WO2021075572A1 - グルクロン酸転移酵素、それをコードする遺伝子及びその利用方法 - Google Patents

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光 關
スヨン チョン
政男 石本
勧 平賀
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    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme that transfers glucuronic acid to the hydroxyl group at the 3-position of an oleanane-type triterpenoid, a gene encoding the enzyme, and a method for producing glycyrrhizin.
  • Glycyrrhiza uralensis (Glycyrrhiza uralensis) is a perennial herbaceous plant of the leguminous family. The root and stolon of this plant are known as "licorice", an important crude drug in Chinese medicine, and are widely used worldwide.
  • the main active ingredient of licorice is glycyrrhizin, an oleanane-type triterpenoid saponin (Non-Patent Document 1). Glycyrrhizin has been studied from various aspects such as its pharmacognosy, pharmacological usefulness, and breeding research.
  • the genes involved in the glycyrrhizin biosynthesis system and the expression level of the genes are used as markers to establish optimal production conditions and glycyrrhizin. It is necessary to breed high-producing plants of glycyrrhizin by selecting high-producing strains or introducing synthase genes. For that purpose, identification of genes involved in the biosynthetic system of glycyrrhizin is indispensable.
  • Glycyrrhizin is commonly contained in plants and is biosynthesized by a two-step oxidation reaction and a two-step glycation reaction using ⁇ -amyrin, which belongs to the oleanane-type triterpenoid, as a starting material.
  • ⁇ -Amyrin is known to be a precursor substance that serves as a biosynthetic junction between glycyrrhizin and soyasaponin I in the triterpenoid saponin biosynthesis system (Fig. 1).
  • the synthases from ⁇ -amylline to glycyrrhizin have so far been the two-step oxidation reaction for biosynthesizing glycyrrhetinic acid, which is an aglycone (non-sugar portion) of glycyrrhizin, from ⁇ -amylin.
  • Patent Document 1 Two oxidases CYP88D6 (Patent Document 1) and CYP72A154 (Patent Document 2) that catalyze each of the above, and synthesis that biosynthesizes glycyrrhizin by catalyzing the above-mentioned two-step glycation reaction with the obtained glycyrrhetinic acid.
  • Patent Document 3 the glycosyltransferase UGT73P12 (Patent Document 3) that catalyzes the second step has been known.
  • the present invention isolates a gene for glucuronic acid first transferase that catalyzes glucuronic acid transfer to the hydroxyl group at the 3-position of oleanane-type triterpenoids such as glycyrrhetinic acid, and expresses the gene. It is an object of the present invention to prepare and provide a biological expression system capable of biosynthesizing a large amount of ⁇ -amylin to glycyrrhizin in an individual or in a cell using the system.
  • Legumes to which licorice plants belong generally have a pathway for biosynthesizing soyasaponin I from ⁇ -amyrin via soyasapogenol B as an intermediate (Fig. 1).
  • the oleanane-type triterpenoid soyasapogenol B has a hydroxyl group at the 3-position, while the final product, soyasaponin I, has glucuronic acid bound at the 3-position.
  • glycyrrhetinic acid which is an intermediate product and an oleanane-type triterpenoid, has a hydroxyl group at the 3-position, whereas glucuronic acid is bound to the 3-position of the final product, glycyrrhizin. That is, glucuronic acid first transferase that functions in the biosynthetic pathway from ⁇ -amyrin to glycyrrhizin may also function in the biosynthetic pathway from ⁇ -amyrin to soyasaponin I.
  • the present inventors attempted to identify a gene capable of having glucuronic acid first transfer activity from soybean having a biosynthetic pathway from ⁇ -amyrin to soyasaponin I, and as a result, a specific function was obtained.
  • As a result of verifying the transglycosylation activity of this enzyme using soyasapogenol B as a sugar-accepting substrate it was clarified that glucuronic acid is transglycosylated to the hydroxyl group at the 3-position of soyasapogenol B. This enzymatic activity was similar even when the sugar accepting substrate was glycyrrhetinic acid.
  • the present inventors have succeeded in identifying the first glucuronic acid transferase that could not be isolated so far by changing the derived plant to soybean instead of the licorice genus plant.
  • the present invention is based on the research results and provides the following.
  • A Amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5.
  • B An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, or
  • SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 An amino acid sequence polypeptide having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in any of the above.
  • the oleanane-type triterpenoids are ⁇ -amyrin, 11-oxo- ⁇ -amyrin, 30-hydroxy-11-oxo- ⁇ -amyrin, 30-hydroxy- ⁇ -amylin, 24-hydroxy- ⁇ -amyrin, 11 -The polypeptide according to (1), which is selected from the group consisting of deoxoglycyrrhetinic acid, glycyrrhetinic acid, oleanolic acid, medicagenic acid, soyasapogenol B, soyasapogenol A, hederagenin, amyrinin, and psychogenin.
  • the polypeptide according to (1) or (2) which is derived from a legume (Fabaceae) plant.
  • the polynucleotide according to (4) which comprises any of the base sequences shown in (a) to (d) below.
  • the method comprising the step of culturing the above-mentioned culture and the step of extracting the polypeptide according to any one of (1) to (3) from the culture.
  • (13) A genetically recombinant product capable of biosynthesizing ⁇ -amyrin and containing all the expression vectors shown in (A) to (D) below for producing glycyrrhizin.
  • a CYP88D6 expression vector which has an activity of oxidizing the 11th position of an oleanane-type triterpenoid and contains a polypeptide containing any of the amino acid sequences shown in (a) to (c) below.
  • (A) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • Array (B) A CYP72A154 expression vector, which has an activity of oxidizing the 30th position in an oleanane-type triterpenoid and contains a polypeptide containing any of the amino acid sequences shown in (d) to (f) below.
  • a polypeptide having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxy group at the 3-position of an oleanane-type triterpenoid it is possible to provide a polypeptide having an activity of transferring glucuronic acid to the hydroxy group at the 3-position of an oleanane-type triterpenoid, a polynucleotide encoding the polypeptide, or a method using them.
  • the biosynthetic pathway of glycyrrhizin and soyasaponin I in the triterpenoid saponin biosynthesis system is shown.
  • the catalytic position of the acid first transferase CSyGT is shown.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing a triterpenoid-producing yeast strain used in the functional analysis of soybean Glyma.06G324300 and Glyma.06G324300 homologous protein derived from licorice and Lotus japonicus in Examples.
  • the yeast strain of (a) produces glycyrrhetinic acid from 2,3-oxide squalane inherent in yeast by co-expressing the ⁇ -amyrin synthase gene (derived from Miyakogusa), CYP88D6 (derived from licorice), and CYP72A63 (derived from Medicago truncatula). It can be produced intracellularly.
  • the yeast strain of (b) simultaneously expresses the ⁇ -amyrin synthase gene (derived from licorice), CYP93E3 (derived from licorice), and CYP72A566 (derived from licorice) to cell soyasapogenol B from 2,3-oxide squalene endogenous to yeast.
  • ⁇ -amyrin synthase gene derived from licorice
  • CYP93E3 derived from licorice
  • CYP72A566 derived from licorice
  • Sample A of (a) expresses Glyma.06G324300 derived from soybean
  • sample B of (b) expresses Glyur003152s00037491 derived from licorice
  • sample C of (c) expresses Lj3g3v1981230 derived from Lotus japonicus in glycyrrhetinic acid-producing yeast.
  • This is the detection result of glycyrrhetinic acid monoglucuronide produced thereby.
  • the peak of the black arrow indicates glycyrrhetinic acid monoglucuronide.
  • Sample D in (d) is the detection result in glycyrrhetinic acid-producing yeast into which an empty vector was introduced as a negative control.
  • sample H in (d) is the detection result in soyasapogenol B-producing yeast into which an empty vector was introduced as a negative control. It is a figure which shows the outline of the substrate feeding experiment.
  • UDP-glucuronic acid intracellularly, UDP-glucose dehydrogenase (AtUGD) of Arabidopsis thaliana and Glyma.06G324300 and their homologous genes were co-expressed in yeast.
  • A is a diagram of conversion reaction to monoglucuronide when glycyrrhetinic acid is administered to the yeast culture medium and
  • (b) is a diagram of soyasapogenol B administered to the yeast culture medium.
  • the peak of the black arrow indicates glycyrrhetinic acid monoglucuronide. It is a figure which shows the metabolite analysis result in Glyur003152s00037491 introduction yeast derived from licorice which fed glycyrrhetinic acid.
  • A It is a conceptual diagram of the expected conversion reaction to glycyrrhetinic acid monoglucuronide when Glyur003152s00037491 is used.
  • B The detection result of glycyrrhetinic acid before conversion is shown. The peak of the white arrow indicates glycyrrhetinic acid.
  • the peak of the white arrow indicates glycyrrhetinic acid.
  • C The detection result of glycyrrhetinic acid monoglucuronide produced by Lj3g3v1981230 is shown. The peak of the black arrow indicates glycyrrhetinic acid monoglucuronide. It is a figure which shows the metabolite analysis result in the empty vector-introduced yeast which fed glycyrrhetinic acid with the negative control of FIGS. 7-9.
  • A It is a conceptual diagram of a possible conversion reaction to glycyrrhetinic acid monoglucuronide when an empty vector is used.
  • glycyrrhetinic acid monoglucuronide It is expected that glycyrrhetinic acid monoglucuronide will not be produced due to lack of enzymatic activity.
  • B The detection result of glycyrrhetinic acid before the reaction is shown. The peak of the white arrow indicates glycyrrhetinic acid.
  • C The detection result of glycyrrhetinic acid monoglucuronide after the reaction is shown. The peak of the black arrow indicates glycyrrhetinic acid monoglucuronide. The dashed arrow indicates the peak occurrence position when glycyrrhetinic acid monoglucuronide is produced.
  • the peak of the black arrow indicates soyasapogenol B monoglucuronide.
  • D The detection result of Soyasapogenol B monoglucuronide produced by Lj3g3v1981230 derived from Lotus japonicus is shown. The peak of the black arrow indicates soyasapogenol B monoglucuronide.
  • E The negative controls of (b) to (d) above. It is a figure which shows the LC-PDA / MS / MS analysis result of the Glyma.06G324300 homologous gene function-deficient mutant extract of Lotus japonicus.
  • (A) shows the base peak ion chromatogram of the plant extract derived from the wild type (Gifu), and (b) and (c) show the plant extract derived from the transposon-inserted homozygous mutant (30006020, 30115796, respectively). It is a figure which shows the LC-PDA / MS / MS analysis result of the Glyma.06G324300 homologous gene function-deficient mutant extract of Lotus japonicus.
  • (A) shows the total ion chromatogram of the plant extract derived from the wild type (Gifu), and (b) and (c) show the plant extract derived from the transposon-inserted homozygous mutant (30006020, 30115796, respectively).
  • Sample Q in (a) is the AsCSyGT gene, which is a Glyma.06G324300 ortholog gene derived from astragalus
  • Sample R in (b) is a Glyma04g255400 gene, which is a Glyma.06G324300 paralog gene derived from soybean
  • Sample S in (c) is soybean.
  • This is the detection result of glycyrrhetinic acid monoglucuronide produced by expressing the Glyma.11g151800 gene, which is the derived Glyma.06G324300 paralog gene, in glycyrrhetinic acid-producing yeast.
  • the peak of the black arrow indicates glycyrrhetinic acid monoglucuronide.
  • 11g151800 gene transfer yeast derived from soybean which fed betulinic acid (A) It is a conceptual diagram of a possible conversion reaction to betulinic acid monoglucuronide when using Glyma.11g151800 feeding assay extract (sample Y). (B) The detection result of betulinic acid monoglucuronide produced by Glyma.11 g151800 when sample Y is added is shown. The peak of the black arrow indicates betulinic acid monoglucuronide. (C) The detection result of monoglucuronide betulinate when the negative control sample Z is added is shown.
  • a first aspect of the present invention relates to a glucuronic acid first transferase and a fragment thereof having a glucuronic acid first transfer activity, and a nucleic acid encoding them.
  • the first glucuronic acid transferase of the present invention is obtained from ⁇ -amyrin, which can be biosynthesized by many plants, through a two-step oxidation reaction from ⁇ -amyrin in a synthetic pathway peculiar to the genus Licorice that biosynthesizes glycyrrhizin.
  • the first glucuronic acid transfer enzyme of the present invention can not only transfer glucuronic acid to the hydroxyl group at the 3-position of oleanane-type triterpenoids such as glycyrrhetinic acid, but also participate in the biosynthetic pathway from ⁇ -amyrin to glycyrrhizin.
  • oleanane-type triterpenoids such as glycyrrhetinic acid
  • glucuronic acid first transferase (CSyGT)
  • CSyGT glucuronic acid first transferase
  • first as used herein means that the oleanane-type triterpenoid has the first glycosyl transfer activity in a two-step transglycosylation reaction at the hydroxyl group at the 3-position. The specific composition of the first glucuronic acid transferase will be described later.
  • fragment thereof having glucuronic acid first transferase activity refers to an active fragment of the glucuronic acid first transferase.
  • glucuronic acid first transfer activity refers to the activity of catalyzing the glycosyl transfer reaction of CSyGT, that is, the activity of transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 3-position of the oleanane-type triterpenoid. This activity produces the oleanane-type triterpenoid monoglucuronide from the oleanane-type triterpenoid.
  • CSyGT and fragments thereof having glucuronic acid first transferase activity are collectively referred to as "polypeptide having glucuronic acid first transferase activity" or "glucuronic acid first transferase etc. (CSyGT etc.)". write.
  • the glucuronic acid first transferase or the like may be a glycoprotein to which a different sugar chain is added.
  • the glucuronic acid first transferase to which a plant-derived sugar chain is added the glucuronic acid first transferase to which a yeast-derived sugar chain is added, and the like are all glucuronic acid first transferases and the like in the present specification. include.
  • Oleanane-type triterpenoid refers to a C30 isoprenoid having a pentacyclic oleanane skeleton and consisting of 6 isoprene units. It corresponds to the non-sugar portion (aglycone) of glycyrrhizin, which is the final object in the present invention.
  • the oleanane-type triterpenoid described in the present specification means an oleanane-type triterpenoid having a hydroxyl group (OH group) at the carbon at the 3-position.
  • oleanane-type triterpenoids include, but are not limited to, ⁇ -amyrin, 11-oxo- ⁇ -amylin, 30-hydroxy-11-oxo- ⁇ -amylin, 30-hydroxy- ⁇ -amylin, and 24-hydroxy- ⁇ .
  • the legume (Fabaceae) plant is not limited to the licorice genus plant, and includes all plant species belonging to the legume family in terms of plant taxonomy.
  • Specific examples of licorice plants include G. glabra, G. inflata, G. aspera, G. eurycarpa, and G. pallidiflora (G. Paridiflora), G. yunnanensis (G. yunnanensis), G.
  • lepidota G. lepidota
  • G. echinata G. echinata
  • G. acanthocarpa G. licorice carpa
  • M. truncatula M. licorice; Medicago truncatula
  • the first glucuronic acid transferase (CSyGT) of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5.
  • These polypeptides are wild-type CSyGT (GmCSyGT) from soybean (Glycine max), wild-type CSyGT (GuCSyGT) from licorice (G. uralensis), and wild-type CSyGT (GuCSyGT) from Lotus japonicus, respectively.
  • GmCSyGT wild-type CSyGT
  • GuCSyGT from licorice
  • LjCSyGT derived from Lotus japonicus has 82% amino acid identity with that of GmCSyGT derived from soybean.
  • CSyGT may have orthologs in many other plant species other than the above-mentioned plant species, especially in the legume (Fabaceae) plant species.
  • the CSyGT of the present invention also includes allogeneic wild-type CSyGT paralogs and mutant CSyGT having glucuronic acid first transfer activity.
  • wild type CSyGT orthologs and mutant CSyGT an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5.
  • GuCSyGT and LjCSyGT are CSyGT orthologs of licorice and Lotus japonicus, respectively, as opposed to soybean GmCSyGT, but have amino acid identity of 80% or more as described above.
  • the mutant CSyGT having the first glucuronic acid transfer activity is not limited, and specific examples thereof include splicing variants and mutants based on SNPs and the like.
  • amino acid identity means that in the amino acid sequences of the two polypeptides to be compared, a gap is appropriately inserted in one or both of them as necessary so as to maximize the number of matching amino acid residues.
  • the ratio (%) of the number of matching amino acid residues to the total number of amino acid residues when aligned. Alignment of two amino acid sequences to calculate amino acid identity can be performed using known programs such as Blast, FASTA, and Clustal W.
  • substitution (of amino acids) refers to a group of conservative amino acids having similar properties such as charge, side chain, polarity, and aromaticity among the 20 amino acids that make up a natural protein. Refers to replacement. For example, a group of uncharged polar amino acids (Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr) having a low side chain, a group of branched amino acids (Leu, Val, Ile), and a group of neutral amino acids (Gly, Ile).
  • the "active fragment thereof" refers to a polypeptide fragment containing a part of the glucuronic acid first transferase and retaining the glucuronic acid first transferase activity.
  • a polypeptide fragment containing a substrate binding site of glucuronic acid first transferase can be mentioned.
  • the substrate of the first glucuronic acid transferase of the present invention include the above-mentioned oleanane-type triterpenoid. Glycyrrhetinic acid is preferable.
  • the length of the amino acids of the polypeptide constituting the active fragment is not particularly limited.
  • it may be a continuous region of at least 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 or 150 amino acids.
  • CSyGT and its active fragments are often collectively referred to as "CSyGT or the like (glucuronic acid first transferase, etc.)".
  • oleanane-type triterpenoid monoglucuronide can be obtained by glycosyl-transferring glucuronic acid to the hydroxyl group at the 3-position by glucuronic acid first transfer activity using oleanane-type triterpenoid as a glycosyl acceptor substrate. ..
  • ⁇ -amyrin can be biosynthesized by many plant species other than licorice, an in vivo synthetic system using common plant species as a host is also possible. Furthermore, if the organism does not contain ⁇ -amyrin but can biosynthesize the precursor of ⁇ -amyrin, by using it together with the gene that biosynthesizes ⁇ -amyrin, even organisms other than plants can host them in vivo. A synthetic system is also possible.
  • a second aspect of the present invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide (CSyGT, etc.) according to the first aspect, that is, a glucuronic acid first transferase gene and an active fragment thereof.
  • the polynucleotide of the present invention enables the construction of the recombinant vector of the third aspect described later.
  • the “glucuronic acid first transferase gene” (often referred to herein as the “CSyGT gene”) refers to the polynucleotide encoding the CSyGT described in the first aspect. As long as it is a polynucleotide encoding CSyGT, its base sequence is not particularly limited. Preferably, it is a polynucleotide encoding a wild-type CSyGT containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5.
  • a polynucleotide encoding a soybean-derived wild-type GmCSyGT consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 specifically, for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, that is, a soybean-derived wild-type GmCSyGT gene.
  • SEQ ID NO: 1 specifically, for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, that is, a soybean-derived wild-type GmCSyGT gene.
  • SEQ ID NO: 3 specifically, for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, that is, a wild-type GuCSyGT gene derived from licorice.
  • a polynucleotide encoding a wild-type LjCSyGT derived from Miyakogusa consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 that is, a wild-type LjCSyGT gene derived from Miyakogusa.
  • CSyGT gene is a polynucleotide containing a base sequence in which one or more bases of the wild-type CSyGT gene are deleted, substituted or added.
  • a wild-type GmCSyGT gene derived from soybean for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • a wild-type GuCSyGT gene derived from Kanzo for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4).
  • Bases in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence of either the nucleotide) or the wild-type LjCSyGT gene derived from Miyakogusa for example, a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6).
  • a polynucleotide containing a sequence for example, a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Polynucleotides can be mentioned. Specifically, for example, a wild-type GmCSyGT gene derived from soybean (for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2) and a wild-type GuCSyGT gene derived from Kanzo (for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4).
  • nucleotide sequence and the nucleotide sequence of either the wild-type LjCSyGT gene derived from Miyakogusa (for example, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6) and 80% or more, 85% or more, 87% or more, 90% or more, Examples thereof include polynucleotides containing a base sequence having a base identity of 95% or more, or 99% or more and less than 100%.
  • nucleotide that retains enzymatic activity with a polynucleotide containing a nucleotide sequence that hybridizes under highly stringent conditions with a nucleotide fragment consisting of a nucleotide sequence complementary to the partial nucleotide sequence of the wild-type CSyGT gene.
  • the "stringent condition” means a condition in which a non-specific hybrid is unlikely to be formed.
  • the “high stringent condition” refers to a condition in which a non-specific hybrid is less likely to be formed or is not formed.
  • the lower the salt concentration and the higher the temperature the higher the stringent conditions.
  • the conditions are, for example, washing at 50 ° C. to 70 ° C., 55 ° C. to 68 ° C., or 65 ° C. to 68 ° C. with 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS.
  • other conditions such as probe concentration, probe base length, and hybridization time can be appropriately combined to increase the stringency of hybridization.
  • the "active fragment thereof” refers to a fragment of the CSyGT gene in which the polypeptide encoded by the fragment has CSyGT activity.
  • the polynucleotide encoding the active fragment of CSyGT according to the first aspect is applicable. Therefore, the length of the base sequence of the polynucleotide constituting the active fragment, that is, the number of bases may be three times the number of amino acid sequences in the active fragment of CSyGT according to the first aspect.
  • a recombinant vector capable of expressing CSyGT and the active fragment thereof in a host cell can be constructed.
  • CSyGT gene and its active fragments are often collectively referred to as "CSyGT gene, etc. (glucuronic acid first transferase gene, etc.)".
  • the CSyGT gene and the like of this embodiment can be isolated from a suitable plant, for example, a legume by a known method.
  • a primer pair having an appropriate nucleotide sequence length is designed based on the nucleotide sequence of the wild-type GmCSyGT gene derived from soybean shown in SEQ ID NO: 2.
  • the primer pairs shown in SEQ ID NOs: 17 and 18 can be mentioned.
  • the GmCSyGT gene can be obtained by performing a nucleic acid amplification reaction such as PCR using a nucleic acid derived from a soybean DNA library or a genomic DNA library as a template using the pair.
  • polynucleotide of the present invention can be obtained by hybridization from the library or the like using a nucleic acid fragment consisting of a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a probe.
  • a nucleic acid fragment consisting of a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a probe.
  • a third aspect of the present invention relates to a recombinant vector.
  • the recombinant vector of the present invention contains the polynucleotide described in the second aspect, and can clone the CSyGT gene or the like or express CSyGT or the like in a host cell.
  • a CSyGT expression vector expressing CSyGT or the like is particularly preferably applied.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed by introducing the polynucleotide described in the second aspect into an appropriate recombinant vector.
  • the type of vector is not particularly limited.
  • a vector for cloning (transformation), gene expression, etc. may be appropriately selected depending on the purpose or the host into which the vector is introduced.
  • Vectors for plant transformation or (gene) expression vectors are particularly preferred.
  • the "(gene) expression vector” is a gene expression system capable of transporting a polynucleotide encoding an encapsulated polypeptide into a target plant cell to express the polypeptide.
  • an expression vector using a plasmid or a virus can be mentioned.
  • a CSyGT expression vector that expresses CSyGT or the like incorporating a CSyGT gene or the like is applicable.
  • the plasmid is not limited, but for example, pPZP system, pSMA system, pUC system, pBR system, pBluescript system (Agilent Technologies). , PTriEX TM system (TaKaRa company), or pBI system, pRI system, pGW system binary vector, etc. can be used.
  • virus expression vector cauliflower mosaic virus (CaMV), green beans golden mosaic virus (BGMV), tobacco mosaic virus (TMV), etc. are used as the virus. can do.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • BGMV green beans golden mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • the recombinant vector contains a promoter and terminator expression regulatory region.
  • an enhancer a poly A addition signal, a 5'-UTR (untranslated region) sequence, a labeled or selective marker gene, a multicloning site, a replication origin, and the like can also be included.
  • Each type is not particularly limited as long as it can exert its function in the host cell. Those known in the art may be appropriately selected depending on the host to be introduced.
  • the host is a plant cell or a plant.
  • promoter various promoters, for example, overexpressing promoters, constitutive promoters, site-specific promoters, time-specific promoters, and / or inducible promoters can be used.
  • overexpressing and constitutive promoters that can operate in plant cells include the 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus (CaMV), the promoter Pnos of the noparin synthase gene derived from Ti plasmid, the ubiquitin promoter derived from corn, and the rice-derived promoter. Actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter and the like.
  • a small subunit (Rubisco ssu) promoter of ribulose diphosphate carboxylase of various plant species, or a histone promoter can also be used.
  • the maltogenic amylase gene of Bacillus stearothermophilus the ⁇ -amylase gene of Bacillus licheniformis (B. licheniformis), and Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) ) BAN amylase gene, Bacillus subtillis (B. subtillis) alkaline protease gene or Bacillus pumilus (B. pumilus) xylosidase gene promoter, or phage lambda PR or PL promoter, Escherichia coli lac, trp or tac promoter, etc. Can be mentioned.
  • promoters that can operate in yeast host cells include promoters derived from yeast glycolytic genes, alcohol dehydrogenase gene promoters, TPI1 promoters, ADH2-4c promoters and the like.
  • fungal-operable promoters include ADH3 promoter, tpiA promoter and the like.
  • promoters that can be activated in animal cells include the SV40 early promoter, SV40 late promoter, and CMV promoter.
  • promoters that can be activated in insect cells are the polyhedrin promoter, the P10 promoter, and the baculovirus Autographa californica polyhedrosis. -Calihornica polyhedrosis) basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, baculovirus 39K delayed early gene promoter and the like.
  • Terminators include, for example, nopaline synthase (NOS) gene terminator, octopine synthase (OCS) gene terminator, CaMV 35S terminator, Escherichia coli lipopolyprotein lpp 3'terminator, trp operon terminator, amyB terminator, ADH1 gene terminator. And so on.
  • NOS nopaline synthase
  • OCS octopine synthase
  • CaMV 35S terminator CaMV 35S terminator
  • Escherichia coli lipopolyprotein lpp 3'terminator trp operon terminator
  • amyB terminator ADH1 gene terminator.
  • ADH1 gene terminator ADH1 gene terminator.
  • the sequence is not particularly limited as long as it is a sequence capable of terminating the transcription of the gene transcribed by the promoter.
  • an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter can be mentioned.
  • an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter can be mentioned.
  • the expression efficiency of the nucleic acid encoding the active peptide can be enhanced.
  • Selection marker genes include drug resistance genes (eg, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, canamycin resistance gene, hyglomycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, or neomycin resistance gene), fluorescence, or Luminescent reporter genes (eg, luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase (GUS), or green fluorescence protein (GFP)), neomycin phosphotransferase II (NPT II), dihydrofolate reductase and other enzyme genes can be mentioned.
  • drug resistance genes eg, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, canamycin resistance gene, hyglomycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, or neomycin resistance gene
  • fluorescence eg, luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase (GUS
  • the manipulation and / or expression of the polynucleotide according to the second aspect can be easily controlled, and the expression of CSyGT or the like in the host cell can be manipulated.
  • a fourth aspect of the present invention relates to a transformant or its progeny.
  • the transformant or its progeny of the present invention contains the polynucleotide described in the second aspect or the recombinant vector described in the third aspect in the cell, and clones the CSyGT gene or the like and / or expresses CSyGT or the like. can do.
  • composition refers to a host transformed by the introduction of the polynucleotide described in the second aspect or the recombinant vector described in the third aspect.
  • the host to be transformed is not particularly limited.
  • bacteria such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, such as budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) or methanol assimilating yeast (Pichia pastoris), aspergillus.
  • Fungi such as (Aspergillus), Aspergillus, Neurospora, Fuzarium or Trichoderma, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants, or plant cells, mammalian cells, or insect cells (eg, sf9, or sf21).
  • It is preferably a legume or yeast.
  • the transformant of the present invention includes clones having the same genetic information.
  • the host is an asexually reproducing unicellular microorganism such as Escherichia coli or yeast
  • a clone newly generated from the first generation of the transformant by division or budding is also included in the transformant of the present invention.
  • the host is a plant
  • a part of the plant collected from the first generation of the transformant for example, a plant tissue such as epidermis, master, soft tissue, wood or rhizome, leaves, petals, stems.
  • Plant organs such as roots or seeds, or clones obtained from plant cells by plant tissue culture, cuttings, grafting or cuttings, or transformants such as rhizomes, lump roots, bulbs, runners, etc. New clones newly generated from the vegetative reproduction organ obtained by asexual reproduction are also included in the transformants of the present invention.
  • the transformant of the present invention may further have one or more other polynucleotides or other recombinant vectors in addition to the polynucleotide described in the second aspect or the recombinant vector described in the third aspect. ..
  • the term "other polynucleotide” as used herein refers to a polynucleotide other than the polynucleotide described in the second aspect.
  • the other recombinant vector refers to a recombinant vector other than the recombinant vector described in the third aspect.
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing the above-mentioned polynucleotide or recombinant vector into an appropriate host.
  • a method for introducing the polynucleotide or recombinant vector a method known in the art, for example, an Agrobacterium method, a PEG-calcium phosphate method, an electroporation method, a liposome method, a particle gun method, or a microinjection method can be used. it can.
  • the introduced polynucleotide may be integrated into the genomic DNA of the host or may be present in the state of the introduced polynucleotide (eg, as it is contained in a foreign vector).
  • the introduced polynucleotide may continue to be maintained in the host cell as if it had been integrated into the host's genomic DNA, or it may be transiently retained.
  • the presence or absence of introduction of the desired polynucleotide is determined by the PCR method, the Southern hybridization method, or the Northern hybridization method. , In situ hybridization and the like.
  • the "host” is a progeny of the first generation of the transformant via sexual reproduction, and is the polynucleotide described in the second aspect of the present invention or the recombination described in the third aspect. It means a host that holds the vector in an expressible state. Preferably, it refers to a host progeny that retains the polynucleotide described in the second aspect of the polynucleotide or the recombinant vector in an expressible state. For example, when the transformant is a plant, the seedling of the transformant is applicable. It doesn't matter what the next generation is.
  • the oleanane-type triterpenoid existing in the host cell can be converted to the oleanane-type triterpenoid monoglucuronide by enhancing the expression of the introduced polynucleotide.
  • a glucuronic acid first transferase to which a different sugar chain is added can be obtained.
  • the host of the transformant is yeast, unlike the case where a legume is used as a host, glucuronic acid first transferase to which a high mannose type sugar chain is added is expressed. This is because the glycosylation reaction in yeast is different from that in plants (Strasser R. Glycobiology, 2016, 26 (9): 926-939).
  • Method for producing glucuronic acid first transferase and its active fragment (CSyGT, etc.) 5-1.
  • the transformant or the progeny of the fourth aspect is cultured, and the polypeptide having the first glucuronic acid transfer activity according to the first aspect, that is, CSyGT or the like, is obtained from the culture.
  • the present invention relates to a manufacturing method such as CSyGT including extraction. According to the method for producing a polynucleotide of the present invention, it is possible to stably obtain a large amount of CSyGT or the like by using the host as a biological production system.
  • the production method of the present invention includes a culture step and an extraction step as essential steps. Hereinafter, each step will be specifically described.
  • the “culturing step” is a step of culturing the transformant or the progeny of the fourth aspect.
  • the transformant or progeny used in the present invention it is preferable to use a transformant or progeny capable of overexpressing or constitutively expressing the polypeptide according to the first aspect.
  • the recombinant vector is an expression vector containing an overexpressing promoter or a constitutive promoter.
  • the transformant of the fourth aspect or its progeny may be any host, but is preferably a legume or yeast. By changing the host, a glycoprotein to which a different sugar chain is added can be obtained even if the first glucuronic acid transferase described in the same first aspect is expressed.
  • a medium suitable for culturing the host may be appropriately used.
  • a medium known in the art can be used.
  • a medium for culturing a bacterium such as Escherichia coli as a host, LB medium or M9 medium, etc.
  • yeast when culturing yeast as a host, YPD medium, YPG medium, YPM medium, YPDM medium, etc. , SMM medium, etc.
  • suitable culture medium and medium for hydroponic cultivation can be mentioned.
  • the medium is a carbon source (for example, glucose, glycerin, mannitol, fructose, lactose, etc.), a nitrogen source (for example, inorganic nitrogen such as ammonium sulfate, ammonium chloride, etc., casein decomposition product, yeast extract, polypeptone, bactotripton, beef extraction).
  • Organic nitrogen sources such as substances
  • inorganic salts for example, sodium diphosphate, potassium diphosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride, etc.
  • vitamins vitamin B1, etc.
  • drugs ampicillin, tetracycline, canamycin, etc.
  • Antibiotics and the like are appropriately contained.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they are suitable for the expression of the polynucleotide, but are usually aerated, irradiated, and / or stirred at temperatures of 10 to 45 ° C, 15 to 40 ° C, and 18 to 37 ° C as necessary. Incubate for several hours to several hundred hours.
  • the “extraction step” is a step of extracting CSyGT or the like from the culture obtained in the culture step.
  • culture refers to a culture supernatant or a cultured transformant. Not only the intracellular of the transformant but also the content supernatant may contain CSyGT and the like secreted from the transformant.
  • the polypeptide present in the culture may be extracted by a known method and purified if necessary.
  • solvent extraction method, salting out method, solvent precipitation method, dialysis method, ultrafiltration method, gel electrophoresis method, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, etc. can be performed alone.
  • the desired polypeptide can be obtained by appropriately combining them.
  • the method of Hayashi et al. Hayashi et al., 1996, Phytochemistry, 42: 665-666
  • Noguchi et al. Noguchi et al.
  • the expression polypeptide of the present invention has a high mannose-type sugar chain added, so that a mannose-binding lectin (for example, UDA lectin, BC2L-A) is added. It can also be extracted and purified using a lectin or the like).
  • a mannose-binding lectin for example, UDA lectin, BC2L-A
  • a sixth aspect of the present invention is a genetically modified product for producing glycyrrhizin.
  • the gene recombinant of the present invention catalyzes a set of enzymes required for the biosynthetic pathway from ⁇ -amylin to glycyrrhizin in plants of the genus Licorice, namely, a two-step oxidation reaction and a two-step glycation reaction.
  • the gene recombinant of the present invention can biosynthesize glycyrrhizin from ⁇ -amyrin in living cells, whereby it can be used as a biological production system for glycyrrhizin.
  • the genetic recombinants of the present invention are characterized by the fact that they contain a set of 4 types of enzymes required for the biosynthetic pathway from ⁇ -amyrin to glycyrrhizin and / or their active fragments in host cells. It contains at least an expression vector containing the encoding polynucleotide. If necessary, an expression vector containing a polynucleotide encoding the ⁇ -amyrin synthase gene may be further included.
  • the four enzymes are polypeptides that catalyze the first-stage and second-stage oxidation reactions of ⁇ -amyrin, the first-stage glycation reaction and the second-stage glycation reaction of oleanane-type triterpenoids.
  • Expression vectors containing each enzyme or an active fragment thereof are shown in (1) to (4) below, and will be specifically described. In (1) to (4), the four types of expression vectors are described separately, but the genes of each enzyme may be contained in different expression vectors or the same expression vector. May be contained in two or more types.
  • CYP88D6 expression vector is a polypeptide having an activity of oxidizing the 11th position of an oleanane-type triterpenoid, that is, CYP88D6 and an active fragment thereof (often referred to as "CYP88D6 etc.” in the present specification). It contains a gene encoding and a fragment thereof (often referred to herein as "CYP88D6 gene, etc.”). Therefore, CYP88D6 and the like are expressed by the CYP88D6 expression vector in the recombinant body.
  • CYP88D6 include, but are not limited to, CYP88D6 derived from licorice (G. uralensis) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. Further, it is composed of an amino acid sequence having the activity of the first stage of oxidation and in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. Polypeptides consisting of amino acid sequences having 80% or more identity are also exemplified.
  • the 11-position thereof is oxidized mainly by using endogenous or extrinsic ⁇ -amyrin as a substrate by the catalytic activity of CYP88D6 expressed from the CYP88D6 expression vector.
  • 30-hydroxy-11-oxo- ⁇ -amyrin can be produced by oxidizing the 11th position using 30-hydroxy- ⁇ -amyrin as a substrate.
  • 11-deoxoglycyrrhetinic acid can be used as a substrate and its 11-position can be oxidized to produce glycyrrhetinic acid.
  • composition of the plasmid region in the CYP88D6 expression vector conforms to the expression vector in the recombinant vector described in the third aspect. Further, the recombinant vector described in Japanese Patent No. 5526323 may be used.
  • CYP72A154 expression vector is a polypeptide having an activity of oxidizing the 30th position in an oleanane-type triterpenoid, that is, CYP72A154 and an active fragment thereof (often referred to as "CYP72A154 etc.” in the present specification). It contains a gene encoding and a fragment thereof (often referred to herein as "CYP72A154 gene, etc.”). Therefore, CYP72A154 and the like are expressed by the CYP72A154 expression vector in the recombinant body.
  • CYP72A154 include, but are not limited to, CYP72A154 derived from G. uralensis consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and CYP72A154 derived from G. glabra consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11. , And CYP72A63 derived from Medicago truncatula consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • amino acid sequence having the activity of the second stage of oxidation and having one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 9, 11 and 13 is composed of, or Also exemplified are polypeptides consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 9, 11, and 13.
  • ⁇ -amyrin and 11-oxo- ⁇ -amyrin are mainly used as substrates, and the 30th position thereof is used due to the catalytic activity of CYP72A154 etc. expressed from the CYP72A154 expression vector. It can be oxidized to produce 30-hydroxy- ⁇ -amyrin and 30-hydroxy-11-oxo- ⁇ -amyrin, respectively. Further, using 30-hydroxy-11-oxo- ⁇ -amyrin as a substrate, the 30-position thereof can be further oxidized to produce glycyrrhetinic acid.
  • composition of the plasmid region in the CYP72A154 expression vector conforms to the expression vector in the recombinant vector described in the third aspect. Further, the recombinant vector described in Japanese Patent No. 5771846 may be used.
  • UGT73P12 recombinant vector is a polypeptide that transfers glucuronic acid to the hydroxy group at the 2-position of glucuronic acid in the oleanane-type triterpenoid monoglucuronide, that is, UGT73P12 and an active fragment thereof (the present specification). Contains a gene encoding (often referred to as "UGT73P12, etc.") and a fragment thereof (often referred to herein as "UGT73P12, etc.”). Therefore, UGT73P12 and the like are expressed by the UGT73P12 expression vector in the recombinant body.
  • UGT73P12 examples include, but are not limited to, UGT73P12 derived from licorice (G. uralensis) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15. Further, the amino acid sequence having the second-stage glycosylation activity and consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 Polypeptides consisting of amino acid sequences having 80% or more identity are also exemplified.
  • composition of the plasmid region in the UGT73P12 expression vector conforms to the expression vector in the recombinant vector described in the third aspect. Further, the recombinant vector described in Japanese Patent No. 6344774 may be used.
  • the "glycyrrhetinic acid production gene recombinant" of the present invention is a transformant into which an expression vector containing at least the above four enzyme gene groups has been introduced, or a gene group thereof.
  • the successor to hold. Therefore, the basic composition may be the same as that of the transformant and its progeny according to the fourth aspect, except that the type of expression vector to be included is different.
  • the present invention is a gene recombinant capable of biosynthesizing glycyrrhizin from ⁇ -amyrin in cells, it is a host capable of biosynthesizing ⁇ -amyrin, which is a starting material in the biosynthesis system, in cells. Is preferable.
  • the biosynthesis of ⁇ -amyrin in the host may be based on an endogenous synthetic system or an extrinsic synthetic system. Since ⁇ -amyrin, which is an oleanane-type triterpenoid, can be biosynthesized by many plants, the host of the present invention is preferably a plant based on an endogenous synthetic system.
  • it is a plant species having high ⁇ -amyrin synthesizing ability, vigorous fertility, and easy to grow. More preferably, it is a plant relatively closely related to licorice, that is, a legume. For example, a species belonging to the genus Grikiliza, a species belonging to the genus Soybean, a species belonging to the genus Lotus japonicus and the like can be mentioned.
  • the host itself may be a species that cannot biosynthesize ⁇ -amyrin.
  • a transformant of the yeast can be used as a host capable of intracellular biosynthesis of ⁇ -amyrin.
  • a seventh aspect of the present invention is a method for producing glycyrrhizin.
  • the production method of the present invention is characterized in that glycyrrhizin is produced from ⁇ -amyrin by using the gene recombinant for producing glycyrrhizin according to the sixth aspect as a biological production system. According to the production method of the present invention, glycyrrhizin, which has been expensive in the past, can be stably produced in large quantities without relying on extraction from licorice.
  • the production method of the present invention includes a culturing step as an essential step and an "extraction step” as a selection step.
  • Culturing Step The “culturing step” in this aspect may basically follow the culturing step described in the fifth aspect.
  • the genetically modified product is a plant
  • a method for culturing a known conditional plant may be applied.
  • glycyrrhizin is produced in the gene recombinant for producing glycyrrhizin according to the sixth aspect.
  • Extraction Step The “extraction step” in this aspect may basically follow the extraction step described in the fifth aspect.
  • the recombinant is a plant, the same method as for extracting glycyrrhizin from licorice can be used.
  • glycyrrhizin can be stably produced in large quantities from various gene recombinants without relying on extraction from licorice.
  • Example 1 Isolation of soybean-derived cellulose synthase-like gene Glyma.06G324300> The seeds of the soybean (Glycine max) variety "Williams 82" cultivated in the greenhouse during ripening were collected. Total RNA was prepared using the RNA extraction reagent RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) according to the attached protocol. Using 200 ng of the obtained total RNA, fast-strand cDNA was synthesized using the QuantiTech Reverse Transcription Kit (QIAGEN) according to the attached protocol.
  • QIAGEN QuantiTech Reverse Transcription Kit
  • the oligo DNAs at the locations corresponding to the N-terminal and C-terminal of the polypeptide estimated from Glyma.06G324300 were used as a forward primer (SEQ ID NO: 17) and a reverse primer (SEQ ID NO: 17), respectively.
  • SEQ ID NO: 17 a forward primer
  • SEQ ID NO: 17 a reverse primer
  • 30 cycles of PCR were performed using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio Co., Ltd.) at an annealing temperature of 55 ° C. and a reaction temperature of 68 ° C.
  • the forward primer has 12 bases (AAAAAGCAGGCT) at the 5'end. ), And 12 bases (AGAAAGCTGGGT) are artificially added to the reverse primer at the 5'end.
  • a DNA fragment amplified from seed-derived fast-strand cDNA was cloned into pDONR TM 221 by a nucleotide sequence-specific recombination reaction (GATEWAY attB x attP reaction) using Gateway BP Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher Technologies). The polynucleotide sequences of the three independent clones obtained were determined. The sequence thus obtained was SEQ ID NO: 2, and the polypeptide sequence deduced from it was SEQ ID NO: 1.
  • Example 2 Search for licorice-derived Glyma.06G324300 homologous gene> Glyma.06G324300 homologous gene was searched as an ortholog gene candidate of Glyma.06G324300 by gene homology search from licorice (Glycyrrhiza uralensis), which is the same legume as soybean and is known to biosynthesize glycyrrhizin.
  • Glyma.06G324300 using the BLAST homology search function in Glycyrrhiza uralensis GDB (http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/index.pl), which is a genome information database of licorice.
  • Glyur003152s00037491 that encodes a protein that exhibits high amino acid identity.
  • the polypeptide inferred from Glyur003152s00037491 showed 81% amino acid identity to Glyma.06G324300.
  • RNA was prepared from licorice root using the RNA extraction reagent PureLink Plant RNA Reagent (Thermo Fisher Scientific). Using 1 ⁇ g of the obtained total RNA, fast-strand cDNA synthesis was performed using the SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) according to the attached protocol.
  • oligo DNA at the N-terminal and C-terminal parts of the polypeptide estimated from Glyur003152s00037491 was used as the forward primer (SEQ ID NO: 19) and reverse primer (SEQ ID NO: 20), respectively, and PrimeSTAR Max. 30 cycles of PCR were performed using DNA Polymerase (Takara Bio) at an annealing temperature of 55 ° C and a reaction temperature of 72 ° C. Since it is necessary for cloning into the pENTR TM / D-TOPO (registered trademark) entry vector (Thermo Fisher Technologies), 4 bases (cacc) are artificially added to the 5'end of the forward primer. ing.
  • the amplified DNA fragment was cloned into the pENTR TM / D-TOPO entry vector, and the four independent clones obtained were sequenced.
  • the nucleotide sequence of the Glyma.06G324300 homologous gene of licorice obtained thereby is SEQ ID NO: 4, and the polypeptide sequence deduced from it is SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 had 82% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Example 4 Search for Lotus japonicus-derived Glyma.06G324300 homologous gene> The Glyma.06G324300 homologous gene was searched for as a candidate for the Glyma.06G324300 ortholog gene derived from Lotus japonicus by the same method as in Example 2. High amino acid identity to Glyma.06G324300 using the BLAST homology search function in Miyakogusa.jp (http://www.kazusa.or.jp/lotus/release1/index.html), which is the genome information database of Lotus japonicus. We found one base sequence Lj3g3v1981230 encoding a protein showing the above. The polypeptide estimated from Lj3g3v1981230 showed 81.4% amino acid identity to Glyma.06G324300.
  • Example 5 Isolation of Glyma.06G324300 homologous gene derived from Lotus japonicus> Using 1 ⁇ g of total RNA obtained from Lotus japonicus, fast-strand cDNA was synthesized using the SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) according to the attached protocol. Using 2 ⁇ l of first-strand cDNA as a template, oligo DNA at the N-terminal and C-terminal of the polypeptide estimated from Lj3g3v1981230 was used as the forward primer (SEQ ID NO: 37) and reverse primer (SEQ ID NO: 38), respectively, and PrimeSTAR Max.
  • SEQ ID NO: 37 forward primer
  • SEQ ID NO: 38 reverse primer
  • SEQ ID NO: 6 The nucleotide sequence of the Lotus japonicus Glyma.06G324300 homologous gene thus obtained is SEQ ID NO: 6, and the polypeptide sequence deduced from it is SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 5 had 82% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Example 6 Construction of destination vector for yeast expression>
  • 06G324300 and its homologous proteins isolated in Examples 1, 3 and 5 an expression vector for each protein was constructed using a yeast expression system.
  • the yeast (Saccharomyces cerevisiae) INVSc1 strain used does not contain UDP-glucuronic acid, which is a sugar donor substrate, in the glycation reaction expected in the candidate gene product. Therefore, the UDP-glucose dehydrogenase (UGD) gene, which synthesizes UDP-glucuronic acid using UDP-glucose in yeast as a substrate, was introduced into a destination vector for yeast expression.
  • UDP-glucose dehydrogenase (UGD) gene which synthesizes UDP-glucuronic acid using UDP-glucose in yeast as a substrate, was introduced into a destination vector for yeast expression.
  • the oligo DNA at the N-terminal and C-terminal of the polypeptide is used as a forward primer (SEQ ID NO: 21) and a reverse primer (SEQ ID NO: 22), respectively.
  • SEQ ID NO: 21 a forward primer
  • SEQ ID NO: 22 a reverse primer
  • 30 cycles of PCR were performed at an annealing temperature of 55 ° C and a reaction temperature of 72 ° C.
  • the forward primer contains 15 bases upstream of the cloning position of the destination vector and 4 bases (aaaa) at the 5'end of the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 23 (gggcggccgcactag). A total of 19 bases are artificially added. Further, in the reverse primer, 15 bases downstream of the cloning position of the destination vector are added to the 3'end of the polynucleotide shown by SEQ ID NO: 24 (atccatcgatactag).
  • SpeI is a destination vector pESC-HIS-GW made by introducing Gateway cassette A (Thermo Fisher Technologies) into the SrfI restriction enzyme site in MCS2 of the pESC-HIS® yeast expression vector (Agilent Technologies). Treat with restriction enzymes, mix with DNA fragments amplified from cDNA, and use In-Fusion® HD Cloning Kit (Takara Bio) to extract the DNA fragment shown by SEQ ID NO: 25 in pESC-HIS-GW. It was introduced into MCS1 to obtain the destination vector pESC-HIS-AtUGD2-GW.
  • Gateway cassette A Thermo Fisher Technologies
  • Example 7 Construction of yeast expression clone> The plasmid (entry clone) having the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 prepared in Example 1 and the destination vector pESC-HIS-AtUGD2-GW prepared in Example 6 were mixed, and Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher) was mixed.
  • yeast expression vector pESC- of the gene shown in SEQ ID NO: 2 HIS-AtUGD2-Glyma.06 G324300 was obtained.
  • yeast expression vectors pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491 and pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230 of the genes shown in SEQ ID NOs: 4 and 6 prepared in Examples 3 and 5 were obtained by the same method as above.
  • ⁇ Example 8 Introduction into yeast strains producing glycyrrhetinic acid and soyasapogenol B> Expression vector of Lotus japonicus ⁇ -amylin synthase (LjOSC1) gene in yeast INVScI strain (Thermo Fisher Technologies) (MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52 MATAlpha his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52) pYES3-BAS, CYP88D6 Glycyrrhetinic acid-producing yeast by introducing the expression vector pDEST52-CYP72A63 of the CYP72A63 gene, which is the tarumagoyashi ortholog of the gene and the lotus japonicus citchrome P450 reductase (LjCPR1), pESC-CPR-CYP88D6 and Kanzo CYP72A154 A strain was obtained (Fig.
  • the pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300, pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491, and pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230 obtained in Example 7 were introduced into these yeast strains, respectively.
  • pESC-HIS-AtUGD2 which corresponds to an empty vector, was introduced into a glycyrrhetinic acid-producing yeast strain.
  • Yeast transformation was performed using Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research) according to the attached protocol.
  • Example 9 In vivo enzyme assay using recombinant yeast> Glycyrrhetinic acid-producing yeast strain carrying pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300, pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491, pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230 or negative control pESC-HIS-AtUGD2 obtained in Example 8.
  • YNB Yeast nitrogen base
  • YNB Yeast nitrogen base
  • yeast cell pellets The obtained yeast cell pellet was suspended in 1 mL of Yeast nitrogen base (YNB) medium (-Trp / -Leu / -Ura / -His), and then centrifuged again at 3,000 g at 4 ° C for 5 minutes to obtain yeast cells. Pellets were obtained. The obtained yeast cell pellet was suspended in 5 mL of Yeast nitrogen base (YNB) medium (-Trp / -Leu / -Ura / -His) containing 2% galactose, and cultured with shaking at 30 ° C. and 200 rpm for 5 days. ..
  • YNB Yeast nitrogen base
  • a metabolite extract (sample A) derived from a glycyrrhetinic acid-producing yeast strain expressing the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 (Glyma.06G324300) and glycyrrhetinic acid production expressing the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 (Glyur003152s00037491).
  • Metabolite extract derived from yeast strain (Sample B), metabolite extract derived from glycyrrhetinic acid-producing yeast strain expressing the polypeptide (Lj3g3v1981230) shown in SEQ ID NO: 5 (Sample C), and an empty vector that does not express any gene.
  • a metabolite extract (Sample D) derived from a glycyrrhetinic acid-producing yeast strain was obtained.
  • the product was extracted.
  • a metabolite extract (sample E) derived from a yeast strain producing soyasapogenol B expressing the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 (Glyma.06G324300) and soyasapogenol B producing the polypeptide shown in SEQ ID NO: 3 (Glyur003152s00037491) were produced.
  • a metabolite extract derived from a yeast strain (Sample F), a metabolite extract derived from a soyasapogenol B-producing yeast strain expressing the polypeptide (Lj3g3v1981230) shown in SEQ ID NO: 5 (Sample G), and an empty vector that does not express any gene.
  • a metabolite extract (Sample H) derived from a soyasapogenol B-producing yeast strain was obtained.
  • Example 10 Analysis of yeast metabolite extract> Samples A, B, C, and D obtained in Example 9 and samples E, F, G, and H were evaporated using a rotary evaporator. The precipitate was suspended in 300 ⁇ L of methanol and filtered through Millex-GV, 0.22 ⁇ m, PVDF, 4 mm (Merck) to prepare a sample for LC-MS analysis.
  • FIG. 4 shows the results of the enzymatic activity of Glyma.06G324300 or its homologue when glycyrrhetinic acid and glucuronic acid were used as substrates.
  • sample A of (a) one peak corresponding to glycyrrhetinic acid monoglucuronide was detected (black arrow).
  • the retention time of the peak and the mass spectrum were in good agreement with glycyrrhetinic acid monoglucuronide.
  • a peak corresponding to glycyrrhetinic acid monoglucuronide was detected in sample B of (b) and sample C of (c) (black arrow).
  • FIG. 5 shows the results of the enzymatic activity of Glyma.06G324300 or its homologue when soyasapogenol B and glucuronic acid were used as substrates.
  • sample E of (a) one peak corresponding to soyasapogenol B monoglucuronide was detected (black arrow).
  • a peak corresponding to soyasapogenol B monoglucuronide was also detected in sample F in (b) and sample G in (c) (black arrow).
  • the retention time and mass spectrum of each peak were in good agreement with soyasapogenol B monoglucuronide.
  • no peak corresponding to soyasapogenol B monoglucuronide was detected in sample H of (d), which is a negative control group.
  • Example 11 Preparation of transformed yeast for substrate feeding assay>
  • the pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300, pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491, and pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230 obtained in Example 8 were introduced into the yeast INVScI strain, respectively.
  • pESC-HIS-AtUGD2 which corresponds to an empty vector, was introduced into the same yeast INVScI strain.
  • Yeast transformation was performed using Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research) according to the attached protocol.
  • Example 12 Substrate feeding assay using recombinant yeast> A transformed yeast carrying pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300, pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491, pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230, or negative control pESC-HIS-AtUGD2 obtained in Example 11. 2 mL of Yeast nitrogen base (YNB) medium (-His) containing 2% glucose was used for shaking culture at 30 ° C. and 200 rpm for 24 hours. Then, the culture solution was centrifuged at 3,000 g at 4 ° C. for 5 minutes to obtain yeast cell pellets.
  • YNB Yeast nitrogen base
  • -His containing 2% glucose
  • the obtained yeast cell pellet was suspended in 2 mL of Yeast nitrogen base (YNB) medium (-His), and then centrifuged again at 3,000 g at 4 ° C. for 5 minutes to obtain yeast cell pellet.
  • the resulting yeast cell pellet was suspended in 10 mL of Yeast nitrogen base (YNB) medium (-His) containing 2% galactose and bisected into 5 mL.
  • YNB Yeast nitrogen base
  • YNB Yeast nitrogen base
  • Fig. 4 a final concentration of 5 ⁇ M soyasapogenol B
  • a feeding assay extract (Sample I) in which glycyrrhetinic acid was added to a transformed yeast expressing the polypeptide (Glyma.06G324300) shown in SEQ ID NO: 1 and a feeding assay extract (Sample M) in which Soyasapogenol B was added.
  • Feeding assay extract (Sample J) in which glycyrrhetinic acid was added to transformed yeast expressing the polypeptide (Glyur003152s00037491) shown in SEQ ID NO: 3
  • Feeding assay extract (Sample N) in which Soyasapogenol B was added, and sequence.
  • Feeding assay extract (Sample K) in which glycyrrhetinic acid was added to transformed yeast expressing the polypeptide (Lj3g3v1981230) shown by No. 5, Feeding assay extract (Sample O) in which Soyasapogenol B was added, and all genes were expressed.
  • a feeding assay extract (Sample L) in which glycyrrhetinic acid was added to a transformed yeast containing only an empty vector and a feeding assay extract (Sample P) in which Soyasapogenol B was added were obtained.
  • Example 13 Analysis of substrate feeding assay extract> Samples I, J, K, L, M, N, O, and P obtained in Example 12 were evaporated using a rotary evaporator. The precipitate was suspended in 300 ⁇ L of methanol and filtered through Millex-GV, 0.22 ⁇ m, PVDF, 4 mm (Merck) to prepare a sample for LC-MS analysis.
  • Soyasapogenol B monoglucuronide 633.8
  • Soyasapogenol B diglucuronide 809.9 were analyzed as parameters.
  • the identification of metabolites was determined by comparing the LC retention time and MS spectrum using a sample of commercially available glycyrrhetinic acid monoglucuronide, glycyrrhizin, and soyasapogenol B monoglucuronide dissolved in methanol at a concentration of 1 ⁇ M as a standard.
  • FIG. 7 shows the results of the substrate feeding assay in Sample I. From (b), a peak (white arrow) corresponding to the glycosyl acceptor substrate glycyrrhetinic acid was detected, and from (c), one peak considered to be glycyrrhetinic acid with one molecule of glucuronic acid added (white arrow). Black arrow) was detected. The retention time of the peak and the mass spectrum were in good agreement with glycyrrhetinic acid monoglucuronide.
  • the result of the substrate feeding assay when soyasapogenol B is used as a glycosyl acceptor substrate is shown in FIG.
  • the sample O containing Lj3g3v1981230 derived from Miyako grass shown in (d) all of them.
  • the soybean-derived novel enzyme Glyma.06G324300 obtained in Example 1 the licorice-derived novel enzyme Glyur003152s00037491 obtained in Example 3, and Example 5 were obtained. It was revealed that the novel enzyme Lj3g3v1981230 derived from licorice has a first glucuronic acid transfer activity that converts glycyrrhetinic acid into glycyrrhetinic acid monoglucuronide by transferring glucuronic acid to the hydroxy group at the 3-position of glycyrrhetinic acid. ..
  • Example 14 Isolation of Glyma.06G324300 homologous gene function-deficient mutant of Lotus japonicus> Based on the sequence information of Lotus japonicus genes and proteins, and their expression database Lotus Base (https://lotus.au.dk/), we searched for mutant strains with LORE insertion in Lj3g3v1981230. The strain was a hit. From these strains, two strains (30006020, 30115796) were selected based on the LORE1 insertion position in Lj3g3v1981230 and the number of LORE1 insertions in other genes, and seeds were obtained from a distribution organization (Aarhus University, Denmark).
  • PCR genomic DNA was extracted from a part of the developed cotyledons, and the insertion of LORE1 into Lj3g3v1981230 was confirmed by PCR.
  • 25 cycles of PCR were performed using GoTaq (registered trademark) Colorless Master Mix (Promega) at an annealing temperature of 60 ° C. and a reaction temperature of 72 ° C.
  • GoTaq registered trademark
  • a reverse primer SEQ ID NO: 27 for 300006020, SEQ ID NO: 29 for 30115796
  • P2 primer SEQ ID NO: 30
  • Example 15 Triterpenoid saponin composition analysis of Glyma.06G324300 homologous gene function-deficient mutant of Lotus japonicus> After sowing in Example 14, the whole plant of the Lotus japonicus Glyma. 06G324300 homologous gene function-deficient mutant line (30006020, 30115796) was freeze-dried one month later, and then 10 times the dry weight of 80% methanol was added. added. The mixture was shaken at room temperature for 1 hour and centrifuged at 15 krpm for 5 minutes.
  • the supernatant obtained by centrifugation was cleaned with a membrane filter (GL chromatodisc 4P, GL science) having a pore size of 0.45 ⁇ m, and 2 ⁇ L of each extract was subjected to LC-PDA / MS / MS analysis.
  • the apparatus used was Ultimate 3000SD HPLC / LTQ orbitrap discovery MS (both from Thermo Fisher Scientific). Apply the extract to a reverse phase column (C30, Develosil C30-UG-3, Nomura Kagaku) and apply a linear grangeant of acetonitrile (20-80% /) containing 0.1% (v / v) formic acid at a flow rate of 0.15 ml / min. 60 minutes) to elute saponins.
  • a reverse phase column C30, Develosil C30-UG-3, Nomura Kagaku
  • the eluate was detected by UV absorption and mass spectrometry (parent ion was detected by orbitrap type, fragment ion was detected by ion trap type).
  • the eluate vaporized and positively ionized by the electrospray ionization method was injected into the mass spectrometer.
  • Example 16 Construction of expression vector for Lotus japonicus> Using the cloning vector containing the Glyma. 06G324300 homologous gene derived from Kanzo prepared in Example 4 as a template, a forward primer (SEQ ID NO: 31) and a reverse primer (SEQ ID NO: 32) that amplify from the start codon to the stop codon of SEQ ID NO: 4 are used. ), And using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio), PCR was performed for 30 cycles at an annealing temperature of 60 ° C and a reaction temperature of 68 ° C.
  • the amplified DNA fragment was cloned into pDONR TM 221 by a nucleotide sequence-specific recombination reaction (GATEWAY attB x attP reaction) using Gateway BP Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher Technologies), and the three independent cells obtained were obtained.
  • GATEWAY attB x attP reaction Gateway BP Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher Technologies)
  • the polynucleotide sequence was determined and confirmed to match SEQ ID NO: 4.
  • the plasmid pDONR-Glyur003152s00037491 having the polynucleotide was obtained as an entry clone.
  • the plasmid pDONR-Lj3g3v1981230 having the polynucleotide was obtained as an entry clone. Since it is necessary for a base sequence-specific recombination reaction (GATEWAY attB ⁇ attP reaction) at the time of cloning into pDONR TM 221 (Thermo Fisher Technologies), the forward primer has SEQ ID NO: 35 at the 5'end. The 12 bases shown in (AAAAAGCAGGCT) and the reverse primer have 12 bases (AGAAAGCTGGGT) shown in SEQ ID NO: 36 added to the 5'end.
  • the plasmid (entry clone) pDONR-Glyma.06g324300 having the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 or the plasmid (entry clone) having the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 4 prepared in Example 1 is shown in SEQ ID NO: 6
  • a plasmid having a polynucleotide (entry clone) pDONR-Lj3g3v1981230 and a destination vector pG35NGw are mixed, and a nucleotide sequence-specific recombination reaction (GATEWAY attL ⁇ attR reaction) is used using Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher Technologies).
  • Example 17 Rescue experiment by introducing soybean Glyma.06G324300 and Glyma.06G324300 homologous gene of licorice and Lotus japonicus into Lotus japonicus mutant> Glyma.06G324300 homologous genes in Diaz et al., (2005) Induction of hairy roots for symbiotic gene expression studies. In Lotus japonicus Handbook, AJ Marquez, ed (Dordrecht, The Netherlands: Springer), pp. 261-277. It was introduced into a Glyma. 06G324300 homologous gene function-deficient mutant of Miyakogusa according to the method described. Seeds obtained from a mutant homozygous strain of Glyma.
  • 06G324300 homologous gene function-deficient mutant 300006020 obtained in Example 14 with hypochlorous acid (including 0.02% Tween20) having an effective chlorine concentration of 2% were used for 20 After sterilization for minutes, it was allowed to absorb water overnight in sterile distilled water. The seed coats of the absorbed seeds were removed, sowed on 0.8% water agar medium, shielded from light with aluminum foil, cultured at 25 ° C. for 4 days, and then exposed to light for 1 day. The vector prepared in Example 16 was introduced into Agrobacterium (LBA1334), plated on the anterior surface of L medium, and cultured at 28 ° C. for 1 day.
  • Agrobacterium LBA13344
  • Agrobacterium cultured for 1 day in 10 mL of sterile water is suspended and placed in a round sterile petri dish, and then the seedlings of the mutant homozygous of Miyakogusa's Glyma.06G324300 homologous gene function-deficient mutant 300006020 are soaked in the razor.
  • the hypocotyl was cut with a blade.
  • the cut seedlings were placed in a coexisting medium, shielded from light with aluminum foil, and co-cultured at 21 ° C. for 4 days.
  • the plants were arranged on HRE medium and grown at light period 16 hours, 25 ° C / dark period 8 hours, and 23 ° C for 2 weeks. Plants with hairy roots were confirmed to have GFP fluorescence under a fluorescent stereomicroscope.
  • Example 18 Triterpenoid saponin composition analysis of Lotus japonicus hairy root>
  • the hairy root-developing plant obtained in Example 17 was transplanted into a pot filled with vermiculite, B & D hydroponic solution (Diaz et al., 2005) was added, and the plant was grown for 1 month.
  • Well-grown plants were freeze-dried and crushed with a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.) at 2500 rpm for 30 seconds.
  • 80% methanol, 100 times the weight of the lyophilized product, was added, shaken at room temperature for 1 hour, and then centrifuged at 15 krpm for 5 minutes to collect the supernatant.
  • Example 19 Search and isolation of Glyma.06G324300 homologous gene derived from astragalus>
  • the Glyma.06G324300 homologous gene was searched for as an ortholog gene candidate for Glyma.06G324300 by gene homology search from Astragalus sinicus, which is the same legume as soybean.
  • Astragalus sinicus which is the same legume as soybean.
  • AsCSyGT one base sequence, AsCSyGT, that encodes a protein that exhibits high amino acid identity in Glyma.06G324300.
  • First-strand cDNA was synthesized using 1 ⁇ g of total RNA obtained from astragalus stalk using the SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) according to the attached protocol. Using 2 ⁇ L of first-strand cDNA as a template, oligo DNA at the N-terminal and C-terminal of the polypeptide estimated from AsCSyGT was used as the forward primer (SEQ ID NO: 39) and reverse primer (SEQ ID NO: 40), respectively, and PrimeSTAR Max. 30 cycles of PCR were performed using DNA Polymerase (Takara Bio) at an annealing temperature of 55 ° C and a reaction temperature of 72 ° C.
  • DNA Polymerase Takara Bio
  • Example 20 Isolation of soybean-derived Glyma.06G324300 homologous gene>
  • the Glyma.06G324300 homologous gene was searched for as a paralog gene candidate for Glyma.06G324300 by gene homology search from soybean.
  • Soybase https://soybase.org
  • Glyma.11g 151800 were found.
  • Glyma.06G324300 homologous genes Glyma.04g255400 and Glyma.11g151800
  • pDONR TM 221 Thermo Fisher Technologies
  • the oligo DNA at the N-terminal and C-terminal parts of the polypeptide estimated from Glyma.04g255400 was used as the forward primer (SEQ ID NO: 43) and the reverse primer (SEQ ID NO: 44), respectively, and the poly estimated from Glyma.11g151800.
  • the oligo DNAs corresponding to the N-terminal and C-terminal of the peptide were used as the forward primer (SEQ ID NO: 45) and the reverse primer (SEQ ID NO: 46), respectively. Since it is necessary for a base sequence-specific recombination reaction (GATEWAY attB x attP reaction) when cloning into pDONR TM 221 (Thermo Fisher Technologies), the forward primer has 12 bases (AAAAAGCAGGCT) at the 5'end. ), And 12 bases (AGAAAGCTGGGT) are artificially added to the reverse primer at the 5'end.
  • a DNA fragment amplified from seed-derived fast-strand cDNA was cloned into pDONR TM 221 by a nucleotide sequence-specific recombination reaction (GATEWAY attB x attP reaction) using Gateway BP Clonase II Enzyme Mix (Thermo Fisher Technologies).
  • the polynucleotide sequences were determined for the three independent clones obtained for each. The sequences thus obtained are SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 49, and the polypeptide sequences deduced from them are SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 50.
  • SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 50 had 93.9% and 71.1% identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, respectively.
  • Example 21 Introduction of Glyma.06G324300 homologous genes of astragalus and soybean into glycyrrhetinic acid and soyasapogenol B-producing yeast strains>
  • pESC-HIS-AsCSyGT and pESC-HIS-AtUGD2 which are yeast expression clones of the soybean Glyma.06G324300 homologous gene obtained in Example 19 and the soybean obtained in Example 20.
  • -Glyma04g255400 and pESC-HIS-AtUGD2-Glyma. 11g151800 were constructed and introduced into glycyrrhetinic acid and soyasapogenol B-producing yeast strains by the method shown in Example 8, respectively.
  • Example 22 In vivo enzyme assay using recombinant yeast introduced with Glyma.06G324300 homologous gene of astragalus and soybean> Recombinant yeast was cultured and metabolites were extracted by the method shown in Example 9.
  • a metabolite extract (sample Q) derived from the glycyrrhetinic acid-producing yeast strain expressing the polypeptide (AsCSyGT) shown in SEQ ID NO: 42
  • a metabolite extract derived from (Sample R) and a metabolite extract derived from a glycyrrhetinic acid-producing yeast strain expressing the polypeptide (Glyma.11g151800) shown in SEQ ID NO: 50 (Sample S) were obtained.
  • Soyasapogenol B-producing yeast strains carrying pESC-HIS-AsCSyGT, pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400, and pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800 were also cultured and metabolites were extracted in the same manner.
  • a metabolite extract (sample T) derived from the soyasapogenol B-producing yeast strain expressing the polypeptide (AsCSyGT) shown in SEQ ID NO: 42, and a soyasapogenol B-producing yeast strain expressing the polypeptide (Glyma04g255400) shown in SEQ ID NO: 48.
  • a metabolite extract (sample U) derived from the soyasa pogenol B-producing yeast strain expressing the polypeptide (Glyma. 11g151800) shown in SEQ ID NO: 50 was obtained.
  • Example 23 Analysis of metabolite extract of yeast into which Glyma.06G324300 homologous gene of astragalus and soybean was introduced>
  • a sample for LC-MS analysis was prepared and analyzed by the method shown in Example 10. The results are shown in FIGS. 14 and 15. From the sample Q of (a) shown in FIG. 14, one peak corresponding to glycyrrhetinic acid monoglucuronide was detected (black arrow). The retention time of the peak and the mass spectrum were in good agreement with glycyrrhetinic acid monoglucuronide.
  • Example 24 Preparation of transformed yeast for substrate feeding assay of soybean Glyma.06G324300 homologous gene>
  • the pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400 and pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800 obtained in Example 21 were introduced into the yeast INVScI strain, respectively.
  • Yeast transformation was performed using Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research) according to the attached protocol.
  • Example 25 Substrate feeding assay using transformed yeast into which a soybean Glyma.06G324300 homologous gene has been introduced>
  • the recombinant yeast obtained in Example 24 was cultured by the method shown in Example 12.
  • the suspension of each yeast cell obtained was divided into equal parts, and ursolic acid, a ursan-type triterpenoid, or bethulinic acid, a lupine-type triterpenoid, at a final concentration of 5 ⁇ M was added. Then, the cells were cultured again and the metabolites were extracted by the method shown in Example 12.
  • Example 26 Analysis of substrate feeding assay extract using transformed yeast into which Glyma.06G324300 homologous gene of soybean was introduced>
  • FIG. 16 is an analysis result of a feeding assay extract (sample W) in which ursolic acid was added to a transformed yeast expressing the polypeptide (Glyma.11g151800) shown in SEQ ID NO: 50.
  • FIG. 17 is an analysis result of a feeding assay extract (sample Y) in which bethulinic acid was added to a transformed yeast expressing the polypeptide (Glyma.11g151800) shown in SEQ ID NO: 50.
  • a peak presumed to be betulinic acid monoglucuronide was detected in sample Y shown in (b).
  • the negative control sample Z shown in (c) a peak presumed to be betulinic acid monoglucuronide was not detected.
  • the polypeptide shown in SEQ ID NO: 50 is not only an oleanane-type triterpenoid, but also a hydroxy group at the 3-position of a ursan-type triterpenoid such as ursolic acid and ⁇ -boswellic acid, and a lupine-type triterpenoid such as betulinic acid. Is also considered to be the first glucuronic acid transferase capable of transferring glucuronic acid.

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Abstract

オレアナン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシル基にグルクロン酸転移を触媒するグルクロン酸第１転移酵素の遺伝子を同定する。　マメ科植物（ダイズ、カンゾウ、及びミヤコグサ）に由来し、それぞれ配列番号２、４、及び６で示す塩基配列からなる目的の活性を有したグルクロン酸第１転移酵素遺伝子を提供する。

Description

グルクロン酸転移酵素、それをコードする遺伝子及びその利用方法
　本発明は、オレアナン型トリテルペノイドにおける3位のヒドロキシル基にグルクロン酸を転移する酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及びグリチルリチンの製造方法に関する。
　カンゾウ（Glycyrrhiza uralensis：グリキルリザ　ウラレンシス）は、マメ科の多年生草本植物である。この植物の根部及びストロン(stolon：地下茎)は、漢方上重要な生薬「甘草」として知られており、世界的に広く利用されている。甘草の主活性成分は、オレアナン型トリテルペノイドサポニンのグリチルリチン（glycyrrhizin）である（非特許文献１）。グリチルリチンについては、その生薬学的、薬理学的有用性、及び育種学的研究等の様々な側面から研究が行われている。
　医薬品として良質のグリチルリチンを生物生産系によって安定的かつ持続的に提供するためには、グリチルリチンの生合成系に関与する遺伝子や当該遺伝子の発現量をマーカーに用いて、最適産生条件の確立、グリチルリチン高生産株の選抜又は合成酵素遺伝子の導入によるグリチルリチン高産生植物の育種等を行う必要がある。そのためにはグリチルリチンの生合成系に関与する遺伝子群の同定が不可欠である。
　グリチルリチンは、植物に共通に含まれ、オレアナン型トリテルペノイドに属するβ-アミリンを出発物質として、２段階の酸化反応及び２段階の配糖化反応によって生合成される。β-アミリンとは、トリテルペノイドサポニン生合成系において、グリチルリチンとソヤサポニンI（soyasaponin I）の生合成分岐点となる前駆体物質であることが知られている（図１）。
　図２で示すように、β-アミリンからグリチルリチンに至る合成酵素は、これまでに、グリチルリチンのアグリコン（非糖部）であるグリチルレチン酸をβ-アミリンから生合成するための前記２段階の酸化反応のそれぞれを触媒する2種の酸化酵素CYP88D6（特許文献１）及びCYP72A154（特許文献２）、並びに得られたグリチルレチン酸に対して前記２段階の配糖化反応を触媒してグリチルリチンを生合成する合成酵素遺伝子のうち、２段階目を触媒する糖転移酵素UGT73P12（特許文献３）については知られていた。ところが、グリチルレチン酸に直接グルクロン酸を転移する１段階目の配糖化反応を触媒する糖転移酵素、すなわちグルクロン酸第１転移酵素については、多くの当業者が幾度となくその単離を試みたにもかかわらず、これまで全く得ることができなかった。それ故に、β-アミリンから生物生産系やインビトロ合成系でグリチルリチンを合成する上でのボトルネックとなっており、十分量のグリチルリチンを安定的かつ持続的に得ることができなかった。
特許第5526323号 特許第5771846号 特許第6344774号
Gibson, M. R., 1978, Lloydia-the journal of Natural Products, 41(4): 348-354
　本発明は、上記課題を解決するためにグリチルレチン酸をはじめとするオレアナン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシル基にグルクロン酸転移を触媒するグルクロン酸第１転移酵素の遺伝子を単離すると共に、その遺伝子発現系を用いて個体内又は細胞内においてβ-アミリンからグリチルリチンまでを多量に生合成できる生物発現系を作製し、提供することを目的とする。
　β-アミリンからグリチルリチンへの生合成経路において、最後に残されたグルクロン酸第１転移酵素を同定するため、多くの当業者がカンゾウからの単離を試みたものの、長きにわたって同定されることができなかった。そこで、本発明者らは、カンゾウ属植物からのグルクロン酸第１転移酵素の単離には、何らかの阻害要因があると考え、カンゾウ属植物以外の植物からグルクロン酸第１転移酵素を単離する戦略を試みた。カンゾウ属植物が属するマメ科植物には、一般に、β-アミリンから中間産物としてソヤサポゲノールBを経由してソヤサポニンIを生合成する経路が存在する（図１）。オレアナン型トリテルペノイドであるソヤサポゲノールBは3位にヒドロキシル基を有するが、最終産物のソヤサポニンIは3位にはグルクロン酸が結合している。これは、中間産物でオレアナン型トリテルペノイドでもあるグリチルレチン酸が3位にヒドロキシル基を有するのに対して、最終産物のグリチルリチンの3位にはグルクロン酸が結合しているのと同じである。つまり、β-アミリンからグリチルリチンへの生合成経路で機能するグルクロン酸第１転移酵素は、β-アミリンからソヤサポニンIへの生合成経路でも機能している可能性がある。本発明者らは、この仮説に基づいて、β-アミリンからソヤサポニンIへの生合成経路を有するダイズからグルクロン酸第１転移活性を有し得る遺伝子の同定を試みた結果、具体的な機能が未知のセルロース合成酵素類似遺伝子を単離することに成功した。ソヤサポゲノールBを糖受容基質として、この酵素の糖転移活性を検証した結果、ソヤサポゲノールBの3位のヒドロキシル基にグルクロン酸を糖転移することが明らかとなった。この酵素活性は、糖受容基質がグリチルレチン酸の場合でも同様であった。このように、本発明者らは、由来植物をカンゾウ属植物ではなく、ダイズに変えたことで、これまで単離できなかったグルクロン酸第１転移酵素を同定することに成功した。本発明は、その研究結果に基づくものであり、以下を提供する。
（１）オレアナン型トリテルペノイドにおける3位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有し、以下の（ａ）～（ｃ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド又は前記活性を有するその断片。
　　（ａ）配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列、
　　（ｂ）配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　　（ｃ）配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ポリペプチド。
（２）前記オレアナン型トリテルペノイドが、β-アミリン、11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-β-アミリン、24-ヒドロキシ-β-アミリン、11-デオキソグリチルレチン酸、グリチルレチン酸、オレアノール酸、メジカゲニン酸、ソヤサポゲノールB、ソヤサポゲノールA、ヘデラゲニン、カメリアゲニン、及びサイコゲニンからなる群から選択される、（１）に記載のポリペプチド。
（３）マメ科(Fabaceae)植物に由来する、（１）又は（２）に記載のポリペプチド。
（４）（１）～（３）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）以下の（ａ）～（ｄ）で示すいずれかの塩基配列を含む、（４）に記載のポリヌクレオチド。
　　（ａ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列、
　　（ｂ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、
　　（ｃ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列と80％以上の同一性を有する塩基配列、又は
　　（ｄ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列に相補的な塩基配列と高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
（６）（４）又は（５）に記載のポリヌクレオチドを含むCSyGT発現ベクター。
（７）（４）又は（５）に記載のポリヌクレオチド又は（６）に記載のCSyGT発現ベクターを含む形質転換体、又は前記ポリヌクレオチド又は前記CSyGT発現ベクターを保持したその後代。
（８）宿主がマメ科（Fabaceae）植物である、（７）に記載の形質転換体又はその後代。
（９）宿主が酵母である、（７）に記載の形質転換体又はその後代。
（１０）（９）に記載の形質転換体又はその後代から得られる酵母由来の糖鎖が付加された（１）～（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１１）前記酵母由来の糖鎖が高マンノース型糖鎖である、（１０）に記載のポリペプチド。
（１２）オレアナン型トリテルペノイドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、（７）又は（８）に記載の形質転換体又はその後代を培養する工程、及び前記培養物から（１）～（３）のいずれかに記載のポリペプチドを抽出する工程を含む、前記方法。
（１３）β-アミリンを生合成でき、かつ以下の（Ａ）～（Ｄ）で示す全ての発現ベクターを含むグリチルリチン製造用の遺伝子組換え体。
　（Ａ）オレアナン型トリテルペノイドにおける11位を酸化する活性を有し、以下の（ａ）～（ｃ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するCYP88D6発現ベクター、
　　（ａ）配列番号７で示すアミノ酸配列、
　　（ｂ）配列番号７で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　　（ｃ）配列番号７で示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
　（Ｂ）オレアナン型トリテルペノイドにおける30位を酸化する活性を有し、以下の（ｄ）～（ｆ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するCYP72A154発現ベクター、
　　（ｄ）配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列、
　　（ｅ）配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　　（ｆ）配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
　（Ｃ）オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有し、以下の（ｇ）～（ｉ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するUGT73P12発現ベクター、
　　（ｇ）配列番号１５で示すアミノ酸配列、
　　（ｈ）配列番号１５で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
　　（ｉ）配列番号１５で示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び
　（Ｄ）（６）に記載のCSyGT発現ベクター
（１４）宿主がマメ科植物である、（１３）に記載の遺伝子組換え体。
（１５）β-アミリンからグリチルリチンを製造する方法であって、（１３）又は（１４）に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む前記製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-190060号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、オレアナン型トリテルペノイドにおける3位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらを利用した方法を提供できる。
トリテルペノイドサポニン生合成系におけるグリチルリチン及びソヤサポニンIの生合成経路を示す。 β-アミリンからグリチルリチンに至る生合成経路において中間生産物として生じる各オレアナン型トリテルペノイド、各変換反応に関与する既知の酵素（CYP88D6、CYP72A154、及びUGT73P12）、及び本明細書で新たに同定されたグルクロン酸第１転移酵素CSyGTの触媒位置を示す。 実施例において、ダイズGlyma.06G324300、並びにカンゾウ及びミヤコグサ由来のGlyma.06G324300相同タンパク質の機能解析で使用したトリテルペノイド生産酵母株を示す概念図である。(a)の酵母株は、β-アミリン合成酵素遺伝子（ミヤコグサ由来）、CYP88D6（カンゾウ由来）、CYP72A63（タルウマゴヤシ由来）を同時発現することにより酵母内在の2,3-オキシドスクアレンからグリチルレチン酸を細胞内生産することができる。(b)の酵母株は、β-アミリン合成酵素遺伝子（ミヤコグサ由来）、CYP93E3（カンゾウ由来）、CYP72A566（カンゾウ由来）を同時発現することにより酵母内在の2,3-オキシドスクアレンからソヤサポゲノールBを細胞内生産することができる。 Glyma.06G324300及び相同遺伝子を導入したグリチルレチン酸生産酵母の代謝物分析結果を示す図である。（a）のサンプルAはダイズ由来のGlyma.06G324300を、（b）のサンプルBはカンゾウ由来のGlyur003152s00037491を、（c）のサンプルCはミヤコグサ由来のLj3g3v1981230を、それぞれグリチルレチン酸生産酵母内で発現させることにより生成したグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果である。黒矢印のピークはグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。また（d）のサンプルDは陰性対照としての空ベクターを導入したグリチルレチン酸生産酵母における検出結果である。 Glyma.06G324300及び相同遺伝子を導入したソヤサポゲノールB生産酵母の代謝物分析結果を示す図である。（a）のサンプルEはダイズ由来のGlyma.06G324300を、（b）のサンプルFはカンゾウ由来のGlyur003152s00037491を、（c）のサンプルGはミヤコグサ由来のLj3g3v1981230を、それぞれソヤサポゲノールB生産酵母内で発現させることにより生成したソヤサポゲノールBモノグルクロニドの検出結果である。黒矢印のピークはソヤサポゲノールBモノグルクロニドを示す。また（d）のサンプルHは陰性対照としての空ベクターを導入したソヤサポゲノールB生産酵母における検出結果である。 基質フィーディング実験の概要を示す図である。糖供与体基質であるUDP-グルクロン酸を細胞内で供給するためシロイヌナズナのUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ（AtUGD）とGlyma.06G324300及びその相同遺伝子を酵母内で同時発現させた。（a）は酵母培養液にグリチルレチン酸を、また（b）は酵母培養液にソヤサポゲノールBを投与したときのモノグルクロニドへの変換反応図である。 グリチルレチン酸をフィーディングしたダイズ由来のGlyma.06G324300導入酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）Glyma.06G324300を用いたときのグリチルレチン酸モノグルクロニドへの想定される変換反応概念図である。（b）変換前のグリチルレチン酸の検出結果を示す。白矢印のピークがグリチルレチン酸を示す。（c）Glyma.06G324300により生成したグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。 グリチルレチン酸をフィーディングしたカンゾウ由来のGlyur003152s00037491導入酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）Glyur003152s00037491を用いたときのグリチルレチン酸モノグルクロニドへの想定される変換反応概念図である。（b）変換前のグリチルレチン酸の検出結果を示す。白矢印のピークがグリチルレチン酸を示す。（c）Glyur003152s00037491により生成したグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。 グリチルレチン酸をフィーディングしたミヤコグサ由来のLj3g3v1981230導入酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）Lj3g3v1981230を用いたときのグリチルレチン酸モノグルクロニドへの想定される変換反応概念図である。（b）変換前のグリチルレチン酸の検出結果を示す。白矢印のピークがグリチルレチン酸を示す。（c）Lj3g3v1981230により生成したグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。 図７～９の陰性対照で、グリチルレチン酸をフィーディングした空ベクター導入酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）空ベクターを用いたときのグリチルレチン酸モノグルクロニドへの想定される変換反応概念図である。酵素活性がないためグリチルレチン酸モノグルクロニドは生成されないことが予想される。（b）反応前のグリチルレチン酸の検出結果を示す。白矢印のピークがグリチルレチン酸を示す。（c）反応後のグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。破線矢印はグリチルレチン酸モノグルクロニドが生成された場合のピーク発生位置を示す。 ソヤサポゲノールBをフィーディングしたGlyma.06G324300及びその相同遺伝子導入酵母の代謝物分析結果を示す図である。（a）ソヤサポゲノールBからソヤサポゲノールBモノグルクロニドへの想定される変換反応の概念図である。（b）ダイズ由来のGlyma.06G324300により生成したソヤサポゲノールBモノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがソヤサポゲノールBモノグルクロニドを示す。（c）カンゾウ由来のGlyur003152s00037491により生成したソヤサポゲノールBモノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがソヤサポゲノールBモノグルクロニドを示す。（d）ミヤコグサ由来のLj3g3v1981230により生成したソヤサポゲノールBモノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがソヤサポゲノールBモノグルクロニドを示す。（e）前記(b)～(d)の陰性対照である。 ミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体抽出物のLC-PDA/MS/MS分析結果を示す図である。（ａ）は野生型（Gifu）由来の、（ｂ）及び（ｃ）はトランスポゾン挿入ホモ変異体（それぞれ30006020、30115796）由来の植物体抽出物のベースピークイオンクロマトグラムを示している。 ミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体抽出物のLC-PDA/MS/MS分析結果を示す図である。（ａ）は野生型（Gifu）由来の、（ｂ）及び（ｃ）はトランスポゾン挿入ホモ変異体（それぞれ30006020、30115796）由来の植物体抽出物のトータルイオンクロマトグラムを示している。 Glyma.06G324300相同遺伝子を導入した機能欠損変異体毛状根のLC-PDA/MS/MS分析結果を示す図である。（ａ）は野生型（Gifu）に空ベクター（pG35N_empty）を導入した株、（ｂ）～（ｅ）はGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損ホモ変異体（30115796）株に、それぞれpG35N_empty、発現ベクターpG35N-GmCSL、pG35N-GuCSL、及びpG35N-LjCSLを導入した形質転換体に由来する毛状根抽出物のトータルイオンクロマトグラムを示す。 レンゲGlyma.06G324300オルソログ遺伝子及びダイズGlyma.06G324300パラログ遺伝子を導入したグリチルレチン酸生産酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）のサンプルQはレンゲ由来のGlyma.06G324300オルソログ遺伝子であるAsCSyGT遺伝子を、（b）のサンプルRはダイズ由来のGlyma.06G324300パラログ遺伝子であるGlyma04g255400遺伝子を、（c）のサンプルSはダイズ由来のGlyma.06G324300パラログ遺伝子であるGlyma.11g151800遺伝子を、それぞれグリチルレチン酸生産酵母内で発現させることにより生成したグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果である。黒矢印のピークはグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。 レンゲGlyma.06G324300オルソログ遺伝子及びダイズGlyma.06G324300パラログ遺伝子を導入したソヤサポゲノールB酸生産酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）のサンプルTはレンゲ由来のAsCSyGT遺伝子を、（b）のサンプルUはダイズ由来のGlyma04g255400遺伝子を、（c）のサンプルVはダイズ由来のGlyma.11g151800遺伝子を、それぞれソヤサポゲノールB生産酵母内で発現させることにより生成したソヤサポゲノールBモノグルクロニドの検出結果である。黒矢印のピークはソヤサポゲノールBモノグルクロニドを示す。 ウソール酸をフィーディングしたダイズ由来のGlyma.11g151800遺伝子導入酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）Glyma.11g151800フィーディングアッセイ抽出物（サンプルW）を用いたときのウソール酸モノグルクロニドへの想定される変換反応概念図である。（b）サンプルWを加えたときのGlyma.11g151800により生成したウソール酸モノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがウソール酸モノグルクロニドを示す。（c）陰性対照のサンプルXを加えたときのウソール酸モノグルクロニドの検出結果を示す。 ベツリン酸をフィーディングしたダイズ由来のGlyma.11g151800遺伝子導入酵母における代謝物分析結果を示す図である。（a）Glyma.11g151800フィーディングアッセイ抽出物（サンプルY）を用いたときのベツリン酸モノグルクロニドへの想定される変換反応概念図である。（b）サンプルYを加えたときのGlyma.11g151800により生成したベツリン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。黒矢印のピークがベツリン酸モノグルクロニドを示す。（c）陰性対照のサンプルZを加えたときのベツリン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。
１．グルクロン酸第１転移酵素（CSyGT）
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、グルクロン酸第１転移酵素及びグルクロン酸第１転移活性を有するその断片、並びにそれらをコードする核酸に関する。本発明のグルクロン酸第１転移酵素は、多くの植物が生合成可能なβ－アミリンから、グリチルリチンを生合成するカンゾウ属特有の合成経路において、β－アミリンから2段階の酸化反応を経て得られるグリチルレチン酸の3位のヒドロキシル基へのグルクロン酸の配糖化反応を触媒する活性を有する。本発明のグルクロン酸第１転移酵素等により、グリチルレチン酸をはじめとするオレアナン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシル基にグルクロン酸を糖転移できるだけでなく、β-アミリンからグリチルリチンまでの生合成経路に関与する既知の酵素と組み合わせることにより、カンゾウ属植物以外の植物を宿主としたβ-アミリンからグリチルリチンまでの生物生産系の作出が可能となる。それにより、良質のグリチルリチンを安定的に、かつ持続的に提供することができる。
１－２．用語の定義
　本明細書において頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「グルクロン酸第１転移酵素（CSyGT）」（本明細書では、しばしば「CSyGT」と表記する）とは、3位の炭素にヒドロキシル基を有するオレアナン型トリテルペノイドに対し、そのヒドロキシル基に糖の一種であるグルクロン酸を1つ転移する糖転移反応を触媒する酵素をいう。ここでいう「第１」とは、オレアナン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシル基における2段階の糖転移反応において、最初の糖転移活性を有することをいう。グルクロン酸第１転移酵素の具体的な構成については、後述する。
　本明細書において「グルクロン酸第１転移活性を有するその断片」とは、前記グルクロン酸第１転移酵素の活性断片をいう。
　本明細書において「グルクロン酸第１転移活性」とは、前記CSyGTが有する糖転移反応を触媒する活性、すなわちオレアナン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシル基にグルクロン酸を転移する活性をいう。この活性により、オレアナン型トリテルペノイドからオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドが生成される。なお、本明細書ではCSyGT及びグルクロン酸第１転移活性を有するその断片をまとめて、しばしば「グルクロン酸第１転移活性を有するポリペプチド」又は「グルクロン酸第１転移酵素等（CSyGT等）」と表記する。なお、本明細書においてグルクロン酸第１転移酵素等は、異なる糖鎖が付加された糖タンパク質であってもよい。例えば、植物由来の糖鎖が付加されたグルクロン酸第１転移酵素等、及び酵母由来の糖鎖が付加されたグルクロン酸第１転移酵素等のいずれも本明細書におけるグルクロン酸第１転移酵素等に含まれる。
　「オレアナン型トリテルペノイド」とは、5環性のオレアナン骨格を有し、6個のイソプレン単位からなるC30のイソプレノイドをいう。本発明において最終目的物であるグリチルリチンの非糖部分（アグリコン）に相当する。本明細書に記載のオレアナン型トリテルペノイドは、特に断りの無い限り、3位の炭素にヒドロキシル基（OH基）を有するオレアナン型トリテルペノイドを意味する。オレアナン型トリテルペノイドの具体例として、限定はしないが、β-アミリン、11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-β-アミリン、24-ヒドロキシ-β-アミリン、11-デオキソグリチルレチン酸、グリチルレチン酸、オレアノール酸、メジカゲニン酸、ソヤサポゲノールB、ソヤサポゲノールA、ヘデラゲニン、カメリアゲニン、及びサイコゲニンが挙げられる。これらは、全て本発明のグルクロン酸第１転移酵素の基質となり得る。グルクロン酸第１転移活性により、前記基質から、β-アミリン-3-O-モノグルクロニド、11-オキソ-β-アミリン-3-O-モノグルクロニド、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリン-3-O-モノグルクロニド、30-ヒドロキシ-β-アミリン-3-O-モノグルクロニド、24-ヒドロキシ-β-アミリン-3-O-モノグルクロニド、11-デオキソグリチルレチン酸-3-O-モノグルクロニド、グリチルレチン酸-3-O-モノグルクロニド、オレアノール酸-3-O-モノグルクロニド、メジカゲニン酸-3-O-モノグルクロニド、ソヤサポゲノールB-3-O-モノグルクロニド、ソヤサポゲノールA-3-O-モノグルクロニド、ヘデラゲニン-3-O-モノグルクロニド、カメリアゲニン-3-O-モノグルクロニド、及びサイコゲニン-3-O-モノグルクロニドが生合成される。
　本明細書においてマメ科（Fabaceae）植物は、カンゾウ属植物に限定はされず、植物分類学上のマメ科に属する全ての植物種が包含される。例えば、ラッカセイ属（Arachis）植物、ヒヨコマメ属（Cicer）植物、アスパラトゥス属（Aspalathus）植物、ツルサイカチ属（Dalbergia）植物、シタン属（Pterocarpus）植物、ヌスビトハギ属（Desmodium）植物、ハギ属（Lespedeza）植物、フジボグサ属（Uraria）植物、ゲンゲ連（Galegeae）植物、ゲンゲ属（Astragalus）植物、カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物、オヤマノエンドウ属（Oxytropis）植物、ギンヨウエニシダ属（Augyrocytisus）植物、エニシダ属（Cytisus）植物、ヒトツバエニシダ属（Genista）植物、レタマ属（Spartium）植物、イワオウギ属（Hedysarum）植物、クアスタマメ属（Cyamopsis）植物、コマツナギ属（Indigofera）植物、ミヤコグサ属（Lotus）植物、ルピナス属（Lupinus）植物、フジ属（Wisteria）植物、キマメ属（Cajanus）植物、ナタマメ属（Canavalia）植物、デイゴ属（Erythrina）植物、ダイズ属（Glycine）植物、ハーデンベルギア属（Hardenbergia）植物、フジマメ属（Lablab）植物、トビカズラ属（Mucuna）植物、インゲン属（Phaseolus）植物、シカクマメ属（Psophocarpus）植物、クズ属（Pueraria）植物、ササゲ属（Vigna）植物、ハリエンジュ属（Robinia）植物、カスタノスペルマム属（Castanospermum）植物、イヌエンジュ属（Maackia）植物、オルモシア属（Ormosia）植物、クララ属（Sophora）植物、エンジュ属（Styphnolobium）植物、ウマゴヤシ属（Medicago）植物、フェヌグリーク属（Trigonella）植物、シャジクソウ属（Trifolium）植物、レンリソウ属（Lathyrus）植物、ヒラマメ属（Lens）植物、エンドウ属（Pisum）植物及びソラマメ属（Vicia）植物が挙げられる。カンゾウ（G. uralensis）が属するカンゾウ属植物及びその近縁種であるウマゴヤシ属植物は、グリチルリチンを生合成する上でCSyGTの基質となるグリチルレチン酸の生合成経路を有する。それ故に、本発明のマメ科植物として好適である。カンゾウ属植物の具体例として、G. glabra（G.グラブラ）、G. inflata（G.インフラータ）、G. aspera（G.アスペラ）、G. eurycarpa（G.ユーリカルパ）、G. pallidiflora（G.パリディフローラ）、G. yunnanensis（G.ユンナネンシス）、G. lepidota（G.レピドータ）、G. echinata（G.エキナータ）、及びG. acanthocarpa（G.アカンソカルパ）等が、またウマゴヤシ属植物の具体例として、M. truncatula（M.トランカツラ；タルウマゴヤシ）等が挙げられる。
１－３．構成
　本発明のグルクロン酸第１転移酵素（CSyGT）は、配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、それぞれ、ダイズ（Glycine max）由来の野生型CSyGT（GmCSyGT）、カンゾウ（G. uralensis；G．ウラレンシス）由来の野生型CSyGT（GuCSyGT）、及びミヤコグサ（Lotus japonicus）由来の野生型CSyGT（LjCSyGT）に該当する。カンゾウ由来のGuCSyGTは、ダイズ由来のGmCSyGTに対して81％のアミノ酸同一性を有する。またミヤコグサ由来のLjCSyGTは、ダイズ由来のGmCSyGTに対して82％のアミノ酸同一性を有する。
　CSyGTは、前述の植物種以外にも他の多くの植物種、特にマメ科（Fabaceae）植物種にオルソログが存在し得る。本発明のCSyGTは、そのような他種野生型CSyGTオルソログの他にも、グルクロン酸第１転移活性を有する、同種野生型CSyGTパラログや変異型CSyGTも包含する。それらの他種野生型CSyGTオルソログや変異型CSyGTの例として、配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列に対して80％以上、82％以上、85％以上、87％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上で、100％未満のアミノ酸同一性を有するポリペプチドが挙げられる。実際、ダイズGmCSyGTに対してGuCSyGTとLjCSyGTは、それぞれカンゾウとミヤコグサのCSyGTオルソログであるが、アミノ酸同一性は前述のように80％以上を有する。また、グルクロン酸第１転移活性を有する変異型CSyGTには、限定はしないが、具体的には、スプライシングバリアントやSNPs等に基づく突然変異体等が挙げられる。
　本明細書において「複数個」とは、例えば、2～20個、2～15個、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個又は2～3個をいう。また、「アミノ酸同一性」とは、比較する2つのポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸残基の一致数が最大限となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入して整列化（アラインメント）したときに、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合（％）をいう。アミノ酸同一性を算出するための2つのアミノ酸配列の整列化は、Blast、FASTA、ClustalW等の既知プログラムを用いて行うことができる。
　本明細書において「(アミノ酸の）置換」とは、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸間において、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似する保存的アミノ酸群内での置換をいう。例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸群（Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr）、分枝鎖アミノ酸群（Leu, Val, Ile）、中性アミノ酸群（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸群（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr，Cys）、酸性アミノ酸群（Asp, Glu）、塩基性アミノ酸群（Arg,Lys,His）、芳香族アミノ酸群（Phe,Tyr,Trp）内での置換が挙げられる。これらの群内でのアミノ酸置換であれば、ポリペプチドの性質に変化を生じにくいことが知られているため好ましい。
　本態様において「その活性断片」とは、グルクロン酸第１転移酵素の一部領域を含み、かつグルクロン酸第１転移活性を保持するポリペプチド断片をいう。例えば、グルクロン酸第１転移酵素の基質結合部位を含むポリペプチド断片が挙げられる。本発明のグルクロン酸第１転移酵素の基質には、前述のオレアナン型トリテルペノイドが挙げられる。好ましくはグリチルレチン酸である。本活性断片を構成するポリペプチドのアミノ酸の長さは、特に制限はしない。例えば、上記（ａ）～（ｃ）のポリペプチドにおいて少なくとも10、15、20、25、30、50、100又は150アミノ酸の連続する領域であればよい。
　なお、本明細書では、CSyGT及びその活性断片をまとめて、しばしば「CSyGT等（グルクロン酸第１転移酵素等）」と表記する。
　本発明のCSyGT等によれば、オレアナン型トリテルペノイドを糖受容体基質として、グルクロン酸第１転移活性によりグルクロン酸を3位のヒドロキシル基に糖転移することでオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドを得ることができる。
　カンゾウにおけるグリチルリチンの生合成系において、起源物質ともいえるオレアナン型トリテルペノイドのβ-アミリンからグリチルレチン酸までを生合成する経路は、既に明らかになっており、人工的な生合成も可能である。さらに、グリチルレチン酸にグルクロン酸が１分子糖転移したグリチルレチン酸モノグルクロニドに、さらにグルクロン酸を糖転移してグリチルリチンを生合成する経路も明らかになっている。つまり、β-アミリンからグリチルリチンを生合成経路において、グリチルレチン酸にグルクロン酸を糖転移してグリチルリチン酸モノグルクロニドを生合成する経路のみがこれまで未知であった。しかし、本発明により、カンゾウにおけるグリチルリチンの生合成経路が全て明らかとなったことで、β-アミリンからグリチルリチンまでのインビトロ合成が可能となる。また、β-アミリンは、カンゾウ以外の数多くの植物種が生合成できることから、それらの中で一般的な植物種を宿主としたインビボ合成系も可能となる。さらにまた、β-アミリンは含まれないがβ-アミリンの前駆体を生合成できる生物であれば、β-アミリンを生合成する遺伝子とともに用いることにより、植物以外の生物でもそれらを宿主としたインビボ合成系も可能となる。
２．グルクロン酸第１転移酵素遺伝子（CSyGT遺伝子）及びその活性断片
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、第１態様に記載のポリペプチド（CSyGT等）をコードするポリヌクレオチド、すなわちグルクロン酸第１転移酵素遺伝子及びその活性断片に関する。本発明のポリヌクレオチドにより、後述の第３態様の組換えベクターの構築が可能となる。
２－２．構成
　「グルクロン酸第１転移酵素遺伝子」（本明細書では、しばしば「CSyGT遺伝子」と表記する）とは、第１態様に記載のCSyGTをコードするポリヌクレオチドをいう。CSyGTをコードするポリヌクレオチドであれば、その塩基配列は特には限定しない。好ましくは配列番号１、３、５で示すアミノ酸配列を含む野生型CSyGTをコードするポリヌクレオチドである。例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるダイズ由来の野生型GmCSyGTをコードするポリヌクレオチド、具体的には、例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、すなわちダイズ由来の野生型GmCSyGT遺伝子が挙げられる。また、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるカンゾウ由来の野生型GuCSyGTをコードするポリヌクレオチド、具体的には、例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、すなわちカンゾウ由来の野生型GuCSyGT遺伝子が挙げられる。そして、配列番号５で示すアミノ酸配列からなるミヤコグサ由来の野生型LjCSyGTをコードするポリヌクレオチド、具体的には、例えば、配列番号６で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、すなわちミヤコグサ由来の野生型LjCSyGT遺伝子が挙げられる。
　また、前記野生型CSyGT遺伝子の他種オルソログ、及び酵素活性を維持した変異型CSyGT遺伝子も含まれる。そのようなCSyGT遺伝子の例として、野生型CSyGT遺伝子の１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、例えば、ダイズ由来の野生型GmCSyGT遺伝子（例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）、カンゾウ由来の野生型GuCSyGT遺伝子（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）、及びミヤコグサ由来の野生型LjCSyGT遺伝子（例えば、配列番号６で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）のいずれかの塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　さらに、野生型CSyGT遺伝子と80％以上、85％以上、87％以上、90％以上、95％以上、又は99％以上で、100％未満のアミノ酸同一性の塩基同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、例えば、ダイズ由来の野生型GmCSyGT遺伝子（例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）、カンゾウ由来の野生型GuCSyGT遺伝子（例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）、及びミヤコグサ由来の野生型LjCSyGT遺伝子（例えば、配列番号６で示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）のいずれかの塩基配列と、80％以上、85％以上、87％以上、90％以上、95％以上、又は99％以上で、100％未満の塩基同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　そして、野生型CSyGT遺伝子の部分塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド断片と高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドで酵素活性を保持するヌクレオチドも含まれる。
　本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されにくい条件を意味する。「高ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドがより形成されにくい、又は形成されない条件をいう。一般に、反応条件が低塩濃度で、かつ高温になるほど高ストリンジェントな条件となる。例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば50℃～70℃、55℃～68℃、又は65℃～68℃で、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。この他、プローブ濃度、プローブ塩基長、ハイブリダイゼーション時間等のその他の条件を適宜組み合わせてハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高くすることもできる。
　本態様において「その活性断片」とは、CSyGT遺伝子の断片であって、その断片にコードされたポリペプチドがCSyGT活性を有するものをいう。実質的に、前記第１態様に記載のCSyGTの活性断片をコードするポリヌクレオチドが該当する。したがって、本活性断片を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の長さ、すなわち塩基数は、前記第１態様に記載のCSyGTの活性断片におけるアミノ酸配列数の3倍あればよい。
　本発明のポリヌクレオチド又はその活性断片によれば、CSyGT及びその活性断片を宿主細胞内で発現可能な組換えベクターを構築することができる。
　なお、本明細書では、CSyGT遺伝子及びその活性断片をまとめて、しばしば「CSyGT遺伝子等（グルクロン酸第１転移酵素遺伝子等）」と表記する。
　本態様のCSyGT遺伝子等は、適当な植物、例えば、マメ科植物から公知の方法を用いて単離することができる。例えば、配列番号２で示すダイズ由来の野生型GmCSyGT遺伝子の塩基配列に基づいて、適当な塩基配列長を有するプライマーペアを設計する。具体的には、例えば、配列番号１７及び１８で示されるプライマーペアが挙げられる。GmCSyGT遺伝子は、そのペアを用いて、ダイズのDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリー由来の核酸を鋳型としてPCR等の核酸増幅反応を行うことにより得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２で示す塩基配列の一部からなる核酸断片をプローブとして、前記ライブラリー等からハイブリダイゼーションにより得ることができる。これらの方法は、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参照すればよい。
３．組換えベクター
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターは、上記第２態様に記載のポリヌクレオチドを含み、宿主細胞内で、CSyGT遺伝子等をクローニングすること、又はCSyGT等を発現することができる。本態様では、特に、CSyGT等を発現するCSyGT発現ベクターが好ましく適用される。
３－２．構成
　本発明の組換えベクターは、第２態様に記載のポリヌクレオチドを適当な組換えベクターに導入することによって構築することができる。ベクターの種類は、特に限定しない。クローニング用（形質転換用）、又は遺伝子発現用等のベクターを目的に応じて、又は導入する宿主に応じて、適宜選択すればよい。植物形質転換用ベクター又は（遺伝子）発現ベクターは特に好ましい。
　本発明において「（遺伝子）発現ベクター」とは、内包するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを目的とする植物細胞内に運搬して、当該ポリペプチドを発現させることのできる遺伝子発現システムである。例えば、プラスミド又はウイルスを利用した発現ベクターが挙げられる。本発明ではCSyGT遺伝子等を組み込んだCSyGT等を発現するCSyGT発現ベクターが該当する。
　プラスミドを利用した発現ベクター（以下、しばしば「プラスミド発現ベクター」と表記する）の場合、プラスミドには、限定はしないが、例えば、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（Agilent Technologies社）、pTriEXTM系（TaKaRa社）、又はpBI系、pRI系若しくはpGW系のバイナリーベクター等を利用することができる。
　ウイルスを利用した発現ベクター（以下、しばしば「ウイルス発現ベクター」と表記する）の場合、ウイルスには、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等を利用することができる。
　前記組換えベクターは、プロモーター及びターミネーターの発現調節領域が含まれる。この他にも、エンハンサー、ポリA付加シグナル、5'-UTR（非翻訳領域）配列、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むこともできる。それぞれの種類は、宿主細胞内でその機能を発揮し得るものであれば、特に限定されない。導入する宿主に応じて当該分野で公知のものを適宜選択すればよい。好ましくは、植物細胞又は植物体を宿主とする場合である。
　プロモーターは、各種プロモーター、例えば、過剰発現型プロモーター、構成的プロモーター、部位特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、及び／又は誘導性プロモーターを用いることができる。植物細胞で作動可能な過剰発現型で構成的プロモーターの具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来の35Sプロモーター、Tiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のプロモーターPnos、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。様々な植物種のリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（Rubisco ssu）プロモーター、又はヒストンプロモーターも使用することができる。また、細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、Bacillus stearothermophilus（バチルス・ステアロテルモフィルス）のマルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformis（B.リケニホルミス）のαアミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens（B.アミロリケファチエンス）のBANアミラーゼ遺伝子、Bacillus subtillis（B.サブチリス）アルカリプロテアーゼ遺伝子若しくはBacillus pumilus（B.プミルス）のキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージ・ラムダのPR若しくはPLプロモーター、大腸菌のlac、trp若しくはtacプロモーター等が挙げられる。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、TPI1プロモーター、ADH2-4cプロモーター等が挙げられる。真菌で作動可能なプロモーターとしては、ADH3プロモーター、tpiAプロモーター等が挙げられる。動物細胞で作動可能なプロモーターとしては、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、CMVプロモーター等、昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、バキュロウイルスであるAutographa californica polyhedrosis（オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス）の塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。
　ターミネーターは、例えば、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（OCS）遺伝子のターミネーター、CaMV 35Sターミネーター、大腸菌リポポリプロテインlppの３’ターミネーター、trpオペロンターミネーター、amyBターミネーター、ADH1遺伝子のターミネーター等が挙げられる。前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定はしない。
　エンハンサーであれば、例えば、CaMV 35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が挙げられる。活性ペプチドをコードする核酸等の発現効率を増強できるものであれば特に限定はされない。
　選抜マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、又はネオマイシン耐性遺伝子）、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ（GUS）、又はグリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP））、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）、ジヒドロ葉酸還元酵素等の酵素遺伝子が挙げられる。
　本発明の組換えベクターによれば、前記第２態様に記載のポリヌクレオチドの操作及び／又は発現等の制御が容易となる他、宿主細胞内でのCSyGT等の発現を操作することができる。
４．形質転換体又はその後代
４－１．概要
　本発明の第４の態様は、形質転換体又はその後代に関する。本発明の形質転換体又はその後代は、前記第２態様に記載のポリヌクレオチド又は前記第３態様に記載の組換えベクターを細胞内に含み、CSyGT遺伝子等のクローニング、及び／又はCSyGT等を発現することができる。本発明の形質転換体によれば、インビボ発現系でCSyGT等を安定的に生合成することかが可能となる。
４－２．構成
　本明細書において「形質転換体」とは、第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターの導入によって形質転換された宿主をいう。
　形質転換される宿主は、特に限定はしない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)又は枯草菌(Bacillus subtilis)のような細菌、例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)又はメタノール資化性酵母(Pichia pastoris)のような酵母、コウジカビ(Aspergillus)、アカパンカビ(Neurospora)、フザリウム(Fuzarium)又はトリコデルマ(Trichoderma)のような真菌、単子葉植物、双子葉植物、あるいは植物細胞、哺乳動物細胞、又は昆虫細胞（例えば、sf9、又はsf21）が挙げられる。好ましくはマメ科植物又は酵母である。
　本発明の形質転換体は、同一の遺伝情報を有するクローン体を包含する。例えば、宿主が大腸菌や酵母等の無性生殖を行う単細胞微生物であれば、形質転換体第１世代から分裂又は出芽等によって新たに生じたクローン体も本発明の形質転換体に包含される。また、宿主が植物であれば、形質転換体第１世代から採取した植物体の一部、例えば、表皮、師部、柔組織、木部若しくは維管束のような植物組織、葉、花弁、茎、根若しくは種子のような植物器官、又は植物細胞から植物組織培養法や挿し木、接木若しくは取り木によって得られるクローン体、あるいは根茎、塊根、球茎、ランナー等のような形質転換体第１世代から無性生殖で得られる栄養繁殖器官より新たに生じた新たなクローン体も本発明の形質転換体に含まれる。
　本発明の形質転換体は、第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターに加え、さらに一以上の他のポリヌクレオチド又は他の組換えベクターを有していてもよい。ここでいう他のポリヌクレオチドとは、第２態様に記載のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドをいう。例えば、β-アミリン合成酵素遺伝子、CYP88D6若しくはCYP72A154、又はいずれかのオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニド合成酵素遺伝子が該当する。また、他の組換えベクターとは、第３態様に記載の組換えベクター以外の組換えベクターをいう。
　本発明の形質転換体は、上記ポリヌクレオチド又は組換えベクターを適当な宿主に導入することによって作製することができる。
　前記ポリヌクレオチド又は組換えベクターの導入方法は、当該分野で公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法を用いることができる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主のゲノムDNA中に組み込まれてもよいし、導入されたポリヌクレオチドの状態（例えば、外来ベクターに含有されたまま）で存在していてもよい。さらに、導入されたポリヌクレオチドは、宿主のゲノムDNA中に組み込まれた場合のように宿主細胞内で維持され続けてもよいし、一過的に保持されてもよい。
　上述の方法で第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターを宿主に導入した後、目的のポリヌクレオチドの導入の有無をPCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション等によって確認することができる。
　本明細書において「その後代」とは、前記形質転換体第1世代の有性生殖を介した子孫であって、本発明の第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターを発現可能な状態で保持している宿主を意味する。好ましくは、前記ポリヌクレオチド又は前記組換えベクターにおける第２態様に記載のポリヌクレオチドを発現可能な状態で保持している宿主子孫をいう。例えば、形質転換体が植物の場合には、その形質転換体の実生が該当する。後代の世代は問わない。
　本態様の形質転換体によれば、導入されたポリヌクレオチドの発現を増強することによって、宿主細胞内に存在するオレアナン型トリテルペノイドをオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドに変換することができる。また、形質転換体の宿主を変えることで、異なる糖鎖が付加されたグルクロン酸第１転移酵素を得ることができる。例えば、形質転換体の宿主が酵母の場合、マメ科植物を宿主とする場合とは異なり、高マンノース型糖鎖が付加されたグルクロン酸第１転移酵素が発現する。これは、酵母における糖鎖付加反応が植物のそれとは異なるためである（Strasser R. Glycobiology, 2016, 26(9): 926-939）。
５．グルクロン酸第１転移酵素及びその活性断片（CSyGT等）の製造方法
５－１．概要
　本発明の第５の態様は、第４態様の形質転換体又はその後代を培養して、その培養物から第１態様に記載のグルクロン酸第１転移活性を有するポリペプチド、すなわちCSyGT等を抽出することを含む、CSyGT等の製造方法に関する。本発明のポリヌクレオチドの製造方法によれば、宿主を生物生産系として利用することで、CSyGT等を安定的に、かつ大量に得ることが可能となる。
５－２．方法
　本発明の製造方法は、必須の工程として培養工程及び抽出工程を含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
（１）培養工程
　本態様において「培養工程」は、第４態様の形質転換体又はその後代を培養する工程である。本発明で使用する形質転換体又はその後代は、第１態様に記載のポリペプチドを過剰発現可能な又は構成的に発現可能な、形質転換体又はその後代を用いることが好ましい。例えば、第３態様に記載の組換えベクターを有する形質転換体又はその後代であれば、組換えベクターが過剰発現型プロモーターや構成的プロモーターを含む発現ベクターであることが好ましい。第４態様の形質転換体又はその後代は、いずれを宿主としていてもよいが、好ましくはマメ科植物又は酵母である。宿主を変えることによって、同じ第１態様に記載のグルクロン酸第１転移酵素を発現しても、異なる糖鎖が付加された糖タンパク質を得ることができる。
　培養に使用する培地には、宿主の培養に適した培地を適宜使用すればよい。培地は、当該分野で公知のものを使用することができる。例えば、限定はしないが、大腸菌等の細菌を宿主として培養する場合であれば、LB培地若しくはM９培地等、酵母を宿主として培養する場合であれば、YPD培地、YPG培地、YPM培地、YPDM培地、SMM培地等、植物を宿主として培養する場合であれば、適当な培養土や水耕栽培用培地が挙げられる。
　培地は、炭素源（例えば、グルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトース等）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等の有機窒素源）、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等）、ビタミン（ビタミンB１等）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等の抗生物質）等を適宜含有する。
　培養条件は、ポリヌクレオチドの発現に適切であれば特に限定されないが、通常10～45℃、15～40℃、18～37℃の温度下で、必要に応じて通気、照射、及び／又は攪拌をしながら、数時間～数百時間培養する。
（２）抽出工程
　本態様において「抽出工程」は、前記培養工程で得られた培養物からCSyGT等を抽出する工程である。
　本明細書において「培養物」とは、培養上清又は培養された形質転換体をいう。形質転換体の細胞内はもちろんのこと、内容上清にも形質転換体から分泌されたCSyGT等が含まれ得る。
　培養物から、第１態様に記載のポリペプチドを回収するには、培養物に存在するポリペプチドを公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。例えば、溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、あるいは適宜組み合わせて、目的のポリペプチドを得ることができる。具体的には、前述のHayashiらの方法 (Hayashi et al., 1996, Phytochemistry, 42: 665-666)やNoguchiらの方法（Noguchi et al., 2007, J. Biol. Chem., 282: 23581-23590）を参照すればよい。また、宿主に特異的な糖鎖に基づいて、目的の第１態様に記載のポリペプチドを回収することもできる。例えば、第４態様の形質転換体又はその後代が酵母の場合、発現した本発明のポリペプチドは、高マンノース型糖鎖が付加されているので、マンノース結合レクチン（例えば、UDAレクチン、BC2L-Aレクチン等）を用いて抽出、精製することもできる。
６．グリチルリチン製造用遺伝子組換え体
６－１．概要
　本発明の第６の態様は、グリチルリチン製造用遺伝子組換え体である。本発明の遺伝子組換え体は、カンゾウ属植物におけるβ-アミリンからグリチルリチンに至る生合成経路に必要とされる1組の酵素群、すなわち２段階の酸化反応及び２段階の配糖化反応を触媒する4種の酵素群を発現する発現ベクターを含む。本発明の遺伝子組換え体は、生物細胞内でβ-アミリンからグリチルリチンを生合成することができ、それによりグリチルリチンの生物生産系として利用することができる。
６－２．構成
６－２－１．包含する発現ベクター
　本発明の遺伝子組換え体は、その特徴として宿主細胞内にβ-アミリンからグリチルリチンに至る生合成経路に必要とされる4種1組の酵素群及び／又はそれぞれの活性断片をコードするポリヌクレオチドを包含する発現ベクターを少なくとも含む。必要に応じて、β-アミリン合成酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドを包含する発現ベクターをさらに含んでいてもよい。前記4種の酵素は、β-アミリンの第1段階酸化反応及び第２段階酸化反応、オレアナン型トリテルペノイドの第1段階配糖化反応及び第２段階配糖化反応のそれぞれを触媒するポリペプチドである。それぞれの酵素又はその活性断片を含む発現ベクターを以下の（１）～（４）で示し、具体的に説明する。なお、（１）～（４）では、前記4種の発現ベクターをそれぞれ別個に記載しているが、各酵素の遺伝子は、それぞれ異なる発現ベクターに含まれていてもよいし、同一の発現ベクターに2種以上含まれていてもよい。
（１）CYP88D6発現ベクター
　「CYP88D6発現ベクター」は、オレアナン型トリテルペノイドにおける11位を酸化する活性を有するポリペプチド、すなわちCYP88D6及びその活性断片（本明細書では、しばしば「CYP88D6等」と表記する）をコードする遺伝子及びその断片（本明細書では、しばしば「CYP88D6遺伝子等」と表記する）を含んでいる。したがって、遺伝子組換え体内ではCYP88D6発現ベクターによりCYP88D6等が発現する。
　前記CYP88D6の具体例として、限定はしないが、配列番号７で示すアミノ酸配列からなるカンゾウ（G. uralensis）由来のCYP88D6が挙げられる。また、前記酸化第1段階の活性を有し、配列番号７で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、又は配列番号７で示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも例示される。
　限定はしないが、本発明の遺伝子組換え体においては、CYP88D6発現ベクターから発現したCYP88D6等の触媒活性等により、主に内因性又は外因性のβ-アミリンを基質として、その11位を酸化して11-オキソ-β-アミリンを生産することができる。また、30-ヒドロキシ-β-アミリンを基質として、その11位を酸化して30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンを生産することができる。さらに、また、11-デオキソグリチルレチン酸を基質として、その11位を酸化してグリチルレチン酸を生産することができる。
　CYP88D6発現ベクターにおけるプラスミド領域の構成は、前記第３態様に記載の組換えベクターにおける発現ベクターに準ずる。また、特許第5526323号に記載の組換えベクターを利用してもよい。
（２）CYP72A154発現ベクター
　「CYP72A154発現ベクター」は、オレアナン型トリテルペノイドにおける30位を酸化する活性を有するポリペプチド、すなわちCYP72A154及びその活性断片（本明細書では、しばしば「CYP72A154等」と表記する）をコードする遺伝子及びその断片（本明細書では、しばしば「CYP72A154遺伝子等」と表記する）を含んでいる。したがって、遺伝子組換え体内ではCYP72A154発現ベクターによりCYP72A154等が発現する。
　前記CYP72A154の具体例として、限定はしないが、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるカンゾウ（G. uralensis）由来のCYP72A154、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるグルキルリザ グラブラ（G. glabra）由来のCYP72A154、及び配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるタルウマゴヤシ（Medicago truncatula）由来のCYP72A63が挙げられる。また、前記酸化第２段階の活性を有し、配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、又は配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも例示される。
　限定はしないが、本発明の遺伝子組換え体においては、CYP72A154発現ベクターから発現したCYP72A154等の触媒活性等により、主にβ-アミリン及び11-オキソ-β-アミリンを基質として、その30位を酸化して、それぞれ30-ヒドロキシ-β-アミリン及び30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンを生産することができる。また、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンを基質として、その30位をさらに酸化してグリチルレチン酸を生産することができる。
　CYP72A154発現ベクターにおけるプラスミド領域の構成は、前記第３態様に記載の組換えベクターにおける発現ベクターに準ずる。また、特許第5771846号に記載の組換えベクターを利用してもよい。
（３）UGT73P12組換えベクター
　「UGT73P12組換えベクター」は、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性をポリペプチド、すなわちUGT73P12及びその活性断片（本明細書では、しばしば「UGT73P12等」と表記する）をコードする遺伝子及びその断片（本明細書では、しばしば「UGT73P12遺伝子等」と表記する）を含んでいる。したがって、遺伝子組換え体内ではUGT73P12発現ベクターによりUGT73P12等が発現する。
　前記UGT73P12の具体例として、限定はしないが、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるカンゾウ（G. uralensis）由来のUGT73P12が挙げられる。また、前記第２段階配糖化活性を有し、配列番号１５で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、又は配列番号１５で示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも例示される。
　UGT73P12発現ベクターにおけるプラスミド領域の構成は、前記第３態様に記載の組換えベクターにおける発現ベクターに準ずる。また、特許第6344774号に記載の組換えベクターを利用してもよい。
（４）CSyGT発現ベクター
　「CSyGT発現ベクター」は、前記第３態様に記載のCSyGT組換えベクターにおけるCSyGT発現ベクターが該当するので、ここでの詳細な説明は省略する。
６－２－２．グリチルリチン製造用遺伝子組換え体
　本発明の「グリチルレチン酸製造用遺伝子組換え体」とは、少なくとも前記4種の酵素遺伝子群を含む発現ベクターを導入された形質転換体、又はそれらの酵素遺伝子群を保持するその後代をいう。したがって、包含する発現ベクターの種類が異なることを除けば、その基本構成は、前記第４態様に記載の形質転換体及びその後代と同じでよい。ただし、本発明は、細胞内でβ-アミリンからグリチルリチンを生合成可能な遺伝子組換え体であることから、前記生合成系における出発物質であるβ-アミリンを細胞内で生合成できる宿主であることが好ましい。宿主におけるβ-アミリンの生合成は、内因的な合成系に基づくものであってもよいし、外因的な合成系に基づくものであってもよい。オレアナン型トリテルペノイドであるβ-アミリンは多くの植物が生合成可能であることから、内因的な合成系に基づく場合、本発明の宿主は植物が好ましい。好ましくはβ-アミリン合成能が高く、繁殖力が旺盛で、育成しやすい植物種である。より好ましくはカンゾウに比較的近縁な植物、すなわちマメ科植物である。例えば、グリキルリザ属に属する種、ダイズ属に属する種、ミヤコグサ属に属する種等が挙げられる。一方、β-アミリンの生合成が外因的な合成系に基づく場合、宿主自身がβ-アミリンを生合成できない生物種であってもよい。例えば、β-アミリン合成酵素遺伝子を含む発現ベクターを酵母に導入しておくことで、その酵母の形質転換体をβ-アミリンを細胞内で生合成できる宿主として利用することができる。
　本発明によれば、従来グリチルリチンを生合成できなかった宿主であっても、β-アミリンを出発物質として、その代謝産物としてグリチルリチンを生合成できるようになる。
７．グリチルリチンの製造方法
７－１．概要
　本発明の第７の態様は、グリチルリチンの製造方法である。本発明の製造方法は、前記第６態様のグリチルリチン製造用遺伝子組換え体を生物生産系として使用し、β-アミリンからグリチルリチンを製造することを特徴とする。
　本発明の製造方法によれば、従来高価であったグリチルリチンをカンゾウからの抽出に依ることなく、安定的に、かつ大量に製造することが可能となる。
７－２．方法
　本発明の製造方法は、必須の工程として培養工程を、また選択工程として「抽出工程」を含む。
（１）培養工程
　本態様における「培養工程」は、基本的には第５態様に記載の培養工程に準ずればよい。遺伝子組換え体が植物の場合、公知の条件植物を培養する方法を適用すればよい。本工程により前記第６態様のグリチルリチン製造用遺伝子組換え体中でグリチルリチンが製造される。
（２）抽出工程
　本態様における「抽出工程」は、基本的には第５態様に記載の抽出工程に準ずればよい。遺伝子組換え体が植物の場合、カンゾウからグリチルリチンを抽出する方法と同じ方法を用いることができる。
　本発明の製造方法によって、様々な遺伝子組換え体からグリチルリチンをカンゾウからの抽出に依ることなく、安定的に、かつ大量に製造することが可能となる。
　以下の実施例において、本発明の一例を挙げて具体的に説明する。
＜実施例１：ダイズ由来セルロース合成酵素類似遺伝子Glyma.06G324300の単離＞
　温室で栽培したダイズ（Glycine max）品種「Williams 82」の登熟中の種子を採取した。RNA抽出試薬RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)を用いて添付のプロトコルに従い、トータルRNAを調製した。得られたトータルRNAを200ng用いて、QuantiTech Reverse Transcription Kit (QIAGEN社)を用いて添付のプロトコルに従いファーストストランドcDNAを合成した。5倍希釈したファーストストランドcDNA各1μLを鋳型として、Glyma.06G324300から推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号１７）及びリバースプライマー（配列番号１８）に用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いてアニール温度55℃、反応温度68℃で30サイクルのPCRを行った。なお、pDONRTM221（Thermo Fisher Technologies社）へのクローニングの際の塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY　attB × attP反応）に必要なことから前記フォワードプライマーには、5’末端に12塩基（AAAAAGCAGGCT）が、そして前記リバースプライマーには、5’末端に12塩基（AGAAAGCTGGGT）が、人工的に付加されている。種子由来のファーストストランドcDNAから増幅されたDNA断片をGateway BP Clonase II Enzyme Mix（Thermo Fisher Technologies社）を用いて塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY attB × attP反応）によりpDONRTM221にクローニングし、得られた３個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られた配列が配列番号２であり、それから推定されるポリペプチド配列が配列番号１であった。
＜実施例２：カンゾウ由来Glyma.06G324300相同遺伝子の探索＞
　ダイズと同じマメ科植物であり、グリチルリチンを生合成することが知られているカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis）から、遺伝子相同検索によってGlyma.06G324300のオルソログ遺伝子候補としてGlyma.06G324300相同遺伝子を探索した。カンゾウのゲノム情報データベースであるGlycyrrhiza uralensis GDB（http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/index.pl）内のBLAST相同性探索機能を使用し、Glyma.06G324300に高いアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする1種の塩基配列Glyur003152s00037491を見出した。Glyur003152s00037491から推定されるポリペプチドは、Glyma.06G324300に対して81％のアミノ酸同一性を示した。
＜実施例３：カンゾウ由来Glyma.06G324300相同遺伝子の単離＞
　カンゾウの根から、RNA抽出試薬PureLink Plant RNA Reagent (Thermo Fisher Scientific社)を用いてトータルRNAを調製した。得られたトータルRNAを1μg用いて、SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech社)を用いて添付のプロトコルに従いファーストストランドcDNA合成を行った。ファーストストランドcDNA 2μLを鋳型として、Glyur003152s00037491から推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）に用い、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いてアニール温度55℃、反応温度72℃で30サイクルのPCRを行った。なお、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（Thermo Fisher Technologies社）へのクローニングに必要なことから、前記フォワードプライマーには、5’末端に4塩基（cacc）が人工的に付加されている。増幅されたDNA断片をpENTRTM/D-TOPOエントリーベクターにクローニングし、得られた4個の独立クローンについて塩基配列を決定した。これにより得られたカンゾウのGlyma.06G324300相同遺伝子の塩基配列が配列番号４であり、それから推定されるポリペプチド配列が配列番号３である。配列番号３のアミノ酸配列は配列番号１で示すアミノ酸配列に対して82％の同一性を有していた。
＜実施例４：ミヤコグサ由来Glyma.06G324300相同遺伝子の探索＞
　実施例２と同様の方法で、ミヤコグサ（Lotus japonicus）由来のGlyma.06G324300オルソログ遺伝子候補としてGlyma.06G324300相同遺伝子を探索した。ミヤコグサのゲノム情報データベースであるmiyakogusa.jp（http://www.kazusa.or.jp/lotus/release1/index.html）内のBLAST相同性検索機能を使用し、Glyma.06G324300に高いアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする1種の塩基配列Lj3g3v1981230を見出した。Lj3g3v1981230から推定されるポリペプチドはGlyma.06G324300に対して81.4％のアミノ酸同一性を示した。
＜実施例５：ミヤコグサ由来Glyma.06G324300相同遺伝子の単離＞
　ミヤコグサから得られたトータルRNAを1μg用いて、SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech社)を用いて添付のプロトコルに従いファーストストランドcDNAを合成した。ファーストストランドcDNA 2μlを鋳型として、Lj3g3v1981230から推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号３７）及びリバースプライマー（配列番号３８）に用い、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いてアニール温度55℃、反応温度72℃で30サイクルのPCRを行った。なお、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（Thermo Fisher Technologies社）へのクローニングに必要なことから、前記フォワードプライマーには、5’末端に4塩基（cacc）が人工的に付加されている。増幅されたDNA断片をpENTRTM/D-TOPOエントリーベクターにクローニングし、得られた2個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られたミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子の塩基配列が配列番号６であり、それから推定されるポリペプチド配列が配列番号５である。配列番号５は配列番号１で示すアミノ酸配列に対して82％の同一性を有していた。
＜実施例６：酵母発現用デスティネーションベクターの構築＞
　実施例１、３、及び５で単離されたGlyma.06G324300とその相同タンパク質の予想される糖転移活性を調べるため、酵母発現系を用いて、各タンパク質の発現ベクターを構築した。
　使用した酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1株には、候補遺伝子産物で想定される配糖化反応において、糖供与体基質となるUDP-グルクロン酸を内在していない。そこで、酵母内在のUDP-グルコースを基質としてUDP-グルクロン酸を合成するUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ（UGD）遺伝子を酵母発現用デスティネーションベクターに導入した。具体的には、シロイヌナズナ由来UGD（AtUGD2）のcDNAを鋳型として、ポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号２１）及びリバースプライマー（配列番号２２）に用い、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いてアニール温度55℃、反応温度72℃で30サイクルのPCRを行った。なお、In-fusionクローニングに必要なことから、フォワードプライマーには、配列番号２３（gggcggccgcactag）で示すポリヌクレオチドの5’末端にデスティネーションベクターのクローニング位置の上流15塩基、及び4塩基(aaaa)の計19塩基が人工的に付加されている。また、前記リバースプライマーには、配列番号２４（atccatcgatactag）で示すポリヌクレオチドの3’末端にデスティネーションベクターのクローニング位置の下流15塩基が付加されている。pESC-HIS（登録商標）酵母発現ベクター（Agilent Technologies）が有するMCS2内のSrfI制限酵素サイトにGateway cassette A（Thermo Fisher Technologies社）を導入して作られたデスティネーションベクターpESC-HIS-GWをSpeI制限酵素で処理し、cDNAから増幅されたDNA断片と混合し、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ社）を用いて配列番号２５で示すDNA断片をpESC-HIS-GW内のMCS1に導入し、デスティネーションベクターpESC-HIS-AtUGD2-GWを得た。
＜実施例７：酵母発現クローンの構築＞
　実施例１で作製した配列番号２で示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）と実施例６で作製したデスティネーションベクターpESC-HIS-AtUGD2-GWを混合し、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix（Thermo Fisher Technologies社）を用いて塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY　attL × attR反応）により、配列番号２で示すDNA断片をpESC-HISに移し替えることで配列番号２で示す遺伝子の酵母発現ベクターpESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300を得た。また、上記と同じ手法で実施例３、５において作製した配列番号４、及び６で示す遺伝子の酵母発現ベクターpESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230をそれぞれ得た。
＜実施例８：グリチルレチン酸及びソヤサポゲノールB生産酵母株への導入＞
　酵母INVScI株（Thermo Fisher Technologies社）（MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52 MATAlpha his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52）に、ミヤコグサのβ-アミリン合成酵素（LjOSC1）遺伝子の発現ベクターpYES3-BAS、CYP88D6遺伝子とミヤコグサのシトクロムP450レダクターゼ（LjCPR1）の同時発現ベクターpESC-CPR-CYP88D6、カンゾウCYP72A154遺伝子のタルウマゴヤシオルソログであるCYP72A63遺伝子の発現ベクターpDEST52-CYP72A63を導入し、同時発現させることでグリチルレチン酸生産酵母株を得た（図３(a)）。同時に、β-アミリン合成酵素遺伝子の発現ベクターpYES3-BAS、CYP93E3遺伝子とミヤコグサのシトクロムP450レダクターゼ（LjCPR1）の同時発現ベクターpESC-CPR-CYP93E3、CYP72A566遺伝子の発現ベクターpDEST52-CYP72A566を導入し、同時発現させることでソヤサポゲノールB生産酵母を得た（図３(b)）。これらの酵母株に、実施例７で得られたpESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230をそれぞれ導入した。陰性対照として、グリチルレチン酸生産酵母株に空ベクターに相当するpESC-HIS-AtUGD2を導入した。酵母の形質転換は、Frozen-EZ Yeast Transformation II（Zymo Research社）を用いて添付のプロトコルに従い行った。
＜実施例９：組換え酵母を用いたインビボ酵素アッセイ＞
　実施例８で得られた、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230又は陰性対照用pESC-HIS-AtUGD2を保持するグリチルレチン酸生産酵母株を、2％グルコースを含む1mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-Trp/-Leu/-Ura/-His）を用いて、30℃、200rpmで24時間振とう培養した。その後、培養液を3,000g、4℃で5分間遠心して酵母細胞のペレットを得た。得られた酵母細胞のペレットを1mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-Trp/-Leu/-Ura/-His）に懸濁した後、再び3,000g、4℃で5分間遠心して酵母細胞のペレットを得た。得られた酵母細胞のペレットを2％ガラクトースを含む5mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-Trp/-Leu/-Ura/-His）に懸濁し、30℃、200rpmで5日間振とう培養した。その後、培養液に１ｍL相当の体積のガラスビーズ（SIGMA社）と、4mLの1－ブタノールを加えた。酵母細胞を破砕するために、30分間ストロングシェーカーで激しく撹拌し、得られた液体を、10,000g、4℃で10分間遠心した後、上清を酵母代謝産物抽出物として回収した。残った液体に4mLの1-ブタノールを新たに加えて、再度30分間撹拌し、得られた液体を、10,000g、4℃で10分間遠心した後、上清を抽出した。その結果、配列番号１で示すポリペプチド（Glyma.06G324300）を発現するグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルA）、配列番号３で示すポリペプチド（Glyur003152s00037491）を発現するグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルB）、配列番号５で示すポリペプチド（Lj3g3v1981230）を発現するグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルC）と、どの遺伝子も発現しない空ベクターのみのグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルD）を得た。
　pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230又は陰性対照用pESC-HIS-AtUGD2を保持するソヤサポゲノールB生産酵母株についても同様に培養、及び代謝産物の抽出を行った。その結果、配列番号１で示すポリペプチド（Glyma.06G324300）を発現するソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルE）、配列番号３で示すポリペプチド（Glyur003152s00037491）を発現するソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルF）、配列番号５で示すポリペプチド（Lj3g3v1981230）を発現するソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルG）と、どの遺伝子も発現しない空ベクターのみのソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルH）を得た。
＜実施例１０：酵母代謝産物抽出物の分析＞
　実施例９で得られたサンプルA、B、C、及びD、並びにサンプルE、F、G、及びHを、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。沈殿物を300μLのメタノールに懸濁した後、マイレクス（Millex）-GV、0.22 μm、 PVDF、 4 mm（Merck社）を用いてろ過し、LC-MS分析の試料とした。
　LC-MS分析は、ACQUITY UPLC/TQD-MS(Waters Corp.)で行った。カラムにはUPLC HSS C18 (2.1 mm x 150 mm, 1.7 μm) (Waters Corp.)を用い、溶媒は0.1%酢酸－アセトニトリル:0.1%酢酸－水＝30:70 (0～5分), 40:60-100:0 (5～28分), 100:0 (28～31.5分)、流速は0.2 mL/分の条件にて分析した。MSはSIMモードを用いて各化合物のm/z、グリチルレチン酸＝469.7、グリチルレチン酸モノグリコシド＝631.9、グリチルレチン酸モノグルクロニド＝645.8、グリチルリチン＝821.9をパラメータとして分析した。代謝産物の同定は、市販のグリチルレチン酸モノグルクロニド及びグリチルリチンを1μMの濃度にメタノールで溶かしたサンプルを標品として、LCの保持時間及びMSスペクトルを比較することで決定した。
　その結果を図４及び図５で示す。
　図４はグリチルレチン酸とグルクロン酸を基質としたときの、Glyma.06G324300又はその相同物の酵素活性の結果である。（a)のサンプルAからは、グリチルレチン酸モノグルクロニドに相当する1本のピークが検出された（黒矢印）。そのピークの保持時間、及びマススペクトルが、グリチルレチン酸モノグルクロニドと良く一致した。同じく、（b)のサンプルB、及び（c)のサンプルCからも、グリチルレチン酸モノグルクロニドに相当するピークが検出された（黒矢印）。各ピークの保持時間、及びマススペクトルが、グリチルレチン酸モノグルクロニドと良く一致した。一方、陰性対照である（d)のサンプルDについてはグリチルレチン酸モノグルクロニドに相当するピークは検出されなかった。
　図５はソヤサポゲノールBとグルクロン酸を基質としたときの、Glyma.06G324300又はその相同物の酵素活性の結果である。（a)のサンプルEからは、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当する1本のピークが検出された（黒矢印）。（b)のサンプルF、及び（c)のサンプルGからも、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当するピークが検出された（黒矢印）。各ピークの保持時間、及びマススペクトルが、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドと良く一致した。一方、陰性対照である（d)のサンプルHについてはソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当するピークは検出されなかった。
＜実施例１１：基質フィーディングアッセイ用形質転換酵母の作製＞
　酵母INVScI株に、実施例８で得られたpESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230をそれぞれ導入した。陰性対照として、同じ酵母INVScI株に空ベクターに相当するpESC-HIS-AtUGD2を導入した。酵母の形質転換は、Frozen-EZ Yeast Transformation II（Zymo Research社）を用いて添付のプロトコルに従い行った。
＜実施例１２：組換え酵母を用いた基質フィーディングアッセイ＞
　実施例１１で得られたpESC-HIS-AtUGD2-Glyma.06G324300、pESC-HIS-AtUGD2-Glyur003152s00037491、pESC-HIS-AtUGD2-Lj3g3v1981230、又は陰性対照用pESC-HIS-AtUGD2を保持する形質転換酵母を、2％グルコースを含む2mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-His）を用いて、30℃、200rpmで24時間振とう培養した。その後、培養液を3,000g、4℃で5分間遠心して酵母細胞のペレットを得た。得られた酵母細胞のペレットを2mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-His）に懸濁した後、再び3,000g、4℃で5分間遠心して酵母細胞のペレットを得た。得られた酵母細胞のペレットを2％ガラクトースを含む10mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-His）に懸濁し、5mLに二等分した。一つのサンプルには終濃度5μMのグリチルレチン酸を加え、もう片方のサンプルには終濃度5μMのソヤサポゲノールBを加えた（図4）。その後、30℃、200rpmで10日間振とう培養した。培養液に1mL相当の体積のガラスビーズ（SIGMA社）と、4mLの1-ブタノールを加えた。酵母細胞を破砕するために、30分間ストロングシェーカーで激しく撹拌し、得られた液体を、10,000g、4℃で10分間遠心した後、上清を酵母フィーディングアッセイ抽出物として回収した。残った液体に4mLの1-ブタノールを新たに加えて、再度抽出した。その結果、配列番号１で示すポリペプチド（Glyma.06G324300）を発現する形質転換酵母にグリチルレチン酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルI）、ソヤサポゲノールBを加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルM）、配列番号３で示すポリペプチド（Glyur003152s00037491）を発現する形質転換酵母にグリチルレチン酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルJ）、ソヤサポゲノールBを加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルN）、配列番号５で示すポリペプチド（Lj3g3v1981230）を発現する形質転換酵母にグリチルレチン酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルK）、ソヤサポゲノールBを加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルO）、どの遺伝子も発現しない空ベクターのみの形質転換酵母にグリチルレチン酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルL）と、ソヤサポゲノールBを加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルP）を得た。
＜実施例１３：基質フィーディングアッセイ抽出物の分析＞
　実施例１２で得られたサンプルI、J、K、L、M、N、O、及びPを、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。沈殿物を300μLのメタノールに懸濁した後、マイレクス（Millex）-GV、0.22 μm、 PVDF、 4 mm（Merck）を用いてろ過し、LC-MS分析の試料とした。
　LC-MS分析は、実施例１０と同じ条件で実施したが、MSはSIMモードを用いて、サンプルI、J、K、Lの場合、各化合物のm/z、グリチルレチン酸＝469.7、グリチルレチン酸モノグリコシド＝631.9、グリチルレチン酸モノグルクロニド＝645.8、グリチルリチン＝821.9をパラメータとして分析し、サンプルM、N、O、Pの場合、各化合物のm/z、ソヤサポゲノールB＝457.8、ソヤサポゲノールBモノグリコシド＝619.8、ソヤサポゲノールBモノグルクロニド＝633.8、ソヤサポゲノールBジグルクロニド＝809.9をパラメータとして分析した。代謝産物の同定は、市販のグリチルレチン酸モノグルクロニド、グリチルリチン、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドを1μMの濃度にメタノールで溶かしたサンプルを標品として、LCの保持時間及びMSスペクトルを比較することで決定した。
　グリチルレチン酸を糖受容体基質としたときの結果を図７～１０で示す。図７は、サンプルIにおける基質フィーディングアッセイの結果である。(b)から糖受容体基質であるグリチルレチン酸に相当するピーク（白矢印）が検出されたほか、(c)からはグリチルレチン酸に1分子のグルクロン酸が付加したと考えられる1本のピーク（黒矢印）が検出された。そのピークの保持時間、及びマススペクトルが、グリチルレチン酸モノグルクロニドと良く一致した。
　図８で示すサンプルJ、及び図９で示すサンプルKからも、それぞれ(b)及び(c)で示すように、グリチルレチン酸（白矢印）とグリチルレチン酸モノグルクロニド（黒矢印）に相当するピークが検出された。各ピークの保持時間、及びマススペクトルが、グリチルレチン酸モノグルクロニドと良く一致した。
　一方、図１０で示す陰性対照のサンプルLでは、(b)で糖受容体基質であるグリチルレチン酸に相当するピーク（白矢印）は検出されたが、(c)でグリチルレチン酸モノグルクロニドに相当する位置（破線矢印）にピークは検出されなかった。
　また、ソヤサポゲノールBを糖受容体基質としたときの基質フィーディングアッセイの結果を図１１で示す。(b)で示すダイズ由来のGlyma.06G324300を含むサンプルM、(c)で示すカンゾウ由来のGlyur003152s00037491を含むサンプルN、及び(d)で示すミヤコ具草由来のLj3g3v1981230を含むサンプルOでは、いずれもソヤサポゲノールBに1分子のグルクロン酸が付加したソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当するピークが検出された（黒矢印）。そのピークの保持時間、及びマススペクトルが、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドと良く一致した。一方、(e)で示す陰性対照のサンプルPでは、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当するピークは検出されなかった。
　以上の結果と実施例１０から得られた結果から、前記実施例１で得られたダイズ由来の新規酵素 Glyma.06G324300、実施例３で得られたカンゾウ由来の新規酵素Glyur003152s00037491、実施例５で得られたミヤコグサ由来の新規酵素Lj3g3v1981230は、グリチルレチン酸の3位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移することによってグリチルレチン酸をグリチルレチン酸モノグルクロニドに変換するグルクロン酸第一転移活性を有することが明らかになった。また、ソヤサポゲノールBの3位のヒドロキシ基にもグルクロン酸を転移することによってソヤサポゲノールBをソヤサポゲノールBモノグルクロニドに変換するグルクロン酸第一転移活性を有することが立証された。以上より、得られた新規酵素はオレアナン型トリテルペノイド3位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移するグルクロン酸第一転移酵素と同定された。
＜実施例１４：ミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体の単離＞
　ミヤコグサの遺伝子及びタンパク質の配列情報、さらにそれらの発現データベースであるLotus Base（https://lotus.au.dk/）に基づいて、Lj3g3v1981230にLOREの挿入を持つ変異体系統を検索した結果、19系統がヒットした。それらの系統の中から、Lj3g3v1981230へのLORE1挿入位置や他の遺伝子へのLORE1挿入数に基づき、2系統（30006020、30115796）を選抜し、種子を配布機関（デンマークAarhus大学）から入手した。その種子を播種し、展開した子葉の一部からゲノムDNAを抽出して、PCRによりLj3g3v1981230へのLORE1の挿入を確認した。PCRは、GoTaq（登録商標） Colorless Master Mix（Promega社）を用いアニール温度60℃、反応温度72℃で25サイクルのPCRを行った。PCRにはフォワードプライマー（30006020は配列番号２６、30115796は配列番号２８）とリバースプライマー（30006020は配列番号２７、30115796は配列番号２９）及びP2プライマー（配列番号３０）を用いた。
＜実施例１５：ミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体のトリテルペノイドサポニン組成分析＞
　実施例１４で播種し、1カ月後のミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体系統（30006020、30115796）の植物体全体を凍結乾燥させた後、乾燥重量の10倍量の80%メタノールを加えた。室温で1時間振とうさせ、15k rpmで5分間遠心分離した。遠心分離で得た上清を孔径0.45μmのメンブレンフィルター（GLクロマトディスク4P、GLサイエンス）で清浄化し、各抽出液2μLをLC-PDA/MS/MS分析に供した。装置は、Ultimate 3000SD HPLC/LTQ orbitrap discovery MS（いずれもThermo Fisher Scientific社）を用いた。抽出液を逆相カラム（C30、Develosil C30-UG-3、野村化学）にアプライし、流速0.15ml/minで0.1%（v/v）ギ酸を含むアセトニトリルのリニアグランジエント（20-80%/60分）によりサポニン類を溶出した。溶出物は、UV吸収と質量分析（ペアレントイオンをオービトラップ型、フラグメントイオンをイオントラップ型）で検出した。質量分析計には、エレクトロスプレーイオン化法で気化・正イオン化した溶出物をインジェクトした。分析の標品にはソヤサポニンBb（m/z=943.52）を用いMS/MS分析によるフラグメントパターンにより、各サポニン分子のアノテーションを行った。
　その結果、図１２－１及び図１２－２において、（ｂ）及び（ｃ）で示すように、ホモ変異体（mutant homo)では通常蓄積しているサポニン類（Bb、βg等）が検出限界以下となり、サポニン組成に異常が認められた。この結果から、ミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子（Lj3g3v1981230）は、サポニン生合成系において実際に生体内で機能をしていることが明らかとなった。
＜実施例１６：ミヤコグサ用発現ベクターの構築＞
　実施例４で作成したカンゾウ由来のGlyma.06G324300相同遺伝子を含むクローニング用ベクターを鋳型として、配列番号４の開始コドンから終止コドンまでを増幅させるフォワードプライマー（配列番号３１）とリバースプライマー（配列番号３２）を用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いてアニール温度60℃、反応温度68℃で30サイクルのPCRを行った。増幅されたDNA断片をGateway BP Clonase II Enzyme Mix（Thermo Fisher Technologies社）を用いて塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY　attB × attP反応）によりpDONRTM221にクローニングし、得られた3個の独立クローンについて、ポリヌクレオチド配列を決定し、配列番号４と一致することを確認した。そのポリヌクレオチドを有するプラスミドpDONR-Glyur003152s00037491をエントリークローンとして得た。
　続いて、実施例５で作成したミヤコグサ由来のGlyma.06G324300相同遺伝子を含むクローニング用ベクターを鋳型として、配列番号６の開始コドンから終止コドンまでを増幅させるフォワードプライマー（配列番号３３）とリバースプライマー（配列番号３４）を用い、上記と同様PCRを行い、pDONRTM221にクローニングし、得られた３個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定し、配列番号６と一致していることを確認した。そのポリヌクレオチドを有するプラスミドpDONR-Lj3g3v1981230ををエントリークローンとして得た。なお、pDONRTM221（Thermo Fisher Technologies社）へのクローニングの際の塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY　attB × attP反応）に必要であることから、フォワードプライマーには、5’末端に配列番号３５で示す12塩基（AAAAAGCAGGCT）、及びリバースプライマーには、5’末端に配列番号３６で示す12塩基（AGAAAGCTGGGT）が付加されている。実施例１において作製した、配列番号２で示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）pDONR-Glyma.06g324300又は配列番号４で示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）pDONR-Glyur003152s00037491、配列番号６で示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）pDONR-Lj3g3v1981230とデスティネーションベクターpG35NGwを混合し、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix（Thermo Fisher Technologies社）を用いて塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY　attL × attR反応）により、配列番号６で示すDNA断片をpCAMBIA－G35NGwに移し替えることで配列番号６で示すミヤコグサ由来のGlyma.06G324300相同遺伝子を含むミヤコグサ形質転換用ベクターpG35N-LjCSLを得た。また、上記と同じ手法で、及び配列番号２で示すダイズ由来のGlyma.06G324300遺伝子、及び配列番号４で示すカンゾウ由来のGlyma.06G324300相同遺伝子を移し替えて、それぞれミヤコグサ形質転換用ベクターpG35N-GmCSL、pG35N-GuCSLをそれぞれ得た。
＜実施例１７：ダイズGlyma.06G324300、並びにカンゾウ及びミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子のミヤコグサ変異体への導入によるレスキュー実験＞
　Glyma.06G324300相同遺伝子を、Diaz et al., (2005) Induction of hairy roots for symbiotic gene expression studies. In Lotus japonicus Handbook, A.J. Marquez, ed (Dordrecht, The Netherlands: Springer), pp. 261-277.に記載の方法に従ってミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体に導入した。実施例１４で得られたミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体30006020の変異体ホモ系統から得られた種子を、有効塩素濃度2％の次亜塩素酸（0.02％Tween20を含む）で20分間滅菌後、滅菌蒸留水中で一晩吸水させた。吸水させた種子の種皮を除き、0.8％水寒天培地に播種し、アルミホイルで遮光し、25℃で4日間培養した後、光に1日当てた。実施例１６で作成したベクターをアグロバクテリウム（LBA1334）に導入し、L培地前面にプレーティングし、28℃で1日培養した。10mLの滅菌水に1日培養したアグロバクテリウムを懸濁し、丸型滅菌シャーレに入れた後、その中でミヤコグサのGlyma.06G324300相同遺伝子機能欠損変異体30006020の変異体ホモの芽生えを浸し、カミソリ刃で胚軸を切断した。切断した芽生えを共存培地に並べ、アルミホイルで遮光し、21℃で4日間共存培養した。共存培養後、植物をHRE培地に並べ、明期16時間、25℃／暗期8時間、23℃で2週間生育させた。毛状根が発生した植物は、蛍光実体顕微鏡下でGFP蛍光を確認した。
＜実施例１８：ミヤコグサ毛状根のトリテルペノイドサポニン組成分析＞
　実施例１７で得られた毛状根を発生させた植物を、バーミキュライトを詰めたポットに移植し、B&D水耕液（Diaz et al., 2005）を加え、1カ月生育させた。十分生育した植物を凍結乾燥し、マルチビーズショッカー（安井器械株式会社）で2500rpm、30秒間粉砕した。凍結乾燥物の重量の100倍量の80％メタノールを加え、室温で1時間振とう後、15krpmで5分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を実施例１５で示す方法で、LC-PDA/MS/MS分析した結果、図１３で示すように、変異体で消失していたサポニンが、形質転換毛状根で復活していた。このことから、Glyma.06G324300相同遺伝子は、生体内でもサポニン合成反応を触媒していると考えられた。
＜実施例１９：レンゲ由来Glyma.06G324300相同遺伝子の探索と単離＞
　ダイズと同じマメ科植物であるレンゲ（Astragalus sinicus）から、遺伝子相同検索によってGlyma.06G324300のオルソログ遺伝子候補としてGlyma.06G324300相同遺伝子を探索した。レンゲの根、茎、葉から得られたRNAシークエンスデータを統合した配列データセットからGlyma.06G324300に高いアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする1種の塩基配列AsCSyGTを見出した。レンゲの茎から得られたトータルRNAを1μg用いて、SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech社)を用いて添付のプロトコルに従いファーストストランドcDNAを合成した。ファーストストランドcDNA 2μLを鋳型として、AsCSyGTから推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号３９）及びリバースプライマー（配列番号４０）に用い、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いてアニール温度55℃、反応温度72℃で30サイクルのPCRを行った。なお、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（Thermo Fisher Technologies社）へのクローニングに必要なことから、前記フォワードプライマーには、5’末端に4塩基（cacc）が人工的に付加されている。増幅されたDNA断片をpENTRTM/D-TOPOエントリーベクターにクローニングし、得られた2個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られたレンゲのGlyma.06G324300相同遺伝子の塩基配列が配列番号４１であり、それから推定されるポリペプチド配列が配列番号４２である。配列番号４２は配列番号１で示すアミノ酸配列に対して77％の同一性を有していた。
＜実施例２０：ダイズ由来Glyma.06G324300相同遺伝子の単離＞
　ダイズから遺伝子相同検索によってGlyma.06G324300のパラログ遺伝子候補としてGlyma.06G324300相同遺伝子を探索した。ダイズのゲノム情報データベースであるSoybase (https://soybase.org)内のBLAST相同性探索機能を使用し、Glyma.06G324300に高いアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする2種の塩基配列Glyma.04g255400及びGlyma.11g151800を見出した。実施例１に示した方法により2種のGlyma.06G324300相同遺伝子であるGlyma.04g255400及びGlyma.11g151800を増幅しpDONRTM221（Thermo Fisher Technologies社）にクローニングした。Glyma.04g255400から推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号４３）及びリバースプライマー（配列番号４４）に用い、Glyma.11g151800から推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号４５）及びリバースプライマー（配列番号４６）に用いた。なお、pDONRTM221（Thermo Fisher Technologies社）へのクローニングの際の塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY　attB × attP反応）に必要なことから前記フォワードプライマーには、5’末端に12塩基（AAAAAGCAGGCT）が、そして前記リバースプライマーには、5’末端に12塩基（AGAAAGCTGGGT）が、人工的に付加されている。種子由来のファーストストランドcDNAから増幅されたDNA断片をGateway BP Clonase II Enzyme Mix（Thermo Fisher Technologies社）を用いて塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY attB × attP反応）によりpDONRTM221にクローニングし、それぞれについて得られた3個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られた配列が配列番号４７及び配列番号４９であり、それらから推定されるポリペプチド配列が配列番号４８及び配列番号５０である。配列番号４８及び配列番号５０は配列番号１で示すアミノ酸配列に対してそれぞれ93.9％及び71.1％の同一性を有していた。
＜実施例２１：レンゲ及びダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子のグリチルレチン酸及びソヤサポゲノールB生産酵母株への導入＞
　実施例７に示した方法により、実施例１９で得られたレンゲ、及び実施例２０で得られたダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子の酵母発現クローンであるpESC-HIS-AsCSyGT、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma. 11g151800を構築し、実施例８に示した方法により、グリチルレチン酸及びソヤサポゲノールB生産酵母株にそれぞれ導入した。
＜実施例２２：レンゲ及びダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子を導入した組換え酵母を用いたインビボ酵素アッセイ＞
　実施例９に示した方法により、組換え酵母の培養、及び代謝物の抽出を行った。その結果、配列番号４２で示すポリペプチド（AsCSyGT）を発現するグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルQ）、配列番号４８で示すポリペプチド（Glyma04g255400）を発現するグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルR）、配列番号５０で示すポリペプチド（Glyma.11g151800）を発現するグリチルレチン酸生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルS）を得た。pESC-HIS-AsCSyGT、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400、pESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800を保持するソヤサポゲノールB生産酵母株についても同様に培養、及び代謝産物の抽出を行った。その結果、配列番号４２で示すポリペプチド（AsCSyGT）を発現するソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルT）、配列番号４８で示すポリペプチド（Glyma04g255400）を発現するソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルU）、配列番号５０で示すポリペプチド（Glyma.11g151800）を発現するソヤサポゲノールB生産酵母株由来の代謝産物抽出物（サンプルV）を得た。
＜実施例２３：レンゲ及びダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子を導入した酵母の代謝産物抽出物の分析＞
　実施例１０に示した方法によりLC-MS分析の試料を調製、及び分析を行った。その結果を図１４及び図１５で示す。
　図１４に示した（a)のサンプルQからは、グリチルレチン酸モノグルクロニドに相当する1本のピークが検出された（黒矢印）。そのピークの保持時間、及びマススペクトルが、グリチルレチン酸モノグルクロニドと良く一致した。同じく、（b)のサンプルR、及び（c)のサンプルSからも、グリチルレチン酸モノグルクロニドに相当するピークが検出された（黒矢印）。各ピークの保持時間、及びマススペクトルが、グリチルレチン酸モノグルクロニドと良く一致した。
　図１５に示した（a)のサンプルTからは、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当する1本のピークが検出された（黒矢印）。（b)のサンプルU、及び（c)のサンプルVからも、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドに相当するピークが検出された（黒矢印）。各ピークの保持時間、及びマススペクトルが、ソヤサポゲノールBモノグルクロニドと良く一致した。
　以上の結果から、実施例１９で得られたレンゲ由来のAsCSyGT、及び実施例２０で得られたダイズ由来のGlyma04g255400及びGlyma.11g151800は、グリチルレチン酸の3位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移することによってグリチルレチン酸をグリチルレチン酸モノグルクロニドに変換するグルクロン酸第一転移活性を有することが明らかになった。また、ソヤサポゲノールBの3位のヒドロキシ基にもグルクロン酸を転移することによってソヤサポゲノールBをソヤサポゲノールBモノグルクロニドに変換するグルクロン酸第一転移活性を有することが立証された。
＜実施例２４：ダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子の基質フィーディングアッセイ用形質転換酵母の作製＞
　酵母INVScI株に、実施例２１で得られたpESC-HIS-AtUGD2-Glyma04g255400及びpESC-HIS-AtUGD2-Glyma.11g151800をそれぞれ導入した。酵母の形質転換は、Frozen-EZ Yeast Transformation II（Zymo Research社）を用いて添付のプロトコルに従い行った。
＜実施例２５：ダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子を導入した形質転換酵母を用いた基質フィーディングアッセイ＞
　実施例２４で得られた組換え酵母を、実施例１２に示した方法により培養した。得られた各酵母細胞の懸濁液を等分し、終濃度5μMのウルサン型トリテルペノイドのウルソール酸、又はルパン型トリテルペノイドのベツリン酸をそれぞれ加えた。その後、実施例１２に示した方法により再度培養、及び代謝物の抽出を行った。その結果、配列番号４８で示すポリペプチド（Glyma04g255400）、又は配列番号５０で示すポリペプチド（Glyma.11g151800）を発現する形質転換酵母にウルサン型トリテルペノイドであるウルソール酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物、及びルパン型トリテルペノイドであるベツリン酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物を得た。
＜実施例２６：ダイズのGlyma.06G324300相同遺伝子を導入した形質転換酵母を用いた基質フィーディングアッセイ抽出物の分析＞
　実施例２５で得られたサンプルを実施例１０と同じ条件で分析した、MSはSIMモードを用いて、想定される各反応生成物のm/z、ウルソール酸モノグルクロニド＝631(図１６、a)、ベツリン酸モノグルクロニド＝631(図１７、a)をパラメータとして分析した。図１６は、配列番号５０で示すポリペプチド（Glyma.11g151800）を発現する形質転換酵母にウルソール酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルW）の分析結果である。(b)に示したサンプルWからウルソール酸モノグルクロニドと推定されるピークが検出された。一方、(c)で示す陰性対照のサンプルXでは、ウルソール酸モノグルクロニドと推定されるピークは検出されなかった。
　図１７は、配列番号５０で示すポリペプチド（Glyma.11g151800）を発現する形質転換酵母にベツリン酸を加えたフィーディングアッセイ抽出物（サンプルY）の分析結果である。(b)に示したサンプルYからベツリン酸モノグルクロニドと推定されるピークが検出された。一方、(c)で示す陰性対照のサンプルZでは、ベツリン酸モノグルクロニドと推定されるピークは検出されなかった。
　以上より、配列番号５０で示すポリペプチド（Glyma.11g151800）はオレアナン型トリテルペノイドだけでなくウルソール酸やβ-ボスウェリン酸等のウルサン型トリテルペノイド、及びベツリン酸等のルパン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシ基にもグルクロン酸を転移し得るグルクロン酸第一転移酵素と考えられる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. 　オレアナン型トリテルペノイドにおける3位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有し、以下の（ａ）～（ｃ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド又は前記活性を有するその断片。
    　　（ａ）配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列、
    　　（ｂ）配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    　　（ｃ）配列番号１、３、及び５のいずれかで示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    ポリペプチド。
  2. 　前記オレアナン型トリテルペノイドが、β-アミリン、11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-β-アミリン、24-ヒドロキシ-β-アミリン、11-デオキソグリチルレチン酸、グリチルレチン酸、オレアノール酸、メジカゲニン酸、ソヤサポゲノールB、ソヤサポゲノールA、ヘデラゲニン、カメリアゲニン、及びサイコゲニンからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　マメ科(Fabaceae)植物に由来する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  5. 　以下の（ａ）～（ｄ）で示すいずれかの塩基配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
    　　（ａ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列、
    　　（ｂ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、
    　　（ｃ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列と80％以上の同一性を有する塩基配列、又は
    　　（ｄ）配列番号２、４、及び６のいずれかで示す塩基配列に相補的な塩基配列と高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
  6. 　請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含むCSyGT発現ベクター。
  7. 　請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド又は請求項６に記載のCSyGT発現ベクターを含む形質転換体、又は前記ポリヌクレオチド又は前記CSyGT発現ベクターを保持したその後代。
  8. 　マメ科（Fabaceae）植物である、請求項７に記載の形質転換体又はその後代。
  9. 　オレアナン型トリテルペノイドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
    　請求項７又は８に記載の形質転換体又はその後代を培養する工程、及び
    　前記培養物から請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドを抽出する工程を含む、前記方法。
  10. 　β-アミリンを生合成でき、かつ以下の（１）～（４）で示す全ての発現ベクターを含むグリチルリチン製造用の遺伝子組換え体。
    　（１）オレアナン型トリテルペノイドにおける11位を酸化する活性を有し、以下の（ａ）～（ｃ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するCYP88D6発現ベクター、
    　　（ａ）配列番号７で示すアミノ酸配列、
    　　（ｂ）配列番号７で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    　　（ｃ）配列番号７で示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    　（２）オレアナン型トリテルペノイドにおける30位を酸化する活性を有し、以下の（ｄ）～（ｆ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するCYP72A154発現ベクター、
    　　（ｄ）配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列、
    　　（ｅ）配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    　　（ｆ）配列番号９、１１、及び１３のいずれかで示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    　（３）オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有し、以下の（ｇ）～（ｉ）で示すいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含するUGT73P12発現ベクター、
    　　（ｇ）配列番号１５で示すアミノ酸配列、
    　　（ｈ）配列番号１５で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    　　（ｉ）配列番号１５で示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び
    　（４）請求項６に記載のCSyGT発現ベクター
  11. 　宿主がマメ科植物である、請求項１０に記載の遺伝子組換え体。
  12. 　β-アミリンからグリチルリチンを製造する方法であって、請求項１０又は１１に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む前記製造方法。
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