CN106103729B - 甜菊醇糖苷的重组制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有UDP‑糖基转移酶活性的重组多肽，包括用于合成甜菊醇糖苷的1,2‑19‑O‑葡萄糖糖基化活性和1,2‑13‑O‑葡萄糖糖基化活性。本发明也提供使用这种重组多肽制备甜菊醇糖苷组合物的方法。本发明也公开了被称为甜叶菊甙Z1和甜叶菊甙Z2的甜菊醇糖苷。
Description
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背景技术
本发明内容主要涉及甜菊醇糖苷(steviol glycosides)的生物合成。特别地，本发明内容涉及催化甜菊醇糖苷(例如甜叶菊甙D、甜叶菊甙E和一种新的甜叶菊甙(甜叶菊甙Z))的制备的重组多肽。
甜菊醇糖苷是从甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中分离的天然产物，并且被广泛用作高强度、低热量的甜味剂。自然产生的甜菊醇糖苷具有相同的基本结构(甜菊醇)并且在C13和C19位置上的碳水化合物残基(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的含量上不同。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊糖(stevioside)、甜叶菊甙A、甜叶菊甙B、甜叶菊甙C、甜叶菊甙D、甜叶菊甙E、甜叶菊甙F和杜尔可甙(dulcoside)A。
基于干重，甜菊糖、甜叶菊甙A、甜叶菊甙C和杜尔可甙A分别占叶中的甜菊醇糖苷总重量的9.1、3.8、0.6和0.3％，而其他甜菊醇糖苷以低得多的量存在。来自甜叶菊(Steviarebaudiana)植物的提取物是商业可得的，其通常含有作为主要化合物的甜菊糖和甜叶菊甙A。其他甜菊醇糖苷通常作为次要组分存在于甜叶菊提取物中。例如，甜叶菊甙A在商业制品中的量可以从总的甜菊醇糖苷含量的约20％至多于90％变化，而甜叶菊甙B的量可以是总的甜菊醇糖苷的约1-2％，甜叶菊甙C的量可以是总的甜菊醇糖苷的约7-15％，甜叶菊甙D的量可以是总的甜菊醇糖苷的约2％。
作为天然的甜味剂，不同的甜菊醇糖苷具有不同的甜度和余味。甜菊醇糖苷的甜度显著高于蔗糖的甜度。例如，甜菊糖比蔗糖甜100-150倍并具有苦的余味，而甜叶菊甙A和E比蔗糖甜250-450倍并且余味比甜菊糖好得多。相应地，任何甜叶菊提取物的味道特征被提取物中甜菊醇糖苷的相对含量极度的影响，其进而可以被植物的来源、环境因素(比如含泥量和气候)以及提取工艺影响。具体地，提取条件的变化可能导致甜叶菊提取物中甜菊醇糖苷的组成不一致，使得味道特征在不同批次的提取产物之间变化。甜叶菊提取物的味道特征也可以被提取工艺后残留在产物中的植物来源的污染物(比如色素、脂类、蛋白类、酚类和糖类)影响。这些污染物通常具有对于甜叶菊提取物作为甜味剂的用途所不期望的异味。
大多数甜菊醇糖苷是通过甜菊醇的几个糖基化反应形成的，所述反应通常被使用尿苷-5’-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作为糖部分的供体的UDP-糖基转移酶(UGT)催化。在植物中，UGT是将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移到甜菊醇的非常不同组的酶。甜菊糖是甜叶菊甙化合物生物合成中的中间物。例如，甜菊糖的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化产生甜叶菊甙A；甜菊糖的19-O-葡萄糖的C-2’的糖基化产生甜叶菊甙E。甜叶菊甙A(在19-O-葡萄糖)或甜叶菊甙E(在C-13-O-葡萄糖)上的进一步的糖基化产生甜叶菊甙D。(图1A-1C)。
改善甜叶菊提取物的味道质量的实用方法是通过甜菊糖的进一步糖基化增加甜叶菊甙化合物的产量。具有1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的UGT对于甜叶菊甙D和E的制备来说是重要的酶类。
蔗糖合酶(SUS)在蔗糖存在下催化UDP转换成UDP-葡萄糖。因此，对于利用UDP-葡萄糖(例如被UGT催化的那些)的糖基化反应，SUS可以被用于从UDP再生UDP-葡萄糖，提高这种反应的效率(图2)。
相应地，对于比目前的商业产品具有一致的味道特征和更少异味的甜菊醇糖苷存在需求。如本文所描述的，本发明内容提供用于制备甜菊醇糖苷(例如甜叶菊甙D和甜叶菊甙E)的重组多肽。本发明内容也提供使用这种重组多肽制备甜菊醇糖苷(甜叶菊甙Z)组合物的方法。
发明内容
本目标技术主要涉及具有UDP-糖基转移酶活性的重组多肽。具体地，本发明提供具有用于甜菊醇糖苷化合物的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的多肽。一方面，本目标技术涉及包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列的重组多肽。在一个示例性实施方式中，本文描述的重组多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同一性。
另一方面，本目标技术涉及包含编码本文所述的重组多肽的核苷酸序列的分离的核酸。另一方面，本目标技术涉及包含本文所述的核酸的载体，以及包含本文所述的载体的宿主细胞。在一个示例性实施方式中，本目标技术的宿主细胞选自由细菌、酵母、丝状真菌、蓝藻(cyanobacteria algae)和植物细胞组成的组。
另一方面，本目标技术也涉及制造甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括用包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列的重组多肽孵育底物(例如甜菊糖、甜叶菊甙A、甜叶菊甙E或其组合)。在一个示例性实施方式中，在本文所述的方法中使用的重组多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同一性。
另一方面，本目标技术也涉及制造甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括用包含与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列的重组多肽孵育底物(例如甜菊糖和甜叶菊甙E)。在一个示例性实施方式中，在本文所述的方法中使用的重组多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:11具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同一性。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括用本文所述的底物和重组多肽孵育重组蔗糖合酶(例如具有与SEQ ID NO:9所示的AtSUS1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的一种重组蔗糖合酶)。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括用本文所述的重组蔗糖合酶、底物和重组多肽孵育重组UDP-糖基转移酶(例如具有与SEQ ID NO:11所示的UGT76G1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的一种重组UDP-糖基转移酶)。在另一个实施方式中，本文所述的方法包括用表达重组多肽的宿主细胞孵育底物。
本目标技术也涉及新的甜菊醇糖苷，被称为甜叶菊甙Z，其特征在于在本文所述的条件下在HPLC上的保留时间约6.68分钟。本目标技术也涉及制备本文所述的甜叶菊甙Z的方法，所述方法包括用包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列的重组多肽孵育底物。如本文使用的，术语“甜叶菊甙Z”或“Reb Z”指化合物的混合物，尤其指甜叶菊甙Z1(“Reb Z1”)和甜叶菊甙Z2(“Reb Z2”)的混合物。
在一个实施方式中，本发明内容进一步涉及用于从甜叶菊甙E合成甜叶菊甙Z的方法。所述方法包括：制备包含甜叶菊苷E、选自由蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)组成的组的底物、和HV1以及蔗糖合酶的反应混合物，孵育所述反应混合物足够的时间以制备甜叶菊甙Z，其中一个葡萄糖被共价连接至甜叶菊甙E以制备甜叶菊甙Z，一个葡萄糖被共价连接至甜叶菊甙E的C2’-13-O-葡萄糖以制备甜叶菊甙Z1，以及一个葡萄糖被共价连接至甜叶菊甙E的C2’-19-O-葡萄糖以制备甜叶菊甙Z2。
在一个实施方式中，甜叶菊甙Z化合物是具有如下结构的甜叶菊甙Z1(Reb Z1)：
在一个实施方式中，甜叶菊甙Z化合物是具有如下结构的甜叶菊甙Z2(Reb Z2)：
如本文所述，本技术的重组多肽是用于开发制备甜菊醇糖苷的生物合成方法，所述甜菊醇糖苷在自然来源中通常为低丰度，例如甜叶菊甙D和甜叶菊甙E。相应地，本技术也提供通过本文所述的生物合成方法制备的甜菊醇糖苷组合物。这种组合物可以包含选自由甜叶菊甙D、甜叶菊甙E、新的甜叶菊甙(本文称为“甜叶菊甙Z”和“Reb Z”)和其组合组成的组的甜菊醇糖苷化合物。进一步地，本发明也提供包含本文所述的甜菊醇糖苷组合物的甜味剂。
在一个实施方式中，本发明内容涉及包括具有如下化学结构的化合物的甜味剂：
在另一个实施方式中，所述甜味剂包括具有如下化学结构的化合物：
本发明内容进一步涉及在消费品(例如饮料、甜食、焙烤食品、饼干和口香糖)中使用甜味剂。
附图说明
当考虑其如下详细的描述时，本发明内容会被更好的理解，并且除了以上所示的那些以外的特点、方面和优势会变得明显。这种详细的描述参考如下附图，其中：
图1A-1C描述了表明从甜菊糖生物合成甜菊醇糖苷的路径的方案。如本文所述，重组HV1多肽(“HV1”)含有1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性，将第二糖部分转移到甜菊糖的19-O-葡萄糖的C-2’以制备甜叶菊甙E(“Reb E”)，或类似地从甜叶菊甙A(“Reb A”)制备甜叶菊甙D(“Reb D”)。图1A-1C也显示了重组UGT76G1酶(“UGT76G1”，不同于重组HV1多肽)催化将糖部分到甜菊糖的C-13-O-葡萄糖的C-3’的反应以制备甜叶菊甙A，或类似地从甜叶甙苷E制造甜叶菊甙D。
图2显示了UDP-糖基转移酶(“UGT”)和蔗糖合酶(“SUS”)的偶联反应体系的示例性方案。反应1显示了将甜叶菊甙A(“Reb A”)转变为甜叶菊甙D(“Reb D”)的UGT催化的反应，该反应使用UDP-葡萄糖作为葡萄糖供体并且引起UDP的产生。反应2显示了将UDP转变为UDP-葡萄糖的SUS催化的反应，该反应使用蔗糖作为葡萄糖供体。反应2也显示了SUS催化的反应可以与UGT催化的反应偶联。
图3显示了在如本文所述的HV1-AtSUS1偶联反应体系中由重组HV1多肽(SEQ IDNO:6)和重组AtSUS1(SEQ ID NO:9)催化的从甜叶菊甙A(“Reb A”)体外制备甜叶菊甙D(“Reb D”)。图3A显示了甜菊糖(“Ste”)、甜叶菊甙A(“Reb A”)和甜叶菊甙D(“Reb D”)的标准品。6、9、12和24小时的结果分别显示于图3B-E中。12和24小时没有重组AtSUS1的反应(即非偶联反应)的结果分别显示于图3F和3G中。
图4显示了在如本文所述的HV1-AtSUS1偶联反应体系中由重组HV1多肽(SEQ IDNO:6)和重组AtSUS1(SEQ ID NO:9)催化的从甜菊糖体外制备甜叶菊甙E(“Reb E”)。图4A显示了甜菊糖(“Ste”)、甜叶菊甙A(“Reb A”)和甜叶菊甙D(“Reb D”)的标准品。20小时的结果显示于图4B中，其包括甜叶菊甙Z化合物(“Reb Z”)。
图5显示了由重组HV1多肽(SEQ ID NO:6)、重组UGT76G1(SEQ ID NO:11)和重组AtSUS1(SEQ ID NO:9)的组合催化的从甜菊糖体外制备甜叶菊甙D(“Reb D”)。图5A显示了甜菊糖(“Ste”)、甜叶菊甙A(“Reb A”)和甜叶菊甙D(“Reb D”)的标准品。6、9、12和24小时的结果分别显示于图5B-E中。
图6显示了纯化的重组HV1多肽的SDS-PAGE分析。
图7显示了纯化的重组AtSUS1多肽的SDS-PAGE分析。
图8显示了在如本文所述的HV1-AtSUS1偶联反应体系中由重组HV1多肽(SEQ IDNO:6)和重组AtSUS1(SEQ ID NO:9)催化的从甜叶菊甙E(“Reb E”)体外制备甜叶菊甙Z(“Reb Z”)。图8A显示了甜叶菊甙E(“Reb E”)的标准品。24小时的结果显示于图8B中，其包括甜叶菊甙Z化合物(“Reb Z”)。
图9显示了纯化的重组UGT76G1多肽的SDS-PAGE分析。
图10：甜叶菊甙Z(包括Reb Z1和Reb Z2)和甜叶菊甙E的结构。
图11：Reb Z1和Reb Z2的关键TOCSY和HMBC关系。
图12：显示了由重组UGT76G1(SEQ ID NO:11)催化的从甜叶菊甙E(“Reb E”)体外制备甜叶菊甙D(“Reb D”)。图12A-12B显示了甜叶菊甙E(“Reb E”)、甜叶菊甙D(“Reb D”)的标准品。分别显示了6小时时没有重组AtSUS1的反应(即非偶联反应)(图12C)和具有重组AtSUS1的反应(即UGT-SUS偶联反应)(图12D)的结果。
虽然本发明内容易有各种变型和可选形式，但是其具体的实施方式已经通过附图中的实施例的方式显示并在下文中详细描述。然而，应该理解的是具体实施方式的描述不意为限制本发明内容覆盖落入由所附的权利要求定义的本发明内容的精神和范围内的所有变型、等价形式和可选方式。
具体实施方式
本目标技术提供具有UDP-糖基转移酶活性的重组多肽，所述活性例如用于合成甜菊醇糖苷的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性和1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性。本目标技术的重组多肽(其在下文中也可以被称为“重组HV1多肽”)对于甜菊醇糖苷化合物的生物合成是有用的。在本发明内容中，UDP-糖基转移酶(UGT)指将糖残基从活化的供体分子(通常为UDP-葡萄糖)转移到受体分子的酶。1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性指将糖部分转移到甜菊糖、甜叶菊甙A或甜叶菊甙E的19-O-葡萄糖部分的C-2’的酶活性(图1A-1C和图10)。1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性指将糖部分转移到甜叶菊甙E的13-O-葡萄糖部分的C-2’的酶活性(图10)。
在本发明内容中所用的UGT酶的名称与被UGT命名委员会采用的命名系统一致(Mackenzie等,“The UDP glycosyltransferase gene super family:recommendednomenclature updated based on evolutionary divergence,”Pharmacogenetics,1997,第7卷,第255-269页)，其通过家族数字、表示亚家族的字母和代表单独基因的数字的组合分类UGT基因。例如，名称“UGT76G1”指由属于UGT家族数字76(其是植物的起源)、亚家族G和基因数字1的基因编码的UGT酶。
在植物中存在大的UGT基因家族。然而，大多数的这些UGT的生物功能仍然是未知的。
定义
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非所述内容另有清楚地指示。
就在本说明书或权利要求中所用的术语“包括”、“具有”或等等来说，这种术语以类似于术语“包含”如当被用作权利要求中的过度用语时“包含”被解释的方式意指包括。
用语“示例性的”在本文使用以指“作为一个例子、情况或说明”。本文中被描述为“示例性的”任何实施方式并不必须被解释为优选的或优越于其他实施方式。
术语“互补的”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思，并且无限制地用于描述能够互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA来说，腺苷互补于胸腺嘧啶，胞嘧啶互补于鸟嘌呤。相应地，本目标技术也包括互补于如在所附的序列表中报道的完整序列以及那些实质上相似的核酸序列的分离的核酸片段。
术语“核酸”和“核苷酸”对本领域普通技术人员给出了它们各自普通的和惯常的意思，并且无限制地用于指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合性质并且以类似于自然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另外表明，特定的核酸序列也暗示包含其保守性修饰变体或简并变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确表明的序列。
术语“分离的”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思，当被用在分离的核酸或分离的多肽的语境中时，其被无限制地用于指由人手脱离其原本环境而存在并因此不是天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化的形式存在或可以存在于非原本环境，比如，在转基因宿主细胞中。
术语“孵育”在本文中用于指混合两种或更多种化学或生物实体(例如化学化合物和酶)并使它们在有利于制备甜菊醇糖苷组合物的条件下相互接触。
术语“简并变体”指具有因一个或多个简并密码子取代而不同于参照核酸序列的残基序列的核酸序列。简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列实现。核酸序列和其所有的简并变体会表达相同的氨基酸或多肽。
术语“多肽”、“蛋白”和“肽”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通的和惯常的意思；这三个术语有时交替使用，并且无限制的用于指氨基酸或氨基酸类似物的多聚物，无论其大小或功能。虽然“蛋白”常常用于指相对大的多肽，“多肽”常常用于指小的多肽，本领域中这些术语的用法重叠并且变化。术语“多肽”在本文中用于指肽、多肽和蛋白，除非另外注明。当指多聚核苷酸产物时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中交替使用。因此，示例性的多肽包括多聚核苷酸产物、自然产生的蛋白、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其他等价物、变体和类似物。
当用于指参照多肽时，术语“多肽片段”和“片段”对本领域普通技术人员给出了它们普通和惯常的意思，并且无限制地用于指与参照多肽本身相比其中氨基酸残基被删除而剩余氨基酸序列通常与参照多肽上的相应位置相同的多肽。这种删除可以发生在参照多肽的氨基端或羧基端，或可选地二者均有。
术语多肽或蛋白的“功能片段”指肽片段，该肽片段为全长多肽或蛋白的一部分，并且具有与全长多肽或蛋白基本相同的生物活性，或实现与全长多肽或蛋白基本相同的功能(例如，实现相同的酶促反应)。
交替使用的术语“变体多肽”、“修饰的氨基酸序列”或“修饰的多肽”指因一个或多个氨基酸(例如，一个或多个氨基酸取代、删除和/或添加)而不同于参照多肽的氨基酸序列。一方面，变体是保留了参照多肽的一些或所有能力的“功能变体”。
术语“功能变体”进一步包括保守取代的变体。术语“保守取代的变体”指具有因一个或多个保守性氨基酸取代而不同于参照多肽的氨基酸序列并且保留参照肽的一些或所有活性的肽。“保守性氨基酸取代”是用功能类似的残基的氨基酸残基取代。保守性取代的实例包括用一个非极性(疏水性)残基比如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个；用一个带电荷的或极性(亲水性)残基取代另一个，比如在精氨酸和赖氨酸之间，在谷氨酰胺和天冬酰胺之间，在苏氨酸和丝氨酸之间；用一个碱性残基例如赖氨酸或精氨酸取代另一个；或用一个酸性残基，例如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个；或用一个芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代另一个。这种取代被期望对蛋白或多肽的表观分子量或等电点具有小的影响或没有影响。短语“保守性取代的变体”也包括其中残基被化学衍生的残基替换的肽，条件是生成的肽保留如本文所述的参照肽的一些或所有活性。
与本目标技术的多肽有关的术语“变体”进一步包括功能活性的多肽，所述多肽具有与参照多肽的氨基酸序列具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％同一性的氨基酸序列。
所有语法形式和拼写变型的术语“同源的”指具有“共同进化起点”的多聚核苷酸或多肽(包括来自超家族的多聚核苷酸或多肽以及来自不同种类的同源多聚核苷酸或蛋白(Reeck等,Cell 50:667,1987))之间的关系。这种多聚核苷酸或多肽具有如由它们的序列相似性反映的序列同源性，无论是从百分比同一性来说还是在保守位置上特定氨基酸或基序的存在来说。例如，两个同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％同一性的氨基酸序列。
关于本目标技术的变体多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为，在比对序列和(如果需要)引入间隔以获得最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的部分后，候选序列中与参照多肽(例如，比如，SEQ ID NO:6)的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。
用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以在本领域技术内的多种方式实现，比如，采用公共可得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的那些技术人员可以确定用于测量比对的适当的参数，包括在被比较的全长序列上实现最大比对所需的任何运算法则。例如，％氨基酸序列同一性可以采用序列比较程序NCBI-BLAST2确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从ncbi.nlm.nih.gov下载。NCBI BLAST2采用几种搜索参数，其中所有的那些搜索参数被设定为默认值，例如，所述默认值包括unmask yes、strand＝all、expected occurrences 10、minimum low complexity length＝15/5、multi-pass e-value＝0.01、constant formulti-pass＝25、dropoff for final gapped alignment＝25以及scoring matrix＝BLOSUM62。当在采用NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对于、与或对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其或者可以叙述为具有或包含对于、与或对给定氨基酸序列B有一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是被记分为在A和B的所述程序的比对中通过序列比对程序NCBI-BLAST2同一性匹配的氨基酸残基的数目，Y是B中氨基酸残基的总数。应该意识到，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性不会等于B对A的％氨基酸序列同一性。
从这个意义上讲，用于确定氨基酸序列“相似性”的技术在本领域是公知的。一般而言，“相似性”意味着在适当位置上两个或更多个多肽的准确的氨基酸对氨基酸比较，其中氨基酸是相同的或具有类似的化学和/或物理性质，比如带电荷或疏水性。这种被称为“百分比相似性”然后可以在被比较的多肽序列之间确定。用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术也可以是本领域公知的并且包括确定对于所述基因的mRNA的核苷酸序列(通常通过cDNA中间体)和确定编码其的氨基酸序列，并比较其与第二氨基酸序列。一般而言，“同一性”分别指两个多聚核苷酸或多肽序列的准确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应性。两个或更多个多聚核苷酸序列可以通过确定它们的“百分比同一性”被比较，如可以是两个或多个氨基酸序列。在Wisconsin Sequence Analysis Package,第8版中可获得的程序(可从Genetics Computer Group,Madison,Wis.获得)(例如，GAP程序)能分别计算两个多聚核苷酸之间的同一性和两个多肽序列之间的同一性和相似性。本领域那些技术人员已知其他用于计算序列之间同一性或相似性的程序。
“相对于”参照位置的氨基酸位置是与参照序列比对的位置，如通过比对氨基酸序列所识别的。这种比对可以通过手动或使用公知的序列比对程序例如ClustalW2、Blast 2等进行。
除非另有说明，两个多肽或多聚核苷酸序列的百分比同一性指在两个序列中较短的那个的全长上相同氨基酸残基或核苷酸的百分比。
“编码序列”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且无限制的用于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“合适的调控序列”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且无限制的用于指位于编码序列的上游(5’-非编码序列)、之内或下游(3’-非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可以包括启动子、翻译先导序列、内含子和多聚腺苷酸识别序列。
“启动子”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且无限制的用于指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3’方向。启动子可以以它们的整体源自原本基因，或由源自在自然中发现的不同的启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域的那些技术人员理解的是不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发展阶段、或应答不同的环境条件的表达。大部分时候在大多数细胞类型中引起基因表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的准确边界没有被完全定义，所以不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”指在单一的核酸片段上联合核酸序列，使得一个的功能被另一个影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时(即，所述编码序列在所述启动子的转录控制下)，启动子可操作地连接于编码序列。编码序列可以以正义或反义方向可操作地连接到调控序列。
如在本文中所用的术语“表达”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且无限制的用于指衍生于本目标技术的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”指在转基因或重组有机体中基因产物的产生，所述产生超过在正常或非转化的有机体中产生的水平。
“转化”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且无限制的用于指将多聚核苷酸转移到目标细胞。被转移的多聚核苷酸可以被包含到目标细胞的基因组或染色体DNA，引起遗传上的稳定继承，或它可以独立于宿主染色体复制。包含转化的核酸片段的宿主有机体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”有机体。
当在本文中与宿主细胞连用时，术语“转化的”、“转基因的”以及“重组的”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通和惯常的意思，并且无限制的用于指已经向其中引入外源核酸分子的宿主有机体的细胞，例如植物或微生物细胞。核酸分子可以稳定整合到宿主细胞的基因组中，或核酸分子可以以染色体外分子出现。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞、组织或主体被理解为不仅包括转化程序的最终产物也包括其转基因后代。
当在本文中与多聚核苷酸连用时，术语“重组的”、“异源的”以及“外源的”对本领域普通技术人员给出了它们普通和惯常的意思，并且无限制的用于指源于相对于特定宿主细胞为外源的多聚核苷酸(例如，DNA序列或基因)或如果来自相同来源，其是从其原始形式被修饰的。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞是内源的但是已经通过例如使用定点突变或其他重组技术所修饰的基因。该术语也包括自然产生DNA序列的非自然产生的多拷贝。因此，该术语涉及相对于细胞为外源或异源的DNA部分，或与细胞同源的DNA部分，但是在所述元件在所述宿主细胞中通常不被发现的位置或形式。
类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列连用时，术语“重组的”、“异源的”以及“外源的”指源于相对于特定宿主细胞为外源的多肽或氨基酸序列，或者，如果来自相同来源，其是从其原始形式被修饰的。因此，重组DNA片段可以在宿主细胞中表达以制备重组多肽。
术语“质粒”、“载体”以及“盒”对本领域普通技术人员给出了它们各组普通和惯常的意思，并且无限制的用于指常常携带基因的染色体外元件，所述基因不是细胞的中心新陈代谢的部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。这种元件可以是任意来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中多个核苷酸序列已经被连接至或重组至单一构造中，所述构造能将用于所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列引入细胞。“转化盒”指含有外源基因并且具有除了所述外源基因以外的促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指含有外源基因并且具有除了所述外源基因以外的使得所述基因在外源宿主中的表达提高的元件的特定载体。
这里所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是公知的并且例如被Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版；Cold Spring Harbor Laboratory:冷泉港,N.Y.,1989(以下“Maniatis”)；以及Silhavy,T.J.、Bennan,M.L.和Enquist,L.W.Experiments with Gene Fusions；ColdSpring Harbor Laboratory:冷泉港,N.Y.,1984；以及Ausubel,F.M.等，In CurrentProtocols in Molecular Biology,由Greene Publishing and Wiley-Interscience出版，1987(其每一篇的全部内容以引用的方式特此并入本文中)描述。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明内容所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的意思。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任意方法和材料可以用于实践或检测本发明内容，优选的材料和方法描述如下。
当考虑到接下来的非限制性实施例时，会更充分地理解本发明内容。虽然表示了本目标技术的优选实施方式，但应该理解的是这些实施例仅通过例证的方式给出。从上面的讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本目标技术的必要特征，并在不违背其精神和范围下，可以做出本目标技术的各种变化和变型以使其适应各种用途和条件。
重组多肽
一方面，本发明内容涉及具有与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％同一性的氨基酸序列的重组多肽。适当地，所述重组多肽的氨基酸序列具有与SEQ ID No:6至少80％的同一性。更适当地，所述重组多肽的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:6至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的同一性。在一个示例性实施方式中，所述重组多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:6组成。相应地，本文描述的重组多肽包括SEQ ID NO:6的功能片段、SEQ ID NO:6的功能变体和具有例如与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的序列同一性的其他同源多肽。
另一方面，本发明内容涉及具有编码本文所述的重组多肽的核苷酸序列的分离的核酸。例如，所述分离的核酸可以包括编码具有与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。适当地，所述分离的核酸包括编码具有与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。更适当地，所述分离的核酸包括编码具有与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。因此所述分离的核酸包括编码SEQ ID NO:6的功能片段、SEQ ID NO:6的功能变体，或具有例如与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的序列同一性的其他同源多肽的那些。
在一个实施方式中，本发明内容涉及具有与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％同一性的核苷酸序列的分离的核酸。适当地，所述分离的核酸包括具有与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。更适当地，所述分离的核酸包括具有与SEQ ID NO:7所示的核酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％的同一性的核苷酸序列。
另一方面，本目标技术涉及具有本文所述的核酸的载体，以及具有本文所述的载体的宿主细胞。在一些实施方式中，本发明内容涉及表达载体，所述表达载体包括本目标技术中的至少一种多聚核苷酸并且其中通过转染进入宿主细胞的所述表达载体能表达本文所述的至少一种重组HV1多肽。在一个实施方式中，所述表达载体包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或其变体。
所述表达载体的设计取决于如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等等这些因素。可以将所述表达载体引入至宿主细胞从而制备本目标技术的重组多肽，例如具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其变体的重组HV1多肽。
原核生物中蛋白的表达大部分常常在具有含指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体的细菌宿主细胞中完成。融合载体将一些氨基酸添加至在其中编码的蛋白，常常添加至重组蛋白的氨基端。这种融合载体通常用于三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；以及3)通过作为亲和纯化中的配体起作用帮助重组蛋白的纯化。常常，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白裂解位点以在纯化融合蛋白后使重组蛋白从融合部分分离。这些载体在本发明内容的范围内。
在一个实施方式中，所述表达载体包括用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。用于在细菌细胞中转录和翻译的元件可以包括启动子、针对蛋白复合体的编码区和转录终止子。
在一个实施方式中，本目标技术的所述表达载体包括细菌表达载体，(例如重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA)、酵母表达载体(例如重组酵母表达载体)、用于在昆虫细胞中表达的载体(例如重组病毒表达载体，如杆状病毒)、或用于在植物细胞中表达的载体(例如重组病毒表达载体，如花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、或重组质粒表达载体(例如Ti质粒))。
在一种实施方式中，所述载体包括细菌表达载体。在另一种实施方式中，所述表达载体包括高拷贝数的表达载体；或者，所述表达载体包括低拷贝数的表达载体，例如，Mini-F质粒。
本领域普通技术人员会知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于包含进本目标技术的所述表达载体的多聚核苷酸可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)的常规技术制备。
已经开发了许多分子生物学技术以通过互补的粘性末端可操作地将DNA连接至载体。在一种实施方式中，可以将互补的均聚物片段添加至待被插入载体DNA的核酸分子中。所述载体和核酸分子然后通过互补的均聚物尾之间的氢键连接以形成重组DNA分子。
在一个可选的实施方式中，含有一和或多个限制性位点的合成的连接体提供用于可操作地将本目标技术的多聚核苷酸连接到所述表达载体。在一个实施方式中，多聚核苷酸通过限制性内切酶消化产生。在一个实施方式中，核酸分子用噬菌体T4DNA聚合酶或E.coli DNA聚合酶I处理，这些酶用它们的3’-5’核酸外切酶活性去除突出的3’-单链末端，并用它们的聚合活性填补凹进的3’-末端，从而产生平末端DNA片段。在酶的存在下所述平末端片段然后用大摩尔过量的连接体分子进行孵育，所述酶能够催化平末端DNA分子的连接，比如噬菌体T4DNA连接酶。因此，反应产物是在它的末端携带有聚合的连接体序列的多聚核苷酸。这些多聚核苷酸然后用合适的限制性酶裂解并连接至已经用酶裂解而产生与多聚核苷酸的那些末端相容的末端的表达载体。
或者，可以使用具有不依赖于连接的克隆(ligation-independent cloning(LIC))位点的载体。所要求的PCR扩增的多聚核苷酸然后可以不经限制性消化或连接地被克隆到LIC载体(Aslanidis和de Jong,Nucl.Acid.Res.18,6069-6074,(1990),Haun,等,Biotechniques 13,515-518(1992),其以与其一致的程度通过引用的方式并入本文)。
在一个实施方式中，为了分离和/或修饰用于插入所选质粒的目标多聚核苷酸，适合用PCR。可以设计用于序列的PCR制备的合适的引物以分离核酸分子的所要求的编码区、加入限制性核酸内切酶或LIC位点、将编码区放入期望的读码框。
在一个实施方式中，用于包含进本目标技术的表达载体的多聚核苷酸通过使用合适的寡核苷酸引物使用PCR制备。编码区被扩增，同时引物本身变为包含进扩增的序列产物中。在一个实施方式中，扩增引物包含限制性核酸内切酶识别位点，所述位点使得扩增的序列产物被克隆到合适的载体。
在一个实施方式中，根据本领域公知的技术，通过PCR获得SEQ ID NO:7的多聚核苷酸或其变体并使用限制性核酸内切酶消化和连接将它们引入至表达载体。
本发明内容进一步涉及包含本文所述的表达载体的宿主细胞。本目标技术的合适的宿主通常包括微生物宿主或植物宿主。例如，本目标技术的所述宿主细胞选自由细菌、酵母、丝状真菌、蓝藻和植物细胞组成的组。
所述微生物宿主可以包括能够表达所述多聚核苷酸(例如SEQ ID NO:7)以制备本文所述的重组HV1多肽的任何有机体。在本目标技术中使用的微生物包括细菌(例如肠道细菌(如埃希氏菌属和沙门氏菌属)以及杆菌属、不动细菌属、放线菌(如链霉菌属)、棒状杆菌属、甲烷氧化菌(如甲基弯曲菌属)、甲基单胞菌属、红球菌属和假单胞菌属；蓝细菌(如红细菌属和集胞藻属)；酵母(如酵母菌属、接合酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉森酵母属、德巴利(氏)酵母属、毛霉属、毕赤酵母属和球拟酵母属；以及丝状真菌(如曲霉属和线虫捕捉菌属)，以及藻类，以及埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、沙门氏杆菌、梭菌属(如丙酮丁醇梭菌)。优选地，所述微生物宿主为细菌(如埃希氏菌属)或酵母(如酵母菌属)。所述表达载体可以被包含进这些和其他的微生物宿主以制备大的、商业用量的甜菊醇糖苷。
在一个实施方式中，所述重组多肽可以在为植物细胞的宿主细胞中表达。如本文所用的，术语“植物细胞”被理解为指来源于单子叶植物或双子叶植物的任何细胞并能够构成未分化的组织(如愈伤组织)、分化的组织(如胚)、单子叶植物的部分、单子叶植物或种子。术语“植物”被理解为指能够光合作用的任何分化的多细胞有机体，包括单子叶植物和双子叶植物。在一些实施方式中，所述植物细胞可以为拟南芥植物细胞、烟草植物细胞、大豆植物细胞、牵牛植物细胞或来自另一种油料作物的细胞(包括但不限于加拿大油菜植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞以及芝麻植物细胞)。
有用的植物宿主可以包括支持本目标技术的重组多肽制备的任何植物。用作宿主的合适的绿色植物包括但不限于大豆、油菜籽(欧洲油菜白菜型油菜)、向日葵(Helianthusannus)、棉花(陆地棉)、玉米、烟草(Nicotiana tabacum)、苜蓿(Medicago sativa)、小麦(Triticum sp)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥、十字花科蔬菜(西兰花、菜花、卷心菜、欧洲防风草等)、瓜、胡萝卜、芹菜、西芹、番茄、马铃薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、甜菜、甘蔗、豆、豌豆、黑麦、亚麻、阔叶树、针叶树和禾本科牧草。藻类包括但不限于商业重要的宿主，如螺旋藻、Haemotacoccus和杜氏藻。用于本目标技术的方法的合适的植物也包括生物燃料、生物质和生物能农作物植物。示例性的植物包括拟南芥、水稻(Oryza sativa)、大麦、柳枝稷(Panicum vigratum)、短柄草属、芸苔属和海甘蓝。
在一些实施方式中，本发明内容包括转基因宿主细胞或已经用本文公开的一种或多种载体转化的宿主。
或者，所述宿主细胞可以是适用于生物合成产物的那些，包括单细胞有机体、微生物、多细胞有机体、植物、真菌、细菌、藻类、培养的农作物、非培养的农作物和/或类似物。
可以通过传统的转化或转染技术将所述表达载体引入到植物或微生物宿主细胞。用本目标技术的表达载体进行合适细胞的转化通过本领域已知的方法完成并通常取决于载体和细胞的类型。合适的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、化学穿孔(chemoporation)或电穿孔。
通过本领域公知的技术可以鉴别成功转化的细胞(即，含有表达载体的那些细胞)。例如，可以培养用本目标技术的表达载体转染的细胞以制备本文所述的多肽。可以通过本领域公知的技术检查细胞中是否存在表达载体DNA。
所述宿主细胞可以含有单拷贝的前面所述的表达载体，或者，多拷贝的所述表达载体。
在一些实施方式中，所述转化的细胞为动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方式中，所述细胞是选自由如下组成的组的植物细胞：加拿大油菜植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和牵牛植物细胞。
含有指导外源蛋白高水平表达的调控序列的微生物宿主细胞表达体系和表达载体是本领域技术人员公知的。这些中的任何可以被用于构建用于在微生物宿主细胞中表达本目标技术的重组多肽的载体。然后可以通过转化将这些载体引入至合适的微生物中以使得本目标技术的重组多肽的高水平表达。
用于合适的微生物宿主细胞的转化的载体或盒在本领域是公知的。典型地所述载体或盒含有指导相关多聚核苷酸的转录和翻译的序列、选择性标记以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括具有转录起始控制的多聚核苷酸的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。对于两个控制区均优选的是源自于与被转化的宿主细胞同源的基因，虽然应该被理解的是这些控制区不需要源自被选作宿主的特定种类的原本的基因。
用于驱动在期望的微生物宿主细胞中表达重组多肽的起始控制区或启动子对于本领域技术人员来说是非常多的并且是熟悉的。事实上，任何能驱动这些基因的启动子都适合于本目标技术，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母菌属中的表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中的表达)；以及lac、trp、IPL、IPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中的表达)。
终止控制区也可以来自微生物宿主原本的各种基因。对于本文所述的微生物宿主来说，可选地可以包括终止位点。
在植物细胞中，本目标技术的所述表达载体可以包括可操作地连接到能指导本目标技术的重组多肽在期望的组织在期望的发育阶段中表达的启动子的编码区。出于方便，待表达的多聚核苷酸可以包含来自相同多聚核苷酸的启动子序列和翻译先导序列。编码转录终止信号的3’-非编码序列也应该存在。所述表达载体也可以包含一个或多个内含子以促进多聚核苷酸表达。
对于植物宿主细胞，能够诱导编码区表达的任何启动子和任何终止子的任何组合可以用在本目标技术的载体序列中。启动子和终止子的一些合适的实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。可以使用的有效的植物启动子的一种类型是高水平植物启动子。与本目标技术的表达载体可操作连接的这种启动子应该能促进所述载体的表达。在本目标技术中可以使用的高水平植物启动子包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子(例如来自大豆(Berry-Lowe等,J.Molecularand App.Gen.,1:483 498(1982),其以与其一致的程度将其全部内容特此并入本文))以及叶绿素a/b结合蛋白的启动子。这两种启动子已知在植物细胞中是光诱导的(参见，比如，Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective,A.Cashmore,Plenum,N.Y.(1983),第29 38页；Coruzzi,G.等,The Journal of Biological Chemistry,258:1399(1983),和Dunsmuir,P.等,Journal of Molecular and Applied Genetics,2:285(1983)，以与它们一致的程度通过引用的方式将其每一篇的全部内容特此并入本文)。
质粒载体的选择取决于将用于转化宿主植物的方法。技术人员熟知必须存在于质粒载体上以成功转化、选择和繁殖含有嵌合的多聚核苷酸的宿主细胞的遗传元件。技术人员也会认识到不同的独立转化事件会引起不同水平和类型的表达(Jones等,EMBO J.4:2411 2418(1985)；De Almeida等,Mol.Gen.Genetics 218:78 86(1989)，以与它们一致的程度通过引用的方式将其每一篇的内容特此并入本文)，并且因此必须筛选多个事件以获得展示期望的表达水平和类型的系。这种筛选可以通过DNA印记的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白表达的Western分析或表型分析完成。
将本目标技术的所述表达载体引入到植物细胞可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行，包括将目标核酸序列插入到毛根农杆菌Ri或根癌农杆菌Ti质粒中、微注射、电穿孔或直接沉淀。作为一个例子提供，在一些实施方式中，目标多聚核苷酸的瞬时表达可以通过农杆菌渗透方法进行。在这方面，含有目标多聚核苷酸的根癌农杆菌的悬浮液可以在培养物中生长，然后通过将注射器的尖放置在叶子的背面同时温和的将反压力施加到叶子的另一面而将悬浮液注射到植物中。然后通过气孔将所述农杆菌溶液注射到叶的内部空间。一旦进入叶的内部，土壤杆菌将目标基因转化到植物细胞的部分，然后所述基因在其中被瞬时表达。
作为另一个实例，将目标质粒转化到植物细胞中可以通过基因枪轰击技术(即，基因枪法)进行。在这方面，植物胚的悬浮液可以在液体培养物中生长，然后用结合至金颗粒的质粒或多聚核苷酸轰击，其中结合至目标质粒或核酸的金颗粒可以被推动穿过植物组织的膜，如胚性组织。在轰击后，然后可以用合适的抗生素选择转化的胚以产生新的、无性繁殖的、转化的胚胎发生悬浮培养物。
宿主细胞可以是未改造的细胞或细胞系，或已经被遗传改造的细胞系。在一些实施方式中，所述宿主细胞是已经被改造以使得在期望的条件下(如在更低温度下)生长的细胞系。
标准的重组DNA方法可以用于获得编码本文所述的重组多肽的核酸、将所述核酸包含进表达载体以及将所述载体引入宿主细胞，如在Sambrook,等(eds),MolecularCloning；A Laboratory Manual,第三版,冷泉港,(2001)；和Ausubel,F.M.等(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1995)中描述的那些。编码多肽的核酸可以被插入表达载体或载体使得所述核酸被可操作地连接到转录和翻译控制序列(如启动子序列、转录终止序列等)。所述表达载体和表达控制序列通常被选择以与所用的表达宿主细胞相容。
多肽在本文所述的宿主中的表达可以进一步通过密码子优化提高。例如，用更常见的密码子更改较不常见的密码子可以影响mRNA的半衰期或通过引入干预信息翻译的二级结构改变其结构。可以优化全部或部分的编码区。在一些情况下所期望的表达的调整通过优化基本上全部基因实现。在另一些情况下，所期望的调整会通过优化部分而不是全部基因序列实现。
可以调整任何编码序列的密码子的使用以实现所期望的性能，例如在特定细胞类型中高水平的表达。对于这种优化的起始点可以是具有100％常见密码子的编码序列，或含有常见和不常见密码子的混合物的编码序列。
可以产生和检测在它们的密码子使用上不同的两种或更多种候选序列以确定它们是否具有所期望的性质。候选序列可以通过使用计算机评价以寻找调控元件(如沉默子或增强子)的存在，以及寻找通过密码子使用上的变化可以被转变为这种调控元件的编码序列区的存在。额外的标准可以包括特定核苷酸(如A、C、G或U)的丰度、特定氨基酸的密码子偏好或特定mRNA二级或三级结构的存在或缺失。基于许多这些标准可以进行对候选序列的调整。
在一些实施方式中，密码子优化的核酸序列可以以密码子没有被优化的核酸序列所表达的约110％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％或约500％的水平表达其蛋白。
除了编码本目标技术的重组多肽的核酸外，本目标技术的表达载体可以另外携带控制蛋白在宿主细胞中表达的调控序列，如启动子、增强子或控制核酸转录或翻译的其他表达控制元件。这种调控序列在本领域是已知的。本领域技术人员会意识到，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可以取决于如待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白的表达水平等这些因素。另外，本目标技术的重组表达载体可以携带额外的序列，如调控载体在宿主细胞中复制的序列(如，复制起点)和选择标记基因。
甜菊醇糖苷的生物合成
如本文所述，本技术的重组多肽具有UDP-糖基转移酶活性，更具体地包括1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性，并且用于开发制备甜菊醇糖苷的生物合成方法，所述甜菊醇糖苷在自然来源中通常是低丰度的，如甜叶菊甙D和甜叶菊甙E。本技术的重组多肽具有UDP-糖基转移酶活性，用于开发制备新的甜菊醇糖苷的生物合成方法，如甜叶菊甙Z1和甜叶菊甙Z2。
相应地，一方面，本目标技术也涉及制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括用重组多肽孵育底物，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列。
所述底物可以是能在被一种或多种UDP-糖基转移酶催化的反应中被转变为甜菊醇糖苷化合物的任何天然的或合成的化合物。例如，所述底物可以是天然的甜叶菊提取物、甜菊醇、甜菊醇-13-O-糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜茶素、甜菊糖、甜叶菊甙A、甜叶菊甙G或甜叶菊甙E。所述底物可以是纯的化合物或不同化合物的混合物。优选地，所述底物包括选自由甜茶素、甜菊糖、甜叶菊甙A、甜叶菊甙E和其组合组成的组的化合物。
本文所述的方法也提供偶联反应体系，其中允许本文所述的重组肽与一种或多种另外的酶组合起作用以提高效率或调整甜菊醇糖苷化合物的整体生物合成的结果。例如，另外的酶可以通过(例如，使用蔗糖作为葡萄糖残基的供体)将糖基化反应制备的UDP转变回UDP-葡萄糖而再生糖基化反应所需的UDP-葡萄糖，因此提高糖基化反应的效率。在另一个实例中，本目标技术的重组多肽可以制备甜菊醇糖苷的中间产物(如，甜叶菊甙E)，该中间产物在由另一种UDP-糖基转移酶(如UGT76G1)催化的反应中被进一步转变为另一种甜菊醇糖苷(如，甜叶菊甙D)。在另一个实例中，本目标技术的重组多肽可以制备甜菊醇糖苷的中间产物(如，甜叶菊甙E)，该中间产物在由UDP-糖基转移酶(如HV1)催化的反应中被进一步转变为另一种甜菊醇糖苷(如，甜叶菊甙Z1和甜叶菊甙Z2)。
相应地，在一个实施方式中，本目标技术的方法进一步包括用本文所述的底物和重组多肽孵育重组蔗糖合酶(SUS)。所述重组蔗糖合酶用蔗糖作为葡萄糖的来源将UDP转变为UDP-葡萄糖。合适的蔗糖合酶包括来自拟南芥和绿豆SUS基因的那些，或来自编码蔗糖合酶的功能同系物的任意基因(所述蔗糖合酶由拟南芥和绿豆SUS1序列编码)或其功能同系物。合适的蔗糖合酶可以为例如拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3以及绿豆蔗糖合酶。特别合适的蔗糖合酶可以为例如拟南芥蔗糖合酶1。例如，重组SUS包括与SEQ ID NO:9所示的AtSUS1的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的氨基酸序列。优选地，本目标技术的重组SUS包括与SEQ ID NO:9所示的AtSUS1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
本目标技术的重组蔗糖合酶可以通过在如上所述的宿主细胞中表达具有编码目标氨基酸序列(如与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列)的核苷酸序列的核酸获得。例如，包括SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的载体可以通过传统的转化技术引入到微生物宿主(如大肠杆菌)以制备重组蔗糖合酶。
在另一个实施方式中，本目标技术的方法进一步包括用本文所述的重组蔗糖合酶、底物和重组多肽孵育重组UDP-糖基转移酶。所述重组UDP-糖基转移酶可以催化不同于本目标技术的重组多肽所催化的反应的糖基化反应。例如，重组UDP-糖基转移酶可以催化将糖部分转移到甜菊糖的C-13-O-葡萄糖的C-3’的反应以制备甜叶菊甙A(或类似地从甜叶菊甙E制备甜叶菊甙D)，而本目标技术的重组多肽将第二糖部分转移到甜菊糖的19-O-葡萄糖的C-2’以制备甜叶菊甙E(或类似地从甜叶菊甙A制备甜叶菊甙D)。
合适的UDP-糖基转移酶包括本领域已知的任何UGT，所述UGT能催化甜菊醇糖苷化合物的生物合成中一种或多种反应，如UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1或它们的功能同系物。例如，如本文所述的UDP-糖基转移酶可以包括与SEQ ID NO:11所示的UGT76G1的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的氨基酸序列。优选地，所述UDP-糖基转移酶包括与SEQ ID NO:11所示的UGT76G1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
所述重组UDP-糖基转移酶可以通过在如上所述的宿主细胞中表达具有编码目标氨基酸序列(如与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列)的核苷酸序列的核酸获得。例如，包括SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的载体可以通过传统的转化技术引入到微生物宿主(如大肠杆菌)以制备本目标技术的重组UDP-糖基转移酶。
甜菊醇糖苷化合物的体外和体内制备均包含在本目标技术中。
例如，所述孵育可以为体外方法，其中使得底物与本目标技术的重组多肽相互作用。优选地，在体外方法中，重组多肽在与所述底物孵育之前被纯化。传统的多肽纯化技术，如离心、细胞裂解和层析包含在本目标技术的方法中。例如，编码本目标技术的重组多肽的核酸可以被克隆进具有组氨酸标签的表达载体中，这样所表达的重组多肽可以被亲和柱层析纯化。
本目标技术的体外方法包括适用于用本目标技术的一种或多种重组多肽进行甜菊醇糖苷制备的任意缓冲体系。通常，所述缓冲体系是水溶液，如具有从约6.0至约8.0的pH的Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液。更适合地，所述pH为从约6.5至约7.5。甚至更适合地，所述pH为从约7.0至约7.5。
通常，在本目标技术的体外方法中，所述底物以从约0.2mg/mL至约5mg/mL，优选从约0.5mg/mL至约2mg/mL，更优选从约0.7mg/mL至约1.5mg/mL的浓度存在于所述缓冲液中。
通常，在本目标技术的体外方法中，UDP-葡萄糖以从约0.2mM至约5mM，优选从约0.5mM至约2mM，更优选从约0.7mM至约1.5mM的浓度包含于所述缓冲液中。在一个实施方式中，当重组蔗糖合酶被包含在反应中时，蔗糖也以从约100mM至约500mM，优选从约200mM至约400mM，更优选从约250mM至约350mM的浓度包含在所述缓冲液中。
通常，在本目标技术的体外方法中，基于干重，所述重组多肽与所述底物的重量比为从约1:100至约1:5，优选从约1:50至约1:10，更优选从约1:25至约1:15。
通常，体外方法的反应温度为从约20℃至约40℃，适合地从25℃至约37℃，更适合地从28℃至约32℃。
本发明内容也提供由本文所述的生物合成方法制备的甜菊醇糖苷组合物。用本文所述的方法制备的甜菊醇糖苷组合物的准确性质(如分子种类的类型和它们在终产物中的百分含量)取决于所用的底物、孵育条件以及包含在反应体系中的酶活性。例如，当甜菊糖被用作底物时，所制备的甜菊醇糖苷组合物可以包括甜叶菊甙A、甜叶菊甙D、甜叶菊甙E、甜叶菊甙Z1和甜叶菊甙Z2以及它们的组合。
本目标技术提供用于将在天然甜叶菊提取物中的主要甜菊醇糖苷种类(即，甜菊糖和甜叶菊甙A)转变为甜叶菊甙D和甜叶菊甙E的方法，甜叶菊甙D和甜叶菊甙E在天然提取物中为低丰度。相应地，本目标技术也提供富集一种或多种特定的甜菊醇糖苷(如甜叶菊甙D和甜叶菊甙E)的含量的方法，所述方法包括用含有与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列的重组多肽孵育底物(如天然甜叶菊提取物)。例如，当天然甜叶菊提取物被用作底物时，所制备的甜菊醇糖苷组合物可以富集有甜叶菊甙D和/或甜叶菊苷甙，甜叶菊甙D和甜叶菊甙E在天然甜叶菊提取物中为低丰度的。
本领域技术人员会认识到，由本文所述的方法制备的甜菊醇糖苷组合物可以被进一步纯化并与其他的甜菊醇糖苷、香料或甜味剂混合以获得期望的风味或甜味剂组合物。例如，如本文所述制备的富集有甜叶菊甙D的组合物可以与含有甜叶菊甙A作为主要甜菊醇糖苷的天然甜叶菊提取物混合，或与其他合成的或天然的甜菊醇糖苷产物混合以制备所期望的甜味剂组合物。或者，从本文所述的甜菊醇糖苷组合物获得的基本纯净的甜菊醇糖苷(如，甜叶菊甙D)可以与其他的甜味剂(如蔗糖、麦芽糊精、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰氨基磺酸钾和糖精)结合。如本领域已知的，可以调节甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的量以获得期望的味道。本文所述的甜菊醇糖苷组合物(包括甜叶菊甙D、甜叶菊甙E、甜叶菊甙Z1、甜叶菊甙Z2或它们的组合)可以包含在食品(如饮料、软饮料、冰激凌、乳制品、甜品、谷物、口香糖、烘焙商品等)、膳食补充品、医药营养品以及药品中。
实施例
实施例1：候选UGT基因的选择
用系统发育分析和蛋白BLAST分析识别属于UGT91亚家族的用于1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的7个候选基因(表1)。
表1：UGT候选基因列表
实施例2：候选UGT基因的酶活性筛选
所有候选UGT基因的全长DNA片段是商业合成的。cDNA的几乎所有密码子被改变为大肠杆菌偏好的那些(Genscript,NJ)。将合成的DNA克隆到细菌表达载体pETite N-HisSUMO Kan Vector(Lucigen)。
将每个表达构件转化到E.coli BL21(DE3)，其随后在37℃含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中生长直至达到OD600为0.8-1.0。通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达并且培养物在16℃进一步生长22小时。通过离心(3,000x g；10min；4℃)收集细胞。收集细胞团并或者立即使用或在-80℃贮存。
细胞团通常在裂解缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液、pH 7.2，25ug/ml溶菌酶，5ug/mlDNase I，20mM咪唑，500mM NaCl，10％丙三醇和0.4％Triton X-100)中重悬。通过超声法在4℃下裂解细胞，并且通过离心(18,000x g；30min)使细胞碎片澄清。将上清上样到平衡(平衡缓冲液：50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2，20mM咪唑，500mM NaCl，10％丙三醇)的Ni-NTA(Qiagen)亲和柱上。上样蛋白样品后，用平衡缓冲液洗柱以除去未结合的杂蛋白。用含有250mM咪唑的平衡缓冲液洗脱带有组氨酸标签的UGT重组多肽。
通过使用甜菊糖或Reb A作为底物测定纯化的候选UGT重组多肽的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性(图1A-1C)。通常，重组多肽(10μg)在200μl体外反应体系中检测。该反应体系含有50mM的磷酸钾缓冲液，pH7.2，3mM MgCl2，1mg/ml甜菊糖或甜叶菊甙A，1mM UDP-葡萄糖。该反应在30℃进行并通过添加200μL 1-丁醇终止。该样品用200μL 1-丁醇提取三次。干燥合并的部分并溶解在70μL 80％甲醇中用于高效液相色谱(HPLC)分析。含有95％甜菊糖的甜叶菊提取物(Blue California，CA)被用作甜菊糖底物。甜叶菊甙A(纯度99％)也是由Blue California提供。
UGT催化的糖基化反应被偶联到由蔗糖合酶(如SEQ ID NO:9的AtSUS1)催化的UDP-葡萄糖生成反应。在该方法中，UDP-葡萄糖产生于蔗糖和UDP(图2)，这样额外的UDP-葡萄糖的添加可以被忽略。合成AtSUS1序列(Bieniawska等,Plant J.2007,49:810-828)并插入到细菌表达载体。表达重组AtSUS1蛋白并通过亲和层析纯化。纯化的重组AtSUS1多肽通过SDS-PAGE分析(分子量：106.3kD，图7)。
相应地，重组UGT多肽的活性可以在没有AtSUS1偶联(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.2，3mM MgCl2，1mg/ml甜菊糖或甜叶菊甙A，1mM UDP)或有AtSUS偶联(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.2，3mM MgCl2，1mg/ml甜菊糖或甜叶菊甙A，1mM UDP和285mM蔗糖)时测定。通常，10μg的AtSUS1被用于200μl体外反应。该体外反应在30℃孵育，并通过用1-丁醇提取终止。
然后使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(Sunnyvale,CA)进行HPLC分析，所述系统包括四元泵、温度控制柱隔室、自动采样器和UV吸收检测器。具有保护柱的PhenomenexLuna NH2用于甜菊醇糖苷的表征。乙腈水用于在HPLC分析中的等度洗脱。甜叶菊甙D、甜叶菊甙E、甜叶菊甙Z产物通过NMR分析鉴别。
由SEQ ID NO:7编码的重组多肽(SEQ ID NO:6)显示1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性，并且被用于额外的分析。该基因来自大麦亚种(Hordeum vulgare subsp.vulgare)(本文简写为“HV1”)。纯化的重组HV1多肽通过SDS-PAGE分析(图6)。如图6所示，重组HV1蛋白(分子量：61.4kD)通过亲和层析纯化。由其他候选基因(表1)编码的多肽在本文所述的分析中没有显示出任何可检测的活性，即使它们与重组HV1多肽享有约62-74％的序列同一性。
如本文所述，在存在或不存在AtSUS1的所有反应条件下，HV1的重组多肽将糖部分转移到甜叶菊甙A以制备甜叶菊甙D。在UGT-SUS偶联反应体系中通过重组HV1多肽将甜叶菊甙A完全转变为甜叶菊甙D(图3B-E)。然而，在24小时后通过没有被偶联到AtSUS1的单独的重组HV1多肽仅将部分甜叶菊甙A转变为甜叶菊甙D(图3F-G)。因此，重组HV1多肽显示了1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性以从甜叶菊甙A制备甜叶菊甙D并且AtSUS1提高了UGT-SUS偶联体系的转变效率。
另外，与AtSUS1(SEQ ID NO:9)偶联的重组HV1多肽在体外将甜菊糖转变为甜叶菊甙E(图4)。制备了不同于甜叶菊甙D和E的具有HPLC保留时间6.68分钟(参见，图4)的未预期的化合物(“Reb Z”)。该化合物为一种新的甜菊醇糖苷，并称为“甜叶菊甙Z”(“Reb Z”)。为了确定Reb E到Reb Z的转换，用重组HV1多肽(20μg)和AtSUS1(20μg)在类似于以上实施例中使用的那些条件下在UGT-SUS偶联反应体系(200μL)中孵育Reb E底物(0.5mg/ml)。如图8所示，Reb Z通过重组HV1多肽和AtSUS1的组合制备。这些结果表明HV1可以将葡萄糖部分转移到Reb E以形成Reb Z。
实施例3：使用重组HV1多肽生物合成甜菊醇糖苷
如图1A-1C所示，甜叶菊甙D也可以通过甜叶菊甙E的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化形成。因此，取决于其中糖基化反应发生的顺序，甜叶菊甙D可以通过不同的生物合成途径(例如通过甜叶菊甙A对甜叶菊甙E)制备。例如，可以首先发生甜菊糖的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化以制备甜叶菊甙A中间体，接着甜叶菊甙A的19-O-葡萄糖的C-2’的糖基化以制备甜叶菊甙D。至此，来自甜叶菊的UGT76G1(SEQ ID NO；11)已经被鉴定为将糖残基转移至甜菊糖的C-13-O-葡萄糖的C-3’以形成甜叶菊甙A的酶。
将密码子优化的UGT76G1cDNA插入至细菌表达载体，表达重组UGT76G1蛋白并通过亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析纯化的重组UGT76G1多肽(分子量：65.4kD，图9)。在类似于以上实施例中所用的那些条件下，用有或没有AtSUS1的重组UGT76G1孵育甜叶菊甙E底物。通过HPLC分析产物。如图12所示，通过重组UGT76G1制备甜叶菊甙D。反应中重组AtSUS的添加提高了UGT-SUS偶联体系的转换效率。因此，重组UGT76G1多肽显示了1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性以从Reb E制备Reb D。
相应地，进一步确定与UGT76G1组合的用于甜菊醇糖苷生物合成(如，甜叶菊甙D的制备)的重组HV1多肽的催化活性。在类似于以上实施例中所用的那些条件下在UGT-SUS偶联反应体系(200μl)中用重组HV1多肽(10μg)、UGT76G1(10μg)和AtSUS1(10μg)孵育甜菊糖底物。用HPLC分析产物。如图5所示，通过重组HV1多肽、UGT76G1和AtSUS1的组合制备甜叶菊甙D。因此，显示了至少1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性的重组HV1多肽可以与其他UGT酶(如UGT76G1)组合使用用于甜菊醇糖苷的复杂、多步骤生物合成。
实施例4：NMR分析Reb Z的结构
用甜叶菊甙E的酶转换制备并通过HPLC纯化用于甜叶菊甙Z(Reb Z)的表征的材料。
用LTQ Orbitrap Discovery HRMS仪器产生HRMS数据，其分辨率设为30k；在阳离子电喷雾模式中扫描的数据从m/z 150至1500。针电压设定为4kV；其他源条件为鞘流气＝25，辅助气＝0，尾气＝5(所有气体以任意单位流动)，毛细管电压＝30V，毛细管温度＝300℃，以及管透镜电压＝75。样品用2:2:1乙腈:甲醇:水(与注入洗脱剂相同)稀释并注入50微升。
在Bruker Avance DRX 500MHz或Varian INOVA 600MHz仪器上用标准脉冲序列获得NMR谱。在C5D5N中进行1D(1H和13C)和2D(COSY、TOCSY、HMQC和HMBC)NMR谱。
显示为Reb Z1和Reb Z2的混合物的化合物Reb Z显示于图10中。基于其正高分辨(HR)质谱，化合物Reb Z的分子式已被推导为C50H80O28，其正高分辨(HR)质谱显示了在m/z1151.4713对应于[M+Na]+的加合离子；该组合物被13C NMR谱数据支持。Reb Z的1H NMR谱数据显示了两种化合物(Reb Z1和Reb Z2)以60:40至70:30之间的比例的混合物的存在。因此Reb Z的1H和13C NMR谱数据显示了针对存在于其结构中的每个质子和碳的一组峰。用5％H2SO4酸水解Reb Z提供了D-葡萄糖，该D-葡萄糖通过用TLC与真实试样直接比较鉴别。Reb Z的酶水解提供了糖苷配基，通过与标准化合物比较1H NMR和共同TLC将所述糖苷配基鉴定为甜菊醇。基于TOCSY、HMQC和HMBC数据分派化合物Reb Z的1H和13C NMR值。针对葡萄糖部分的5个端基质子所观察到的大的偶联常数表明如对于甜菊醇糖苷所报道的它们的β-定位。
表2.对于甜叶菊甙Z(“Reb Z”)和甜叶菊甙E a-c的1H和13C NMR谱数据(化学迁移和偶联常数)。
a基于TOCSY、HMQC和HMBC相关性所做的分派；b以δ(ppm)为单位的化学迁移值；c以Hz为单位的偶联常数。
基于来自Reb Z的NMR谱数据和水解实验的结果以及Reb Z与甜叶菊甙E的1H和13CNMR值的详细比较表明由酶转换制备的两种化合物的混合物推定为13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]对映-贝壳杉-16-烯-19-羧酸-2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖酯(Reb Z1)或13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]对映-贝壳杉-16-烯-19-羧酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯(Reb Z2)。
化合物Reb Z的酸水解。向化合物Reb Z(5mg)的甲醇溶液(10ml)中加入3ml 5％H2SO4并且将该混合物回流24小时。该反应混合物然后用饱和的碳酸钠中和并用乙酸乙酯(EtOAc)(2x 25ml)萃取以产生含有糖的水部分和含有糖苷配基部分的EtOAc部分。浓缩水相并用TLC体系EtOAc/正丁醇/水(2:7:1)和CH2Cl2/MeOH/水(10:6:1)与标准糖进行比较；该糖被鉴定为D-葡萄糖。
化合物Reb Z的酶水解。将化合物Reb Z(1mg)溶解于10ml 0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.5)中并加入来自黑曲霉的天然果胶酶(50uL，Sigma-Aldrich，P2736)。在50℃搅拌混合物96小时。在反应期间沉淀出产物并过滤然后结晶。从1的水解获得的所得产物通过与标准化合物比较共同TLC和1H NMR谱数据(图11)将从1的水解获得的所得产物鉴定为甜菊醇。
使用酶促法通过甜叶菊甙E的生物转换制备被称为Reb Z的两种化合物的混合物，且基于外延的1D和2D NMR以及高分辨率质谱数据和水解研究，其结构表征为13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]对映-贝壳杉-16-烯-19-羧酸-2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖酯(Reb Z1)，或13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]对映-贝壳杉-16-烯-19-羧酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-2-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯(Reb Z2)。
因此，通过其将第二糖部分转移到甜菊糖的19-O-葡萄糖的C-2’以制备甜叶菊甙E的能力，确定重组HV1多肽的1,2-19-O-葡萄糖糖基化活性。HV1重组多肽也具有将第三葡萄糖部分转移到甜叶菊甙E的13-O-葡萄糖的C-2’或19-O-葡萄糖的C-2’以制备Reb Z1和RebZ2的活性。
Claims (33)
1.由SEQ ID NO:6氨基酸序列组成的重组多肽在制备甜菊醇糖苷中的用途。
2.编码权利要求1所述的重组多肽的核苷酸序列组成的分离的核酸在制备甜菊醇糖苷中的用途。
3.包含权利要求2中的分离的核酸的载体在制备甜菊醇糖苷中的用途。
4.包含权利要求3中的载体的宿主细胞在制备甜菊醇糖苷中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述宿主细胞选自由细菌、酵母、丝状真菌、蓝藻和植物细胞组成的组。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述宿主细胞选自由沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动细菌属、链霉菌属、棒状杆菌属、甲基弯曲菌属、甲基单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、红细菌属、集胞藻属、酵母菌属、接合酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利(氏)酵母属、毛霉属、毕赤酵母属、球拟酵母属、曲霉属、线虫捕捉菌属、短杆菌属、微杆菌属、节细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和梭菌属组成的组。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述宿主细胞是分离自由大豆、油菜籽、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、西兰花、菜花、欧洲防风草、瓜、胡萝卜、芹菜、西芹、番茄、马铃薯、草莓、花生、葡萄、甜菜、甘蔗、豆、黑麦、亚麻、阔叶树、针叶树、禾本科牧草、拟南芥、柳枝稷(Panicum vigratum)、芸苔属和海甘蓝组成的组的植物的细胞。
8.一种制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括用由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的重组多肽孵育底物。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括用所述底物和所述重组多肽孵育重组蔗糖合酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述重组蔗糖合酶由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括用所述蔗糖合酶、所述底物和所述重组多肽孵育重组UDP-糖基转移酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组UDP-糖基转移酶由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述底物选自由甜菊糖、甜叶菊甙A、甜叶菊甙E和它们的组合组成的组。
14.一种制备甜叶菊甙Z的方法，所述方法包括用由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的重组多肽孵育底物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述底物选自由甜茶素、甜菊糖和它们的组合组成的组。
16.根据权利要求14所述的方法，进一步包括用所述底物和所述重组多肽孵育重组蔗糖合酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述重组蔗糖合酶由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括用所述蔗糖合酶、所述底物和所述重组多肽孵育重组UDP-糖基转移酶。
19.由权利要求18所述的方法制备的甜叶菊甙Z，其中所述甜叶菊甙Z化合物包含下式甜叶菊甙Z1(Reb Z1)和甜叶菊甙Z2(Reb Z2)的混合物：
20.一种从甜叶菊甙E合成甜叶菊甙Z的方法，所述方法包括：
制备包含甜叶菊甙E，选自由蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)组成的组的底物以及由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的HV1的反应混合物；
孵育所述反应混合物足够的时间以制备甜叶菊甙Z，其中葡萄糖被共价偶联至甜叶菊甙E以制备甜叶菊甙Z，葡萄糖被共价偶联至甜叶菊甙E的C2’-13-O-葡萄糖以制备甜叶菊甙Z1，以及葡萄糖被共价偶联至甜叶菊甙E的C2’-19-O-葡萄糖以制备甜叶菊甙Z2,
其中甜叶菊甙Z1(Reb Z1)和甜叶菊甙Z2(Reb Z2)如下式所示：
21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括将蔗糖合酶加入到所述反应混合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述蔗糖合酶选自由拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述蔗糖合酶为拟南芥蔗糖合酶1。
24.一种甜叶菊甙Z1化合物，其结构如下：
25.一种甜叶菊苷Z2化合物，其结构如下：
26.一种甜味剂，其包含如下化学结构的化合物：
27.根据权利要求26所述的甜味剂，进一步包含填料、膨松剂和抗结块剂中的至少一种。
28.一种消费品，其包含使变甜的量的权利要求27所述的甜味剂。
29.根据权利要求28所述的消费品，所述消费品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
30.一种甜味剂，其包含如下化学结构的化合物：
31.根据权利要求30所述的甜味剂，进一步包含填料、膨松剂和抗结块剂中的至少一种。
32.一种消费品，其包含使变甜的量的权利要求31所述的甜味剂。
33.根据权利要求32所述的消费品，所述消费品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
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