JP2022524214A

JP2022524214A - Ｕｄｐ－ラムノースの生合成生産

Info

Publication number: JP2022524214A
Application number: JP2021557654A
Authority: JP
Inventors: グオホンマオ，; フィリップジェイムズハント，; マイケルジェイムズバッテン，; ティモシージョゼフハンリー，; オリバーユー，
Original assignee: コナゲンインコーポレイテッド
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-29
Publication date: 2022-04-28
Anticipated expiration: 2040-03-29
Also published as: JP2023118929A; CN113646320A; JP7318989B2; MX2021011480A; CA3131818A1; EP3947409A1; EP3947409A4; US20220090158A1; KR20210146922A; WO2020205685A1; BR112021019470A2

Abstract

本開示は、ＵＤＰ－ラムノースの生合成およびＵＤＰ－ラムノースを生成するための関連する生合成経路で有用な酵素活性を有する組換えポリペプチドに関する。本発明はまた、少なくとも１つのラムノース含有ステビオール配糖体を含むステビオール配糖体組成物を調製する方法を提供する。本開示は、さまざまな実施形態で、ＵＤＰ－ラムノースを調製する生合成方法を包含する。好ましい実施形態では、本開示は、ウリジン二リン酸ベータ－Ｌ－ラムノース（「ＵＤＰ－Ｌ－ラムノース」または「ＵＤＰ－Ｌ－Ｒ」またはＵＤＰ－Ｌ－Ｒｈ」）を調製する生合成方法に関する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年３月２９日に出願された米国仮出願第６２／８２５，７９９号に基づく優先権を主張している。

発明の分野
本開示は、一般に、ウリジン二リン酸ラムノース（「ＵＤＰ－ラムノース」または「ＵＤＰＲ」または「ＵＤＰ－Ｒｈ」）の生合成に関する。より具体的には、本開示は、今度はラムノース含有ステビオール配糖体の生合成で使用することができる、ＵＤＰ－ラムノースを調製するための生体触媒プロセス、ならびにＵＤＰ－ラムノースおよびラムノース含有ステビオール配糖体を生成するための関連する生合成経路で有用な酵素活性を有する組換えポリペプチドに関する。

発明の背景
ステビオール配糖体は、高強度低カロリー甘味料として使用することができるＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物の葉に見られる化合物のクラスである。これらの天然に存在するステビオール配糖体は、同じ基本ジテルペン構造（ステビオール骨格）を共有するが、ステビオール骨格のＣ１３位およびＣ１９位の炭水化物残基（例えば、グルコース、ラムノースおよびキシロース残基）の数および種類が異なる。興味深いことに、基本ステビオール構造の糖「装飾」のこれらの変動は、しばしば劇的かつ予測不能に、得られるステビオール配糖体の特性に影響を及ぼす。影響を受ける特性には、限定されないが、数ある違いの中でも、全体的な味プロファイル、任意の異臭の存在および程度、結晶化点、「食感」、溶解度および知覚される甘味が含まれ得る。既知の構造を有するステビオール配糖体としては、ステビオシド、レバウジオシドＡ（「ＲｅｂＡ」）、レバウジオシドＢ（「ＲｅｂＢ」）、レバウジオシドＣ（「ＲｅｂＣ」）、レバウジオシドＤ（「ＲｅｂＤ」）、レバウジオシドＥ（「ＲｅｂＥ」）、レバウジオシドＦ（「ＲｅｂＦ」）、レバウジオシドＭ（「ＲｅｂＭ」）、レバウジオシドＪ（「ＲｅｂＪ」）、レバウジオシドＮ（「ＲｅｂＮ」）、およびズルコシドＡが挙げられる。

乾燥重量ベースで、ステビオシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＣおよびズルコシドＡは、それぞれ野生型ステビア葉に見られる全てのステビオール配糖体の総重量のおよそ９．１％、３．８％、０．６％および０．３％を占める。ＲｅｂＪおよびＲｅｂＮなどの他のステビオール配糖体は、有意に少ない量で存在する。Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物からの抽出物は市販されている。このような抽出物では、典型的にはステビオシドおよびＲｅｂＡが主成分であるが、他の公知のステビオール配糖体が少量または微量成分として存在する。任意の所与のステビア抽出物中のさまざまなステビオール配糖体の実際の含有量レベルは、例えば、ステビア植物が栽培される気候および土壌、ステビア葉が収穫される条件、ならびに所望のステビオール配糖体を抽出するために使用されるプロセスに応じて変化し得る。例示すると、市販の調製物中のＲｅｂＡの量は、総ステビオール配糖体含有量の約２０重量％～約９０重量％超まで変動し得るが、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣおよびＲｅｂＤの量は、それぞれ、総ステビオール配糖体含有量の約１～２％、約７～１５％および約２重量％であり得る。このような抽出物では、ＲｅｂＪおよびＲｅｂＮは、典型的には、個別に、総ステビオール配糖体含有量の０．５重量％未満を占める。

天然甘味料として、さまざまなステビオール配糖体は、さまざまな程度の甘味、食感および後味を有する。ステビオール配糖体の甘味は、グラニュー糖（すなわち、スクロース）の甘味よりも有意に高い。例えば、ステビオシド自体はスクロースよりも１００～１５０倍甘いが、多数の味覚試験で認められるように苦味の後味を有する一方、ＲｅｂＡおよびＲｅｂＥはスクロースよりも２５０～４５０倍甘く、後味プロファイルはステビオシドよりもはるかに優れている。しかしながら、これらのステビオール配糖体自体は、依然として顕著な後味を保持している。したがって、任意のステビア抽出物の全体的な味プロファイルは、抽出物中のさまざまなステビオール配糖体の相対含有量によって大いに影響され、これは植物の供給源、環境因子（土壌内容物および気候など）、および抽出プロセスによって影響され得る。特に、抽出条件の変動は、ステビア抽出物中のステビオール配糖体の組成の不一致をもたらし、その結果、味プロファイルは抽出生成物の異なるバッチ間で変動する。ステビア抽出物の味プロファイルはまた、抽出プロセス後に生成物中に残る植物由来または環境由来の汚染物質（顔料、脂質、タンパク質、フェノール類および糖類など）によって影響を受け得る。これらの汚染物質は、典型的には、甘味料としてステビア抽出物を使用するのに望ましくない異臭を有する。さらに、ステビア抽出物に豊富ではないステビオール配糖体の個々のまたは特定の組み合わせを単離するプロセスは、費用的および資源的に禁止となり得る。

さらに、植物からの抽出プロセスは、典型的には、ヘキサン、クロロホルムおよびエタノールなどの溶媒を使用する固液抽出技術を使用する。溶媒抽出はエネルギー集約的プロセスであり、有毒廃棄物処理に関する問題を引き起こす可能性がある。したがって、ステビオール配糖体の生産コストを低減すると同時に大規模な栽培および加工の環境への影響を低減するために、新たな生産方法が必要である。

したがって、より優れており、より一貫した味プロファイルを有する生成物を得ることができる、ステビオール配糖体、特にＲｅｂＪおよびＲｅｂＮなどのラムノース含有ステビオール配糖体の新規な調製方法が当技術分野で必要とされている。このようなラムノース含有ステビオール配糖体への生合成経路が、通常、出発基質の１つとしてＵＤＰ－ラムノースを使用するという事実を考慮すると、ＵＤＰ－ラムノースの新規で効率的な調製方法が当技術分野で必要とされている。

発明の要旨
本開示は、さまざまな実施形態で、ＵＤＰ－ラムノースを調製する生合成方法を包含する。好ましい実施形態では、本開示は、ウリジン二リン酸ベータ－Ｌ－ラムノース（「ＵＤＰ－Ｌ－ラムノース」または「ＵＤＰ－Ｌ－Ｒ」またはＵＤＰ－Ｌ－Ｒｈ」）を調製する生合成方法に関する。一般に、本方法は、ウリジン二リン酸－グルコース（「ＵＤＰ－グルコース」または「ＵＤＰＧ」）を、ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰＨ源の存在下で、ＵＤＰ－ラムノースを生成するのに十分な時間、１または複数の組換えポリペプチドと共にインキュベートすることを含み、１または複数の組換えポリペプチドは、個別にまたは集合的に、ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有する。

いくつかの実施形態では、１または複数の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼおよびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性を有する三機能性酵素であり得る。このような三機能性ポリペプチドは、ＲＨＭ酵素とも呼ばれる。このような実施形態では、１または複数の組換えポリペプチドが、Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ，Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ、Ａｚｏｌｌａｆｉｌｉｃｕｌｏｉｄｅｓ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ、Ｕｌｖａｌａｃｔｕｃａ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａｌｏｎｇｉｓｐｉｃｕｌａ、ＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓまたはＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ由来のＲＨＭ酵素から選択され得る。これらの実施形態では、１または複数の組換えポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７または配列番号８９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドから選択され得る。これらの１または複数の組換えポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８または配列番号９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドから選択され得る。

一定の実施形態では、１または複数の組換えポリペプチドが、第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドを含むことができ、第１の組換えポリペプチドおよび第２の組換えポリペプチドが、集合的にＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有する。具体的には、第１の組換えポリペプチドは、主にＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ活性を有することができ、このような組換えポリペプチドは、本明細書では「ＤＨ」（デヒドラターゼ）酵素と呼ばれる。第２の組換えポリペプチドは、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性とＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性の両方を有する二機能性組換えポリペプチドであり得る。この二機能性組換えポリペプチドは、本明細書では「ＥＲ」酵素（エピメラーゼ活性を表す文字「Ｅ」およびレダクターゼ活性を表す文字「Ｒ」）と呼ばれる。

このような実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ａｃｒｏｓｔｉｃｈｕｍａｕｒｅｕｍ、Ｅｔｔｌｉａｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｖｏｌｖｏｘｃａｒｔｅｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、ＯｏｐｈｉｌａａｍｂｌｙｓｔｏｍａｔｉｓまたはＤｕｎａｌｉｅｌｌａｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ由来のＤＨ酵素から選択され得る。これらの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号７、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドから選択され得る。このような第１の組換えポリペプチドは、配列番号８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドから選択され得る。

適切な第２の組換えポリペプチドの例としては、以下に由来するＥＲ酵素が挙げられ得る：Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓｓｕｂｓｐ．Ｐａｔｅｎｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ、Ｕｌｖａｌａｃｔｕｃａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｍｏｅｗｕｓｉｉ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａｌｏｎｇｉｓｐｉｃｕｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｐａｖｌｏｖａｌｕｔｈｅｒｉ、Ｎｉｔｅｌｌａｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ、Ｂｒｙｕｍａｒｇｅｎｔｅｕｍｖａｒａｒｇｅｎｔｅｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、ＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅまたはＣｉｔｒｕｓｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ。例えば、第２の組換えポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号９１、配列番号９３または配列番号９５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドから選択され得る。このような第２の組換えポリペプチドは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号９２、配列番号９４または配列番号９６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドから選択され得る。

さらに他の実施形態では、１または複数の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ活性を有する第１のドメイン（ＤＨドメイン）および二機能性ＥＲ活性（すなわち、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性とＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性の両方）を有する第２のドメインを含む融合酵素であり得る。ＤＨドメインは、ペプチドリンカーを介してＥＲドメインに連結され得る。さまざまな実施形態では、ペプチドリンカーが２～１５個のアミノ酸を含むことができる。例示的なリンカーとしては、グリシンおよびセリンを含むもの、例えば、グリシンの繰り返し単位、セリンの繰り返し単位、グリシンおよびセリンからなる一定のモチーフの繰り返し単位、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーがＧＳＧであり得る。したがって、このような融合酵素は、集合的にＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有し、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの変換を触媒する能力を有するＥＲドメインに融合されたＤＨドメインを含む。

融合酵素を含む実施形態では、融合酵素の第１のドメインが、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ａｃｒｏｓｔｉｃｈｕｍａｕｒｅｕｍ、Ｅｔｔｌｉａｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｖｏｌｖｏｘｃａｒｔｅｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、ＯｏｐｈｉｌａａｍｂｌｙｓｔｏｍａｔｉｓまたはＤｕｎａｌｉｅｌｌａｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ由来のＤＨ酵素を含み得る。これらの実施形態では、第１のドメインが、配列番号７、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを含むことができる。このようなＤＨドメインは、配列番号８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドを含むことができる。融合酵素の第２のドメインは、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓｓｕｂｓｐ．Ｐａｔｅｎｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ、Ｕｌｖａｌａｃｔｕｃａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｍｏｅｗｕｓｉｉ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａｌｏｎｇｉｓｐｉｃｕｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｐａｖｌｏｖａｌｕｔｈｅｒｉ、Ｎｉｔｅｌｌａｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ、Ｂｒｙｕｍａｒｇｅｎｔｅｕｍｖａｒａｒｇｅｎｔｅｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、ＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅまたはＣｉｔｒｕｓｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ由来のＥＲ酵素を含み得る。例えば、ＥＲドメインは、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号９１、配列番号９３または配列番号９５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを含むことができる。このようなＥＲドメインは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号９２、配列番号９４または配列番号９６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドを含むことができる。一定の好ましい実施形態では、融合酵素の第１のドメインが、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。第２のドメインは、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号６１または配列番号６３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。このような好ましい実施形態では、融合酵素が全体として、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３、配列番号８３または配列番号８５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。一定の好ましい実施形態では、融合酵素の第１のドメインが、配列番号７または配列番号３１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、融合酵素の第２のドメインが、配列番号６３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。融合酵素は全体として、配列番号８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７または配列番号８９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号８５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号８７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、配列番号８９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

さまざまな実施形態では、本明細書で提供される生合成方法が、第１の組換えポリペプチドを形質転換細胞系で発現させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、形質転換細胞系が、酵母、非ＵＤＰ－ラムノース産生植物、藻類、真菌および細菌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細菌または酵母は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；ＰａｎｔｏｅａおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態では、ウリジン二リン酸－グルコースを、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース（「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」）を生成するのに十分な時間、第１の組換えポリペプチドと共にインキュベートした後に、ＮＡＤＰＨ源を提供することができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、酸化反応基質およびＮＡＤＰ^＋依存性酵素を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、リンゴ酸およびリンゴ酸酵素を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、ギ酸およびギ酸デヒドロゲナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、亜リン酸および亜リン酸デヒドロゲナーゼを含むことができる。

いくつかの態様では、インキュベーションステップが形質転換細胞系で実施され得る。他の実施形態では、インキュベーションステップがインビトロで実施され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される生合成方法が、形質転換細胞系から第１の組換えポリペプチドを単離することと、インビトロでインキュベーションステップを実施することとを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ラムノースシンターゼ活性を有する第１の組換えポリペプチドおよびスクロースシンターゼ活性を有する第２の組換えポリペプチドを、スクロースおよびウリジン二リン酸（「ＵＤＰ」）を含む培地中でインキュベートする。第２の組換えポリペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓスクロースシンターゼ、ＶｉｇｎａｒａｄｉａｔｅスクロースシンターゼおよびＣｏｆｆｅａスクロースシンターゼからなる群から選択され得る。この実施形態では、反応の第１のステップで、スクロースシンターゼ活性がＵＤＰ－グルコースを生成し、これが第１の組換え酵素によって基質として使用されてＵＤＰ－ラムノースを生成する。この実施形態におけるＮＡＤＰＨ源は、酸化反応基質およびＮＡＤＰ^＋依存性酵素を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、リンゴ酸およびリンゴ酸酵素を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、ギ酸およびギ酸デヒドロゲナーゼを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ源が、亜リン酸および亜リン酸デヒドロゲナーゼを含むことができる。

とりわけ、少なくとも１つのラムノース含有ステビオール配糖体を含むステビオール配糖体組成物を調製する生合成方法も本明細書で提供される。本方法は、ＵＤＰ－グルコースを、ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰＨ源の存在下で、ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有する第１の組換えポリペプチドと共にインキュベートして、ＵＤＰ－ラムノースを生成することと；ラムノース部分がステビオール配糖体基質に連結して、少なくとも１つのラムノース含有ステビオール配糖体を生成するように、ＵＤＰ－ラムノースを、ＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組換えポリペプチドの存在下で、ステビオール配糖体基質と反応させることとを含むことができる。いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体基質がＲｅｂＡであり、得られたステビオール配糖体組成物がＲｅｂＮ、ＲｅｂＪ、またはその両方を含むことができる。

本開示の態様はまた、上記の実施形態のいずれかを含む、本明細書に記載される任意の生合成方法によって得られるかまたは生産される少なくとも１つのラムノース含有ステビオール配糖体を含むステビオール配糖体組成物を提供する。

本開示の態様はまた、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７または配列番号８９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号１４の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号４０の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号４２の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号４４の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号４６の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号８４の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号８６の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号８８の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸が配列番号９０の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸がプラスミドまたは他のベクターである。

本開示の態様はまた、上記の実施形態のいずれかを含む、本明細書に記載される核酸を含む細胞を提供する。

本開示の態様は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７または配列番号８９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号１の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号１１の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号１３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号３７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号４１の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号４３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号４５の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号４７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号８３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号８５の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号８７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、配列番号８９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞が、酵母細胞、非ＵＤＰラムノース産生植物細胞、藻類細胞、真菌細胞または細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌または酵母細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｐａｎｔｏｅａ；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞が、本明細書に記載されるＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ活性および／またはスクロースシンターゼ活性を有する１または複数の他のポリペプチドをさらに含む。

実施形態における細胞系については、これが、１または複数の細菌、１または複数の酵母およびこれらの組み合わせ、または選択された遺伝子による遺伝子形質転換およびその後のＵＤＰ－ラムノースの生合成生産を可能にする任意の細胞系からなる群から選択され得る。最も好ましい微生物系では、所望の化合物を生産するために大腸菌が使用される。

本開示の他の態様は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７または配列番号８９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むインビトロ反応混合物を提供する。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号１の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号５の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号１１の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号１３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号３７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号４１の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号４３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号４５の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号４７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号８３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号８５の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号８７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、配列番号８９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ反応混合物が、本明細書に記載されるＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ活性および／またはスクロースシンターゼ活性を有する１または複数の他の組換えポリペプチドをさらに含む。

本開示は、さまざまな修正および代替形態の影響を受けやすいが、その特定の実施形態を、例として図面に示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本明細書に提示される図面および詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に入る全ての修正、同等物および代替物を網羅することを意図していることを理解すべきである。

本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明で明らかになる。

図１はウリジン二リン酸ベータ－Ｌ－ラムノースの化学構造を示している。

図２は、（ａ）ＵＤＰ－グルコースからＵＤＰ－ラムノースを生成する；（ｂ）中間体ＲｅｂＪを介してＲｅｂＡおよびＵＤＰ－ラムノースからＲｅｂＮを生成する；（ｃ）リンゴ酸酵素ＭａｅＢを使用してＮＡＤＰ^＋およびリンゴ酸からＮＡＤＰＨを再生する；および（ｄ）本開示によるスクロースシンターゼを使用してＵＤＰおよびスクロースからＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰＧ）を再生する多酵素合成経路を示す概略図である。

図３は、３つの異なる酵素を伴う植物および真菌におけるＵＤＰ－ラムノース生合成経路を示している。この生合成経路の第１のステップでは、ＵＤＰ－グルコース４，６デヒドラターゼが、ＵＤＰ－グルコースをＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」）に変換する。この生合成経路の第２のステップでは、酵素ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５エピメラーゼが、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースをＵＤＰ－４－ケトラムノースに変換する。この生合成経路の第３の酵素ステップでは、ＵＤＰ－４－ケトラムノース－４－ケトレダクターゼが、ＵＤＰ－４－ケトラムノースをＵＤＰ－ラムノースに変換する。３つ全ての酵素の活性を有する三機能性ポリペプチドは、「ＲＨＭ」酵素と呼ばれる。ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼおよびＵＤＰ－４－ケトラムノース－４－ケトレダクターゼ活性を有する二機能性ポリペプチドは、「ＥＲ」酵素と呼ばれる。ＵＤＰ－グルコース４，６デヒドラターゼ活性のみを有するポリペプチドは、「ＤＨ」酵素と呼ばれる。さらに、この実施形態では、ＮＡＤＰＨ補因子が、酸化剤としてＮＡＤＰ^＋を使用してリンゴ酸をピルビン酸に酸化することによって再生され、この反応はＮＡＤＰ^＋依存性リンゴ酸酵素（ＭａｅＢ）によって触媒される。また、この実施形態では、ＵＤＰ－グルコースが、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）によってＵＤＰおよびスクロースから変換され得る。

図４は、本開示によるＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰＧ）のＵＤＰ－ラムノースへの生物変換のために三機能性ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ（例えば、ＮＲＦ１またはＮＲ３２）を使用したＵＤＰ－ラムノースのインビトロ合成のためのワンポット多酵素系を示している。ＵＤＰ－グルコースは、示されるように、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）によって触媒される反応でＵＤＰおよびスクロースから補充され得る。ＵＤＰ－ラムノースの合成は、ＮＡＤＰＨ補因子を再生するための酸化反応と連結することができる。示される実施形態では、ＮＡＤＰＨ補因子が、酸化剤としてＮＡＤＰ^＋を使用するギ酸の二酸化炭素への酸化によって再生され、この反応はギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）によって触媒される。

図５は、本開示によるＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの生物変換のために三機能性ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ（例えば、ＮＲＦ１またはＮＲ３２）を使用したＵＤＰ－ラムノースのインビトロ合成のためのワンポット多酵素系を示している。ＵＤＰ－グルコースは、示されるように、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）によって触媒される反応でＵＤＰおよびスクロースから補充され得る。ＵＤＰ－ラムノースの合成は、ＮＡＤＰＨ補因子を再生するための酸化反応と連結することができる。示される実施形態では、ＮＡＤＰＨ補因子が、酸化剤としてＮＡＤＰ^＋を使用する亜リン酸のリン酸への酸化によって再生され、この反応は亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＴＤＨ）によって触媒される。

図６は、ＵＤＰ－ラムノース生産のための３つの三機能性ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ候補（ＮＲ１２、ＮＲ３２およびＮＲ３３）の酵素活性分析の結果を示している。酵素の隣の文字「ａ」は、ＮＡＤ^＋とＮＡＤＰＨの両方を反応の開始時に添加する一段階補因子添加アプローチを指す。酵素の隣の文字「ｂ」は、ＮＡＤ^＋を反応の開始時に添加したが、ＮＡＤＰＨを３時間まで反応に添加しなかった二段階補因子添加アプローチを指す。全ての試料を３時間後（Ａ）、６時間後（Ｂ）および１８時間後（Ｃ）に回収した。回収した試料をクロロホルムによって抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。凡例：「ＵＤＰ－Ｒｈ」＝ＵＤＰ－ラムノース；「ＵＤＰＧ」＝ＵＤＰ－グルコース；および「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」＝ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース。

図７は、本開示による二段階補因子添加アプローチがＵＤＰ－ラムノース生産のための変換効率をどのように高めることができるかを示している。この実験では、組換えＵＤＰ－ラムノースシンターゼ酵素ＮＲＦ１を使用した。回収した試料をクロロホルムによって抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。全ての試料を１時間後、３時間後、４時間後、６時間後および１８時間後に回収した。反応時間の隣の文字「ａ」は、ＮＡＤ^＋とＮＡＤＰＨの両方を反応の開始時に添加する一段階補因子添加アプローチを指す。反応時間の隣の文字「ｂ」は、ＮＡＤ^＋を反応の開始時に添加したが、ＮＡＤＰＨを３時間まで反応に添加しなかった二段階補因子添加アプローチを指す。凡例：「ＵＤＰ－Ｒｈ」＝ＵＤＰ－ラムノース；「ＵＤＰＧ」＝ＵＤＰ－グルコース；および「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」＝ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース。

図８は、さまざまなワンポット多酵素反応系を使用したＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰＧ）、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）およびＵＤＰ－ラムノース（ＵＤＰ－Ｒｈ）の生産を比較している。図８のパネルＡは、６時間の反応時間後の結果を示している。図８のパネルＢは、１８時間の反応時間後の結果を示している。反応系１～６の詳細を表２に要約する。

ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）生産のためのＤＨ候補の酵素分析。この実験に含まれるＤＨ候補は、ＮＲ５５Ｎ、ＮＲ６０Ｎ、ＮＲ６６Ｎ、ＮＲ６７Ｎ、ＮＲ６８ＮおよびＮＲ６９Ｎであった。三機能性酵素活性を有する以下のＲＨＭ候補もこの実験に含めた：ＮＲ５３Ｎ、ＮＲ５８Ｎ、ＮＲ６２Ｎ、ＮＲ６４ＮおよびＮＲ６５Ｎ。全ての試料を１８時間で回収した。回収した試料をクロロホルムによって抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。「ＵＤＰ－Ｒｈ」：ＵＤＰ－ラムノース；「ＵＤＰＧ」：ＵＤＰ－グルコース；「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」：ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース。「対照」：酵素を添加しない反応。

ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）のＵＤＰ－β－Ｌ－ラムノースへの生物変換のためのＥＲ候補の酵素分析。全ての試料を１８時間で回収した。回収した試料をクロロホルムによって抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。「ＵＤＰ－Ｒｈ」：ＵＤＰ－ラムノース；「ＵＤＰＧ」：ＵＤＰ－グルコース；「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」：ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース。

ＵＤＰ－ラムノース生産についてのＤＨ酵素（ＮＸ１０）に対する３つの融合酵素（ＮＲＦ３、ＮＲＦ２およびＮＲＦ１）の酵素活性の比較。ＮＡＤ^＋を反応の開始時に添加し、ＮＡＤＰＨを反応が開始した３時間後に添加した。全ての試料を２１時間で回収した。回収した試料をクロロホルムによって抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。凡例：「ＵＤＰ－Ｒｈ」＝ＵＤＰ－ラムノース；「ＵＤＰＧ」＝ＵＤＰ－グルコース；および「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」＝ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース。

ＵＤＰ－ラムノース生産のための融合酵素の酵素分析。ＮＡＤ^＋を最初の反応に添加し、ＮＡＤＰＨを３時間後に反応に添加した。全ての試料を２１時間で回収した。回収した試料をクロロホルムによって抽出し、ＨＰＬＣによって分析した。「ＵＤＰ－Ｒｈ」：ＵＤＰ－ラムノース；「ＵＤＰＧ」：ＵＤＰ－グルコース；「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」：ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース。

図１３は、ＵＤＰ－ラムノースのインビトロ合成のために最適化されたワンポット多酵素反応系を使用したＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）およびＵＤＰ－ラムノース（ＵＤＰ－Ｒｈ）の生産を示している。この実施形態では、ＮＲＦ１をＲＨＭ酵素として使用した。二段階補因子添加アプローチを使用し、ＮＡＤ^＋を反応の開始時に添加し、ＮＡＤＰ^＋、ＭａｅＢおよびリンゴ酸を３時間後に添加してＮＡＤＰＨを再生した。生成物を、反応時間の３時間後および１８時間後に分析した。

図１４は、本開示による選択されたＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ（１，２ＲｈａＴ）およびＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）によって触媒されるＲｅｂＡからのＲｅｂＪおよびＲｅｂＮのインビトロ生産を確認するＨＰＬＣスペクトルを示している。図１４のパネルＡはＲｅｂＪ標準を示している。図１４のパネルＢはＲｅｂＮ標準を示している。図１４のパネルＣは、生成物を２２時間で測定した場合に、ＲｅｂＪが例示的な１，２ＲｈａＴとしてのＥＵＣＰ１によって酵素的に生成されたことを示している。図１４のパネルＤは、生成物を２５時間で測定した場合に、ＲｅｂＮが例示的なＵＧＴとしてのＣＰ１によってＲｅｂＪ生成物から酵素的に生成されたことを示している。

詳細な説明
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などの用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、このような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が請求項の移行語として使用される場合に解釈されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語と同様の方法で包括的であることを意図している。

「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」という単語は、本明細書では、例、実例または例示として役立つことを意味するために使用される。本明細書で「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」として記載される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。

細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これには、細菌、酵母、植物細胞および動物細胞が含まれた。これには、原核細胞と真核細胞の両方が含まれる。これはまた、リボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。

「コード配列（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために使用される。

「細胞系を増殖させる（ｇｒｏｗｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、細胞が増殖および分裂することを可能にする適切な培地を提供することを意味する。これはまた、細胞または細胞成分が組換えタンパク質を翻訳および生成することができるように資源を提供することを含む。

タンパク質発現は、遺伝子発現後に起こり得る。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。次いで、ｍＲＮＡがポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、トランスフェクション（核酸を細胞に意図的に導入するプロセス）を通して細胞内に存在する。この用語は、通常、真核細胞における非ウイルス法に使用される。これはまた、他の方法および細胞型を指し得るが、他の用語が好ましい：「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ導入を説明するためにより頻繁に使用される。動物細胞では、形質転換がこれらの細胞における癌状態への進行（発癌）を指すためにも使用されるので、トランスフェクションが好ましい用語である。形質導入は、通常、ウイルス媒介ＤＮＡ導入を説明するために使用される。形質転換、形質導入およびウイルス感染は、本出願のトランスフェクションの定義に含まれる。

本開示によると、本明細書で請求される酵母は、菌界のメンバーとして分類される真核生物の単細胞微生物である。酵母は、多細胞の祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として知られる接続された出芽細胞のストリングを形成することによって多細胞特性を発達させる能力を有するものである。

本開示で使用されるＵＧＴ酵素の名称は、ＵＧＴ遺伝子を、ファミリー番号、サブファミリーを示す文字、および個々の遺伝子の番号の組み合わせによって分類する、ＵＧＴ命名委員会（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら、「ＴｈｅＵＤＰｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｕｐｄａｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９７、第７巻、２５５－２６９頁）によって採用された命名体系と一致している。例えば、「ＵＧＴ７６Ｇ１」という名称は、ＵＧＴファミリー番号７６（植物起源）、サブファミリーＧおよび遺伝子番号１に属する遺伝子によってコードされるＵＧＴ酵素を指す。

「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本技術には、添付の配列表に報告されている完全な配列に相補的な単離された核酸フラグメント、ならびに実質的に類似の核酸配列も含まれる。

「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）」および「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖もしくは二本鎖形態のポリマーを指すために使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的改変または縮重変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。

「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈で使用される場合、限定されないが、人の手によって、その天然の環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない核酸またはポリペプチドを指すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製形態で存在することができる、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。

本明細書で使用される「インキュベートする（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」および「インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」という用語は、２またはそれを超える化学的または生物学的実体（化合物および酵素など）を混合し、最初の出発実体とは明らかに異なる１または複数の化学的または生物学的実体を生成するのに好ましい条件下でこれらが相互作用することを可能にするプロセスを意味する。

「縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１またはそれを超える縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる。核酸配列とその縮重変異体の全ては、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。

「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、３つの用語は時々互換的に使用され、限定されないが、そのサイズまたは機能に関係なく、アミノ酸またはアミノ酸類似体のポリマーを指すために使用される。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は通常、比較的大きなポリペプチドに関して使用され、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は通常、小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複し、変化する。本明細書で使用される「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、特に注記しない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、ポリヌクレオチド産物を指す場合、本明細書では互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変異体、ならびに前記の類似体が含まれる。

参照ポリペプチドに関して使用される場合、「ポリペプチドフラグメント（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｆｒａｇｍｅｎｔ）」および「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、当業者にそれらの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が参照ポリペプチド中の対応する位置と通常同一であるポリペプチドを指すために使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で起こり得る。

ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的フラグメント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、実質的に同じ生物学的活性を有する、または完全長ポリペプチドもしくはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチドフラグメントを指す。

互換的に使用される「変異体ポリペプチド（ｖａｒｉａｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「改変アミノ酸配列（ｍｏｄｉｆｉｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「改変ポリペプチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、１またはそれを超えるアミノ酸、例えば１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および／または付加によって参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。ある態様では、変異体が、参照ポリペプチドの能力の一部または全てを保持する「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｎｔ）」である。

「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、保守的に置換された変異体をさらに含む。「保存的に置換された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、参照ペプチドの活性の一部または全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基の機能的に類似した残基による置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどのある非極性（疎水性）残基の別の残基への置換；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間など、ある荷電もしくは極性（親水性）残基の別の残基への置換；リジンもしくはアルギニンなどのある塩基性残基の別の残基への置換；またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基の別の残基への置換；またはフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンなどのある芳香族残基の別の残基への置換が挙げられる。このような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量にも等電点にもほとんどまたは全く影響を及ぼさないと予想される。「保存的に置換された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｖａｒｉａｎｔ）」という句はまた、得られるペプチドが本明細書に記載される参照ペプチドの活性の一部または全てを維持する限り、残基が化学的に誘導体化された残基で置き換えられているペプチドを含む。

本技術のポリペプチドに関連する「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。

全ての文法形態および綴りのバリエーションにおける「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なる種からの相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、共通の進化的起源（ｃｏｍｍｏｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｏｒｉｇｉｎ）を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ５０：６６７、１９８７）。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、パーセント同一性または保存された位置での特定のアミノ酸もしくはモチーフの存在に関して、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９００、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有することができる。

「適切な調節配列（ｓｕｉｔａｂｌｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すために使用される。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。

「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すために使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置している。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されていてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答し
て、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者によって理解される。ほとんどの場合、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認識されている。

「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結している。コード配列を、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。

本明細書で使用される「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、本技術の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指すために使用される。「過剰発現（ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、正常な生物または非形質転換生物における産生のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指すために使用される。導入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、または宿主染色体とは無関係に複製することができる。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」と呼ばれる。

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」、および「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」という用語は、本明細書で宿主細胞に関連して使用される場合、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、異種核酸分子が導入された、植物または微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る、または核酸分子は染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は自己複製することができる。形質転換細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。

本明細書でポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の組換え技術の使用によって改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含む。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種である、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞内の位置もしくは形態にあるＤＮＡセグメントを指す。

同様に、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」、および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、本明細書でポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞で発現させて、組換えポリペプチドを生産することができる。

「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」、および「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、細胞の中央代謝の一部ではないが、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を通常有する染色体外要素を指すために使用される。このような要素は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる独自の構築物に結合されたまたは組み換えられた、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線形または環状の自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得る。「形質転換カセット（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。

本開示は、いくつかの実施形態では、ＵＤＰ－ラムノースの生合成生産に関する。好ましい実施形態では、本発明は、その化学構造が図１に示される、ＵＤＰ－Ｌ－ラムノースの生産に関する。ＵＤＰ－ラムノースは、ＲｅｂＪおよびＲｅｂＮなどのラムノース含有ステビオール配糖体の生合成生産でラムノースドナー部分として使用することができるので、本開示はまた、部分的には、例えばＵＤＰ－グルコースからのＵＤＰ－ラムノースの調製を含む、ラムノース含有ステビオール配糖体を調製するための生合成経路に関する。

図２を参照すると、本開示の態様は、最低限、中間体ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（「ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ」）を介したＵＤＰ－グルコースからのＵＤＰ－ラムノースの生物変換を触媒するＵＰＤ－ラムノースシンターゼ活性を有する第１の組換えポリペプチドを含む反応系に関する。図２に示される実施形態では、第１の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ４Ｋ６Ｇへの生物変換とＵＤＰ４Ｋ６ＧのＵＤＰ－ラムノースへの生物変換の両方を触媒する三機能性酵素である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドが、それぞれが生物変換の異なるステップを担う２つの異なる酵素を含むことができる。反応系はまた、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの生物変換に使用される補因子であるＮＡＤＰＨを再生するための反応を触媒する第２のポリペプチドを含むことができる。反応系は、ＵＤＰおよびスクロースをＵＤＰ－グルコースに変換する第３の組換えポリペプチドをさらに含むことができる。ＲｅｂＪおよびＲｅｂＮなどのラムノース含有ステビオール配糖体の生合成生産でＵＤＰ－ラムノースがラムノースドナー部分として使用される実施形態では、反応系が、ラムノシルトランスフェラーゼ活性およびグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する追加の酵素を含むことができる。

３つの異なる酵素を伴う植物および真菌におけるＵＤＰ－ラムノース生合成経路。この生合成経路の第１のステップでは、ＵＤＰ－グルコース４，６デヒドラターゼ（「ＤＨ」）が、ＵＤＰ－グルコースをＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）に変換する。この生合成経路の第２のステップでは、酵素ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５エピメラーゼが、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースをＵＤＰ－４－ケトラムノースに変換する。この生合成経路の第３の酵素ステップでは、ＵＤＰ－４－ケトラムノース－４－ケトレダクターゼが、ＵＤＰ－４－ケトラムノースをＵＤＰ－ラムノースに変換する。さまざまな実施形態では、本発明は、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼおよびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性を有する三機能性組換えポリペプチドを提供する。このような三機能性ポリペプチドは、ＲＨＭ酵素とも呼ばれる。三機能性組換えポリペプチドは３つの異なる酵素機能を示すので、この三機能性組換えタンパク質は多酵素タンパク質とも呼ばれる。

一定の実施形態では、本発明は、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ酵素の活性のみを有する組換えポリペプチドであって、本明細書で「ＤＨ」（デヒドラターゼ）ポリペプチドと呼ばれる組換えポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性とＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性の両方を有する二機能性組換えポリペプチドを提供する。この二機能性組換えポリペプチドは、本明細書では「ＥＲ」（エピメラーゼ活性を表す文字「Ｅ」およびレダクターゼ活性を表す文字「Ｒ」）と呼ばれる。さらに別の実施形態では、本発明は、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ活性を有する酵素（ＤＨポリペプチド）が、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性とＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性の両方を有する二機能性ＥＲポリペプチドと融合されている組換え融合ポリペプチドを提供する。このような融合ポリペプチドは、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの変換を触媒する能力を有することが分かっている。

補因子ＮＡＤ^＋はＤＨ触媒ステップで必要とされ、補因子ＮＡＤＰＨはＥＲ触媒ステップの２番目で必要とされる。

表１を参照して、本発明者らは、ＵＤＰ－グルコースをＵＤＰ－ラムノースに生物変換するためのさまざまな三機能性ＵＤＰ－ラムノースシンターゼを同定した。以下の図６に示されるように、Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ［配列番号１］由来のＮＲ１２、Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓｔｈａｌｉｃｔｒｏｉｄｅｓ［配列番号３］由来のＮＲ３２およびＡｚｏｌｌａｆｉｌｉｃｕｌｏｉｄｅｓ［配列番号５］由来のＮＲ３３は、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの変換を触媒することができると示された。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号３または配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを、補因子ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰＨの存在下で、ＵＤＰ－グルコースなどの基質と一緒にインキュベートすることによって、ＵＤＰ－ラムノースを調製する生合成方法に関する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＤＰ－グルコースなどの基質を、高活性ＤＨ酵素および高活性ＥＲ酵素の融合から得られる人工融合酵素と共にインキュベートすることによって、ＵＤＰ－ラムノースを調製する生合成方法に関する。ＤＨおよびＥＲ酵素は、以下の実施例に示されるさまざまな供給源から得ることができ、それらの活性は生化学的アッセイを使用して決定することができる。選択されたＤＨ酵素をコードする核酸配列は、ＵＤＰ－グルコースからのＵＤＰ－ラムノースの合成を触媒する組換え融合ペプチドを生成するために、当業者に周知の組換え技術を使用して、選択されたＥＲ酵素をコードする核酸と融合され得る。ＤＨ酵素およびＥＲ酵素は、ペプチドリンカーを介して連結され得る。さまざまな実施形態では、ペプチドリンカーが２～１５個のアミノ酸を含むことができる。例示的なリンカーとしては、グリシンおよびセリンを含むものが挙げられる。好ましい実施形態では、ＤＨ酵素およびＥＲ酵素が、ＧＳＧリンカーを介して連結され得る（表３）。

さまざまな実施形態では、ＵＤＰ－グルコースが、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）の存在下で、ＵＤＰおよびスクロースからインサイチューで調製され得る。例えば、ＳＵＳは、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。

図３～５に示されるように、本反応系は、ＮＡＤＰ^＋依存性酵素および補因子ＮＡＤＰＨを再生するための酸化反応基質を含むことができる。図３を参照すると、補因子ＮＡＤ^＋は、ＵＤＰ－グルコースがＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースに変換されるＤＨ触媒反応で必要とされる。次いで、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースが、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼによってＵＤＰ－４－ケト－ラムノースに変換される。ＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼによってＵＤＰ－４－ケト－ラムノースをＵＤＰ－ラムノースに触媒的に変換する最後のステップは、補因子ＮＡＤＰＨを必要とする。したがって、ＮＡＤＰＨ補因子を再生してＵＤＰ－ラムノースの連続的な変換を確実にするのを助けることができる副反応を組み込むことが有益である。

引き続き図３を参照すると、リンゴ酸およびＮＡＤＰ^＋依存性リンゴ酸酵素（「ＭａｅＢ」）を含めて本経路を最適化することができる。示されるように、リンゴ酸はＮＡＤＰ^＋の存在下でＭａｅＢによってピルビン酸に酸化され、その過程でＮＡＤＰ^＋因子が還元されてＮＡＤＰＨに戻り、したがってＵＤＰ－ラムノースの生物変換のためにＮＡＤＰＨを再生する。

図４は、別のＮＡＤＰ^＋依存性酵素、ギ酸デヒドロゲナーゼ（「ＦＤＨ」）およびギ酸が使用される代替実施形態を示している。リンゴ酸およびＭａｅＢと同様に、ギ酸は、補因子としてＮＡＤＰ^＋を使用するＦＤＨ酵素によってＣＯ_２に酸化される。ギ酸から除去された電子がＮＡＤＰ^＋に伝達され、ＮＡＤＰ^＋が還元されてＮＡＤＰＨに戻る。

図５は、ＮＡＤＰＨを再生するためのさらに別の代替実施形態を示している。別の例示的なＮＡＤＰ^＋依存性酵素である亜リン酸デヒドロゲナーゼ（「ＰＴＤＨ」）に亜リン酸を添加する。リンゴ酸およびＭａｅＢと同様に、亜リン酸は、補因子としてＮＡＤＰ^＋を使用するＰＴＤＨ酵素によってリン酸に酸化される。亜リン酸から除去された電子がＮＡＤＰ^＋に伝達され、ＮＡＤＰ^＋が還元されてＮＡＤＰＨに戻る。

本開示の一部は、ラムノースドナー部分としてＵＤＰ－ラムノースを使用するラムノース含有ステビオール配糖体の生産に関する。戻って図２を参照すると、ＲｅｂＪおよびＲｅｂＮなどのラムノース含有ステビオール配糖体を、ＲｅｂＡから生成することができる。いくつかの実施形態では、ＲｅｂＡが、ラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｈａＴ）、例えば、ＥＵ１１［配列番号９７］、ＥＵＣＰ１［配列番号２３］、ＨＶ１［配列番号９９］、ＵＧＴ２Ｅ－Ｂ［配列番号１０１］またはＮＸ１１４［配列番号１０３］、およびＵＤＰ－ラムノースなどのラムノースドナー部分を使用して、ＲｅｂＪに変換され得る。その後、ＲｅｂＪが、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１［配列番号１０７］、ＣＰ１［配列番号２５］、ＣＰ２［配列番号１０５］、またはＵＧＴ７６Ｇ１とＳＵＳの融合酵素［配列番号１０９］を使用してＲｅｂＮに変換され得る。

実施例１
ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ酵素の酵素活性スクリーニング
系統発生学、遺伝子クラスターおよびタンパク質ＢＬＡＳＴ分析を使用して、ＵＤＰ－グルコースからＵＤＰ－ラムノースを生成するための候補ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ（「ＲＨＭ」）遺伝子を同定した。全ての候補ＲＨＭ遺伝子の全長ＤＮＡ断片を、大腸菌のコドン選好に従って最適化し、合成した（ＧｅｎｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ、ＤＥ）。合成したＤＮＡ断片を細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅＮ－ＨｉｓＳＵＭＯＫａｎＶｅｃｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にクローニングした。

各発現構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、その後、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃でＯＤ_６００が０．８～１．０に達するまで増殖させた。１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、タンパク質発現を誘導し、培養物を１６℃で２２時間さらにインキュベートした。細胞を遠心分離（３，０００×ｇ；１０分；４℃）によって収穫した。細胞ペレットを回収し、直ちに使用するか、または－８０℃で保存した。

細胞ペレットを典型的には溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５μｇ／ｍｌリゾチーム、５μｇ／ｍｌＤＮアーゼＩ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび０．４％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）に再懸濁した。細胞を４℃で超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離（１８，０００×ｇ；３０分）によって清澄化した。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティーカラムにロードした。タンパク質試料をロードした後、カラムを平衡緩衝液で洗浄して、未結合の汚染タンパク質を除去した。Ｈｉｓタグ化ＲＨＭ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液で溶出した。

精製された候補ＲＨＭ組換えポリペプチドを、基質としてＵＤＰ－グルコースを使用することによってＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性についてアッセイした。典型的には、組換えポリペプチド（２０～５０μｇ）を２００μｌのインビトロ反応系で試験した。反応系は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３ｍＭＭｇＣｌ_２、３～６ｍＭＵＤＰ－グルコース、１～３ｍＭＮＡＤ^＋、１ｍＭＤＴＴおよび１～３ｍＭＮＡＤＰＨを含有する。反応を３０～３７℃で実施し、２００μＬのクロロホルムを添加することによって反応を終了させた。試料を同体積のクロロホルムで頂点ごとに１０分間抽出した。１０分間の遠心分離後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために上清を回収した。

次いで、ＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含むＡｇｉｌｅｎｔ１２００システム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を使用して実施した。クロマトグラフィー分離を、ＤｉｏｎｅｘＣａｒｂｏＰＡ１０カラム（４×１２０ｍｍ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、移動相を１ｍｌ／分の流速で送達して実施した。移動相はＨ_２Ｏ（ＭＰＡ）および７００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）（ＭＰＢ）とした。ＭＰＢの勾配濃度を試料分析のためにプログラムした。ＨＰＬＣ分析に用いた検出波長は２６１ｎｍであった。活性スクリーニング後、３つのＲＨＭ酵素（ＮＲ１２、ＮＲ３２およびＮＲ３３）を、ＵＤＰ－グルコースからＵＤＰ－ラムノースへの生物変換の候補として同定した（表１）。

３つの異なるＲＨＭ酵素、すなわちＮＲ１２、ＮＲ３２およびＮＲ３３の活性を、３つの異なる期間（３時間、６時間および１８時間）試験した。３時間の最後の酵素活性を図６の上部パネル（Ａ）に示す。６時間および１８時間の最後の酵素活性をそれぞれ図６の中央のパネル（Ｂ）および下部パネル（Ｃ）に示す。さらに、これらの実験では、これらの３つのＲＨＭ酵素のＵＤＰ－グルコース４，６デヒドラターゼ成分の作用中のＮＡＤ^＋の還元に対するＮＡＤＰＨの効果を理解する努力もなされた。１つの実験条件下で、補因子ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰＨを実験の開始時に添加した。このプロセスバリエーションは、「一段階補因子添加」と呼ばれ、図６で酵素名の後に文字「ａ」でマークされている（ＮＲ１２－ａ、ＮＲ３２－ａおよびＮＲ３３－ａ）。第２の実験セットでは、ＮＡＤ^＋を実験の開始時に添加し、反応が開始してから３時間後までＮＡＤＰＨを添加しなかった。このプロセスバリエーションは、「二段階補因子添加」と呼ばれ、図６で酵素名の後に文字「ｂ」でマークされている（ＮＲ１２－ｂ、ＮＲ３２－ｂおよびＮＲ３３－ｂ）。

引き続き図６を参照すると、両因子が存在する場合、３つ全ての候補酵素が３時間マークと同じくらい早くＵＤＰ－ラムノースを生成し始めたことが分かる（パネルＡ）。反応をより長い反応時間延長した場合、より多くのＵＤＰ－ラムノースが生産された（図６のパネルＢおよびＣ）。一段階補因子添加アプローチでは、ＮＲ３２－ａが、３つの候補酵素の中で最も高いＵＤＰ－ラムノース生産活性（１８時間で０．５７ｇ／ＬＵＤＰ－Ｒｈ）を示した。この第１の実験セット（ａ）では、ＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰＧ）からＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）への高レベル（ほぼ完全）の変換によって証明されるように、ＮＲ１２－ａが、高いＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ（ＤＨ）活性を有するが、非常に低いＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性およびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ（ＥＲ）活性を有することが観察された。これらの結果は、３つの酵素全てが、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの生物変換のための三機能性ＵＤＰ－ラムノースシンターゼであることを示した。

さらに、本発明者らはまた、二段階補因子添加アプローチが変換効率を高めることができることを見出し、後のＮＡＤＰＨ添加がＤＨ酵素に対するＵＤＰ－ラムノースの負のフィードバック調節を回避することができることを示した。二段階補因子添加プロセスでは、ＮＡＤ^＋を最初の反応に添加し、ＮＡＤＰＨを３時間後に反応に添加した。図６に示されるように、ＮＲ３２（ＮＲ３２－ｂ）とＮＲ３３（ＮＲ３３－ｂ）の両方が、一段階反応（ＮＲ３２－ａおよびＮＲ３３－ａ）よりも高いＵＤＰ－ラムノース生産を有する。ＮＲ３２－ｂは、ＵＤＰ－Ｒｈを生産する最も高い活性を有し、１８時間で１．１ｇ／ＬのＵＤＰ－Ｒｈに達する（パネルＣ）。実験の第１のセットの結果と一致して、ＮＲ１２－ｂは、ＵＤＰ－グルコースからＵＤＰ４Ｋ６Ｇへの高レベルの変換によって証明されるように、高いＤＨ活性を示し、非常に低いＥＲ活性を示したが、ＵＤＰ－ラムノース生産はほとんどなかった。

これらの結果は、二段階補因子添加アプローチを使用して、ＵＤＰ－グルコースからＵＤＰ－ラムノースへの変換効率を高めることができることを示した。

実施例２
補因子の二段階添加
図７は、本開示による二段階補因子添加アプローチが、三機能性酵素ＮＲＦ１を伴う反応において、ＵＤＰ－ラムノース生産のための変換効率をどのように高めることができるかを示している。二段階反応（ｂ－１時間、ｂ－３時間、ｂ－４時間、ｂ－６時間、ｂ－１８時間）では、ＮＡＤ^＋を最初の反応に添加した。ＵＤＰＧ基質は、３時間（ｂ－３時間）で、ＤＨ活性によってＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコースに完全に変換された。次いで、ＮＡＤＰＨを反応物に添加し、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコースが１８時間（ｂ－１８時間）でＵＤＰ－ラムノースに完全に変換されたことが示された。一段階反応（ａ－１時間、ａ－３時間、ａ－４時間、ａ－６時間、ａ－１８時間）では、ＮＡＤ＋とＮＡＤＰＨの両方を最初の反応に添加し、ＵＤＰＧはＵＤＰ－ラムノースに不完全に変換され、報告されているようにＵＤＰ－ラムノースがＤＨ活性に対して負のフィードバック効果を有することが示唆された。ＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰＧ）、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）およびＵＤＰ－ラムノース（ＵＤＰ－Ｒｈ）のレベルを、両方のアプローチ下で１時間、３時間、４時間、６時間および１８時間後に測定した（「ａ」は一段階アプローチを示し、「ｂ」は二段階アプローチを示す）。

実施例３
ＵＤＰ－ラムノースのインビトロ合成のためのワンポット多酵素系の最適化
スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）はスクロース分子を分解してフルクトース分子およびグルコース分子を生成することができる。さらに、ＳＵＳは、１つのグルコースをＵＤＰに転移させてＵＤＰ－グルコースを形成することができる。したがって、供給原料にスクロース、ＵＤＰおよびＳＵＳを含めることによって、本明細書に開示されるＵＤＰ－ラムノース合成経路における必要なＵＤＰ－グルコース成分をスクロースシンターゼの存在下で補充することができる。

さらに、ＮＡＤＰＨはＥＲ活性の重要な補因子である。ＥＲ触媒反応の過程で、ＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ^＋に酸化される。ＮＡＤＰ^＋依存性酸化反応を本明細書中に開示されるＵＤＰ－ラムノース合成の一部として組み込むことによって、ＮＡＤＰＨを再生することができる。例示的なＮＡＤＰ^＋依存性酸化反応には、リンゴ酸のピルビン酸への酸化、ギ酸のＣＯ_２への酸化、および亜リン酸のリン酸への酸化が含まれる。これらの酸化反応の各々を触媒することができるリンゴ酸、ギ酸または亜リン酸および対応する酵素（それぞれ、ＭａｅＢ、ＦＤＨおよびＰＴＤＨ）を供給原料に含めることによって、ＮＡＤＰＨが連続的に再生され、全体的なＵＤＰ－ラムノース生産収率がさらに最適化される。表１は、さまざまな酵素の配列に関する情報を提供する。

この実施例では、二段階補因子添加アプローチを使用して、ワンポット多酵素反応系において出発物質のさまざまな組み合わせで６つの異なる実験を実施した。表２は、この実験で試験した６つの異なる反応系の組成を提供する。

６つの系の各々で、ＵＤＰ－グルコースを含めなかった。代わりに、ＵＤＰ、スクロースおよびＳＵＳを提供して、必要なＵＤＰ－グルコースを生成した。図８を参照すると、系１からの結果は、ＵＤＰ－グルコースが生成されたことを示し、ＳＵＳがＵＤＰをＵＤＰ－グルコースに完全に変換することができることが確認される。ＲＨＭ酵素（例えば、ＮＲＦ１）と共にスクロースシンターゼ酵素（ＳＵＳ）を提供することによって、ＵＤＰを基質として使用してＵＤＰ－ラムノースを生産することができる（系２）。

これらの実験はまた、ＵＤＰ－ラムノース生産におけるＮＡＤＰＨ再生の効果を確認した。引き続き図８を参照すると、少量のＮＡＤＰＨを含有する反応系にＭａｅＢ酵素およびリンゴ酸を添加することによって（系４）、高レベルのＵＤＰ－ラムノースを依然として得ることができ、ＮＡＤＰＨの再生が確認される。比較すると、同じ量のＮＡＤＰＨを含めたが、ＭａｅＢ酵素が存在しない系３では、はるかに少ない量のＵＤＰ－Ｒｈが生産された。同様に、少量のＮＡＤＰ^＋を含有する反応系（系５および系６）では、ＭａｅＢ酵素が存在するならば、添加されたＮＡＤＰ^＋をＭａｅＢによってＮＡＤＰＨに変換することができ、ＵＤＰ－ラムノース生産のためにＮＡＤＰＨを連続的に再生することができる（系６）。１ｍＭのＮＡＤＰ^＋のみを含む系６で得られたＵＤＰ－ラムノースの量は、３ｍＭのＮＡＤＰＨを含む系２で得られた量に匹敵した。比較すると、ＮＡＤＰＨもＭａｅＢも含まない系５では、ＵＤＰ４Ｋ６ＧのほとんどがＵＤＰ－ラムノースに変換されなかった。上記のように、リンゴ酸／ＭａｅＢ系は、ギ酸／ＦＤＨおよび亜リン酸／ＰＴＤＨなどの他のＮＡＤＰ^＋依存性酸化系で置換することができる。

実施例４
ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼの酵素活性スクリーニング
ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ（ＤＨ）は、ＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰＧ）のＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）への生物変換のための酵素反応を触媒することができる。特異的ＤＨ酵素を同定するために、系統発生およびＢｌａｓｔ解析に基づいて酵素候補を選択した。

全ての候補ＤＨ遺伝子の完全長ＤＮＡ断片を商業的に合成した。ｃＤＮＡのほとんど全てのコドンを、大腸菌にとって好ましいコドンに変更した（ＧｅｎｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ、ＤＥ）。合成したＤＮＡを細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅＮ－ＨｉｓＳＵＭＯＫａｎＶｅｃｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にクローニングした。

各発現構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、その後、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃でＯＤ６００が０．８～１．０に達するまで増殖させた。１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、タンパク質発現を誘導し、培養物を１６℃で２２時間さらに増殖させた。細胞を遠心分離（３，０００×ｇ；１０分；４℃）によって収穫した。細胞ペレットを回収し、直ちに使用するか、または－８０℃で保存した。

細胞ペレットを典型的には溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５ｕｇ／ｍｌリゾチーム、５ｕｇ／ｍｌＤＮアーゼＩ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび０．４％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）に再懸濁した。細胞を４℃で超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離（１８，０００×ｇ；３０分）によって清澄化した。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティーカラムにロードした。タンパク質試料をロードした後、カラムを平衡緩衝液で洗浄して、未結合の汚染タンパク質を除去した。Ｈｉｓタグ化ＤＨ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液によって溶出した。

精製された候補ＤＨ組換えポリペプチドを、基質としてＵＤＰＧを使用することによってＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース合成についてアッセイした。典型的には、組換えポリペプチド（２０μｇ）を２００μｌのインビトロ反応系で試験した。反応系は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３ｍＭＭｇＣｌ_２、３ｍＭＵＤＰＧ、３ｍＭＮＡＤ^＋および１ｍＭＤＴＴを含有する。反応を３０～３７℃で実施し、２００μＬのクロロホルムを添加することによって反応を終了させた。試料を同体積のクロロホルムで頂点ごとに１０分間抽出した。１０分間の遠心分離後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために上清を回収した。

次いで、ＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を含むＡｇｉｌｅｎｔ１２００システム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を使用して実施した。クロマトグラフィー分離を、ＤｉｏｎｅｘＣａｒｂｏＰＡ１０カラム（４×１２０ｍｍ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、移動相を１ｍｌ／分の流速で送達して実施した。移動相はＨ_２Ｏ（ＭＰＡ）および７００ｍＭ酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔｉｃ）（ｐＨ５．２）（ＭＰＢ）とした。ＭＰＢの勾配濃度を試料分析のためにプログラムした。ＨＰＬＣ分析に用いた検出波長は２６１ｎｍであった。

活性スクリーニング後、１２の新規ＤＨ酵素を、ＵＤＰＧのＵＤＰ４Ｋ６Ｇへの生物変換について同定した（表１）。図９に示されるように、ＤＨ酵素は、ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ生産についてさまざまなレベルの酵素活性を示す。さらに、６つの候補（ＮＲ１５Ｎ、ＮＲ５３Ｎ、ＮＲ５８Ｎ、ＮＲ６２Ｎ、ＮＲ６４ＮおよびＮＲ６５Ｎ）はまた、ＵＤＰ－ラムノース生産について低い酵素活性を示し、これらの酵素が、ＵＤＰＧからのＵＤＰ－Ｌ－ラムノース合成のための三機能性活性（ＲＨＭ）を有し得ることを示している。

実施例５
二機能性ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ／ＵＤＰ－４－ケトラムノース４－ケトレダクターゼの酵素活性スクリーニング
二機能性ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ／ＵＤＰ－４－ケトラムノース４－ケトレダクターゼ（ＥＲ）酵素は、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースをＵＤＰ－β－Ｌ－ラムノースに変換することができる。特異的ＥＲ酵素を同定するために、系統発生およびＢｌａｓｔ解析に基づいて一定の酵素候補を選択した。

全ての候補ＥＲ遺伝子の完全長ＤＮＡ断片を商業的に合成した。ｃＤＮＡのほとんど全てのコドンを、大腸菌にとって好ましいコドンに変更した（ＧｅｎｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ、ＤＥ）。合成したＤＮＡを細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅＮ－ＨｉｓＳＵＭＯＫａｎＶｅｃｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にクローニングした。

細胞ペレットを典型的には溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５ｕｇ／ｍｌリゾチーム、５ｕｇ／ｍｌＤＮアーゼＩ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび０．４％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）に再懸濁した。細胞を４℃で超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離（１８，０００×ｇ；３０分）によって清澄化した。上清を平衡化（平衡化緩衝液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール）Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティーカラムにロードした。タンパク質試料をロードした後、カラムを平衡緩衝液で洗浄して、未結合の汚染タンパク質を除去した。Ｈｉｓタグ化ＥＲ組換えポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液によって溶出した。

精製された候補ＥＲ組換えポリペプチドを、基質としてＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）を使用することによってＵＤＰ－ラムノース合成についてアッセイした。典型的には、組換えポリペプチド（２０μｇ）を２００μｌのインビトロ反応系で試験した。反応系は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３ｍＭＭｇＣｌ_２、３ｍＭＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース、３ｍＭＮＡＤＰＨおよび１ｍＭＤＴＴを含有する。反応を３０～３７℃で実施し、２００μＬのクロロホルムを添加することによって反応を終了させた。試料を同体積のクロロホルムで頂点ごとに１０分間抽出した。１０分間の遠心分離後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために上清を回収した。

活性スクリーニング後、１７の新規ＥＲ酵素を、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースのＵＤＰ－Ｌ－ラムノースへの生物変換について同定した（表１）。図１０に示されるように、１７の候補は、ＵＤＰ－Ｌ－ラムノース産生についてさまざまなレベルの酵素活性を示す。１７の酵素候補のうち、以下の酵素が高いＥＲ活性を示す：ＮＲ２１Ｃ、ＮＲ３７Ｃ、ＮＲ４０Ｃ、ＮＲ４１ＣおよびＮＲ４６Ｃ。

実施例６
ＵＤＰ－ラムノース生産のための新規な融合酵素の同定
組換えＤＮＡ技術による融合酵素の構築は、ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有する新たな三機能性酵素を得るのに有用であり得る。しかしながら、２つの機能性酵素の融合は、必ずしも両酵素成分の活性を有する活性融合酵素を提供するとは限らない。さらに、適切なリンカーは、通常、実験的にのみ同定される。

さまざまなＤＨおよびＥＲ酵素候補ならびに三機能性ＲＨＭ酵素のＮ末端およびＣ末端ドメインの広範なスクリーニングに基づいて、特異的ＤＨおよびＥＲドメインを有する一連の融合酵素を同定し、スクリーニングした。

このようなさらなるスクリーニングの後、６つの融合酵素が、ＵＤＰ－グルコースのＵＤＰ－ラムノースへの生物変換のための三機能活性を有することが分かった（表３）。

具体的には、これらの融合酵素のうちの５つは、異なるＥＲ酵素（ＮＸ５Ｃ、ＮＸ１３、ＮＲ５Ｃ、ＮＲ４０ＣおよびＮＲ４１Ｃ）と融合した高活性ＤＨ酵素ＮＸ１０に基づく、すなわちＮＲＦ１（ＮＸ１０－ＮＸ５Ｃ）、ＮＲＦ２（ＮＸ１０－ＮＸ１３）、ＮＲＦ３（ＮＸ１０－ＮＲ５Ｃ）、ＮＲＦ４（ＮＸ１０－ＮＲ４０Ｃ）およびＮＲＦ５（ＮＸ１０－ＮＲ４１Ｃ）である。三機能性活性を有する追加の融合酵素ＮＲＦ７（ＮＲ６６Ｎ－ＮＲ４１Ｃ）は、高活性ＥＲ酵素ＮＲ４１Ｃと融合した高活性ＤＨ酵素ＮＲ６６Ｎに基づく。図１１に示されるように、ＮＸ１０シグナル酵素は、ＵＤＰ－グルコースをＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコース（ＵＤＰ４Ｋ６Ｇ）に完全に変換することができる。一方、図１１および１２は、融合酵素ＮＲＦ１、ＮＲＦ２、ＮＲＦ３、ＮＲＦ４、ＮＲＦ５およびＮＲＦ７が全て、ＮＡＤＰＨを３時間の反応後に添加した二段階補因子添加反応において、ＵＤＰ－ラムノース合成のための三機能性活性を有することを示している。特に、ＮＲＦ１、ＮＲＦ２、ＮＲＦ４、ＮＲＦ５およびＮＲＦ７融合酵素は、ＮＲＦ３よりも高い酵素活性を有する。

実施例７
ＵＤＰ－ラムノースおよびステビオール配糖体生産の組み合わせ
現在国際公開第２０１９／１７８１１６号パンフレットとして公開されている、共同所有の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２１８７６に記載されているように、本発明者らは、ＲｅｂＪおよびＲｅｂＮなどのラムノース含有ステビオール配糖体の生合成のためのさまざまなＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ（１，２ＲｈａＴ）を同定した。具体的には、ＲｅｂＡおよびＵＤＰ－ラムノースからＲｅｂＪおよびＲｅｂＮを合成することができる。

図２を参照すると、本明細書に開示されるＵＤＰ－ラムノースを生成するための生合成経路を、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２１８７６に開示されるＲｅｂＡからＲｅｂＪ／Ｎを生成するための生合成経路と連結することによって、ＲｅｂＡおよびＵＤＰ－グルコースからのＲｅｂＪ／Ｎのインビトロ生物変換のためのワンポット多酵素反応系が提供される。

第１のステップで、ＵＤＰ－グルコースを、ＮＲＦ１（配列番号９）などのＲＨＭ酵素によって、二段階補因子添加プロセスを通してＵＤＰ－ラムノースに変換した。ＵＤＰ－グルコース（６ｍＭ）を、３時間でＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコースに完全に変換した（図１３）。その後、０．５ｍＭＮＡＤＰ^＋およびＮＡＤＰＨ再生系（例えば、ＭａｅＢ酵素およびリンゴ酸）を反応に添加し、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシグルコースをＵＤＰ－ラムノースに変換した。図１３を参照すると、１８時間後にほぼ３ｇ／ＬのＵＤＰ－Ｒｈが得られた。

第２のステップでは、ＲｅｂＡおよびＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ、例えばＥＵＣＰ１（配列番号２３）を反応系に添加した。ＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ酵素は、１つのラムノース部分をＵＤＰ－ラムノースからＲｅｂＡ基質の１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’に転移し、それによってＲｅｂＡをＲｅｂＪに変換する。ＲｅｂＪのレベルを２２時間で測定した。ＥＵＣＰ１の活性をＨＰＬＣによって確認したところ、ＲｅｂＪ（図１４のパネルＣ）の存在が示された。ＵＤＰが副産物として放出された。

第３のステップでは、ＣＰ１（配列番号２５）などのＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素、ＳＵＳ（配列番号１５）などのスクロースシンターゼ酵素およびスクロースを反応混合物に添加した。ＳＵＳ酵素は、ＵＤＰおよびスクロースからＵＤＰ－グルコースおよびフルクトースを生成する反応を触媒した。ＣＰ１酵素は、具体的には、１つのグルコシル部分をＵＤＰ－グルコースからＲｅｂＪの１９－Ｏ－グルコースのＣ－３’に転移してＲｅｂＮおよびＵＤＰを生成することによって、ＲｅｂＪのＲｅｂＮへの変換を触媒した。生成されたＵＤＰを、ＵＤＰ－ラムノースおよびＲｅｂＮ生産のためにスクロースの存在下でＳＵＳ酵素によってＵＤＰ－グルコースに戻した。ＨＰＬＣ分析により、ＲｅｂＮが２５時間でＲｅｂＪから生成されたことが確認された（図１４のパネルＤ）。

これらの結果に基づいて、再び図２を参照すると、本ワンポット多酵素反応を以下のように要約することができる。この反応では、ＵＤＰ－グルコースを、二段階補因子付加プロセスを介してＵＤＰ－ラムノースシンターゼ（例えば、ＮＲＦ１）によってＵＤＰ－ラムノースに変換することができる。ＵＤＰ－ラムノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＵＣＰ１）を使用して、１つのラムノース部分をＵＤＰ－ラムノースからＲｅｂＡの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’に転移してＲｅｂＪおよびＵＤＰを生成することができる。生成されたＵＤＰを、グルコース源としてスクロースを使用してＳＵＳ酵素によりＵＤＰ－グルコースに変換することができる。ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＣＰ１）を使用して、１つのグルコシル部分をＵＤＰＧからＲｅｂＪの１９－Ｏ－グルコースのＣ－３’に転移してＲｅｂＮおよびＵＤＰを生成することができる。生成されたＵＤＰを、ＵＤＰ－ラムノースおよびＲｅｂＮ生産のためにＳＵＳ酵素によってＵＤＰ－グルコースに戻すことができる。

Claims

ウリジン二リン酸－グルコース（ＵＤＰ－グルコース）からウリジン二リン酸－ラムノース（ＵＤＰ－ラムノース）を調製する生合成方法であって、ＵＤＰ－グルコースを、ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰＨ源の存在下で、ＵＤＰ－ラムノースを生成するのに十分な時間、ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有する１または複数の組換えポリペプチドと共にインキュベートすることを含む方法。
前記１または複数の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ、ＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼおよびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性を有する三機能性酵素である第１の組換えポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
前記１または複数の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ活性を有する第１のドメインならびにＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性およびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性を有する第２のドメインを含む融合酵素である第１の組換えポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
前記１または複数の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ活性を有する第１の組換えポリペプチドならびにＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性およびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性を有する第２の組換えポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
前記融合酵素の前記第１のドメインが、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
前記融合酵素の前記第２のドメインが、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号６１または配列番号６３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
前記融合酵素が、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３、配列番号８３または配列番号８５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
前記第１の組換えポリペプチドが、配列番号９、配列番号１１、配列番号８３または配列番号８５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
前記融合酵素の前記第１のドメインが、配列番号７または配列番号３１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
前記融合酵素の前記第２のドメインが、配列番号６３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
前記第１の組換えポリペプチドが、配列番号８７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
前記第１のドメインが、ＧＳＧリンカーを介して前記第２のドメインに連結される、請求項５から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記１または複数の組換えポリペプチドが、ＵＤＰ－グルコース４，６－デヒドラターゼ酵素をコードする第１のヌクレオチドとＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコース３，５－エピメラーゼ活性およびＵＤＰ－４－ケト－ラムノース４－ケト－レダクターゼ活性を有する二機能性酵素をコードする第２のヌクレオチドとの間の融合から生じるヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドである第１の組換えポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
前記第１のヌクレオチドが、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
前記第１のヌクレオチドが、配列番号３２と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
前記第２のヌクレオチドが、配列番号６２と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
前記第２のヌクレオチドが、配列番号６４と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
前記三機能性酵素が、配列番号３または配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
前記第１の組換えポリペプチドが、配列番号７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
前記第２の組換えポリペプチドが、配列番号４９、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６３または配列番号７１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４または１９に記載の方法。
前記１または複数の組換えポリペプチドを形質転換細胞系で発現させることを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
前記形質転換細胞系が、酵母、非ＵＤＰ－ラムノース産生植物、藻類、真菌および細菌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
前記形質転換細胞系が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｐａｎｔｏｅａ；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される細菌または酵母である、請求項２２に記載の方法。
ＵＤＰ－ラムノースが、中間体としてのＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースを介してＵＤＰ－グルコースから生成される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＮＡＤＰＨ源が、ＵＤＰ－グルコースがＵＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－グルコースを生成するのに十分な時間、１または複数の組換えポリペプチドと共にインキュベートされた後に提供される、請求項２４に記載の方法。
前記ＮＡＤＰＨ源が酸化反応基質およびＮＡＤＰ^＋依存性酵素を含む、請求項２５記載の方法。
前記ＮＡＤＰＨ源がリンゴ酸およびリンゴ酸酵素を含む、請求項２５記載の方法。
前記ＮＡＤＰＨ源がギ酸およびギ酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項２５記載の方法。
前記ＮＡＤＰＨ源が亜リン酸および亜リン酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項２５記載の方法。
前記ウリジン二リン酸－グルコースおよび前記１または複数の組換えポリペプチドを、スクロースおよびスクロースシンターゼ活性を有する第３の組換えポリペプチドと共にインキュベートする、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
前記第３の組換えポリペプチドが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓスクロースシンターゼ、ＶｉｇｎａｒａｄｉａｔｅスクロースシンターゼおよびＣｏｆｆｅａスクロースシンターゼからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
少なくとも１つのラムノース含有ステビオール配糖体を含むステビオール配糖体組成物を調製する生合成方法であって、
（ａ）ウリジン二リン酸－ラムノースを生成するために、スクロース、ウリジン二リン酸およびウリジン二リン酸－グルコースからなる群から選択される基質を、ＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰＨ源の存在下で、ＵＤＰ－ラムノースシンターゼ活性を有する１または複数の組換えポリペプチドと共にインキュベートすることと；
（ｂ）ラムノース部分がステビオール配糖体基質に連結して、少なくとも１つのラムノース含有ステビオール配糖体を生成するように、前記ウリジン二リン酸－ラムノースを、ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する組換えポリペプチドの存在下で、ステビオール配糖体基質と反応させることと
を含む方法。
前記ステビオール配糖体基質がレバウジオシドＡである、請求項３２に記載の方法。
前記ステビオール配糖体組成物が、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＪ、またはその両方を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
グルコース部分がラムノース含有ステビオール配糖体に連結するように、前記ラムノース含有ステビオール配糖体を、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する組換えポリペプチドの存在下で反応させることをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
前記基質がウリジン二リン酸－グルコースを含む、請求項３２に記載の方法。
前記ウリジン二リン酸－グルコース基質が、スクロースシンターゼの存在下で、スクロースおよびウリジン二リン酸を反応させることによってインサイチューで提供される、請求項３６に記載の方法。
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号８３、配列番号８５または配列番号８７と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
請求項３８に記載の核酸を含む細胞。
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号８３、配列番号８５または配列番号８７と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物。
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号８３、配列番号８５または配列番号８７と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む細胞。
酵母細胞、非ＵＤＰラムノース産生植物細胞、藻類細胞、真菌細胞または細菌細胞である、請求項３９または４１に記載の細胞。