トリテルペンを酸化する活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、およびそれらの利用を提供する。本発明は、具体的には、カンゾウ属植物から得られる、ダンマラン系列トリテルペンを酸化する活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子およびその使用に関し、タンパク質は配列番号１、２または１３に示され、それをコードする遺伝子はそれぞれ配列番号３、４、１４に示される。また、該遺伝子を導入した形質転換体が作製され、トリテルペン酸化酵素を得ることができる。

Description

カンゾゥ属植物由来トリテルペン酸化酵素、 それをコードする遺伝子および その利用 技術分野
本発明は、カンゾゥ属植物由来のダンマラン系列トリテルペンを酸化する酵素、 それをコードする遺伝子およびその利用に関する。
明
背景技術 田
カンゾゥ属植物は、 マメ科の多年生草本植物である。 その地下部の根およびス
.トロン（stolon)は、 漢方原料として最も重要なものの一つであり、 世界的にも広 く薬用に用いられている。 カンゾゥ属植物のうち、 ダルキルリザ · ゥラレンシス
{ Glychyrrhiza uralensis) グノレキノレリザ · グ フブラ 、Glychyrrhiza glabra) ^ およびグルキルリザ · インフラータ （ Glychyrrhiza infla ta) の主活性成分は、 トリテルペンサポニンのグリチルリチンである。本成分について、生薬学的研究、 薬理学的研究、 育種学的研究などさまざまな側面から数多くの研究が行われてい る。 ところが、 本成分の生合成経路については、 トリテルペンである i3—ァミリ ン以降どのように生合成されるか全く不明であった。 良質の生薬を安定かつ持続 的に提供するためには、 活性成分グリチルリチンの生合成遺伝子そのものあるい は遺伝子発現をマーカーとして、 産生に最適な条件の確立や高生産株の選抜など を行う必要がある。 ところが生合成経路が不明であるために、 このようなァプロ ーチができなかった。 また、 生合成遺伝子の導入による高グリチルリチン産生植 物の分子育種もできなかった。
β—ァミリンからソャサポゲノール Βを生合成する経路については研究が進め られており、 ]3—アミ リンめ 2 4位を水酸化する酵素をコードする遺伝子 CYP93E (図 1 ) が国際公開第 WO Z 2 0 0 5 / 0 8 0 5 7 2号および Shibuya et al. Ident i icat ion of beta-amyrin ana sophoradiol24- hydroxylase by expressed sequence tag raining and functional express ion assay. FEBS J. 2006 Mar；273 (5) : 948 - 59.に開示されている。 発明の開示
本発明の課題は、 ダンマラン系列トリテルペンを酸化する活性を有するタンパ ク質、 およびそれをコードする遺伝子を同定し、 当該タンパク質、 遺伝子および それらの利用を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、 ；3—アミリンなどの ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する触媒機能を有する新規チ トクローム P 4 5 0遺伝子 （以下 P 4 5 0遺伝子という） を単離することに成功 し、 本発明を完成した。
本発明は、 要約すると以下の通りである。
〔 1〕 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を有するタン パク質。
〔2〕 前記ダンマラン系列トリテルペンが、 i3—アミリンまたは 3 0—ヒ ドロキ シ一 i3—アミリンである、 〔1〕 に記載のタンパク質。
〔3〕 カンゾゥ属植物に由来する、 〔1〕 または 〔2〕 に記載のタンパク質。
〔4〕前記カンゾゥ属植物が、 ダルキルリザ ·ゥラレンシスまたはダルキルリザ · グラブラである、 〔3〕 に記載のタンパク質。
〔5〕以下の（a )〜（c ) に示すいずれかのアミノ酸配列を有する、 〔1〕 〜〔4〕 のいずれかに記載のタンパク質。
( a ) 配列番号 1に示すァミノ酸配列
( b )配列番号 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列
( c ) 配列番号 1に示すアミノ酸配列に対して 8 0 %以上の同一性を有するアミ ノ酸配列
〔6〕配列番号 2または配列番号 1 3に示すアミノ酸配列を有する、 〔1〕〜〔5〕 のいずれかに記載のタンパク質。
〔7〕 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を有するタン パク質をコードする遺伝子。 〔8〕 前記ダンマラン系列トリテルペンが、 ]3—アミリンまたは 30—ヒ ドロキ シ一 i3—アミリ ンである、 〔7〕 に記載の遺伝子。
〔9〕 カンゾゥ属植物に由来する、 〔7〕 または 〔8〕 に記載の遺伝子。
〔1 0〕 前記カンゾゥ属植物が、 ダルキルリザ · ゥラレンシスまたはグルキルリ ザ · グラブラである、 〔9〕 に記載の遺伝子。
〔1 1〕 以下の （d) 〜 （g) に示すいずれかの塩基配列を有する、 〔7〕 〜 〔1 0〕 のいずれかに記載の遺伝子。
(d) 配列番号 3に示す塩基配列
(e) 配列番号 3に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 瞿換も しくは付加された塩基配列
( f ) 配列番号 3に示す塩基配列に対して 80%以上の同一性を有する塩基配列
(g) 配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェント な条件でハイブリダイズする塩基配列
〔1 2〕配列番号 4または配列番号 14に示す塩基配列を有する、 〔7〕〜〔1 1〕 のいずれかに記載の遺伝子。
〔1 3〕 〔7〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
〔1 4〕 〔7〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の遺伝子または 〔1 3〕 に記載の組換 えベクターを有する形質転換体。
〔1 5〕 カンゾゥ属植物である、 〔1 4〕 に記載の形質転換体。
〔1 6〕 カンゾゥ属植物が、 ダルキルリザ . ゥラレンシスまたはグルキルリザ · グラブラである、 〔1 5〕 に記載の形質転換体。
[1 7〕 〔7〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の遺伝子の発現が増強された、 〔14〕 〜 〔1 6〕 のいずれかに記載の形質転換体。
〔1 8〕 〔7〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の遺伝子の発現が抑制された、 〔14〕 〜 〔1 6〕 のいずれかに記載の形質転換体。
[1 9] (14) ~ [1 7〕のいずれかに記載の形質転換体を培養または育成させ、 培養物または育成物から 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載のタンパク質を採取す ることを含む、 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
〔20〕 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかに記載のタンパク質をダンマラン系列トリテル ペンに作用させる、 ダンマラン系列トリテルペンの酸化方法。
〔2 1〕 植物における 〔7〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載の遺伝子の有無または 発現を判定し、 植物を選抜する方法であって、 前記植物から調製された核酸含有 サンプルについて、 前記遺伝子もしくはその断片を用いて P C R法、 R T— P C R法または核酸ハイブリダィゼーションを行い、 前記遺伝子を検出または定量す ることを含む、 前記植物選抜法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007- 204769号の明細書 およびノまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 グリチルリチン、 ソャサポニン Iの生合成経路を示し、 図 1 Bは、 R T— P C R法による遺伝子発現解析結果を示す。
図 2は、 トリテルぺノィ ドの合成方法を示す。
図 3は、 トリテルぺノィ ドの合成方法を示す。
図 4は、 本発明のタンパク質による ]3—ァミリンの変換物の検出結果を示す。 図 5は、 本発明のタンパク質による 3 0—ヒ ドロキシ一 ;3—アミリンの変換物 の検出結果を示す。
図 6は、 NM Rによる 1 1—ォキソー j3—ァミ リンの測定結果を示す。
図 7は、 N M Rによる 1 1 α—ヒ ドロキシー]3—ァミリンの測定結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に述べる。
( 1 ) 本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化す る活性を有するトリテルペン酸化酵素である。ダンマラン系列トリテルペンとは、 2 , 3—ォキシドスクアレンが chair (いす型） -chair- chair- boat (舟型） のコ ンフオメーシヨンをとつて閉環したダンマレンカチオン （dammarene cat ion) か ら生成する化合物群であり、 四環性化合物、 五環性化合物などを含む。 具体的に はダンマラン型、 リモノイ ド型、 クアシノイ ド型、 ルパン型、 ォレアナン型、 ゥ ルサン型トリテルペンが挙げられる。 本発明においてダンマラン系列トリテルぺ ンは特に限定されないが、 好ましくはォレアナン型トリテルペンである。 ォレア ナン型トリテルペンとして ]3—アミ リン、 ォレアノール酸、 へデラゲニン、 1 1 - デォキソグリチルレチン酸、 カメリアゲニン、 ソャサポゲノール、 サイコゲニン が挙げられ、 特に限定されないが、 好ましくは ]3—アミリン、 および 3 0 —ヒ ド 口キシー β —ア ミ リンである。
本発明のタンパク質として、
( a ) 配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
( b )配列番号 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質、 または
( c ) 配列番号 1に示すアミノ酸配列に対して 8 0 %以上の同一性を有するアミ ノ酸配列を有し、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を 有するタンパク質
が挙げられる。
配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、 カンゾゥ属植物
Glycyrrhiza uralensis) のスト口ンから得られた遺伝子 （配列番号 3 ) により コードされるタンパク質である。
本発明において 「配列番号 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列」 とは、 例えば、 配列番号 1に示すアミノ酸配列の 1 〜 1 0個、 好ましくは 1 〜 5個のアミノ酸が欠失して もよく、 配列番号 1に示すアミノ酸配列に 1 〜 1 0個、 好ましくは 1 〜 5個のァ ミノ酸が付加してもよく、あるいは配列番号 1に示すアミノ酸配列の 1 〜 1 0個、 好ましくは 1 〜 5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいことを意味する。 このようなァミノ酸配列の例として、 配列番号 2、 配列番号 1 3に示すァミノ 酸配列が挙げられる。 配列番号 2、 配列番号 1 3に示すアミノ酸配列は、 配列番 号 1に示すアミノ酸配列と比較して、それぞれアミノ酸が 4箇所、 7箇所異なる。 また配列番号 2、 配列番号 1 3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、 それ ぞれ配列番号 4、 配列番号 1 4に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされ る。
また、 本発明において 「配列番号 1に示すアミノ酸配列に対して 80%以上の 同一性を有するアミノ酸配列」 の 「同一性」 は、 80%以上、 好ましくは 85% 以上、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上である。
本発明のタンパク質の由来は特に限定されなレ、が、カンゾゥ属植物が好ましく、 Glychyrrhiza uralensisまたは Glychyrrhiza glabra ¾、より好ましい。
本発明におけるカンゾゥ属植物とは、 マメ科カンゾゥ属に分類される植物であ つて、 Glychyrrhiza glaora^ Glycnyrrhiza inflataヽ Glychyrrhiza uralensisヽ Glychyrrhiza aspera^ Glychyrrhiza eurycarpa^ Glychyrrhiza pallidiflora、 Glychyrrhiza yunnanensis^ Glychyrrhiza lepidota、 Glychyrrhiza echina ta^ Glychyrrhiza aca?iA。caT?a等カ例示できる。 このうち、 Glychyrrhiza glabra^ Glychyrrhiza infla taおよび Glychyrrhiza uralensis力 らグリチノレリチンカ恢 出されたとの報告がある。
本発明のタンパク質は、 例えばカンゾゥ属植物のストロンあるいは根から公知 の方法を用いて得ることができるが、 配列番号 1、 2または 1 3に示すアミノ酸 配列を有するタンパク質を公知の化学合成法により合成してもよいし、 後述の当 該タンパク質をコードする遺伝子を取得して、 公知の遺伝子組換え技術により作 製してもよい。
また、 配列番号 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列、 または配列番号 1に示すアミノ酸配 列に対して 80%以上の同一性を有するアミノ酸配列は、 例えば後述の遺伝子を 当該技術分野で公知の手法で改変することによって得ることができる。 遺伝子に 変異を導入するには、例えば Ku n k e 1法又は G a p p e d d u p l e x法な どの公知手法またはこれに準ずる方法により行うことができ、 例えば部位特異的 突然変異誘発法を利用した変異導入用キッ ト （例えば Mu t a n t -K (宝酒造 社製） や Mu t a n t— G (宝酒造社製））、 あるいは LAP CR in vitro Mutagenesisシリーズキッ ト （宝酒造社製） などを用いて変異を導入できる。 ま た、 変異原となる薬剤と接触作用させる方法、 紫外線を照射する方法なども用い ることができる。 本発明のタンパク質は、 ダンマラン系列トリテルペンの酸化方法に用いること ができる。 例えば、 本発明のタンパク質を基質である ]3—アミリンに作用させる と、 一アミリンの 1 1位の炭素が酸化される。 酸化によって得られる物質とし て 1 1 ひ-ヒ ドロキシ - ]3 -アミリン、 1 1—ォキソ アミリンなどが例示できる。 また、 本発明のタンパク質を基質である 3 0—ヒ ドロキシー ]3—ァミ リンに作用 させると、 3 0—ヒ ドロキシ一 /3 _アミリンの 1 1位の炭素が酸化される。 酸化 によって得られる物質として 1 1 α , 3 0—ジヒ ドロキシ- ]3 -アミリン、 3 0 -ヒ ド 口キシ- 1 1 -ォキソ - ]3 -アミリンなどが例示できる。
( 2 ) 本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活 性を有するタンパク質をコードする。
本発明者らは、 カンゾゥ属植物のス トロンから m R N Aを調製し、 c D N Aラ イブラリーを作製して E S T解析を行った。 ]3—アミリンから数段階の酸化、 配 糖化などを経てグリチルリチン （ダリチルリチン酸ともいう） を生合成する経路 において P 4 5 0遺伝子が関係していると考え、 公知の P 4 5 0遺伝子の塩基配 列で検索を行い、 候補遺伝子を絞り込んだ。 候補遺伝子について遺伝子発現解析 を行い、 本発明の遺伝子を同定した （後記実施例参照）。
本発明の遺伝子として、
( d ) 配列番号 3に示す塩基配列、
( e ) 配列番号 3に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換も しくは付加された塩基配列であって、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭 素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
( f ) 配列番号 3に示す塩基配列に対して 8 0 %以上の同一性を有する塩基配列 であって、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を有する タンパク質をコードする塩基配列、 または
( g ) 配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してス トリンジェント な条件でハイブリダイズする塩基配列であって、 ダンマラン系列トリテルペンの
1 1位の炭素を酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列 が挙げられる。 本発明において 「配列番号 3に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が 欠失、 置換もしくは付加された塩基配列」 とは、 例えば、 配列番号 3に示す塩基 配列の 1〜1 0個、 好ましくは 1〜5個の塩基が欠失してもよく、 配列番号 3に 示す塩基配列に 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜5個の塩基が付加してもよく、 ある いは配列番号 3に示す塩基配列の 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜 5個の塩基が他の 塩基に置換してもよいことを意味する。
本発明において 「配列番号 3に示す塩基配列に対して 8 0 %以上の同一性を有 する塩基配列」 の 「同一性」 は、 8 0 %以上、 好ましくは 8 5 %以上、 より好ま しくは 9 0 %、 さらに好ましくは 9 5 %以上である。
このような遺伝子の例として、 例えば配列番号 4に示す塩基配列を有する遺伝 子が挙げられる。 配列番号 4に示す塩基配列は、 配列番号 3に示す塩基配列と比 較して塩基が 1 1箇所異なる。 さらにまた、 このような遺伝子の例として、 Glychyrrhiza ^abraに由来する配列番号 1 4に示す塩基配列を有する遺伝子を 挙げることができる。 配列番号 1 4に示す塩基配列は、 配列番号 3に示す塩基配 列と比較して塩基が 1 4箇所異なる。
本発明において 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイプリ ッドが形成され、 非特異的なハイプリッドが実質的に形成されない条件をいう。 例えば、 同一性が高い核酸、 すなわち配列番号 3で示す塩基配列と 8 0 %以上、 好ましくは 8 5 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以 上の同一性を有する塩基性配列からなる D N Aの相補鎖がハイブリダィズし、 そ れょり同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダィズしない条件が挙げられる。 よ り具体的には、 ナトリウム塩濃度が 1 5〜 7 5 0 mM、 好ましくは 5 0〜7 5 0 mM、 より好ましくは 3 0 0〜7 5 0 mM、 温度が 2 5〜7 0 °C、 好ましくは 5
0〜 7 0 °C、 より好ましくは 5 5〜 6 5 °C、 ホルムァミ ド濃度が 0〜 5 0 %、 好 ましくは 2 0〜 5 0 %、 より好ましくは 3 5〜4 5 %での条件をいう。 さらに、 ストリンジヱントな条件では、 ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条 件が、 通常はナトリゥム塩濃度が 1 5〜6 0 0 mM、 好ましくは 5 0〜 6 0 0 m
M、 より好ましくは 3 0 0〜 6 0 0 mM、 温度が 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは 5 5
〜7 0 °C、 より好ましくは 6 0〜6 5 °Cである。 本発明の遺伝子は、 カンゾゥ属植物から公知の方法を用いて単離できる。 配列 番号 3、 配列番号 4、 または配列番号 14に示す塩基配列に基づいて設計したプ ライマーを用いて、 c DNAライブラリ一またはゲノム DN Aライブラリ一等由 来の核酸を鍀型とした PCR増幅を行うことにより、 核酸断片として得ることが できる。 また、 本発明の遺伝子は、 上記ライブラリ一等由来の核酸を鎵型とし、 当該遺伝子の一部である断片をプローブとしてハイブリダィゼ一ションを行うこ とにより、 核酸断片として得ることができる。 あるいは本発明の遺伝子は、 化学 合成法などの公知の核酸配列合成法によつて合成してもよい。
さらに、 配列番号 3に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置 換もしくは付加された塩基配列、 または配列番号 3に示す塩基配列に対して 8 0%以上の同一性を有する塩基配列は、 上述の方法で変異を導入するなどして作 製することができる。
(3) 本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターは、 上記遺伝子を適当なベクターに導入することによ り構築することができる。 ベクターの種類は特に限定されず、 p B I系、 p PZ
P系、 p SMA系、 pUC系、 p BR系、 p B l u e s c r i p t、 p KS l、 p T r i EXTM系 （宝酒造） などのベクターを用いることができる。 また、 カリ フラワーモザィクウィルス （C aMV)、 ィンゲンマメモザィクウィルス （BGM V)、 タバコモザイクウィルス （TMV) 等のウィルスベクターも用いることがで きる。 また、 例えば p B I系などのバイナリーベクターを用いてもよい。
ベクターに目的遺伝子を揷入するには、 精製された DN Aを適当な制限酵素で 切断し、 適当なベクター DNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイ ト に挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また目的遺伝子のほかに、 例えばプロモーター、 ェンハンサー、 ターミネータ 一、 選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。 さらに ]3—アミ リン合成 酵素遺伝子を含めてもよい。
植物細胞で作動可能なプロモーターとしては、 力リフラワーモザィクウィルス
(C a MV) 3 5 Sプロモーター、 ノパリ ン合成酵素遺伝子のプロモーター （P n o s )、 トウモロコシ由来ュビキチンプロモーター、イネ由来のァクチンプロモ 一ター、 タバコ由来 PRタンパク質プロモーターなどが挙げられる。 また、 細菌 細胞で作動可能なプロモーターとしては、 バチルス · ステア口テルモフィルス · マルトジエニック ·アミラーゼ遺伝子、 バチルス · リケニホルミス αアミラーゼ 遺伝子、 バチルス 'アミロリケファチェンス · BANアミラーゼ遺伝子、 バチル ス ·サブチリス · アル力リプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルス ·プミルス · キ シロシダーゼ遺伝子のプロモーター、 またはファージ ·ラムダの PRもしくは PL プロモーター、 大腸菌の l a c、 t r pもしくは t a cプロモーターなどが挙げ られる。 酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、 酵母解糖系遺伝子由 来のプロモーター、 ァノレコーノレデヒ ドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、 TP I 1 プロモーター、 ADH 2— 4 cプロモーターなどが挙げられる。 真菌で作動可能 なプロモーターとしては、 ADH 3プロモーター、 t p i Aプロモーターなどが 挙げられる。 動物細胞で作動可能なプロモーターとしては、 SV40アーリープ 口モーター、 S V 40レートプロモーター、 CMVプロモータ一など、 昆虫細胞 で作動可能なプロモーターとしては、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモ 一ター、 オートグラファ 'カリホル二力 ·ポリへドロシス塩基性タンパクプロモ 一ター、 バキュロウィルス即時型初期遺伝子 1プロモーター、 バキュロウィルス 3 9 K遅延型初期遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
ェンハンサ一としては、 C a MV 35 Sプロモーター内の上流側の配列を含む ェンハンサー領域、 SV40ェンハンサー、 CMVェンハンサ一などが挙げられ る。
ターミネータ一としては、 ノパリン合成酵素 （NO S) 遺伝子のターミネータ —、 ォク トピン合成酵素 （OC S) 遺伝子のターミネータ一、 C aMV 35 Sタ ーミネーター、 大腸菌リポポリプロテイン 1 p pの 3 ' ターミネータ一、 t r p オペロンターミネータ一、 a my Bターミネータ一、 ADH 1遺伝子のターミネ 一ターなどが挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、 アンピシリ ン耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝 子、 スぺクチノマイシン耐性遺伝子、 クロラムフエ二コール耐性遺伝子、 ネオマ イシン耐性遺伝子など）、 蛍光または発光レポーター遺伝子 （ルシフェラ一ゼ、 β 一ガラク トシダーゼ、 一ダルクロニタ一ゼ （G U S )、 グリーンフノレオレツセン スプロテイン （G F P ) など）、 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ I I ( N P T I 1 )、 ジヒ ドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
( 4 ) 本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、 上記遺伝子または組換えベクターを適当な宿主に導入 することによって作製することができる。 - 宿主は、 導入された遺伝子が発現可能であれば限定されず、 大腸菌や枯草菌な どの細菌、 サッカロマイセス ·セレビシェ、 サッカロマイセス ·ボンべ、 ピヒア ' パス トリスなどの酵母、 ァスペルギルス、 ニューロスポラ、 フザリ ウム、 トリコ デルマなどの真菌、 または単子葉または双子葉植物、 例えばマメ科、 アブラナ科 などに属する植物、 植物細胞、 あるいは動物細胞、 例えば s f 9、 s f 2 1など の昆虫細胞でもよい。
遺伝子または組換えベクターの導入は、 公知の方法、 例えばァグロバクテリウ ム法、 P E G—リ ン酸カ シゥム法、エレク ト口ポレーション法、 リポソーム法、 パーティクルガン法、 マイクロインジェクション法等が挙げられる。 導入された 遺伝子は、 宿主のゲノム D N A中に組み込まれてもよいし、 外来ベクターに含有 されたままで存在していてもよい。
上述の方法で本発明の遺伝子または組換えベクターを宿主に導入し、 遺伝子が 宿主に組み込まれたか否かを確認してもよい。 この確認は、 P C R法、 サザンハ イブリダィゼ一シヨン法、 ノザンハイブリダィゼーシヨン法、 in situハイプリ ダイゼーションなどにより行うことができる。
また、 本発明の遺伝子または組換えベクターを発現可能に導入して、 本発明の 遺伝子の発現を増強した形質転換体を提供することができる。 従って本発明によ れば、 本発明の遺伝子の発現が増強されることによってグリチルリチンの産生量 が増加した形質転換体も提供し得る。
形質転換体が植物の場合、 マメ科植物、 特にカンゾゥ属植物 Glycyrrhiza uralensis^ ulycyrrhiza glaora^ Glycyrrniza in f lata カ^好ましレヽ。 本 発明において 「植物」 は、 植物体、 植物器官、 植物組織、 植物細胞、 それらの培 養物、 種子を含み、 「形質転換植物」 は、 遺伝子操作により作製された形質転換植 物およびその後代を含む。 形質転換の対象は、 植物体、 植物組織 (例えば表皮、 師 部、 柔組織、 木部、 維管束等、 植物器官 (例えば葉、 花弁、 茎、 根、 種子等）を含 む）または植物細胞でもよく、 特に限定されない。
形質転換の結果得られる腫瘍組織、 シュート、 毛状根などは、 そのまま細胞培 養、 組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、 また従来知られている植 物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイ トカイニン、 ジベレリン、 アブシジン酸、 エチレン、 ブラシノライ ド等） の投与などにより植 物体に再生させることができる。 植物体の再生は、 一般的には、 適当な種類のォ ーキシンとサイ トカイニンを混ぜた培地の上で根を分化させてから、 サイ トカイ ニンを多く含む培地に移植させシユートを分化させた後にホルモンを含まない土 壌に移植することによって行う。
さらに、本発明の遺伝子の発現を抑制した形質転換体を提供することができる。 そのような形質転換体は、 例えばグリチルリチン生合成経路の解明の研究などに 用いることができる。 本発明の遺伝子の発現の抑制には、 該遺伝子の転写の抑制 およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれ、 遺伝子の発現の完全な停止のみなら ず発現の減少も含まれる。 遺伝子が人為的または天然に変異、 破壊されたり、 あ るいは各種遺伝子工学的手法、 例えば R N A干渉法、 アンチセンス法、 リボザィ ム法、 共抑制法、 転写因子を制御する方法などを用いることにより、 遺伝子の発 現を不能にし、 または抑制させることができる。
( 5 ) 本発明のタンパク質の製造方法
本発明のタンパク質は、 宿主に応じて、 導入された遺伝子の発現を可能にする 条件下で宿主を適切な培地中で培養、 あるいは育成することによって、 産生する ことができる。
宿主を培養することにより本発明のタンパク質を産生する場合、 培地は、 例え ば L B培地、 M 9培地、 Y P D培地、 Y P G培地、 Y P M培地、 Y P D M培地、
S MM培地などが挙げられ、 炭素源 （例えばグルコース、 グリセリン、 マンニト ール、 フルク トース、 ラタ ト一スなど）、 窒素源 （例えば硫酸アンモニゥム、 塩化 アンモニゥムなどの無機窒素、 カゼイン分解物、 酵母抽出物、 ポリペプトン、 バ ク ト トリプトン、 ビーフ抽出物などの有機窒素源）、 無機塩 （例えばニリン酸ナト リウム、 二リン酸カリウム、 塩化マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化カルシ ゥムなど）、 ビタミン （ビタミン B 1など）、 薬剤 （アンピシリン、 テトラサイク リン、 カナマイシンなどの抗生物質） などを適宜含有する。 さらに、 本発明のタ ンパク質の基質となるダンマラン系列トリテルペン、 好ましくはォレアナン型ト リテルペン、 さらに好ましくは j3—ァミリンを培地に添加してもよい。
培養条件は、 遺伝子の発現に適切であれば特に限定されないが、 通常 1 0〜4 5 °Cで、 必要に応じて通気、 攪拌しながら、 数時間〜数百時間、 培養する。
培養物 （培養上清または培養された形質転換体を含む） から本発明のタンパク 質を採取するには、 培養物に蓄積されたタンパク質を公知の方法で抽出し、 必要 に応じて精製すればよい。 例えば溶媒抽出法、 塩析法、 溶媒沈殿法、 透析法、 限 外濾過法、 ゲル電気泳動法、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマト グラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなど を単独で、あるいは適宜組み合わせて、本発明のタンパク質を得ることができる。 なお、 本発明のタンパク質の基質となる上記 J3—アミリンなどのダンマラン系 列トリテルペンを培地に添加し、 形質転換体を培養すれば、 ダンマラン系列トリ テルペンの 1 1位の炭素が酸化された誘導体を得ることが可能である。
形質転換植物などを育成して本発明のタンパク質を産生する場合、 再生した植 物体などから、 本発明のタンパク質を上記公知の方法で抽出し、 必要に応じて精 製すればよい。 また、 カンゾゥ属植物の場合、 本発明のタンパク質はストロンや 根に多く含まれ、 上記誘導体、 あるいはグリチルリチン生合成経路を経由して産 生されたグリチルリチンを、 ストロンや根から採取することが可能である。
( 6 ) 本発明の遺伝子を用いた植物選抜法
植物における本発明の遺伝子の有無または発現を判定し、 植物を選抜する方法 は、 前記植物から調製された核酸含有サンプルについて、 本発明の遺伝子もしく はその断片を用いて P C 法、 R T— P C R法または核酸ハイブリダイゼーショ ンを行い、 本発明の遺伝子を検出または定量することを含む。
植物の核酸含有サンプルは、 公知の手法、 例えばフ-ノール抽出法、 フエノー ル . クロロフオルム抽出法、 C T A B法などを用いて調製することができる。 本発明の遺伝子の有無または発現は、 P C R (ポリメラーゼ連鎖反応） 法、 R T-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応） 法、 または核酸ハイブリダィゼーシ ョン法を用いて検出または定量することができる。 核酸ハイブリダィゼーション 法は、 例えば DNA— DNAハイブリダィゼーシヨン、 DNA— RNAハイブリ ダイゼーション又は RNA— RNAハイブリダイゼーションが挙げられ、 例えば ノザンハイブリダイゼーション （分子生物学実験プロ トコル I ( 1 997年）， 西 野 ·佐野共訳， 丸善株式会社参照）、 DN Aマイクロアレイ法 （DN Aマイクロア レイと最新 PCR法 （2000年） 村松、 那波監修、 秀潤社参照） などの手法を 利用することができる。
P CR法、 RT— P CR法または核酸ハイブリダィゼーションで用いるプライ マーまたはプローブは、 上記 （d) 〜 (g) に示すいずれかの塩基配列を有する 遺伝子またはその断片を用いて設計すればよい。
本発明において 「断片」 とは、 上記塩基配列において少なく とも 1 0塩基、 1 5塩基、 20塩基、 25塩基、 30塩基、 50塩基、 1 00塩基、 もしくは 1 5 0塩基の連続する塩基配列からなる断片を指す。
本発明で用いるプライマーまたはプローブのサイズは特に限定されないが、 プ ライマーの場合、 通常、 約 1 5〜約 50塩基長、 好ましくは約 1 7〜約 30塩基 長である。 プローブの場合、 ノザンハイプリダイゼーシヨンでは、 少なくとも約 1 0塩基長以上から全長、 好ましくは約 1 5塩基長以上から全長、 より好ましく は約 30塩基長以上から全長、 さらに好ましくは約 50塩基長以上から全長であ り、 DN Aマイクロアレイでは、 約 1 0〜約 50塩基長、 好ましくは約 1 5〜約 30塩基長、 より好ましくは約 20〜約 25塩基長のプローブが使用されるが、 これらに限定されない。 一般に、 プローブが長いほどハイブリダィゼーシヨン効 率がよくなり、 感度は上がる。 逆に、 プローブが短いほど感度は下がるが、 特異 性が上がる。 固相上のプローブは、 通常 0. l w g〜0. 5 gの溶液を用いて スポットする。 プライマー、 プローブの例は、 特に限定されないが、 例えば配列 番号 5、 配列番号 6が挙げられる。
PCR条件は、 例えば DNAの変性を 94〜95°Cで 5秒〜 5分間、 プライマ
—のァニーリングを 50〜70°Cで 1 0秒〜 1分間、 伸長反応を 68〜72でで
30秒〜 3分間行い、 これを 1サイクルとして 1 5〜40サイクルほど行い、 最 後に 68〜7 2°Cで 30秒〜 1 0分間の伸長反応を行うことができる。
P CR産物は、例えばァガロース電気泳動、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 ドットハイブリダィゼーションなどを用いて検出できる。
本発明の遺伝子の発現量を PC R法で定量する方法として、 内部標準物質を用 いた RT— P CR法が挙げられる （P CR法最前線（ 1 996年） 関谷、藤永編、 共立出版参照）。使用する内部標準としてハウスキーピング遺伝子がよく用いられ る。 この方法では標的 mRNA量が内部標準試料に対して多いか少ないかといつ た相対的な結果が得られる。 1つのサンプルについての P CR反応中に、 数サイ クルごとに反応液をサンプリングして、 PCR産物の量を定量し、 グラフにプロ ッ トしていく。 そうして得られたグラフの指数増加期のボイントに対して回帰分 析を行い、 y切片を求めることにより、 初期铸型量を算出することができる （バ ィォ実験イラストレィテイッ ト 3 「本当に増える PC R」 （1 998年） 中山広樹 著、 秀潤社)。
また、 発明の遺伝子の発現量をリアルタイム定量 P CR法で定量することがで きる。 PCR生成物が特異的に蛍光標識される反応系で、 蛍光強度を検出する装 置の備わった温度サイクラ一装置により P CR反応を行うと、 反応中の生成物の 量をサンプリングの必要なく リアルタイムでモニタ一でき、 その結果をコンビュ ータで回帰分析することができる。 PCR生成物を標識する方法としては、 蛍光 標識したプローブを用いる方法と、 2本鎖 DN Aに特異的に結合する試薬を用い る方法とがある。 プローブは、 PCR反応が行われると T a qポリメラーゼのも つ 5 '→3 'ェキソヌクレアーゼ活性により分角早され、蛍光を発するようになる。 その蛍光量は、 P CR生成物の量を反映する。 PCR反応物が検出限界に到達す るときのサイクル数 （CT) と初期铸型量とは逆相関の関係にあることから、 リ アルタイム測定法では CTを測定することによって初期铸型量を定量している。 数段階の既知量の铸型を用いて CTを測定し検量線を作製すれば、 未知試料の初 期铸型量の絶対値を算出することができる。 RT_P CRで使用する逆転写酵素 は、 例えば M— ML V RT a s e , E x S c r i p t RT a s e (タカラバ ィォ社）、 S u p e r S c r i p t I I RT (G I B CO BRL社） など を使用することができる。 核酸ハイブリダィゼーシヨンを行う場合は、 プローブ、 あるいはサンプル中の 核酸にラベリングしてもよく、 アイソトープ （例えば32 P、 33P、 35 S) 又は 蛍光 （フルォレサミン及ぴその誘導体、 ローダミン及びその誘導体、 F I TC、 C y 3、 C y 5) のいずれでもラベリングでき、 特に限定されない。
またハイブリダィゼーションは、 上記ストリンジェントな条件で行うことが好 ましい。
ノザンハイブリダィゼーシヨン法は、 一般に RN A配列の検出、 定量のために 使用される。 植物から公知の手法で得た RN Aサンプルを、 ァガロースゲル電気 泳動にかけてサイズ分離し、 その後、 ナイロンもしくはニトロセルロースメンブ レンに RN Aを転写し、 本発明の遺伝子のラベル化 c DN A又はその断片をプロ ーブとしてハイブリダィゼーシヨンを行い、 本発明の遺伝子を検出、 定量する。
DNAマイクロアレイ法は、 ガラスやフィルターなどのアレイ上に本発明の遺 伝子をコードする c DN A又はそのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、 あるいは それらの断片をプローブとして固定化する。 公知の手法で得た RNAについて逆 転写反応を行い、 Cy 3— dUTP、 C y 5— dUTPなどを取り込ませてラベ ノレィ匕 c DNAを得る。 アレイ上の固定化プローブとラベルイ匕 c DN Aとのハイブ リダィゼーシヨンを行い、 本発明の遺伝子を検出、 定量する。 これにより、 ダリ チルリチン高含量の植物を選抜、 スクリーニングできる。
なお、 上記分子生物学的手法にかかる実験方法等は、 Sambrook, J. et. al. , (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed.， Cold Spring Haroor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照することカ できる。 以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 これらの実施例は本発明を 限定するものではない。 実施例 1
カンゾゥ属植物からの mRNA調製と c DNAライブラリー作製 （1)
独立行政法人医薬基盤研究所の薬用植物資源研究センター北海道研究部 （北海 道名寄巿） において圃場栽培されていた 7年生 Glychyrrhiza uralensisのスト口 ン （地下茎） を 6月に採取した。 RNA抽出試薬、 RNAW I ZTM (Ambion社） を用いて添付のプロ トコールに従いトータル RNAを調製した。 得られたトータ ル RN Aから mRNAを調製し、 ベクターキヤッビング法 （Kato， S. et al. , DNA Res. , 12, 53-62, 2005)により c D N A合成を行った。 c DNA断片をプラスミ ドベクター pGCAPzf3 (Tsugane, T. et al. , Plant Biotechnology. , 22， 161—165， 2005) に組み込み、 c DNAライブラリーを構築した。 実施例 2
カンゾゥ属植物からの mRNA調製と c DNAライブラリ一作製 （2)
独立行政法人医薬基盤研究所の薬用植物資源研究センター筑波研究部 （茨城県 つくば巿） において圃場栽培されていた定植後 4年以上経過したと考えられる Glychyrrhiza uralensisのス トロン （地下茎） を 1 0月に採取した。 R N A抽出 試薬 Trizol (Invitrogen) 及び精 力ラム RN e s e y (Qu i a g e n) を用 いて添付のプロ トコールに従いトータル RNAを調製した。 得られたトータル R NAから mRNAを調製し、 オリゴキャップ法（Murayama, K. et al. , Gene, 138, 171-174, 1994、 及び、 Suzuki, Y. et al. , Gene, 200, 149- 156)により c DNA 合成を行った。 c DNA断片をプラスミ ドベクター pCMVFL3 に組み込み、 c DN Aライブラリーを構築した。 実施例 3
シークェンス解析 （1 )
実施例 1で得られた c DNAライブラリ一で大腸菌株 DH12S (インビトロジェ ン社） あるいは DH10BT1ファージレジスタント （インビトロジェン社） を形質転 換し、 得られた約 3 0， 0 0 0のシングルコロニーを 3 8 4プレートにピックァ ップした。 コロニー P CRでシークェンス反応の铸型にする DNAを増幅し、 ェ タノール沈殿による精製を行った。 それを鋅型にして、 アプライ ドバイオシステ ム社の BigDye ver3.1を用いて、 各 c DNA断片の 5， 末端側から、 シークェン ス反応を行った。 エタノール沈殿による精製後、 アプライ ドバイオシステム社の 3730x1 DNA Analyzer を用いてポリヌクレオチド配列の解析を行った。 実施例 4
シークェンス解析 （2)
実施例 2で得られた c DNAライブラリーで大腸菌株 DH5aを形質転換し、 得 られた約 2 6, 0 0 0のシングルコロニーを 3 8 4プレートにピックアップした。 コロニー P CRでシークェンス反応の铸型にする DN Aを増幅し、 エタノール沈 殿による精製を行った。 それを铸型にして、 アプライ ドバイオシステム社の BigDye ver3.1 を用いて、 各 c DNA断片の 5 ' 末端側から、 シークェンス反応 を行った。 エタノール沈殿による精製後、 アプライ ドバイオシステム社の 3730x1 DNA Analyzer を用いてポリヌクレオチド配列の解析を行った。 実施例 5
E S T (Expression Sequence Tag) のクラスタリング
理化学研究所から得られた約 3 0, 0 0 0の E S Tデータ （実施例 3) と NE DO (独立行政法人新エネルギー ·産業技術総合開発機構）から得られた約 2 6, 0 0 0の E S Tデータ（実施例 4)を 1つのデータセットに統合し、 PHRAP program (http://www. phrap. org) を用いてクラスタリングを行った。 その結果、 1 0, 3 7 2個のユニークなコンテイダを得た。 実施例 6
相同性検索による P 4 5 0遺伝子の抽出
実施例 5で得られた 1 0, 3 7 2個のコンテイダ配列をクエリーとして、 NC B I (National Center for Biotechnology Information; ラ—タべース fこ登録さ れている既知タンパク質に対する B L A S T X検索 （Altschul, S. F. et al. , Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997) を行い、 データベースに登録されて いる既知の P 4 5 0モノォキシゲナーゼに高い相同性を示すコンテイダを選抜し た。 選抜したコンテイダを構成する複数の E S Tクローンから、 最も長い 5 ' 末 端領域を保持すると判定されるものについて、 プラスミ ド DNAを調製し、 クロ ーン化された各 c DN A断片（3 6個）の全長ポリヌクレオチド配列を決定した。 実施例 7
遺伝子発現解析
実施例 6で得られた 3 6個の P 4 5 0分子種のうち、 グリチルリチン生合成に 関わる可能性が高い分子種を選抜するために、各 P 4 5 0分子種が Glychyrrhiza " /？ のどの器官で発現しているのかを RT— P CR法により調べた。
グリチルリチンを高蓄積する地下部組織 （肥大根およびス トロン） とダリチル リチンが全く検出されない地上部組織（葉および茎）、計 4種の異なる植物組織か らトータル RNAを調製した。 得られたトータル RNA l /z gを用いて、 SMART RACE cDNA amplification kit (クロンテック社）を用いて添付のプロ トコ一ノレに 従いファース トス トランド c DN A合成を行った。
各 P 4 5 0遺伝子に特異的にァニールするセンスプライマ一およびアンチセン スプライマーを設計し、 4種のファース トストランド c DNA 各 2 μ 1 を铸型 として、 TaKaRa Ex TaqTM DNAポリメラーゼ （宝酒造） を用いて、 2 5から 3 0 サイクルの P CRを行った。 得られた P CR断片をァガロースゲル電気泳動で分 析し（図 1 )、根およびス トロン由来のファーストストランド c DN A铸型を用い た場合のみで P CR断片の増幅が見られる P 4 5 0分子種を選抜した。このうち、 トリテルペンを酸化する酵素活性が認められた P 4 5 0分子種 （ i ) と （ i i ) (図 1の電気泳動図の矢印のバンドに該当） について、 以下の実施例を記す。 実施例 8
P 4 5 0分子種 （ i ) と （ i i ) の全長コード領域の増幅とクローニング
実施例 7で調製した Glychyrrhiza uralensis(Dス トロン由来ファース トス トラ ンド c DNAを铸型とし、 P 4 5 0分子種 （ i ) と （ i i ) のポリペプチドの N 末端と C末端に相当する箇所のオリゴ DNAをプライマーとして （配列番号 5と 6)、ァニール温度 5 5°( で？〇1^ (3 0サイクル、ストラタジーン社製 Pfu_Turbo DNA Polymeraseを使用） を行った。 なお、 配列番号 5のプライマーには、 5 ' 末 端に 4塩基 （cacc) が付加されているが、 pENTRTM/D_T0P0 (登録商標） エントリ —ベクター （インビトロジェン社） へのクローニングの際に必要である。 該 P C
Rにより増幅された DNA断片を pENTR/D- T0P0 ェントリ一ベクターにクローニ ングし、得られた 6個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。 これにより得られた 2種のポリヌクレオチド配列は、 配列番号 3およぴ配列番号 4であり、 それぞれから推定されるポリペプチド配列は、 配列番号 1および配列 番号 2である。 配列番号 3で示すポリヌクレオチドと配列番号 4で示すポリヌク レオチドは、 26， 1 63， 1 9 7, 294， 480, 59 1, 900, 945, 1 089， 1 3 73, 1 434番目の 1 1箇所が異なる。 また、 配列番号 1で示 すポリペプチドと配列番号 2で示すポリペプチドは、 9， 55， 66， 458番 目の 4箇所のアミノ酸が異なる。 実施例 9
バキュロウィルス—昆虫細胞発現系による本発明のタンパク質発現ベクターの構 築
実施例 8において作製した、 配列番号 3および配列番号 4に示すポリヌクレオ チドをそれぞれ有するプラスミ ド （エントリークローン） とデスティネーション ベクター pDESTTM 8 (インビトロジェン社） を混合し、 塩基配列特異的な組み換 え反応 （GATEWAYTMa iL x a iR 反応） により、 配列番号 3および配列番号 4に 示す DN A断片を pDESTTM8ベクタ一に移すことで、 昆虫細胞発現用コンストラ ク トを作製した。 塩化カルシウム法によって、 得られたコンス トラク トで大腸菌 株 DHlOBac (インビトロジヱン社） を形質転換した。 得られたコロニーから、 添 付のプロ トコールに従い Bacraid DNA (初代組換えバキュロウィルス） を調製 した。 実施例 1 0
バキュロウィルス一昆虫細胞発現系による本発明のタンパク質の発現
常 (づ ンヒ 卜ロシェン社、 Bac-to-Bac Baculovirus Expression System^ 77 タログ番号 10359016) に従い、 実施例 9において作製した Bacmid DNAを昆虫 細胞 Spodoptera frugiperda 9) に感染 ·増殖させ、 純化した高力価ウィルス液
(力価 =約 1 X 1 08 p f u/m 1 ) を調製した。 1. O x 1 06個の昆虫細胞を
3 m 1の Grace' s Insect Cell Culture Medium (GIBC0 BRL社）に懸濁し、 30 μ 1 の高力価ウィルス液を加え、 室温で 30分インキュベー ト した 9 5 Om lの Grace's Insect Cell Culture Medium (終濃度 1 00 μΜのアミノレブリン酸、 終濃度 1 0%のゥシ胎仔血清、 終濃度 100 のクェン酸鉄、 終濃度 0. 1 % の Pluronic F68を添加したもの） を加えた後、 300 m 1容フラスコに移し、 2 7°C、 1 50 r pmで 96時間培養した。 実施例 1 1
昆虫細胞からのミク口ソーム画分の調製
実施例 1 0で得られた昆虫細胞培養液 5 Omlを 2, 3 30 、 4°Cで 5分間遠 心し、 昆虫細胞を回収した。 昆虫細胞を、 氷冷したリン酸バッファーで 3回洗浄 した後、 5m 1の 5 OmMリン酸一カリウムバッファー （pH 7. 2、 1 mM E DTA、 1 mM DTT、 20% Glycerolを含む） に懸濁した。 BRANSON S0NIFER 250 (BRANSON社） を用いて、 細胞を超音波破砕した後、 2, 3 30 、 4°Cで 2 0分間遠心分離を行った。 上清を回収し、 1 00， 000 、 4°Cで一時間遠心 分離し、 得られたペレット （ミクロソーム画分） を 2 m 1の 5 0 mMリン酸一力 リ ゥムバッファー （p H 7. 2、 1 mM EDTA、 1 mM DTT、 20 % g 1 y c e r o 1 を含む） に懸濁した。 実施例 1 2
基質トリテルぺノィ ドの調製
ミクロソーム画分を用いた活性試験に用いるトリテルぺノィ ドは図 2および図 3に示す方法で合成した。
1 ) i3—アミ リン
ォレアノール酸 （SIGMA 社製） をトリメチルシリルジァゾメタンと反応させ力 ルボン酸をメチルエステル体とし、水酸基を tert—ブチルジメチルシリル基とし 保護した。 メチルエステルを還元しアルコールへと導きメシルクロリ ドを作用さ せメシルエステル体とした後、 還元的置換反応によりメチル体へと導いた。 この メチル体を脱保護して /3 _アミリンを得た。 構造は1 H— NMRおよび13 C— N MRスぺク トルを解析し確定した。 2) 1 1—ォキソー ]3—アミリン
]3—アミリンの 3位水酸基をテトラヒ ドロビラニル基で保護し、 塩化ルテニゥ ムと tert—ブチルヒ ドロペルォキシドを作用させ 1 1位メチレン炭素をカルボ ニル基へと導いた。 その後、 脱保護を行い 1 1一ォキソ アミリ ンを得た。 構造は1 H— NMRおよび13 C— NMRスぺク トルを解析し確定した。
3) —ヒ ドロキシー ]3—アミ リ ン
1 1—ォキソ一 i3—アミリンにリチウムアルミニウムヒ ドリ ドを作用させ 1 1 位のカルボ二ル基を還元し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ一で分離し 1 1 ひ 一ヒ ドロキシ一 一アミリンと l l j3—ヒ ドロキシ一 )3—アミ リンを得た。 構 造は1 H— NMRおよび13 C— NMRスぺク トルを解析し確定した。
4) 1 1—デォキソグリチルレチン酸
グリチルレチン酸 (SIGMA 社製） に亜鉛と塩酸を作用させ 1 1位のカルボニル 基を還元し 1 1—デォキソグリチルレチン酸を得た。構造は1 H— NMRおよび1 3C_NMRスぺク トルを解析し確定した。
5) 30—ヒ ドロキシ一 /3—アミリ ン
1 1—デォキソグリチルレチン酸にトリメチルシリルジァゾメタンを作用させ カルボン酸をメチルエステル体へと導き、 エステルを還元し 30—ヒ ドロキシ一 β—アミリンを得た。 構造は1 H— NMRおよび13 C— NMRスぺク トルを解析 し確定した。
6) 30—ヒ ドロキシ一 1 1—ォキソ一 3—アミリン
30—ヒ ドロキシ _ )3—アミ リンの水酸基をテトラヒ ドロビラニル基として保 護し、塩化ルテニウムと tert—ブチルヒ ドロペルォキシドを作用させ 1 1位メチ レン炭素をカルボニル基へと変換し、 脱保護を行い 30—ヒ ドロキシ— 1 1ーォ キソ一 ]3—アミ リンを得た。 構造は1 H— NMRおよび13 C— NMRスぺク トル を解析し確定した。
7) 1 1ひ， 30—ジヒ ドロキシ _ ]3—アミ リン
30—ヒ ドロキシー 1 1—ォキソ一 β—アミリンにリチウムアルミニウムヒ ド リ ドを作用させ 1 1位のカルボ二ル基を還元し、 シリカゲルカラムクロマトダラ フィ一で分離し、 1 1 α, 30—ジヒ ドロキシー ]3—アミ リンと 1 1 /3, 3 0—ジ ヒ ドロキシー ^ーアミリンを得た。 構造は1 H— NMRおよび1.3 C— NMRスぺ ク トルを解析し確定した。 実施例 1 3
ミクロソーム画分を用いた in vitroアツセィ
実施例 1 1で得られたミク口ソーム画分 50 // 1 と、 25 μ 1の 1Mリン酸一 カリウムバッファー （ΡΗ7. 2)、 1 ιχ 1 (終濃度 0. 1 u n i t Zm 1 ) の精 製シロイヌナズナ p 450還元酵素 （Mizutani, M. and Ohta, D. , Plant Physiol. 116, 357-367, 1998)、 25 // 1 (終濃度 1 mM) の NADPH、 5 a 1 (終濃度
20 μΜ)の反応基質（ 一アミリンあるいは 30—ヒ ドロキシ一 ]3—アミリン）、
394 1の滅菌水を混合した後、 30°C、 1， 000 r p mにて撹拌させなが ら 2時間ィンキュベートした。 実施例 1 4
変換物の同定
実施例 1 3で得られた反応溶液は酢酸ェチルで抽出され、 酢酸ェチル区は溶媒 を乾燥除去した後、 N—メチルー N—トリメチルシリルトリフルォロアセトアミ ドを加え、 80°Cで 30分間加熱し、 トリメチルシリルエーテル体に誘導体化し GC— MS分析の試料とした。 GC_MSはAutomass (JE0L) - 6890N (Agilent technologies) を、 カラムは HP- 5column (J & W Scientific; 0.32 mm x 30 m; 0.25 mm film thickness) を用いて変換物を分析した。 変換物の同定は実施例 1 2で調製したトリテルぺノィ ドを標品として GCの保持時間ならびに MSスぺク トルを比較することで決定した。
配列番号 1に示すポリペプチドを発現する昆虫細胞、 および、 配列番号 2に示 すポリべプチドを発現する昆虫細胞、 それぞれから調製したミク口ソームを用い て酵素アツセィを行った結果、 どちらの場合においても i3—ァミリンの変換物と して、 1 1 ひーヒ ドロキシー ]3—アミ リンと 1 1—ォキソ一 ;3—ァミリンが検出 された。 図 4に配列番号 1のポリペプチドを用いた結果を示す。 全イオンクロマ トグラムの点線の矢印は ]3—アミリン、 2重線の矢印は 1 1一ォキソ—;3—アミ リン、 3重線の矢印は 1 1 ct—ヒ ドロキシ一 β—アミ リンを示す。 配列番号 2の ポリべプチドを用いた場合も、 配列番号 1のポリべプチドを用いた場合と同様の 結果が得られた。 さらに、 3 0—ヒ ドロキシー i3—アミリンと配列番号 1のポリ ペプチドを反応させると、 1 1 α , 3 0—ジヒ ドロキシー ]3—アミ リンと 3 0—ヒ ドロキシ— 1 1—ォキソ一 ) 3—ァミリンが検出された。 図 5に配列番号 1のポリ ぺプチドを用いた結果を示す。 全イオンクロマトグラムの点線の矢印は 3 0—ヒ ドロキシ一 |3—アミリン、 2重線の矢印は 3 0—ヒ ドロキシー 1 1一ォキソ一 /3 一アミリン、 3重線の矢印は 1 1 α， 3 0—ジヒ ドロキシ _ ]3—アミリンを示す。 配列番号 2のポリべプチドを用いた場合も、 配列番号 1のポリべプチドを用いた 場合と同様の結果が得られた。 一方、 対照実験として、 ボイ ドベクターを導入し た昆虫細胞に由来するミクロソーム画分を用いて同様の実験を行った。 反応基質 として )3—ァミリンを用いた場合、 図 4のベクターコントロールの全イオンク口 マトグラムに記載の通り、 1 1 α—ヒ ドロキシー /3—アミリン、 1 1—ォキソ一 J3—ァミリンのいずれも生成されなかった。 反応基質として、 3 0—ヒ ドロキシ — j8—ァミリンを用いた場合、 図 5のベクターコントロールの全イオンクロマト グラムに記載の通り、 1 1 c ， 3 0—ジヒ ドロキシ一 j3—アミリン、 3 0—ヒ ドロ キシ一 1 1—ォキソ一 ]3—ァミリンのいずれも生成されなかった。 これにより、 グリチルリチンの生合成に関与すると考えられる、 j3—アミリン骨格の 1 1位を 酸化し、 水酸基およびカルボ-ル基に変換するトリテルペン酵素が初めて同定さ れた。 実施例 1 5
ミヤコグサ p 4 5 0 reductaseの酵母発現ベクター pESC_LEU- LjCPRの構築 ミヤコグサ E S T database (かずさ D N A研究所）を検索し、 シロイヌナズナ P
4 5 0 reductaseとアミノ酸レベルで 7 0 %以上の配列を選抜した。全長コード 領域を含むと思われる E S Tクローン（access ion no. AV778635)をかずさ D N A 研究所より入手し、 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer を用いて D N A配列を決 定した（以下、 LjCPRとする）。 LjCPR導入プラスミ ド（pBluescript SK (-））を铸型 にして、 CPR- F (Not) , GGGCGGCCGCACTAGTATCGATGGAAGAATCAAGCTCCATGAAG (配列番 号 7) と CPR- R(Pac)， TTAATTAATCACCATACATCACGCAAATAC (配列番号 8) の両プラ イマ一を用い、 KOD- Plus- (東洋紡績）を用いて 94 °C 2分間の後、 94°C20秒間、 60°C40秒間、 68°C2分間の保温を 1サイクルとして 1 5サイクルからなる P CR反応を行なった。さらに 68 °Cで 2分間保温した。 P CR反応産物を TAget Clone -Plus- (東洋紡績） を用いて、 pT7Blue T— vector (Novagen) とライゲーシ ヨンした。 DN A配列を確認後、 NotI、 Pacl で消化し、 酵母発現用ベクター pESC-LEU (Stratagene) も Notl, Paclで消ィ匕し、 DNA ligation Kit Ver. 2.1 (タ カラバイオ） を用いてライゲーシヨ ンし、 LjCPR の酵母発現ベクター pESC-LEU-LjCPRを得た。 実施例 1 6
ミヤコグサ ]3—アミ リン合成酵素 （OS C 1) 遺伝子 c DN Aの酵母発現べクタ 一 pYES3- ADH- 0SC1の構築
ミヤコグサ 一アミリン合成酵素 （OS C 1) 遺伝子 c DN A導入プラスミ ド
(Sawai et al. (2006) Plant Sci 170： 247-257) を Kpnl、 Xbalで消化し、 O S C I c DNA領域を切り出した。 pAUR123 (タカラバイオ） も Kpnl、 Xbalで 消化し、 DNA ligation Kit Ver. 2.1 (タカラバイオ） を用いてライゲーシヨンし、 PAUR123 - 0SC1 を得た。 pAUR123- 0SC1 の PADH1 から TADH1 領域を AUR123- F, GGATGATCCACTAGTGGATCCTCTAGCTCCCTAACATGTAGGTGG (配列番号 9 ) と AUR123-R, TAATGCAGGGCCGCAGGATCCGTGTGGAAGAACGATTACAACAGG (配列番号 1 0) の両プライマ 一を用いて、 KOD- Plus- (東洋紡績）を用いて 94 °C 2分間の後、 94 °C 20秒間、 5 5°C40秒間、 68°C 1分 30秒間の保温を 1サイクルとして 20サイクルか らなる P CR反応を行なった。 さらに 68°Cで 2分間保温した。 また、 PYES3/CT
(インビトロジェン） の 1番から 96 0番塩基（PGAL1から CYC1TT)を除く領域を
YES3-F， TGCGGCCCTGCATTAATGAATCGGCCAACG (配列番号 1 1 ) と YES3 - R ,
ACTAGTGGATCATCCCCACGCGCCCTGTAG (配列番号 1 2)を用いて KOD- Plus- (東洋紡績） を用いて 94 °C 2分間の後、 94 °C 20秒間、 55 °C 40秒間、 68 °C 1分 30 秒間の保温を 1サイクルとして 20サイクルからなる PC R反応を行なった。 さ らに 6 8 °Cで 2分間保温した。 両 P C R反応産物を In- Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit (クロンテック） を用いて結合し、 ミヤコグサ O S C 1酵母発現べク ター pYES3- ADH- 0SC1を得た。
実施例 1 7
酵母での発現ベクター構築
実施例 8において作製した、 配列番号 3に示すポリヌクレオチドを有するブラ スミ ド （ェントリークローン） とデスティネーションベクター pYES- DESTTM52 (ィ ンビトロジェン社） を混合し、 塩基配列特異的な組み換え反応 （GATEWAYTMa L x ai R反応） により、配列番号 3で示す D N A断片を pYES-DESTTM52に移し替える ことで、 酵母細胞発現用コンス トラク トを作製した。
pENTER-D-TOPO にクローニングされた配列番号 3に示す遺伝子を Gateway LR Clonase I IEnzyme Mix (イ ンビ ト ロジヱン） を用いて酵母発現用ベクター pYES- DEST52 (ィンビトロジェン） に組み込み、 配列番号 3に示す遺伝子の酵母発 現べクタ一 PDEST52 - GuCYP88を得た。 実施例 1 8
形質転換酵母の培養
酵母 BJ2168株 （二ツボンジーン） MATa pre 1-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3~52 gal2) を Frozen— EZ Yeast Transformat ion II (Zymo Research) を用レヽ て pYES3-ADH- 0SC1、 pESC- LEU_LjCPR、 pDEST52_GuCYP88および pYES2 (ィンビト ロジェン） で形質転換した。
実施例 1 9
形質転換酵母における生成物の確認
実施例 1 8で調製した pYES3- ADH- 0SC1、 pESC- LEU_LjCPR、 pDEST52- GuCYP88の
3つ全てのベクターを保持する酵母を 1 0 O m 1の SC- Trp/Leu/Ura培地 2 8 °C、
1 3 5 r p m、 2日間培養した。 培養した酵母を 3 0 0 0 g、 1 0分間遠心する ことにより集菌し、 ガラク ト一ス （2 O m g Zm 1 )、 塩化へミン （ 1 3 μ g /
1 )を添加した 1 0 0 m l の SC- Trp/Leu/Ura-グルコース培地に懸濁し、 2 8 ° ( 、 1 3 5 r p m、 2日間培養した。 遠心処理により集菌し、 凍結乾燥処理を行なつ た。 5 m 1の酢酸ェチルを加え混合した後、 酢酸ェチル抽出物を回収した。 この 操作を 3回繰り返した。酢酸ェチル抽出物を減圧下で濃縮した。 pYES3-ADH-0SCl、 pESC- LEU- LjCPR、 pYES2の 3つ全てのベクターを保持する酵母についても同様に、 培養、 抽出を行なった。 実施例 1 4に記述した方法と同じく、 酢酸ェチル区は溶 媒を乾燥除去した後、 N—メチル— N—トリメチルシリルトリフルォロアセトァ ミ ドを加え、 8 0°Cで 3 0分間加熱し、 トリメチルシリルエーテル体に誘導体化 し GC— MS分析の試料とした。 変換物の同定は実施例 1 2で調製したトリテル ぺノィ ドを標品として GCの保持時間ならびに MSスぺク トルを比較することで 決定した。 pYES3- ADH-0SC1、 pESC-LEU- LjCPR、 pDEST52_GuCYP88 の 3つ全てのベ クタ一を保持する酵母の抽出物から j3—アミリンと 1 1 α—ヒ ドロキシ一 j3—ァ ミリンと 1 1—ォキソー /3—アミリンが検出された。 一方、 対照実験として行つ た、 pYES3- ADH_0SC1、 pESC- LEU- LjCPR、 pYES2 の 3つ全てのベクターを保持する 酵母の抽出物からは ]3—ァミリンのみが検出され、 1 1 α—ヒ ドロキシ一 /3—ァ ミリンならびに 1 1—ォキソ一 i3—ァミ リンは検出されなかった。 これにより、 本発明の遺伝子がコードするポリべプチドは、 酵母においても jS—アミリンの 1 1位を酸化し、 水酸基およびカルボニル基に変換するトリテルペン酸化酵素であ ることが明らかとなった。 実施例 2 0
NMRによる 1 1—ォキソ一 ]3—ァミ リンの同定
実施例 1 8で調製した pYES3_ADH-0SCl、 pESC- LEU_LjCPR、 pDEST52-GuCYP88の 3つ全てのベクターを保持する酵母を 4 O O m lの SC- Trp/Leu/Ura培地 （ 6本、 計 2. 4 L) で 2 8°C、 1 2 5 r p m、 2日間培養した。 培養した酵母を 3 0 0 0 g、 1 0分間遠心することにより集菌し、 ガラク トース （2 O ni gZm 1 )、 塩 化へミン （l S ^ gZm l ) を添加した 4 0 0 m 1の SC- Trp/Leu/Ura -ダルコ一 ス培地 （6本、 計 2. 4 L) に懸濁し、 2 8°C、 1 2 5 r p m、 2日間培養した。 遠心処理により集菌し、 凍結乾燥処理を行なった。 凍結乾燥した菌に 1 0 O m 1 クロ口ホルムを加え、 混合した後、 クロ口ホルム抽出物を回収した。 この操作を 3回繰り返した。 クロ口ホルム抽出物を減圧下で濃縮した。 抽出物を、 シリカゲ ルクロマトグラフィーで分画した。 シリカゲルは Wako gel C-300 (和光純薬工業） を用レ、、 2. 8 X 4 0 c mのサイズで行ない、 へキサン：酢酸ェチル （1 : 1 ) の溶媒を流し、 溶出液を 7m 1ずつ分画した。 2 2— 2 9番フラクションを集め 溶媒除去し、 シリ力ゲル T L Cプレート LK 6 F (Whatman) 20 x 2 0 c mに付 した。 トルエン： アセトン （1 9 ： 1 ) の溶媒で展開した後に、 1 1—ォキソ一 ]3—アミリンと同じ R f 値のシリカゲルをかき取りクロロホルムで溶出した。 溶 媒除去後、 重クロ口ホルムに溶解し、 日本電子社製 （5 0 0MH z) NMRを用 いて1 H— NMRスぺク トルを測定した。 これら 2つの画分の1 H— NMRスぺク トルは実施例 1 2で調製した標品の 1 1 —ォキソ一 _アミ リン （CDC13， 500 MHz: δ 0.81 (3Η, s)， 0.86 (3H, s)， 0.89 (3H, s) , 0.90 (3H, s) , 1.00 (3H, s), 1.13 (3H， s)， 1.14 (3H, s) , 1.36 (3H, s) 2.34 (1H, s) , 2.79 (1H, dt, J=3.4, 13.8 Hz), 3.23 (1H, dd, J=5.2, 10.9 Hz), 5.59 (1H， s)) と完全に一 致した。 図 6に1 H— NMRスペク トルを示す。 実施例 2 1
NMRによる 1 1 α—ヒ ドロキシ一 ^—ァミ リンの同定
実施例 1 8で調製した PYES3-ADH- 0SC1、 pESC- LEU- LjCPR、 pDEST52- GuCYP88の 3つ全てのベクターを保持する酵母を 4 0 0m lの S C_T r p/L e u/U r a培地 （1 2本、 計 4. 8 L) で 2 8°C、 1 2 5 r p mで、 2日間培養した。 培 養した酵母を 3 0 0 0 、 1 0分間遠心することにより集菌し、ガラク トース （2 0 m g m 1 ) 塩化へミ ン （ 1 3 μ πι 1 ) を添加した 4 0 0 m 1 の SC_Trp/Leu/Ura -グルコース培地 （1 2本、 計 4. 8 L) に懸濁し、 2 8。C、 1 2 5 r p m、 2日間培養した。 遠心処理により集菌し、 凍結乾燥処理を行なった。 凍結乾燥した菌に 1 0 0m l酢酸ェチルを加え、 混合した後、 酢酸ェチル抽出物 を回収した。この操作を 3回繰り返した。酢酸ェチル抽出物を減圧下で濃縮した。 抽出物を、 シリカゲルクロマトグラフィーで分画した。 シリカゲルは Wako gel C - 200 (和光純薬工業） を用い、 2. 8 X 4 0 c mのサイズで行ない、 へキサン ： 酢酸ェチル （1 : 1) の溶媒を流し、 溶出液を 7 m 1ずつ分画した。 4 3— 5 7 番フラクションを集め溶媒除去し、シリカゲル T L Cプレート LK 6 F (Whatman) 2 0 X 2 0 c mに付した。 へキサン：酢酸ェチル （1 : 1 ) の溶媒で展開した後 に、 1 1 α—ヒ ドロキシ一 ]3—アミリンと同じ R f 値のシリカゲルをかき取りク ロロホルムで溶出した。溶媒除去後、重クロ口ホルムに溶解し、 日本電子社製（5 0 OMH z ) NMRを用いて1 H— NMRスペク トルを測定した。 この画分の 1 H— NMRスぺク トルは実施例 YY で調製した標品の 1 1 α—ヒ ドロキシー β— アミリンと完全に一致した （CDC13， 500 MHz： δ 0.81 (3Η, s)， 0.84 (3H, s), 0.89 (6H, s)， 1.00 (3H, s)， 1.01 (3H, s), 1.06 (3H, s)， 1.22 (3H, s), 3.24 (1H， dd, J=4.9, 11.2 Hz), 4.19 (1H, m) , 5.24 (1H, d， J=4.0 Hz))。 図 7に — NMRスぺク トノレを示す。 実施例 2 2
植物発現ベクターの構築
配列番号 3に示すポリヌクレオチドを有するェントリークローンと植物形質転 換用バイナリ一ベクターである pBI_0X-GW (ィンプランタイノベーションズ社）あ るいは pHR- 0X( ） （關と村中、 バイオサイエンスとバイオインダス トリ一、 64, 17-22, 2006) とを混合し、 塩基配列特異的な組み換え反応 （GATEWAYTM attl x a iR反応）により、配列番号 3に示す DN A断片を、 pBI_0X_GWおよび pHR- 0X( f/7) に組み込んだ。 実施例 2 3
シロイヌナズナの形質転換
実施例 2 2において得られた各植物形質転換コンストラク トをァグロパクテリ ゥム . ッメファシエンス GV3101 (pMP90)株に導入した。 各植物形質転換コンスト ラク トを保持するァグロバタテリ ゥム . ッメファシエンスを用いて既知の方法
(Clough, S.J. and Bent, A. F. , Plant J., 16, 735—743， 1998) により、 シロ ィヌナズナ （ェコタイプ C o 1 — 0) の形質転換種子を取得した。 得られた形質 転換種子の表面をエタノールで殺菌した後、 5 Om g/ 1のカナマイシンおよび
2 5 Om g/ 1 のクラフォラン （アベンテイス ' ファーマ社） を添加した MS寒 天培地に播種し、 2 3 ° (：、 日長 1 6時間で培養することで配列番号 3で示すポリ ヌクレオチドを有する形質転換シロイヌナズナを選抜した。 pBI - 0X-GW (ィンプラ ンタイノベーションズ社）を用いた形質転換により、配列番号 1に示すポリぺプチ ドを高発現するシロイヌナズナ植物個体が得られる。また、ァグロパクテリゥム · リゾゲネス由来の ro7遺伝子クラスター （毛状根誘導に必要とされる遺伝子セッ ト） を T- DNA上に有する pHR- 0X (^¾ベクターを用いて形質転換を行った個体か らは、 既知の方法 (Seki. H. et al. , Plant Mol. Biol. , 59, 793-807 2005) に より、 配列番号 1で示すポリべプチドを高発現するシロイヌナズナ培養毛状根を 作出し、 長期的に培養維持することができる。 実施例 2 4
Glycyrrhiza glabraか のトリテノレペン酸ィ匕酵素遺伝子の単離
カンゾゥ属 fit物の一つでめる Glycyrrhiza glabra 、 Glycyrrhiza uralensis と同様にグリチルリチンを産生する。 Glycyrrhiza glabraにおいて、 配列番号 3 および 4で表される遺伝子と同等の機能を有すると推測される相同遺伝子を RT-PCR法により単離した。
(独）医薬基盤研究所、 薬用植物資源研究センター、 北海道研究部 （北海道名寄 巿） から分譲された Glycyrrhiza glabraのストロンから、 実施例 8と同様の方法 により、 c D N Aを単離した。 得られた 6個の独立クローンについてポリヌクレ ォチド配列を決定した。 これにより得られた配列は、 配列番号 1 4であり、 それ から推定されるポリペプチド配列は、 配列番号 1 3である。 配列番号 1 3は配列 番号 1および配列番号 2に示すアミノ酸配列に対して 9 8 . 6 %の同一性を有し ていた。
さらに、 配列番号 1 3で示されるポリペプチドについても、 実施例 1 3 1 7 に示した方法により、形質転換酵母における /3—ァミリン酸化活性を調べた結果、 Glycyrrhiza uralensisカゝら得られた配列番号 1および配列番号 2で示すポリぺ プチドと同様に、 i3—アミリンの 1 1位を酸化し、 水酸基おょぴカルボニル基に 変換する トリテルペン酸化酵素であることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化するタン パク質、 それをコードする遺伝子を提供でき、 例えば該タンパク質をグリチルリ チン合成に適用したり、 あるいは、 カンゾゥ属植物などに前記遺伝子を導入して 高発現させ、 グリチルリチンの産生量を高めることなどが可能になる。
本発明は、 0—ァミ リンからグリチルリチンの生合成経路の解明に適用するこ とができる。 またカンゾゥ属植物のグリチルリチン産生量を増加することができ る。 さらに工業的なグリチルリチンの製造に適用できる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を有するタ ンパク質。
2. 前記ダンマラン系列トリテルペンが、 0—アミリンまたは 3 0—ヒ ドロ キシ一 i3—ァミリンである、 請求項 1に記載のタンパク質。
3. カンゾゥ属植物に由来する、 請求項 1または 2に記載のタンパク質。
4. 前記カンゾゥ属植物が、 ダルキルリザ · ゥラレンシスまたはグルキルリ ザ · グラブラである、 請求項 3に記載のタンパク質。
5. 以下の （a ) 〜 （c) に示すいずれかのアミノ酸配列を有する、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のタンパク質。
( a ) 配列番号 1に示すァミノ酸配列
(b)配列番号 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列
(c) 配列番号 1に示すアミノ酸配列に対して 8 0%以上の同一性を有するアミ ノ酸配列
6. 配列番号 2または配列番号 1 3に示すアミノ酸配列を有する、 請求項 1 〜 5のいずれか 1項に記載のタンパク質。
7. ダンマラン系列トリテルペンの 1 1位の炭素を酸化する活性を有するタ ンパク質をコードする遺伝子。
8. 前記ダンマラン系列トリテルペンが、 ]3 _アミリンまたは 3 0—ヒ ドロ キシ— )3—アミ リ ンである、 請求項 7に記載の遺伝子。
9. カンゾゥ属植物に由来する、 請求項 7または 8に記載の遺伝子。
1 0. 前記カンゾゥ属植物が、 ダルキルリザ ' ゥラレンシスまたはダルキル リザ · ダラブラである、 請求項 9に記載の遺伝子。
1 1. 以下の （d) 〜 （g) に示すいずれかの塩基配列を有する、 請求項 7 〜 1 0のいずれか 1項に記載の遺伝子。
( d) 配列番号 3に示す塩基配列
(e) 配列番号 3に示す塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換も しくは付加された塩基配列
( f ) 配列番号 3に示す塩基配列に対して 8 0 %以上の同一性を有する塩基配列 ( g ) 配列番号 3に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェント な条件でハイブリダイズする塩基配列
1 2 . 配列番号 4または配列番号 1 4に示す塩基配列を有する、 請求項 7〜 1 1のいずれか 1項に記載の遺伝子。
1 3 . 請求項 7〜1 2のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
1 4 . 請求項 7〜 1 2のいずれかに記載の遺伝子または請求項 1 3に記載の 組換えベクターを有する形質転換体。
1 5 . カンゾゥ属植物である、 請求項 1 4に記載の形質転換体。
1 6 . カンゾゥ属植物が、 ダルキルリザ ·ゥラレンシスまたはダルキルリザ · グラブラである、 請求項 1 5に記載の形質転換体。
1 7 . 請求項 7〜1 2のいずれかに記載の遺伝子の発現が増強された、 請求 項 1 4〜 1 6のいずれか 1項に記載の形質転換体。
1 8 . 請求項 7〜 1 2のいずれかに記載の遺伝子の発現が抑制された、 請求 項 1 4〜 1 6のいずれか 1項に記載の形質転換体。
1 9 . 請求項 1 4〜 1 7のいずれかに記載の形質転換体を培養または育成さ せ、 培養物または育成物から請求項 1〜6のいずれかに記載のタンパク質を採取 することを含む、 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のタンパク質の製造方法。
2 0 . 請求項 1〜6のいずれかに記載のタンパク質をダンマラン系列トリテ ルペンに作用させる、 ダンマラン系列トリテルペンの酸化方法。
2 1 . 植物における請求項 7〜 1 2のいずれか 1項に記載の遺伝子の有無ま たは発現を判定し、 植物を選抜する方法であって、 前記植物から調製された核酸 含有サンプルについて、 前記遺伝子もしくはその断片を用いて P C R法、 R T— P C R法または核酸ハイブリダィゼーションを行い、 前記遺伝子を検出または定 量することを含む、 前記植物選抜法。
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