KR20200024789A - 베타-글루코시다제에 의한 스테비올 글리코시드의 가수분해 - Google Patents

Abstract

본 개시는 베타-글루코시다제의 가수분해 활성을 이용하여 다양한 스테비올 글리코시드로부터 증강된 양의 레바우디오시드 M(Reb M)을 제조하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 관심 기질을 함유하는 파괴된 재조합 세포(예컨대, 재조합 미생물 세포)로부터 요망되는 스테비올 글리코시드를 제조하기 위한 개선된 공정을 제공한다. 이는 이러한 세포(예컨대, 미생물)가 레바우디오시드 A(Reb A), 레바우디오시드 E(Reb E), 및/또는 스테비오시드를 포함하는 관심 스테비올 글리코시드를 생성할 수 있는 유전자를 운반하도록 변형된 것이다. 상기 구현예에서, 공정은 파괴된 세포(예컨대, 미생물 세포)로부터 물질을 수득하는 단계 및 상기 폐기물에 존재하는 스테비오시드에 대한 효소적 가수분해를 수행하여 Reb M의 제조를 증강시키는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 스테비올 글리코시드 조성물이 추가로 제공된다.

Description

베타-글루코시다제에 의한 스테비올 글리코시드의 가수분해

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2017년 6월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/527,482호에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 청구하며, 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명의 분야는 요망되는 스테비올 글리코시드를 보다 효율적이고 더 적은 비용으로 제조할 수 있도록 하는 방법 및 공정에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 생체전환을 통해 관심 스테비올 글리코시드의 제조를 유도하는 베타-글루코시다제에 의한 가수분해의 용도에 관한 것이다.

본 개시는 확인된 기질의 관심 스테비올 글리코시드로의 전환에 초점을 맞춘다. 특히, 본 개시는 부분적으로, 파괴된 재조합 세포, 예컨대 재조합 미생물 세포에 존재하는 특정 기질을 가수분해하기 위한 베타-글루코시다제(“B-glu1”)의 사용을 통한 레바우디오시드 M(“Reb M”)의 보다 효율적인 제조에 관한 것이다.

스테비올 글리코시드는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) 잎에서 단리된 천연 산물이며, 식품, 사료 및 음료에서 고강도, 저-칼로리 감미제로서 널리 사용된다. 천연 발생 스테비올 글리코시드는 동일한 염기 디테르펜 골격 구조(스테비올)를 갖지만, 스테비올 골격의 C13 및 C19 위치에서 탄수화물 잔기 변형(예컨대 글루코스, 람노스 및 자일로스 잔기)의 수 및 구조가 상이하다. 구조가 알려진 스테비올 글리코시드에는 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 B, 레바우디오시드 C, 레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 F, 레바우디오시드 M 및 둘코시드 A가 포함된다. 상업적 이용의 측면에서, 레바우디오시드 M 자체는 일반적으로 안전한 것으로 간주되었지만('GRAS' 상태) 추출 공정으로부터 공급받기가 극히 어려우며 미생물 생체전환만을 통해 제조하기 위해 상당한 미생물 변형을 필요로 한다.

건조 중량 기준으로, 스테비오시드, 레바우디오시드 A, 레바우디오시드 C 및 둘코시드 A는 야생형 스테비아(Stevia) 잎에서 각각 스테비올 글리코시드의 총 중량의 9.l%, 3.8%, 0.6% 및 0.30%를 차지하는 반면, 다른 스테비올 글루코시드, 예컨대 Reb M은 상당히 더 소량으로 존재한다. 관심 스테비올 글리코시드를 제조하기 위해 재조합 미생물 세포를 사용하는 것이 알려져 있지만, 특정 효소의 생화학적 활성 범위에 근거하여, 이러한 미생물 균주로부터 다양한 스테비올 글리코시드가 제조될 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 상황에서, 이들 균주의 파괴된 세포는 다량의 스테비오시드(CAS no. 57817-89-7), 레바우디오시드 A(CAS no. 58543-16-1) 또는 다른 스테비올 글리코시드를 함유할 수 있고, 여기서 Reb M이 요망되는 산물이다. 이들 화합물의 양은 스테비오시드 약 10% 내지 20% 및 레바우디오시드 A 약 5% 내지 10% 범위이고 다른 소량의 구성분이 혼합물에 존재한다.

천연 감미제로서, 상이한 스테비올 글리코시드는 평가되는 각각의 레바우디오시드 종에 연관된 상이한 단맛 정도, '구감' 및 특정한 뒷맛을 갖는다. 설탕(즉, "수크로스")에 비해, 스테비올 글리코시드의 단맛은 상당히 더 크다. 예를 들어, 스테비오시드는 수크로스보다 100배 내지 150배 더 달지만 맛 평가에서 주지되는 바와 같이 더 쓴 뒷맛을 갖는 반면, 레바우디오시드 A 및 E는 수크로스보다 250배 내지 450배 더 달고 뒷맛은 스테비오시드보다 훨씬 더 낫지만, 주지 가능한 뒷맛이 여전히 존재한다. 따라서, 임의의 스테비아(stevia) 추출물의 맛 프로필은 추출물 중 스테비올 글리코시드의 상대 함량에 의해 현저히 영향받으며, 이는 다시 기저 식물이 겪는 환경 조건 및 사용되는 추출 방법에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 식물 제조, 기후 조건 및 추출 조건의 변화는 스테비아(stevia) 추출물 중 스테비올 글리코시드의 일관성 없는 조성을 생성할 수 있어서, 이러한 맛 프로필은 상이한 추출 산물 배치에 따라 크게 변한다. 스테비아(stevia) 추출물의 맛 프로필은 또한 추출 공정 후 산물에 잔류하는 식물-유래 또는 환경 유래 오염물(예컨대 색소, 지질, 단백질, 페놀류 및 당류)에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 오염물은 전형적으로 소비재에서 감미제로서의 스테비아(stevia) 추출물의 용도를 위해 바람직하지 못한 이들의 고유한 이취를 갖는다.

또한, 스테비아(stevia) 추출물 중 풍부하지 않은 개별 스테비올 글리코시드 또는 이의 특정 조합의 단리 비용은 고가이며 자원이 제한적이다. 스테비오시드 및 Reb A로부터 스테비올 글리코시드의 비-생물학적 제조는 어렵다. 스테비오시드의 산 가수분해는 제조되는 스테비올이 산성 조건 하에 이소스테비올로 재배열되므로, 문제가 된다. 일부 특정 스테비올 글리코시드의 제한된 양 및 이용 가능성에 기반하여, 천연 효소 또는 특정 미생물이 필요한 효소를 운반하고 관심 글리코시드의 제조를 특이적으로 증가시키기 위해 상업적으로 유의미한 발효 공정을 사용하도록 변형될 수 있는, 바이오-전환에 의해 상업적 공급이 더 잘 해결될 수 있다. 예를 들어, 변형된 미생물을 이용하는 발효 경로를 통한 스테비오시드의 Reb E로의 생체-전환이 앞서 보고되었다(Mao et al., US 특허 출원 공개 제US2016/0207954호, A Non-Caloric Sweetener 참고). 대안적으로, 다른 비-생물학적 합성 수단이 관심 스테비올 글리코시드를 개발하기 위해 사용될 수 있다.

생물학적 관점에서, 모든 스테비올 글리코시드는 스테비올의 일련의 글리코실화 반응에 의해 형성되며, 이는 전형적으로 당 모이어티의 공여체로서 유리딘 5'-디포스포글루코스(UDP-글루코스)를 사용하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제(UGT) 효소에 의해 촉매된다. 식물에서, UGT는 UDP-글루코스로부터 스테비올로 글루코스 잔기를 전달하는 널리 발산된 효소 그룹이다. 이러한 반응에서, 스테비오시드는 종종 다양한 레바우디오시드 화합물의 생합성에서의 중간체이다. 예를 들어, 스테비오시드의 C-13-O-글루코스에서 C-3'에서의 스테비오시드의 글리코실화는 레바우디오시드 A를 산출한다; 반면 스테비오시드의 19-0-글루코스 위치에서 C-2'에서의 글리코실화는 레바우디오시드 E를 산출한다.

본 개시에 따르면, 스테비아(stevia) 추출물의 맛 품질을 개선하기 위한 실제적인 접근은 일반적으로 더 바람직한 맛 특징을 갖는 레바우디오시드 화합물의 수율을 증가시키는 것이며, 보다 생산적인 합성 경로 및 연관된 공정을 통해 이를 수행하는 것이다. 평가된 스테비올 글리코시드 중에서, Reb M이 식품 및 음료에서의 사용을 위해 가장 바람직한 맛 및 화학적 특징을 갖는다고 믿는 이들이 많다. 그러나 상기 언급된 바와 같이, 식물은 그 잎에 극히 소량의 상기 화합물이 존재하므로, 상기 글리코시드의 대규모 제조를 가능하게 하고 보조할 뿐만 아니라 식품 및 음료 산업에 대안적인 감미제를 제공하기 위한 대안적 공정이 필요하다.

따라서, 더 우수하고 더 일관된 맛 프로필을 갖는 스테비올 글리코시드가 상업적 제품으로서 개발될 필요가 있고, 이러한 스테비올 글리코시드에 있어서 비교적 일반적인 출발 기질, 예컨대 더 풍부한 스테비올 글리코시드를 출발 분자로서 이용하여, 이러한 바람직한 글리코시드의 제조가 상업적으로 최대한 비용 효과적일 수 있도록 하는 것이 필요하다. 본 개시는 요망되는 스테비올 글리코시드의 제조를 증강시키는 방법을 제공한다.

스테비올 글리코시드 제조 비용을 감소시키고 대규모 배양 및 가공의 환경적 영향을 경감시키기 위한 새로운 제조 방법이 또한 필요하다(Yao et al., 1994). 이러한 가능한 해결책 중 하나는 상업화를 위해 이용 가능한 요망되는 스테비올 글리코시드의 선택성, 풍부도 및 순도를 증가시키는 소정 미생물 종 또는 다른 재조합 세포에서의 제조 및 변형된 미생물 배양 또는 세포 용해물 중에서 다른 변형된 세포 배양으로부터의 이러한 제조를 유도하는 가수분해 효소를 사용하여 요망되는 레바우디오시드의 존재를 증강시키는 것을 허용하는 발효 생체-전환 기법의 사용이다.

발명의 요약

본 개시는 부분적으로 베타-글루코시다제의 가수분해 활성을 이용하여 다양한 스테비올 글리코시드로부터 증강된 양의 레바우디오시드 M(Reb M)을 제조하는 방법을 포괄한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 관심 기질을 함유하는 파괴된 재조합 세포(예컨대, 재조합 미생물 세포)로부터 요망되는 스테비올 글리코시드를 제조하기 위한 개선된 공정을 제공한다. 이는 이러한 세포(예컨대, 미생물)가 레바우디오시드 A(Reb A), 레바우디오시드 E(Reb E) 및/또는 스테비오시드를 포함하는 관심 스테비올 글리코시드를 생성할 수 있는 유전자를 운반하도록 변형된 것이다. 상기 구현예에서, 공정은 파괴된 세포(예컨대, 미생물 세포)로부터 물질을 수득하는 단계 및 상기 폐기물에 존재하는 스테비오시드에 대한 효소적 가수분해를 수행하여 Reb M의 제조를 증강시키는 단계를 포함한다.

제품/상업적 유용성의 관점에서, 미국 내 시장에는 스테비올 글리코시드를 함유하는 수십 여 제품이 존재하며, 식품뿐만 아니라 진통제에서부터 해충 퇴치제에 이르기까지 모든 것에서, 그리고 식이 보충물질에서 사용될 수 있다. 관심 스테비올 글리코시드를 함유하는 제품은 에어로졸, 액체 또는 과립 제형물을 포함할 수 있다.

본 개시의 세포계에 있어서, 이는 선택된 유전자로의 유전적 형질전환 및 이후 스테비올로부터 요망되는 스테비올 글리코시드의 생합성 제조를 허용할 박테리아, 효모 및 이의 조합 또는 임의의 세포계로 구성되는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 미생물 시스템에서, 이후 베타-글루코시다제 가수분해에 노출되는 요망되는 스테비올 글리코시드 화합물을 제조하기 위해 에스케리치아 콜라이(E. coli)가 사용된다.

베타-글루코시다제는 동물의 하부 위장관에 종종 존재하는 구성적 효소이며 식품 물질의 소화 및 흡수를 보조하는 데 유용하다. 본 개시에 따르면, B-glu1이 스테비오시드, 레바우디오시드 E(Reb E), 레바우디오시드 A(Reb A), 레바우디오시드 I(Reb I), 레바우디오시드 D(Reb D), 레바우디오시드 G(Reb G) 및 루부소시드를 가수분해하기 위해 사용된다. 가수분해는 스테비올을 가수분해의 최종 산물로 하여 스테비올바이오시드의 최초 형성을 통해 진행된다.

따라서, 본 개시의 양태는 a) 제1 기질을 제조하도록 변형된 재조합 세포(예컨대, 미생물, 조류 또는 식물 세포)를 제공하는 단계; b) 상기 재조합 세포가 그 세포의 시토졸을 방출하도록 파괴하는 단계로서, 이러한 시토졸이 상기 제1 기질을 함유하는, 단계; c) 상기 재조합 세포로부터 시토졸을 수득하는 단계; d) 상기 시토졸을 베타-글루코시다제에 노출하는 단계로서, 이러한 베타-글루코시다제는 상기 제1 기질로부터 적어도 하나의 글루코실기를 제거하는 것을 통해 관심 제2 기질을 생성하기 충분한 시간 동안 가수분해 활성을 갖는, 단계; 및; 및 e) 상기 관심 제2 기질을 수집하는 단계를 포함하는, 스테비올 글리코시드의 글리코실화를 변경하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 상기 제1 기질은 스테비올 글리코시드이다. 일부 구현예에서, 상기 관심 제2 기질은 Reb M이다. 일부 구현예에서, 상기 관심 제2 기질은 Reb B이다. 일부 구현예에서, 상기 관심 제2 기질은 Reb A이다. 일부 구현예에서, 제1 기질 및 제2 기질은 본원에서 표 1 또는 도면(예컨대, 도 9)에 기재된 것들이다.

일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 상기 스테비올 글리코시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 상기 스테비올 글리코시드의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 상기 스테비올 글리코시드의 C19 위치 또는 상기 스테비올 글리코시드의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 상기 스테비올 글리코시드의 C19 위치 및 상기 기질의 C13 위치 둘 모두로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 한다.

일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 루부소시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올-13-글루오시드를 제조하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 스테비오시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올바이오시드를 제조하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 Reb E의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올바이오시드를 제조하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 Reb I의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 Reb A를 제조하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 Reb A의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 Reb B를 제조하는 기능을 한다.

일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 스테비올-13-글루오시드의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올을 제조하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 Reb D의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하여 Reb B 또는 Reb A를 제조하는 기능을 한다. 일부 구현예에서, 상기 가수분해 활성은 Reb G의 C19 위치 및 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올-13-글루코시드를 제조하는 기능을 한다.

일부 양태에서, 본원에 제공된 방법은 효소적 가수분해 속도를 증가시키기 위한 베타-갈락토시다제 또는 펙티나제 효소의 용도를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 형질전환된 세포계에서 스테비올 글리코시드를 발현하는 단계; 배지에서 세포계를 성장시키는 단계; 및 상기 관심 제2 기질을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간은 적어도 6시간이다.

일부 구현예에서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간은 적어도 12시간이다. 일부 구현예에서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간은 적어도 18시간이다. 일부 구현예에서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간은 적어도 24시간이다. 일부 구현예에서, 상기 관심 제2 기질은 스테비올 글리코시드이다.

일부 구현예에서, 베타-글루코시다제는 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%(예컨대 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-글루코시다제는 SEQ ID NO: 3과 적어도 95%(예컨대, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 재조합 세포는 박테리아, 효모, 필라멘트성 진균, 시아노박테리아 조류 및 식물 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 재조합 세포(예컨대, 미생물)는 에스케리치아(Escherichia); 살모넬라(Salmonella); 바실러스(Bacillus); 아시네토박터(Acinetobacter); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 코리네박테리움(Corynebacterium); 메틸로사이누스(Methylosinus); 메틸로모나스(Methylomonas); 로도코쿠스(Rhodococcus); 슈도모나스(Pseudomonas); 로도박터(Rhodobacter); 시네코시스티스(Synechocystis); 사카로마이세스(Saccharomyces); 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces); 칸디다(Candida); 한세눌라(Hansenula); 데바리오마이세스(Debaryomyces); 무코르(Mucor); 피치아(Pichia); 토룰롭시스(Torulopsis); 아스페르길러스(Aspergillus); 아르트로보틀리스(Arthrobotlys); 브레비박테리아(Brevibacteria); 마이크로박테리움(Microbacterium); 아르트로박터(Arthrobacter); 시트로박터(Citrobacter); 에스케리치아(Escherichia); 야로위아(Yarrowia); 클렙시엘라(Klebsiella); 판토에아(Pantoea); 살모넬라 코리네박테리움(Salmonella Corynebacterium); 클로스트리듐(Clostridium); 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 상기 관심 제2 기질은 스테비올 글리코시드이다. 일부 구현예에서, 관심 제2 기질은 Reb E이다. 일부 구현예에서, 상기 제2 기질은 Reb E, Reb D4 및 Reb M의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 관심 제2 기질은 Reb D4이다. 일부 구현예에서, 상기 관심 제2 기질은 스테비올 글리코시드 혼합물이며 조합된 상기 혼합물의 스테비올 글리코시드 함량은 건조물 기준으로 시토졸 유래 농축물의 임의의 다른 성분의 중량보다 크다.

일부 구현예에서, 단계 e)의 관심 제2 기질은 미정제 산물이며 단계 e)는 i) 상기 미정제 산물을 정제하는 단계; 및 ii) 진공 하에 용매를 제거하여 농축 산물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 미정제 산물은 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 상기 미정제 산물은 산-염기 추출에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 상기 미정제 산물은 진공 증류에 의해 정제된다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 반-분취형 HPLC를 사용하여 농축 산물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

본 개시에는 다양한 변형 및 대안적 형태가 적용되기 쉽지만, 이의 구체적 구현예를 도면에서 예로서 나타내며, 본원에서 상세히 설명될 것이다. 그러나, 본원에서 제시되는 도면 및 상세한 설명은 본 개시를 개시된 특정 구현예로 제한하려는 것이 아니라, 반대로, 첨부되는 청구범위에 의해 정의되는 본 개시의 정신 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 균등부 및 대안을 커버하기 위한 것임이 이해되어야 한다.

본 발명의 다른 속성 및 장점은 첨부 도면을 참조로 하여, 본 발명의 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명에서 보다 명확해질 것이다.

도 1a및 도 1b는 루부소시드를 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 1a: 루부소시드 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 스테비올(“S”)의 표준물질; b: 루부소시드(“Rub”)의 표준물질; c 내지 d: 루부소시드를 1시간(c) 및 3시간(d)째에 재조합 B-glu1 효소로 절단하였다; e 내지 f: 루부소시드를 1시간(e) 및 6시간(f)째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다. 도 1b: B-glu1에 의해 촉매된 루부소시드 가수분해 경로. 루부소시드를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올-13-글루코시드(“S-13-G”) 및 스테비올을 제조하였다.
도 2a 및 도 2b는 스테비오시드를 B-glu1 효소에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 2a: 스테비오시드 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 스테비오시드(“ST”)의 표준물질; b: 스테비올바이오시드(“SB”)의 표준물질; c 내지 e: 스테비오시드를 1시간(c), 6시간(d) 및 24시간(e)째에 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하였다. 도 2b: B-glu1에 의해 촉매된 스테비오시드 가수분해 경로. 스테비오시드를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올바이오시드를 제조한다.
도 3a 및 도 3b는 레바우디오시드 E를 B-glu1 효소에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 3a: 레바우디오시드 E 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 스테비올바이오시드(“SB”)의 표준물질; b: 레바우디오시드 E(“E”)의 표준물질; c 내지 e: 레바우디오시드 E를 1시간(c), 6시간(d) 및 24시간(e)째에 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하였다. 도 3b: B-glu1에 의해 촉매된 레바우디오시드 E 가수분해 경로. 레바우디오시드 E를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올바이오시드를 제조한다.
도 4a 및 도 4b는 레바우디오시드 A를 B-glu1 효소에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 4a: 레바우디오시드 A 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 레바우디오시드 A(“Reb A”)의 표준물질; b: 레바우디오시드 B(“Reb B”)의 표준물질; c 내지 d: 레바우디오시드 A를 1시간(c) 및 6시간(d)째에 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하였다. 도 4b: B-glu1에 의해 촉매된 레바우디오시드 A 가수분해 경로. 레바우디오시드 A를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 레바우디오시드 B를 제조한다.
도 5a 및 도 5b는 레바우디오시드 I를 B-glu1 효소에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 5a: 레바우디오시드 I 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 레바우디오시드 A(“Reb A”)의 표준물질; b: 레바우디오시드 B(“Reb B”)의 표준물질; c: 레바우디오시드 I(“Reb I”)의 표준물질; d 내지 f: 레바우디오시드 I를 1시간(d), 6시간(e) 및 24시간(f)째에 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하였다. 도 5b: B-glu1에 의해 촉매된 레바우디오시드 I 가수분해 경로. 레바우디오시드 I를 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하여 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 B를 제조한다.
도 6a 및 도 6b는 레바우디오시드 D를 B-glu1 효소에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 6a: 레바우디오시드 D 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 레바우디오시드 B(“Reb B”)의 표준물질; b: 레바우디오시드 D(“Reb D”)의 표준물질; c 내지 e: 레바우디오시드 D를 1시간(c), 6시간(d) 및 24시간(e)째에 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하였다. 도 6b: B-glu1에 의해 촉매된 레바우디오시드 D 가수분해 경로. 레바우디오시드 D를 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하여 레바우디오시드 A 및 레바우디오시드 B를 제조한다.
도 7a 및 도 7b는 레바우디오시드 G를 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. 도 7a: 레바우디오시드 G 가수분해 산물의 HPLC 프로필. a: 스테비올(“스테비올(Steviol)”), 스테비올-13-글루코시드(“S-13-G”)의 표준물질; b: 레바우디오시드 G(“G”)의 표준물질; b 내지 d: 레바우디오시드 G를 0.5시간(c), 1시간(d) 및 6시간(e)째에 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하였다; f: 레바우디오시드 G를 24시간(f)째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다. 도 7b: B-glu1에 의해 촉매된 레바우디오시드 G 가수분해 경로. 레바우디오시드 G를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올-13-글루코시드(“S-13-G”) 및 스테비올을 제조하였다.
도 8은 스테비올 글리코시드를 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하는 것을 나타낸다. a: 스테비올바이오시드(“SB”)의 표준물질; b: 레바우디오시드 B(“B”)의 표준물질; c: 스테비오시드를 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다; d: 레바우디오시드 E(“E”)를 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다; e: 레바우디오시드 A(“A”)를 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다; f: 레바우디오시드 I(“I”)를 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다; g: 레바우디오시드 D(“D”)를 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하였다.
도 9는 B-Glu1이 상이한 스테비올 글리코시드 기질을 가수분해할 수 있다는 것을 나타낸다. 실선: 글리코실화; 점선: 가수분해.
도 10은 Reb M 및 Reb WB2을 제조하기 위한 합성 경로를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어의 설명 :

스테비올 글리코시드는 남아메리카 식물 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana(아스테라세애(Asteraceae)) 잎의 단 맛에 관여하는 화학적 화합물의 한 클래스이며, 식품, 사료 및 음료에서 감미제로서 사용될 수 있다.

정의:

세포계는 이소성 단백질의 발현을 제공하는 임의의 세포이다. 박테리아, 효모, 식물 세포 및 동물 세포가 포함된다. 원핵 및 진핵 세포가 모두 포함된다. 또한 세포 성분, 예컨대 리보솜에 기반하는 단백질의 시험관내 발현이 포함된다.

코딩 서열은 당업자에게 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며 비제한적으로 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 나타내기 위해 사용된다.

세포계의 성장. 성장에는 세포가 증식하고 분열할 수 있도록 하는 적절한 배지의 제공이 포함된다. 또한 세포 또는 세포 성분이 재조합 단백질을 번역하고 제조할 수 있도록 하는 자원의 제공이 포함된다.

단백질 발현. 단백질 제조는 유전자 발현 후 일어날 수 있다. 이는 DNA가 메신저 RNA(mRNA)로 전사된 후의 단계로 구성된다. 이어서 mRNA는 폴리펩타이드쇄로 번역되며, 궁극적으로 단백질로 폴딩된다. DNA는 전달감염 (핵산을 세포 내로 의도적으로 도입하는 공정) 을 통해 세포에 존재한다. 이 용어는 종종 진핵 세포에서 비-바이러스 방법에 대해 사용된다. 이는 또한 다른 방법 및 세포 유형을 나타낼 수 있지만, 다른 용어가 선호된다: "형질전환"은 박테리아, 식물 세포를 포함하는 비-동물 진핵 세포에서의 비-바이러스 DNA 전달을 설명하기 위해 더 자주 사용된다. 형질전환은 이들 세포에서 암성 상태로의 진행(발암)을 나타내기 위해서도 사용되므로, 동물 세포에서는 전달감염이 선호되는 용어이다. 형질도입은 바이러스-매개 DNA 전달을 설명하기 위해 종종 사용된다. 형질전환, 형질도입 및 바이러스 감염이 본 출원에 있어서 전달감염의 정의 하에 포함된다.

효모. 본 개시에 따르면, 본원에서 청구되는 효모는 진균계 구성원으로서 분류되는 진핵, 단세포 미생물이다. 효모는 다세포 선조로부터 진화한 단세포 유기체이지만, 본 개시에 유용한 일부 종은 가성균사 또는 위 균사로 알려진 연결된 발아 세포의 줄을 형성하여 다세포 특징을 전개하는 능력을 갖는 것들이다.

본 개시에서 다양한 스테비올 글리코시드의 제조를 위해 사용되는 UGT 효소의 명칭은 패밀리 번호, 서브패밀리를 표시하는 문자 및 개별 유전자 번호의 조합에 의해 UGT 유전자를 분류하는 UGT 명명 위원회에서 채택되는 명명 체계와 일치한다(Mackenzie et al., "The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence," PHARMACOGENETICS, 1997, vol. 7, pp. 255-269). 예를 들어, 명칭 "UGT76G1"은 UGT 패밀리 번호 76(식물 기원임), 서브패밀리 G 및 유전자 번호 1에 속하는 유전자에 의해 인코딩되는 UGT 효소를 나타낸다.

구조 용어:

본원에서 사용되는 단수 형태 부정관사 및 정관사("a, an" 및 "the")에는 내용 상 명확히 달리 나타내지 않는 한, 복수의 참조물이 포함된다.

용어 "포함된다", "갖는다" 등이 설명 또는 청구범위에서 사용되는 정도까지, 이러한 용어는 "포함한다"라는 용어가 청구범위에서의 연결부로서 사용되는 것과 유사하게 포괄적인 것으로 의도된다.

단어 "예시적인"은 본원에서 "실시예, 예 또는 예시로서 작용하는" 것을 의미하기 위해 사용된다. "예시적인" 것으로서 본원에 기재된 임의의 구현예가 반드시 다른 구현예에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 간주되어야 하는 것은 아니다.

용어 "상보적인"은 당업자에게 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 염기 간 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, DNA에 대해, 아데노신은 티민과 상보적이며 시토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 종속 기술에는 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 첨부된 서열 목록에서 보고되는 전체 서열과 상보적인 단리된 핵산 단편 또한 포함된다.

용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 당업자에게 이의 각각의 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 나타내기 위해 사용된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 천연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라, 묵시적으로 보존적으로 변형된 서열 또는 이의 축퇴성 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적인 서열 또한 포괄한다.

용어 "단리된"은 당업자에게 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 단리된 핵산 또는 단리된 폴리펩타이드의 맥락에서 사용되는 경우, 비제한적으로 인간의 손에 의해, 그 원상태 환경으로부터 벗어나 존재하고 이에 따라 천연 산물이 아닌 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타내기 위해 사용된다. 단리된 핵산 또는 폴리펩타이드는 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 비-원상태 환경에서, 예컨대 트랜스제닉 숙주 세포에서 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "인큐베이션하는" 및 "인큐베이션"은 2개 이상의 화학적 또는 생물학적 실체(예컨대 화학적 화합물 및 효소)를 혼합하고, 이들이 스테비올 글리코시드 조성물을 제조하기 바람직한 조건 하에 상호작용하도록 두는 공정을 의미한다.

용어 "축퇴성 변이체"는 하나 이상의 축퇴성 코돈 치환에 의해 참조 핵산 서열과 상이한 잔기 서열을 갖는 핵산 서열을 나타낸다. 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성하여 달성될 수 있다. 핵산 서열 및 이의 모든 축퇴성 변이체는 동일한 아미노산 또는 폴리펩타이드를 발현할 것이다.

용어 "폴리펩타이드", "단백질" 및 "펩타이드"는 당업자에게 이의 각각의 일반적이고' 통상적인 의미로 주어진다; 3개 용어는 때때로 상호 교환적으로 사용되며, 그 크기 또는 기능과 무관하게 비제한적으로 아미노산 또는 아미노산 유사체의 중합체를 나타내기 위해 사용된다. "단백질"은 종종 상대적으로 큰 폴리펩타이드를 나타내는 데 사용되며 "펩타이드"는 종종 작은 폴리펩타이드를 나타내는 데 사용되고, 당분야에서 이들 용어의 사용은 중첩되며 변한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 달리 언급되지 않는 한, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 나타낸다. 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 폴리뉴클레오타이드 산물을 나타내는 경우 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩타이드에는 폴리뉴클레오타이드 산물, 천연 발생 단백질, 동족체, 오르소로그, 파라로그, 단편 및 이의 다른 등가물, 변이체 및 유사체가 포함된다.

참조 폴리펩타이드에 대해 사용되는 경우, 용어 "폴리펩타이드 단편" 및 "단편"은 당업자에게 이의 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 아미노산 잔기가 참조 폴리펩타이드 자체에 비해 결실되지만, 잔여 아미노산 서열이 보통 참조 폴리펩타이드에서의 대응 위치와 동일한 폴리펩타이드를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 결실은 참조 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카복시-말단에서, 또는 대안적으로 둘 모두에서 일어날 수 있다.

용어 폴리펩타이드 또는 단백질의 "기능적 단편"은 전장 폴리펩타이드 또는 단백질의 일부이며, 전장 폴리펩타이드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖거나 실질적으로 동일한 기능을 수행하는(예컨대, 동일한 효소 반응을 수행하는) 펩타이드 단편을 나타낸다.

상호 교환적으로 사용되는 용어 "변이체 폴리펩타이드", "변형된 아미노산 서열" 또는 "변형된 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산에 의해, 예컨대, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 참조 폴리펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 나타낸다. 하나의 양태에서, 변이체는 참조 폴리펩타이드의 일부 또는 모든 능력을 보유하는 "기능적 변이체"이다.

용어 "기능적 변이체"에는 보존적으로 치환된 변이체가 추가로 포함된다. 용어 "보존적으로 치환된 변이체"는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 참조 펩타이드와 상이하며 참조 펩타이드의 일부 또는 모든 활성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 나타낸다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기의 기능적으로 유사한 잔기로의 치환이다. 보존적 치환의 예에는 하나의 비극성(소수성) 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 비극성(소수성) 잔기로의 치환; 하나의 하전된 또는 극성(친수성) 잔기의 또 다른 극성(친수성) 잔기, 예컨대 아르기닌 및 라이신 간, 글루타민 및 아스파라긴 간, 트레오닌 및 세린 간 치환; 하나의 염기성 잔기, 예컨대 라이신 또는 아르기닌의 또 다른 염기성 잔기로의 치환; 또는 하나의 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의 또 다른 산성 잔기로의 치환; 또는 하나의 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 또 다른 방향족 잔기로의 치환이 포함된다. 이러한 치환은 단백질 또는 폴리펩타이드의 겉보기 분자량 또는 등전점에 대한 효과를 거의 또는 전혀 갖지 않을 것으로 예상된다. 어구 "보존적으로 치환된 변이체"에는 생성 펩타이드가 본원에 기재된 바와 같은 참조 펩타이드의 일부 또는 모든 활성을 유지하는 한, 잔기가 화학적으로 유도체화된 잔기로 대체되는 펩타이드가 또한 포함된다.

주제 기술의 폴리펩타이드에 관한 용어 "변이체"에는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 기능적으로 활성이 있는 폴리펩타이드가 추가로 포함된다.

모든 문법적 형태 및 철자 변형을 포함한 용어 "상동성"은 수퍼 패밀리로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 및 상이한 종으로부터의 상동성 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 포함하는, "공통 진화 기원"을 보유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 간 관계를 나타낸다(Reeck et al., CELL 50:667, 1987). 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 보존된 위치에서의 동일성 백분율 또는 특정 아미노산 또는 모티브의 존재의 관점과 무관하게, 이의 서열 유사성으로 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 예를 들어, 2개의 상동성 폴리펩타이드는 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 900 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 심지어 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

"적합한 조절 서열"은 당업자에게 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하고 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 나타내기 위해 사용된다. 조절 서열에는 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인식 서열이 포함될 수 있다.

"프로모터"는 당업자에게 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며 비제한적으로 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 나타내기 위해 사용된다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 이의 전체가 원상태 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 확인되는 상이한 프로모터로부터 유래되는 상이한 요소로 이루어질 수 있거나, 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업자에게는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서 또는 상이한 발달 단계에서 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 이해된다. 유전자가 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 유도하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로 언급된다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완벽하게 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 의해 영향받도록 하는 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 연합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 해당 코딩 서열(즉, 프로모터의 전사 제어 하에 있는 코딩 서열)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "발현"은 당업자에게 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며 비제한적으로 주제 기술의 핵산 단편으로부터 유래되는 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타내기 위해 사용된다. "과발현"은 정상 또는 형질전환되지 않은 유기체에서의 제조 수준을 초과하는 트랜스제닉 또는 재조합 유기체에서의 유전자 산물의 제조를 나타낸다.

"형질전환"은 당업자에게 그 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 표적 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 전달을 나타내기 위해 사용된다. 전달된 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 혼입되어, 유전적으로 안정한 유전을 야기할 수 있거나, 숙주 염색체와 무관하게 복제할 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉"으로 언급되거나

숙주 세포에 관해 본원에서 사용되는 경우, 용어 "형질전환된", "트랜스제닉" 및 "재조합"은 당업자에게 이의 각각의 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 이종성 핵산 분자가 도입된 숙주 유기체의 세포, 예컨대 식물 또는 미생물 세포를 나타내기 위해 사용된다. 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있거나, 핵산 분자는 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가-복제할 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 대상체는 형질전환 공정의 최종 산물뿐만 아니라, 이의 트랜스제닉 자손도 포괄하는 것으로 이해된다.

폴리뉴클레오타이드에 관해 본원에서 사용되는 경우, 용어 "재조합", "이종성" 및 "외인성"은 당업자에게 이의 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 특정 숙주 세포에 대한 외래 출처에서 기인하는, 또는 동일한 출처로부터인 경우, 그 원래 형태로부터 변형된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA 서열 또는 유전자)를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 숙주 세포 내의 이종성 유전자에는 특정 숙주 세포에 내인성인, 그러나 예를 들어, 부위-지정 돌연변이화 또는 다른 재조합 기법의 사용을 통해 변형된 유전자가 포함된다. 이 용어에는 또한 천연 발생 DNA 서열의 여러 비-천연 발생 카피가 포함된다. 따라서, 이 용어는 세포에 대해 외래이거나 이종성인, 또는 세포와 상동성이지만 요소가 보통 확인되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 있거나 형태인 DNA 절편을 나타낸다.

유사하게, 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 관해 본원에서 사용되는 경우, 용어 "재조합", "이종성" 및 "외인성"은 특정 숙주 세포에 대해 외래 출처에서 기인하는, 또는 동일한 출처로부터인 경우, 그 원래 형태로부터 변형된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 재조합 DNA 절편은 숙주 세포에서 발현되어 재조합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 당업자에게 이의 각각의 일반적이고 통상적인 의미로 주어지며, 비제한적으로 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하고 보통 원형 이중쇄 DNA 분자 형태인 염색체외 요소를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 요소는 임의의 출처로부터 유래되는, 단일쇄 또는 이중쇄 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형, 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있고, 여기서 여러 뉴클레오타이드 서열이 세포 내로 적절한 3' 미번역 서열을 따라 프로모터 단편 및 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 도입할 수 있는 고유한 구성으로 연결되거나 재조합되었다.

"형질전환 카세트"는 외래 유전자를 함유하며 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 외래 유전자에 부가하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다.

"발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하며 외래 숙주에서 해당 유전자의 발현 증강을 허용하는 외래 유전자에 부가하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다.

본 개시는 B-glu1 효소에 의한 관심 스테비올 글리코시드의 제조에 관한 것이다.

합성 생물학

본원에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법은 당분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (이후 "Maniatis"); 및 Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W. EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; 및 Ausubel, F. M. et al., IN CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, published by GREENE PUBLISHING AND WILEY-INTERSCIENCE, 1987; (각각의 전문이 본원에 참조로 포함됨)]에 기재되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 평가에서 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법은 아래에 기재된다.

글리코실화는 종종 생활성 및 식물 천연 산물의 저장을 제어하는 도처에서 일어나는 반응으로 간주된다. 소분자의 글리코실화는 지금까지 연구된 대부분의 식물 종에서 트랜스퍼라제 수퍼패밀리에 의해 촉매된다. 이들 글리코실트랜스퍼라제(GT)는 60개를 초과하는 패밀리로 분류되었다. 이들 중에서, UDP 글리코실트랜스퍼라제(UGT)로도 알려진 GT 효소의 패밀리는 UDP-활성화된 당 모이어티를 특정 수신체 분자로 전달한다. 이들은 스테비올 글리코시드에서 이러한 당 모이어티를 전달하여 다양한 레바우디오시드를 생성하는 분자이다. 각각의 이러한 UGT는 이의 고유한 활성 프로필 및 이들이 이의 활성화된 당 모이어티를 전달하는 선호되는 구조 위치를 갖는다.

제조 시스템

원핵생물에서 단백질의 발현은 가장 흔하게는 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터로 박테리아 숙주 세포에서 수행된다. 융합 벡터는 보통 재조합 단백질의 아미노 말단에, 여기에서 인코딩되는 단백질에 여러 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제를 보조하는 3가지 목적을 위해 작용한다. 종종, 단백분해 절단 부위가 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 단백질의 정제 이후 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 벡터는 본 개시의 범위 내에 있다.

하나의 구현예에서, 발현 벡터에는 박테리아 세포에서 재조합 폴리펩타이드의 발현을 위한 유전적 요소가 포함된다. 박테리아 세포에서 전사 및 번역을 위한 요소에는 프로모터, 단백질 복합체에 대한 코딩 영역 및 전사 종결인자가 포함될 수 있다.

당업자는 발현 벡터의 제조를 위해 이용 가능한 분자 생물학 기법을 인지할 것이다. 상술된 바와 같이, 주제 기술의 발현 벡터 내로의 혼입을 위해 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 일상적 기법, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조될 수 있다.

상보적인 응집성 말단을 통해 DNA를 벡터에 작동 가능하게 연결하기 위해 여러 분자 생물학 기법이 개발되었다. 하나의 구현예에서, 상보적인 단독-중합체 트랙이 벡터 DNA 내로 삽입될 핵산 분자에 부가될 수 있다. 이어서 벡터 및 핵산 분자는 상보적인 단독중합체 꼬리 사이의 수소 결합 형성에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.

대안적인 구현예에서, 제공되는 하나 이상의 제한효소 부위를 함유하는 합성 링커가 주제 기술의 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터에 작동 가능하게 연결하기 위해 사용된다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 제한효소 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성된다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 이의 3'-5'-엑소뉴클레오타이드 분해 활성으로 돌출된 3'-단일쇄 말단을 제거하고 이의 중합 활성으로 오목해진 3'-말단을 채워서 무딘-말단 DNA 절편을 생성하는 효소인 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 또는 에스케리치아 콜라이 DNA 폴리머라제 I로 처리된다. 이어서 무딘-말단 절편은 무딘-말단 DNA 분자의 결찰을 촉매할 수 있는 효소, 예컨대 박테리오파지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 큰 몰 과량의 링커 분자와 인큐베이션된다. 이에 따라, 반응 산물은 그 말단에 중합체성 링커 서열을 운반하는 폴리뉴클레오타이드이다. 이어서 이들 폴리뉴클레오타이드는 적절한 제한 효소로 절단되고 폴리뉴클레오타이드의 말단과 호환성인 말단을 생성하는 효소로 절단된 발현 벡터에 결찰된다.

대안적으로, 결찰-무관 클로닝(LIC) 부위를 갖는 벡터가 채택될 수 있다. 이어서 요구되는 PCR 증폭 폴리뉴클레오타이드가 제한효소 소화 또는 결찰 없이 LIC 벡터 내로 클로닝될 수 있다(본원과 일치하는 정도까지 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Aslanidis and de Jong, NUCL. ACID. RES. 18 6069-74, (1990), Haun, et al, BIOTECHNIQUES 13, 515-18 (1992)]).

하나의 구현예에서, 선택된 플라스미드 내로의 삽입을 위해 관심 폴리뉴클레오타이드를 단리하고/하거나 변형하기 위해, PCR을 사용하는 것이 적합하다. 핵산 분자의 요구되는 코딩 영역을 단리하고, 제한효소 엔도뉴클레아제 또는 LIC 부위를 부가하고, 요망되는 해독틀에 코딩 영역을 배치하기 위해 서열의 PCR 제조에서 사용하기 위해 적절한 프라이머가 설계될 수 있다.

하나의 구현예에서, 주제 기술의 발현 벡터 내로의 혼입을 위한 폴리뉴클레오타이드는 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 제조된다. 프라이머 자체가 증폭된 서열 산물 내로 혼입되는 동안 코딩 영역이 증폭된다. 하나의 구현예에서, 증폭 프라이머는 제한효소 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유하며, 이는 증폭된 서열 산물이 적절한 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 한다.

발현 벡터는 통상적인 형질전환 또는 전달감염 기법에 의해 재조합 숙주 세포(예를 들어, 식물 또는 미생물 숙주 세포) 내로 도입될 수 있다. 주제 기술의 발현 벡터로의 적절한 세포의 형질전환은 당분야에 알려진 방법에 의해 달성되며 전형적으로 벡터 및 세포 유형 모두에 의존한다. 적합한 기법에는 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공-침전, DEAE-덱스트란 매개 전달감염, 리포펙션, 화학천공 또는 전기천공이 포함된다.

성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 발현 벡터를 함유하는 세포는 당분야에 널리 알려진 기법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 주제 기술의 발현 벡터로 전달감염된 세포를 배양하여 본원에 기재된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 세포는 당분야에 널리 알려진 기법에 의해 발현 벡터 DNA의 존재에 대해 조사될 수 있다.

숙주 세포는 이전에 기재된 발현 벡터의 단일 카피 또는 대안적으로 발현 벡터의 복수 카피를 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 형질전환된 세포는 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 조류 세포, 진균 세포 또는 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유채 식물 세포, 평지씨 식물 세포, 야자 식물 세포, 해바라기 식물 세포, 목화 식물 세포, 옥수수 식물 세포, 땅콩 식물 세포, 아마 식물 세포, 참깨 식물 세포, 대두 식물 세포 및 페튜니아 식물 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 식물 세포이다.

외래 단백질의 고-수준 발현을 지시하는 조절 서열을 함유하는 미생물 숙주 세포 및 다른 숙주 세포 발현 시스템 및 발현 벡터는 당업자에게 널리 알려져 있다. 이들 중 임의의 것이 미생물 숙주 세포에서 주제 기술의 재조합 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터를 구축하기 위해 사용될 수 있다. 이어서 이들 벡터는 주제 기술의 재조합 폴리펩타이드의 고수준 발현을 허용하기 위해 형질전환을 통해 적절한 미생물 내로 도입될 수 있다.

적합한 미생물 숙주 세포 및 다른 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트는 당분야에 널리 알려져 있다. 전형적으로 벡터 또는 카세트는 관련 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선별 마커 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는 전사 개시 제어부를 보유하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 영역을 포함한다. 이러한 제어 영역이 숙주로서 선택된 특정 종에 대해 원상태인 유전자로부터 유래될 필요가 없음이 이해되지만, 두 제어 영역이 모두 형질전환된 숙주 세포와 상동성인 유전자로부터 유래되는 것이 바람직하다.

요망되는 미생물 숙주 세포 또는 다른 숙주 세포에서 재조합 폴리펩타이드의 발현을 유도하기 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 여럿이며 당업자에게 친숙하다. 비제한적으로 CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI(사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현에 유용함); AOXI(피치아(Pichia)에서의 발현에 유용함); 및 lac, trp, JPL, IPR, T7, tac 및 trc(에스케리치아 콜라이에서의 발현에 유용함)를 포함하는, 이들 유전자를 유도할 수 있는 실질적으로 모든 프로모터가 주제 기술을 위해 적합하다.

종결 제어 영역은 또한 미생물 숙주에 대해 원상태인 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 본원에 기재된 미생물 숙주를 위해 종결 부위가 선택적으로 포함될 수 있다.

식물 세포에서, 주제 기술의 발현 벡터에는 요망되는 발생 단계에 요망되는 조직에서 주제 기술의 재조합 폴리펩타이드의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역이 포함될 수 있다. 편의 상 이유로, 발현될 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 번역 리더 서열 및 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 신호를 인코딩하는 3' 비-코딩 서열이 또한 존재할 것이다. 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드 발현을 촉진하기 위해 하나 이상의 인트론을 또한 포함할 수 있다.

식물 숙주 세포에 있어서, 코딩 영역의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터 및 임의의 종결인자의 임의의 조합이 주제 기술의 벡터 서열에서 사용될 수 있다. 프로모터 및 종결인자의 일부 적합한 예에는 노팔린 합성효소(nos), 옥토핀 합성효소(ocs) 및 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 유전자로부터의 것들이 포함된다. 사용될 수 있는 효율적인 식물 프로모터의 하나의 유형은 고-수준 식물 프로모터이다. 주제 기술의 발현 벡터와 작동 가능하게 연결된 이러한 프로모터는 벡터의 발현을 촉진할 수 있을 것이다. 주제 기술에서 사용될 수 있는 고수준 식물 프로모터에는 예를 들어 대두로부터의 리불로스-1,5-바이포스페이트 카복실라제의 소형 서브유닛(들)의 프로모터(이것이 본원과 일치하는 정도까지 그 전문이 본원에 포함되는, 문헌[Berry-Lowe et al., J. MOLECULAR AND APP. GEN., 1:483 498 (1982)]) 및 엽록소 alb 결합 단백질의 프로모터가 포함된다. 이들 두 프로모터는 식물 세포에서 광-유도되는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 이들이 본원과 일치하는 정도까지 각각이 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Genetic Engineering of Plants, an Agricultural PerspectiveENETIC ENGINEERING OF PLANTS, AN AGRICULTURAL PERSPECTIVE, A. Cashmore, Plenum, N.Y. (1983), pages 29 38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological ChemistryCHEMISTRY, 258: 1399(1983) 및 Dunsmuir, P. et al., JOURNAL OF MOLECULAR AND APPLIED GENETICSournal of Molecular and Applied Genetics, 2:285(1983)] 참고).

세포 파괴 기법

세포 파괴는 세포 내부로부터 관심 생체분자를 방출하는 데 사용되는 기법의 집합이다. 여러 생물공학적으로 제조된 화합물은 세포내 화합물이며 회수 전에 세포로부터 방출되어야 한다. 산물의 효율적 회수는 세포 파괴를 필요로 하며, 이는 관심 생체분자 및 사용되는 세포계에 따라 기계적이거나 비-기계적 방법인, 상이한 방법 및 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 모든 파괴 방법은 여기서는 스테비올 글리코시드인 관심 분자, 및 용해물 내에서 관심 단백질의 파손을 유도할 수 있는 다른 분자를 방출할 것임이 주지되어야 한다. 단백질 활성이 하류 작업에 대해 중요한 경우, 이를 방지하기 위한 고려가 있어야 한다. 고변성 용액 또는 높은 pH에서의 샘플 용해는 효소 활성을 최소화한다. 얼음 또는 저온 상에서의 파괴를 수행하는 것이 또한 샘플의 분해를 최소화하는 것을 도울 것이다. 따라서, 프로테아제 활성을 억제하는 하나의 기법은 일단 파괴된 용해물에 대해 이용 가능한 일반 포스파타제 억제제 칵테일을 갖는 것이다.

본 개시에 따라 사용될 수 있는 알려져 있는 파괴 기법

표준 파괴는 기계적 균질화, 프렌치 프레스, 초음파분쇄, 비드 균질화, 연마, 냉동-해동 용해, 세제 용해, 효소적 용해 및 삼투압 용해로 구성된다.

기계적 균질화에는 소형 장치, 예컨대 돈스(Dounce) 균질화기 또는 조직을 균질화하기 위한 블렌더와 같은 것들을 사용하는 것이 포함된다. 상기 방법은 비-종자 식물 유형 물질 또는 연조직(즉 간 조직)에 유용하다.

프렌치 프레스는 조직을 균질화하기 위해 전단력을 사용한다. 그 일례는 세포 현탁액을 취해, 시린지 배럴 및 플런저를 사용하여 좁은 게이지의 주사기를 통과시키는 것일 것이다. 이는 박테리아, 효모, 진균, 조류 및 포유류 세포 배양에 있어서 잘 작용하지만, 스케일-업하기가 어렵다.

초음파분쇄는 조직을 파괴하기 위해 짧은 초음파 돌발을 사용한다. 상기 방법은 다량의 열을 생성하며 단백질을 유지하기 위해 전형적으로 얼음 상에서 수행되어야 할 것이다. 상기 방법은 또한 박테리아, 효모, 진균, 조류 및 포유류 세포 배양에 있어 효과적이며 본 개시를 위해 바람직한 방법이다.

비드 균질화에는 유리 또는 금속 비드를 조직 또는 세포 현탁액과 함께 볼텍싱하면서 온건한 마모를 적용하기 위해 이를 사용하는 것이 관여된다. 연마에는 조직 샘플을 균질화하기 위한 사발 및 공이의 사용이 관여된다. 가장 일반적인 방법은 액체 질소를 사용하여 샘플을 냉동하고 연마하는 것이다. 냉동-해동 용해는 거의 말 그대로, 세포를 냉동하기 위해 액체 질소 또는 냉동기를 사용한 후 이들이 해동되도록 두는 것이다. 세포가 냉동되면, 세포 내부의 물은 냉동됨에 따라 팽창하여 세포가 파열 개방되도록 유도한다. 상기 방법은 포유류 세포에 있어 효과적이다.

효소적 용해는 세포벽을 소화시킬 수 있는 효소(즉 효모 세포에 있어서 자이몰라이아제(Zymolyase))를 함유하는 등-삼투압 완충액 중에 세포를 현탁하는 것으로 구성된다. 상기 용해 방법은 종종 샘플의 완전한 용해를 보장하기 위해 또 다른 파괴 기법(보통 초음파분쇄)과 함께 사용된다. 상기 기법은 박테리아, 효모, 진균, 조류, 비-종자 식물 물질 및 포유류 세포 배양에 있어 효과적이며 또한 본 개시에서 구현되는 기법이다.

세제 용해에는 세포막을 가용화하여 세포 내용물을 방출하기 위해 세제 용액 중에 세포를 현탁하는 것이 관여된다. 상기 방법은 또한 일반적으로 완전한 용해를 보장하기 위해 또 다른 용해 방법, 예컨대 초음파분쇄를 사용한다. 상기 방법은 포유류 세포 배양에 있어 효과적이다.

삼투압 용해에는 저장성(저염) 용액 중에 세포를 현탁하는 것이 관여된다. 이는 세포가 팽윤하고 궁극적으로 파열하여 추가 사용을 위해 세포의 내용물을 방출하도록 유도한다.

전형적으로, 주제 기술의 시험관내 방법에서, 건조 중량 기준으로, 재조합 폴리펩타이드 대 기질의 중량 비는 약 1:100 내지 약 1:5, 바람직하게는 약 1:50 내지 약 1:10, 보다 바람직하게는 약 1:25 내지 약 1:15이다.

전형적으로, 시험관내 방법의 반응 온도는 약 20℃ 내지 약 40℃, 적합하게는 25℃ 내지 약 37℃, 보다 적합하게는 28℃ 내지 약 32℃이다.

당업자는 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 스테비올 글리코시드 조성물이 요망되는 풍미제 또는 감미제 조성물을 수득하기 위해 추가 정제되고 다른 스테비올 글리코시드, 풍미제 또는 감미제와 혼합될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제조되는 레바우디오시드 D4 레바우디오시드 M이 또는 농축된 조성물은 레바우디오시드 A를 우세한 스테비올 글리코시드로서 함유하는 천연 스테비아(stevia) 추출물과, 또는 요망되는 감미제 조성물을 제조하기 위해 다른 합성 또는 천연 스테비올 글리코시드 제품과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 스테비올 글리코시드 조성물로부터 수득되는 실질적으로 정제된 스테비올 글리코시드(예컨대, 레바우디오시드 D4 또는 레바우디오시드 M)는 다른 감미제, 예컨대 수크로스, 말토덱스트린, 아스파탐, 수크랄로스, 네오탐, 아세설팜 칼륨 및 사카린과 조합될 수 있다. 다른 감미제 대비 스테비올 글리코시드의 양은 당분야에 알려진 바와 같이, 요망되는 맛을 수득하기 위해 조정될 수 있다. 본원에 기재된 스테비올 글리코시드 조성물(레바우디오시드 D, 레바우디오시드 E, 레바우디오시드 D4, 레바우디오시드 M 또는 이의 조합을 포함함)은 식품 제품(예컨대 음료, 소프트 드링크, 아이스크림, 유제품, 과자류, 시리얼, 츄잉 검, 베이킹 제품 등), 식이 보충물질, 의학적 영양분뿐만 아니라 약학 제품에 포함될 수 있다.

동일성 스코어링을 사용하는 서열 유사성 분석

본원에서 사용되는 "서열 동일성"은 2개의 최적 정렬된 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드 서열이 성분, 예컨대, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 정렬 윈도우에 걸쳐 변함없는 정도를 나타낸다. 평가 서열 및 참조 서열의 정렬된 절편에 대한 "동일성 분율"은, 2개의 정렬된 서열이 공유하는 동일한 성분의 수를, 참조 서열 절편에서 성분의 총 수, 즉 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 더 작은 정의된 부분으로 나눈 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율"은 2개 서열이 최적으로 정렬되는 경우(비교 윈도우에 걸쳐 참조 서열의 총 20% 미만인 적절한 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는는 갭을 포함) 평가("대상체") 폴리뉴클레오타이드 분자(또는 그 상보쇄) 대비 참조("쿼리") 폴리뉴클레오타이드 분자(또는 그 상보쇄)의 선형 폴리뉴클레오타이드 서열에서 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 당업자에게 잘 알려져 있고 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘, Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 방법과 같은 도구에 의해, 바람직하게는 이러한 알고리즘의 전산화된 구현, 예컨대 GCG® Wisconsin Package®(Accelrys Inc., Burlington, MA)의 일환으로 이용 가능한 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA에 의해 수행될 수 있다. 평가 서열 및 참조 서열의 정렬된 절편에 대한 "동일성 분율"은, 2개의 정렬된 서열이 공유하는 동일한 성분의 수를, 참조 서열 절편에서 성분의 총 수, 즉 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 더 작은 정의된 부분으로 나눈 것이다. 서열 동일성 백분율은 동일성 분율에 100을 곱한 것으로 나타난다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부 또는 더 긴 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 것일 수 있다. 본 개시의 목적을 위해 "동일성 백분율"은 또한 번역된 뉴클레오타이드 서열에 대해 BLASTX 버전 2.0을 그리고 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정될 수 있다.

서열 동일성 백분율은 바람직하게는 Sequence Analysis Software Package™(버전 10; Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI)의 "Best Fit" 또는 "Gap" 프로그램을 사용하여 결정된다. "Gap"은 매칭 수를 최대화하고 갭 수를 최소화하는 2개 서열의 정렬을 찾기 위해 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(Needleman and Wunsch, JOURAL OF MOLECULAR BIOLOGYournal of Molecular Biology 48:443-453, 1970)을 이용한다. "BestFit"은 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Smith and Waterman, ADVANCES IN APPLIED MATHEMATICS, 2:482-489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Research 11:2205-2220, 1983)을 사용하여 2개 서열 간 최대 유사성 절편의 최적 정렬을 수행하고 매칭 수를 최대화하기 위해 갭을 삽입한다. 동일성 백분율은 가장 바람직하게는 "Best Fit" 프로그램을 사용하여 결정된다.

서열 동일성을 결정하기 유용한 방법은 또한 National Library of Medicine(National Institute of Health, Bethesda, Md. 20894)의 NCBI(National Center Biotechnology Information)에서 공개적으로 이용 가능한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램에 개시되어 있다; 문헌[BLAST Manual, Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. MOL. BIOL. 215:403-410 (1990)]을 참고한다; 버전 2.0 이상의 BLAST 프로그램은 갭(결실 및 삽입)의 정렬 내 도입을 허용한다; 펩타이드 서열에 있어서 BLASTX가 서열 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있으며; 폴리뉴클레오타이드 서열에 있어서 BLASTN이 서열 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "상당한 서열 동일성 백분율"은 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성 또는 훨씬 더 큰 서열 동일성, 예컨대 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성의 서열 동일성 백분율을 나타낸다. 따라서, 본 개시의 하나의 구현예는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성 또는 훨씬 더 큰 서열 동일성, 예컨대 약 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 본 개시의 베타-글루코시다제 유전자의 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자는 다양한 스테비올 글리코시드의 제조를 지시할 수 있고 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열과 상당한 서열 동일성 백분율을 가지며 본 개시의 범위 내에 포괄된다.

동일성 및 유사성

동일성은 서열 정렬(서열 정보 또는 구조 정보 또는 일부 다른 정보만을 사용하여 수행될 수 있지만, 보통 서열 정보에만 기반함) 후 한 쌍의 서열 간에 동일한 아미노산의 분율이며, 유사성은 일부 유사성 매트릭스를 사용하는 정렬에 기반하여 할당되는 스코어이다. 유사성 지수는 하기 BLOSUM62, PAM250 또는 GONNET 또는 단백질의 서열 정렬을 위해 당업자가 사용하는 임의의 매트릭스 중 하나일 수 있다.

동일성은 2개의 하위-서열 간에 대응하는 정도이다(서열 간 갭 없음). 25% 이상은 동일성은 기능의 유사성을 시사하는 반면, 18% 내지 25%는 구조 또는 기능의 유사성을 시사한다. 2개의 완전 무관한 또는 무작위 서열(100개 잔기 초과임)이 20% 초과 동일성을 가질 수 있음을 유념한다. 유사성은 2개 서열이 비교되는 경우 이들 간 닮음의 정도이다. 이는 이의 동일성에 의존한다.

상기 설명으로부터 명백하듯이, 본 개시의 소정 양태는 본원에 예시되는 실시예의 특정 세부사항에 의해 제한되지 않으며, 이에 따라 다른 변형 및 적용 또는 이의 균등부가 당업자에게 생겨날 것임이 고려된다. 따라서 청구범위는 본 개시의 정신 및 범위에서 벗어나지 않는 모든 이러한 변형 및 적용을 커버하려는 것이다.

또한 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 바람직한 방법 및 물질이 상술되어 있지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 평가에서 사용될 수 있다.

상기 발명이 이해의 목적을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 설명되었으나, 당업자에게는 소정 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 설명 및 실시예는 첨부되는 청구범위에 의해 서술되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

본 개시에 따르면, 베타-글루코시다제(“B-glu1”)는 신규한 방식으로 스테비올 글리코시드를 가수분해하고 원치않는 스테비올 글리코시드의 제조를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 스테비아 추출물 또는 발효 제조에서 바람직하지 않은 스테비올 글리코시드의 존재는 스테비올 글리코시드의 전반적 맛 프로필 및 유용성에 영향을 미친다. 제조 단계를 감소시킴으로써, 본 개시는 스테비아 미정제 추출물에서 요망되는 스테비올 글리코시드의 정제 및 제조 비용 둘 모두를 감소시킬 것이다.

본 개시는 하기 비제한적 실시예의 고려 시 보다 완전히 이해될 것이다. 아래의 실시예는 주제 기술의 바람직한 구현예를 시사하지만, 단지 예시로서 주어짐이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이러한 실시예로부터, 당업자는 주제 기술의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 이의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 맞게 주제 기술을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다.

실시예 1: 피치아 파스토리스( Pichia Pastoris)에서 베타-글리코시다제의 확인

본 개시에 따라, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 게놈 분석을 완료하고 몇몇 베타-글리코시다제 후보 유전자를 확인하였다. 모든 후보 베타-글루코시다제 유전자의 전장 DNA 단편을 상업적으로 합성하였다. cDNA의 거의 모든 코돈을 에스케리치아 콜라이에서 선호되는 것들로 변화시켰다(Genscript, NJ). 합성된 DNA를 박테리아 발현 벡터 pETite N-His SUMO Kan 벡터(Lucigen) 내로 클로닝하였다. 이러한 동일한 실험을 이러한 용도를 위해 최적화된 서열로 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)에서 수행할 수 있었다.

각각의 발현 작제물을 에스케리치아 콜라이 BL21(DE3) 내로 형질전환하고, 이후 OD600이 0.8 내지 1.0에 도달할 때까지 37℃에서 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 성장시켰다. 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하고, 배양을 22 hr 동안 16℃에서 추가 성장시켰다. 세포를 원심분리(3,000 × g; 10분; 4℃)에 의해 수확하였다. 세포 펠렛을 수집하고, 즉시 사용하거나 -80℃에서 보관하였다.

전형적으로 세포 펠렛을 용해 완충액(50 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 25 ug/㎖ 라이소자임, 5 ug/㎖ DNase I, 20 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 0.4% Triton X-100) 중에 재현탁하였다. 세포를 4℃ 하에서 초음파 분쇄에 의해 손상시키고 세포 파편을 원심분리(18,000 × g; 30분)에 의해 청정화하였다. 상청액을 평형화된(평형 완충액: 50 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 20 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤) Ni-NTA(Qiagen) 친화도 칼럼에 로딩하였다. 단백질 샘플의 로딩 후, 칼럼을 평형 완충액으로 세척하여 미결합 오염 단백질을 제거하였다. His-태그가 붙은 베타-글루코시다제 재조합 폴리펩타이드를 250 mM 이미다졸을 함유하는 평형 완충액에 의해 용출하였다.

다양한 스테비올 글리코시드를 기질로서 사용함으로써 정제된 후보 베타-글루코시다제 재조합 폴리펩타이드를 탈-글리코실화 활성에 대해 검정하였다. 전형적으로, 재조합 폴리펩타이드(10 ㎍)를 300 ㎕ 시험관내 반응 시스템에서 평가하였다. 반응 시스템은 50 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 1 mg/㎖ 스테비올 글리코시드를 함유한다. 반응을 30℃ 내지 37℃에서 수행하고, 다양한 시점에 200 ㎕ 1-부탄올을 첨가함으로써 50 ㎕ 반응을 종결하였다. 샘플을 200 ㎕ 1-부탄올로 3회 추출하였다. 풀링된 분획을 건조하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위해 100 ㎕ 80% 메탄올 중에 용해시켰다.

피치아(Pichia) 세포를 추출 완충액(50 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2; 150 mM NaCl) 중에 현탁하였다. 초음파분쇄 후, 상청액(미정제 추출물)을 4℃에서 12,000 g로 설정된 원심분리기에 의해 수집하였다. 생성 미정제 단백질(50 ㎍)을 300 ㎕ 시험관내 반응 시스템에서 평가하였다. 반응 시스템은 50 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.2, 1 mg/㎖ 스테비올 글리코시드를 함유한다. 반응을 30℃ 내지 37℃에서 수행하고, 다양한 시점에 200 ㎕ 1-부탄올을 첨가함으로써 50 ㎕ 반응을 종결하였다. 샘플을 200 ㎕ 1-부탄올로 3회 추출하였다. 풀링된 분획을 건조하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위해 100 ㎕ 80% 메탄올 중에 용해시켰다.

이어서 사차 펌프, 온도 제어 칼럼 구획, 자동 샘플수집장치 및 UV 흡광도 검출기를 포함하는 Dionex UPLC ultimate 3000 시스템(Sunnyvale, CA)을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 가드 칼럼을 포함하는 Synergi Hydro-RP 칼럼(Phenomenex)을 풀링된 샘플에서 스테비올 글리코시드의 특성규명을 위해 사용하였다. 수중 아세토니트릴을 HPLC 분석에서 이동상으로 사용하였다. HPLC 분석에서 사용된 검출 파장은 210 nm였다. 활성 스크리닝 후, 본 발명자들은 베타-글루코시다제(B-glu1, SEQ: 1)가 관련된 스테비올 글리코시드를 절단하는 강력한 활성을 가지며 이에 따라 관심 스테비올 글리코시드의 제조에서 유용한 도구임을 확인하였다.

실시예 2: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아( Pichia ) 세포의 사용에 의한 루부소시드의 가수분해

루부소시드를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올-13-글루코시드를 제조할 수 있다. 이후, 제조된 스테비올-13-글루코시드를 가수분해하여 스테비올을 제조할 수 있다(도 1b). 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 루부소시드를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 루부소시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올-13-글루오시드를 제조할 수 있다(도 1a의 c). 제조된 스테비올-13-글루옥시드(S-13-G)는 이후 시점에 스테비올로 전환될 것이다(도 1a의 d). B-glu1은 스테비올-13-글루코시드의 C13 위치로부터 또 다른 글루코실기를 제거한다. B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 루부소시드를 스테비올-13-글루코시드로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 가지며 계속해서 스테비올을 제조한다(도 1a의 e 및 f).

실시예 3: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아( Pichia ) 세포의 사용에 의한 스테비오시드의 가수분해

스테비오시드를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올바이오시드를 제조할 수 있다(도 2b). 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 스테비오시드를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 스테비오시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올바이오시드를 제조할 수 있다(도 2a의 c 및 d). B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 스테비오시드를 스테비올바이오시드로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 갖는다(도 8의 C).

실시예 4: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아( Pichia ) 세포의 사용에 의한 레바우디오시드 E의 가수분해

레바우디오시드 E를 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하여 스테비올바이오시드를 제조할 수 있다(도 3b). 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 레바우디오시드 E를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 레바우디오시드 E의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비오시드 및 스테비올바이오시드를 제조할 수 있다(도 3a의 c 내지 e). B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 레바우디오시드 E를 스테비올바이오시드로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 갖는다(도 8의 D).

실시예 5: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아( Pichia ) 세포의 사용에 의한 레바우디오시드 A의 가수분해

레바우디오시드 A를 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하여 레바우디오시드 B를 제조할 수 있다(도 4b). 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 레바우디오시드 A를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 레바우디오시드 A의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 레바우디오시드 B를 제조할 수 있다(도 4a의 c 내지 d). B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 레바우디오시드 A를 레바우디오시드 B로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 갖는다(도 8의 e).

실시예 6: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포의 사용에 의한 레바우디오시드 I의 가수분해

레바우디오시드 I를 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하여 레바우디오시드 A를 제조할 수 있고, 제조된 A를 가수분해하여 레바우디오시드 B를 제조할 수 있다(도 5b). 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 레바우디오시드 I를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 레바우디오시드 I의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 레바우디오시드 A를 제조한 후, 레바우디오시드 A의 C19 위치로부터 또 다른 글루코실기를 제거하여 레바우디오시드 B를 제조할 수 있다(도 5a의 d 내지 f). 레바우디오시드 I는 24 시간 째에 레바우디오시드 A로 완전 전환될 수 있다(도 5a의 f). B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 레바우디오시드 I를 레바우디오시드 B로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 갖는다(도 8의 f).

실시예 7: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아( Pichia ) 세포의 사용에 의한 레바우디오시드 D의 가수분해

레바우디오시드 D를 재조합 B-glu1 효소에 의해 가수분해하여 레바우디오시드 B(도 6b) 및 Reb A를 제조할 수 있다. 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 레바우디오시드 D를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 레바우디오시드 D의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 레바우디오시드를 제조할 수 있다(도 6a의 c 내지 e). B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 레바우디오시드 D를 레바우디오시드 B로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 갖는다(도 8의 g).

실시예 8: 재조합 B-glu1 및 파괴된 피치아( Pichia ) 세포의 사용에 의한 레바우디오시드 G의 가수분해

레바우디오시드 G를 재조합 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해하여 스테비올-13-글루코시드를 제조할 수 있다. 제조된 스테비올-13-글루코시드를 계속해서 가수분해하여 스테비올을 제조할 수 있다(도 7b). 반응을 실시예 1에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1 g/L 레바우디오시드 G를 기질로서 반응에 첨가하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, B-glu1은 레바우디오시드 G의 C13 및 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올-13-글루오시드를 제조할 수 있다(도 7a의 b 내지 c). 제조된 스테비올-13-글루옥시드(S-13-G)는 스테비올로 전환될 것이다(도 7a). 제조된 스테비올-13-글루코시드는 24 시간 째에 스테비올로 완전 전환될 것이다(도 7a의 d). B-glu1은 스테비올-13-글루코시드의 C13 위치로부터 또 다른 글루코실기를 제거한다. B-glu1은 피치아(Pichia) 세포에서의 세포내 효소이므로, 파괴된 피치아(Pichia) 세포는 B-glu1 효소를 방출하고, 이는 레바우디오시드 G를 스테비올-13-글루코시드로 가수분해하는 것과 동일한 효소 활성을 가지며 계속해서 스테비올을 제조한다(도 7a의 e).

본 개시에 따라, 본 발명자들은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포 용해물 상에서 베타-글루코시다제의 효소 활성을 확인하고 정량화하였다. 상기 효소는 이것이 특정 스테비올 글리코시드를 가수분해할 수 있도록 하는 비활성을 갖는다(표 1). 도 7을 참조하면, Reb G는 B-glu1 효소 및 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해된다. HPLC는 Reb G 가수분해 산물을 나타낸다. 그 시도에서, 스테비올(“S”); 스테비올-13-글루코시드(“S-13-G”); 루부소시드(“Rub”)를 제조하였다. 시간 경과는 24시간에 걸친 일련의 시점이었다. 스테비올-13-글루코시드(“S-13-G”) 및 스테비올을 재조합 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 배양에 의해 제조하였다.

상기 기법을 사용하여, 본 발명자들은 정제 효능을 증가시키기 위해 Reb M을 가수분해하여 Reb A, Reb D3, Reb D4, Reb W, Reb V, Reb E, Reb I 및 Reb D를 제거하였다(도 9). 상기 기법에는 베타-글루코시다제 생체전환을 통해 스테비올, 스테비올-13-O-글루코시드, 스테비올바이오시드 및 Reb B를 제조하기 위한 스테비오시드 및 Reb A의 사용이 관여된다. 도 8을 참조하여, 스테비올 글리코시드를 파괴된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포에 의해 가수분해하였다. 샘플에는 스테비올바이오시드(“SB”) 및 레바우디오시드 B(“B”) 표준물질이 포함되었다. 본 발명자들의 실험에서, 스테비오시드는 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해되었고; Reb E 및 Reb A는 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해되었다. 마찬가지로, Reb I 및 Reb D는 24시간째에 파괴된 피치아(Pichia) 세포에 의해 가수분해되었다(도 8).

본 개시의 또 다른 구현예에서, 본 발명자들은 스테비올 글리코시드 제조 경로를 제어하기 위해 베타-글루코시다제를 사용할 수 있다. (Ex: Reb W로부터의 Reb M)(도 10).

본 개시의 바람직한 구현예에 따르면, Reb V, Reb W, Reb Z1, Reb Z2, Reb D3 및 Reb D4를 포함하는 추가 스테비올 글리코시드를 가수분해하여 이들을 관심 스테비올 글리코시드로 유도하기 위해 베타-글루코시다제를 사용할 수 있다(도 9). 이후, 본 발명자들은 가수분해된 산물을 분리하고, 수집하고, 농축할 수 있다. 본 개시의 또 다른 구현예에서, 본 발명자들은 베타-글루코시다제 결핍 균주를 사용하며, 이는 본 발명의 생체전환 공정에서 부생산을 감소시킬 것이다.

산업적 적용 가능성/기술 분야의 진술

본 개시는 식품, 사료, 음료 및 약리 산업에서 적용 가능성을 갖는다. 본 개시는 일반적으로 베타 글루코시다제의 가수분해를 통한 스테비올 글리코시드 생합성 방법에 관한 것이다.

참고문헌으로 인용되고 포함되는 문헌 :

관심 서열:

서열:

B-glu1:

B-glu1 아미노산: (SEQ ID NO: 1) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

B-glu1 DNA: (SEQ ID NO: 2)(에스케리치아 콜라이에 대해 최적화된 코돈)

B-glu2 아미노산: (SEQ ID NO: 3) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

B-glu2 DNA (SEQ ID NO: 4) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

B-glu3 아미노산 (SEQ ID NO: 5) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

B-glu3 DNA (SEQ ID NO: 6) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

B-glu4 아미노산 (SEQ ID NO: 7) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

B-glu4 DNA (SEQ ID NO: 8) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 서열(GS115)

SEQUENCE LISTING <110> Conagen Inc. <120> HYDROLYSIS OF STEVIOL GLYCOSIDES BY BETA-GLUCOSIDASE <130> C1497.70026WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/527,482 <151> 2017-06-30 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 839 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 1 Met Thr Gln Leu Asp Val Glu Ser Leu Ile Gln Glu Leu Thr Leu Asn 1 5 10 15 Glu Lys Val Gln Leu Leu Ser Gly Ser Asp Phe Trp His Thr Thr Pro 20 25 30 Val Arg Arg Leu Gly Ile Pro Lys Met Arg Leu Ser Asp Gly Pro Asn 35 40 45 Gly Val Arg Gly Thr Lys Phe Phe Asn Gly Val Pro Thr Ala Cys Phe 50 55 60 Pro Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ala Thr Phe Asp Lys Glu Leu Leu Lys 65 70 75 80 Glu Ala Gly Ser Leu Met Ala Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser 85 90 95 Val Val Leu Gly Pro Thr Ala Asn Ile Ala Arg Gly Pro Asn Gly Gly 100 105 110 Arg Gly Phe Glu Ser Phe Gly Glu Asp Pro Val Val Asn Gly Leu Ser 115 120 125 Ser Ala Ala Met Ile Asn Gly Leu Gln Gly Lys Tyr Ile Ala Ala Thr 130 135 140 Met Lys His Tyr Val Cys Asn Asp Leu Glu Met Asp Arg Asn Cys Ile 145 150 155 160 Asp Ala Gln Val Ser His Arg Ala Leu Arg Glu Val Tyr Leu Leu Pro 165 170 175 Phe Gln Ile Ala Val Arg Asp Ala Asn Pro Arg Ala Ile Met Thr Ala 180 185 190 Tyr Asn Lys Ala Asn Gly Glu His Val Ser Gln Ser Lys Phe Leu Leu 195 200 205 Asp Glu Val Leu Arg Lys Glu Trp Gly Trp Asp Gly Leu Leu Met Ser 210 215 220 Asp Trp Phe Gly Val Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ile Thr Asn Gly Leu 225 230 235 240 Asp Leu Glu Met Pro Gly Pro Pro Gln Cys Arg Val His Ser Ala Thr 245 250 255 Asp His Ala Ile Asn Ser Gly Glu Ile His Ile Asn Asp Val Asp Glu 260 265 270 Arg Val Arg Ser Leu Leu Ser Leu Ile Asn Tyr Cys His Gln Ser Gly 275 280 285 Val Thr Glu Glu Asp Pro Glu Thr Ser Asp Asn Asn Thr Pro Glu Thr 290 295 300 Ile Glu Lys Leu Arg Lys Ile Ser Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Lys 305 310 315 320 Asp Asp Asp Arg Asn Arg Ser Ile Leu Pro Leu Lys Lys Ser Asp Lys 325 330 335 Ile Ala Val Ile Gly Asn Asn Ala Lys Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Gly 340 345 350 Gly Ser Ala Ser Val Leu Ser Tyr 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Asn Asp Lys Val Val Leu Cys Ile 565 570 575 Gly Leu Asn Gln Asp Phe Glu Ser Glu Gly Phe Asp Arg Pro Asp Ile 580 585 590 Lys Ile Pro Gly Ala Thr Asn Lys Met Val Ser Ala Val Leu Lys Ala 595 600 605 Asn Pro Asn Thr Val Ile Val Asn Gln Thr Gly Thr Pro Val Glu Met 610 615 620 Pro Trp Ala Ser Asp Ala Pro Val Ile Leu Gln Ala Trp Phe Gly Gly 625 630 635 640 Ser Glu Ala Gly Thr Ala Ile Ala Asp Val Leu Phe Gly Asp Tyr Asn 645 650 655 Pro Ser Gly Lys Leu Thr Val Thr Phe Pro Leu Arg Phe Glu Asp Asn 660 665 670 Pro Ala Tyr Leu Asn Phe Gln Ser Asn Lys Gln Ala Cys Trp Tyr Gly 675 680 685 Glu Asp Val Tyr Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr Glu Thr Ile Asp Arg Pro 690 695 700 Val Leu Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser Phe Thr Glu Phe Asp Phe 705 710 715 720 Thr Asp Met Phe Val Arg Leu Glu Glu Glu Asn Leu Glu Val Glu Val 725 730 735 Val Val Arg Asn Thr Gly Lys Tyr Asp Gly Ala Glu Val Val Gln Leu 740 745 750 Tyr Val Ala Pro Val Ser Pro Ser Leu Lys Arg Pro Ile Lys Glu Leu 755 760 765 Lys Glu Tyr Ala Lys Ile Phe Leu Ala Ser Gly Glu Ala Lys Thr Val 770 775 780 His Leu Ser Val Pro Ile Lys Tyr Ala Thr Ser Phe Phe Asp Glu Tyr 785 790 795 800 Gln Lys Lys Trp Cys Ser Glu Lys Gly Glu Tyr Thr Ile Leu Leu Gly 805 810 815 Ser Ser Ser Ala Asp Ile Lys Val Ser Gln Ser Ile Thr Leu Glu Lys 820 825 830 Thr Thr Phe Trp Lys Gly Leu 835 <210> 2 <211> 2520 <212> DNA <213> Artificial Seq <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 atgacccaac tggatgtgga gagcctgatt caagagctga ccctgaacga aaaggtgcaa 60 ctgctgagcg gtagcgactt ctggcatacc accccggttc gtcgtctggg catcccgaag 120 atgcgtctga gcgacggtcc gaacggcgtt cgtggtacca aattctttaa cggtgttccg 180 accgcgtgct tcccgtgcgg taccggtctg ggcgcgacct ttgacaagga actgctgaaa 240 gaggcgggta gcctgatggc ggatgaagcg aaagcgaaag cggcgagcgt ggttctgggt 300 ccgaccgcga acattgcgcg tggtccgaac ggtggccgtg gcttcgagag cttcggcgag 360 gacccggtgg ttaacggtct gagcagcgcg gcgatgatca acggcctgca gggcaagtac 420 attgcggcga ccatgaaaca ctatgtttgc aacgatctgg aaatggaccg taactgcatt 480 gacgcgcaag ttagccaccg tgcgctgcgt gaggtgtacc tgctgccgtt ccaaatcgcg 540 gtgcgtgatg cgaacccgcg tgcgattatg accgcgtata acaaggcgaa cggcgaacac 600 gttagccaga gcaaattcct gctggacgaa gtgctgcgta aggagtgggg ctgggatggt 660 ctgctgatga gcgactggtt tggtgtttac gatgcgaaaa gcagcatcac caacggcctg 720 gacctggaga tgccgggtcc gccgcagtgc cgtgtgcaca gcgcgaccga tcacgcgatc 780 aacagcggcg aaatccacat taacgatgtt gacgagcgtg tgcgtagcct gctgagcctg 840 attaactact gccaccaaag cggtgttacc gaggaagatc cggaaaccag cgacaacaac 900 accccggaaa ccatcgagaa gctgcgtaaa atcagccgtg agagcattgt gctgctgaag 960 gacgatgacc gtaaccgtag cattctgccg ctgaagaaaa gcgacaaaat cgcggttatt 1020 ggtaacaacg cgaaacaagc ggcgtattgc ggtggcggta gcgcgagcgt gctgagctat 1080 cacaccacca ccccgttcga cagcatcaag agccgtctgg aagatagcaa caccccggcg 1140 tacaccattg gtgcggacgc gtataaaaac ctgccgccgc tgggtccgca aatgaccgat 1200 agcgacggca agccgggttt tgatgcgaaa ttctttgttg gcagcccgac cagcaaggat 1260 cgtaaactga tcgaccactt ccagctgacc aacagccaag tttttctggt ggactactat 1320 aacgaacaga tcccggaaaa caaggagttc tacgttgacg 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Gly Cys Thr Val Thr Val 325 330 335 Thr Ser Gly Ser Ala Lys Leu Val Phe Tyr 340 345 <210> 4 <211> 1041 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 4 atgaaaagcc agctgatctt tatggctttg gcctcccttg tagcaagtgc accgctggaa 60 caccagcagc agcatcataa acatgagaaa cgcgccgtag ttacgcagac agtaactgtt 120 gcggcgggcc agacagcagc agcgggttcc gcccaggcag ttgttacctc aagcgcggcg 180 ccagcatccg ttgcttcaag tgcggccgcg tctgctagct catcttcttc cagctatacc 240 tctggcgctt caggcgatct tagtagtttc aaagatggta ctattaaatg ttcagaattc 300 ccatcagggg atggcgtggt gtccgtctct tggttaggct tcggcggctg gtctagtatt 360 atgaatctgc agggtggtac ttcagagagt tgtgagaacg gctattattg ttcatatgca 420 tgtgaagccg gttatagcaa aacacagtgg ccatctaacc agccgtcaga tgggagatca 480 gtgggagggt tgctgtgtaa agatggcctg ttatatcgct ccaatacagc gttcgataca 540 ttatgtgtgc ctggaaaagg tacagcatcc gtggagaata atgtgtctaa aggtatttcc 600 atttgtagaa cggattatcc ggggtctgaa aacatgtgcg tcccgacgtg ggtcgatgcc 660 ggtaactcaa acaccttgac agtggtagat gaagataatt attatgaatg gcagggcctt 720 aaaactagtg 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Thr 115 120 125 Ser Ser Asn Asn Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser Thr Thr Arg Ser Val 130 135 140 Val Thr Ser Val Val Val Val Gly Pro Asp Gly Ser Pro Ile Glu Asn 145 150 155 160 Thr Gly Gln Thr Ala Asn Pro Thr Thr Thr Ala Pro Thr Thr Ser Thr 165 170 175 Thr Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Pro Thr Ala Ser 180 185 190 Ser Thr Pro Gly Gly Asn His Pro Arg Ser Ile Val Tyr Ser Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Ser Ser Gln Cys Lys Asp Ala Thr Thr Ile Glu Thr Asp Leu 210 215 220 Glu Phe Ile Ala Ser Lys Gly Ile Ser Ala Val Arg Ile Tyr Gly Asn 225 230 235 240 Asp Cys Asn Tyr Leu Thr Val Val Leu Pro Lys Cys Ala Ser Leu Gly 245 250 255 Leu Lys Val Asn Gln Gly Phe Trp Ile Gly Pro Ser Gly Val Asp Ser 260 265 270 Ile Asp Asp Ala Val Gln Glu Phe Ile Gln Ala Val Asn Gly Asn Asn 275 280 285 Gly Phe Asn Trp Asp Leu Phe Glu Leu Ile Thr Val Gly Asn Glu Ala 290 295 300 Ile Ser Ala Gly Tyr Val Ser Ala Ser Ser Leu Ile Ser Lys Ile Lys 305 310 315 320 Glu Val Ser Ser Ile Leu Ser Ser Ala Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Thr 325 330 335 Thr Ala Glu Pro Pro Asn Val Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Leu Cys Ser 340 345 350 Thr Asp Val Met Ser Ile Val Gly Val Asn Ala His Ser Tyr Phe Asn 355 360 365 Thr Leu Phe Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Phe Val Lys Ser Gln Ile 370 375 380 Glu Val Val Gln Lys Ala Cys Ser Arg Ser Asp Ile Thr Ile Ile Glu 385 390 395 400 Thr Gly Tyr Pro Ser Gln Gly Ala Thr Asn Gly Lys Asn Val Pro Ser 405 410 415 Lys Glu Asn Gln Lys Thr Ala Ile Phe Ser Ile Phe Glu Val Val Gly 420 425 430 Thr Asp Val Thr Ile Leu Ser Thr Tyr Asp Asp Leu Trp Lys Asp Pro 435 440 445 Gly Pro Tyr Gly Ile Glu Gln Phe Phe Gly Ala Ile Asp Leu Phe Ser 450 455 460 <210> 8 <211> 1395 <212> DNA <213> Pichia pastoris <400> 8 atgctgtcca caattctgaa tatttttatt cttctgttat tcatccaggc gtctcttcag 60 gcgcctattc cggtggtgac caaatatgtg accgaaggta ttgccgttgt gactgaaacc 120 aatgtgcggg ttgttactaa aaccattccg attgtgcagg tgctgatctc cgatggtgca 180 acctatactc ataccctgac gacagtgtca acggcggaag aaaatggcaa cttccagcct 240 attaccacga catctattgt caacaaagaa 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Claims (37)

1. 하기 단계를 포함하는, 스테비올 글리코시드의 글리코실화를 변경하는 방법:
   a) 제1 기질을 제조하도록 변형된 재조합 미생물, 조류 또는 식물 세포를 제공하는 단계;
   b) 상기 재조합 미생물, 조류 또는 식물 세포를 파괴하여 그 세포의 시토졸을 방출하는 단계로서, 이러한 시토졸이 상기 제1 기질을 함유하는, 단계;
   c) 상기 재조합 미생물, 조류 또는 식물 세포로부터 시토졸을 수득하는 단계;
   d) 상기 시토졸을 베타-글루코시다제에 노출하는 단계로서, 이러한 베타-글루코시다제는 상기 제1 기질로부터 적어도 하나의 글루코실기를 제거하는 것을 통해 관심 제2 기질을 생성하기 충분한 시간 동안 가수분해 활성을 갖는, 단계; 및
   e) 상기 관심 제2 기질을 수집하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 기질이 스테비올 글리코시드인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 상기 스테비올 글리코시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 하는, 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 상기 스테비올 글리코시드의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 하는, 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 상기 스테비올 글리코시드의 C19 위치 또는 상기 스테비올 글리코시드의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 하는, 방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 상기 스테비올 글리코시드의 C19 위치 및 상기 기질의 C13 위치 둘 모두로부터 글루코실기를 제거하는 기능을 하는, 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 루부소시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올-13-글루오시드를 제조하는 기능을 하는, 방법.
8. 제3항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 스테비오시드의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올바이오시드를 제조하는 기능을 하는, 방법.
9. 제3항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 Reb E의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올바이오시드를 제조하는 기능을 하는, 방법.
10. 제3항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 Reb I의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 Reb A를 제조하는 기능을 하는, 방법.
11. 제3항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 Reb A의 C19 위치로부터 글루코실기를 제거하여 Reb B를 제조하는 기능을 하는, 방법.
12. 제4항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 스테비올-13-글루오시드의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올을 제조하는 기능을 하는, 방법.
13. 제4항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 Reb D의 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하여 Reb B 또는 Reb A를 제조하는 기능을 하는, 방법.
14. 제5항에 있어서, 상기 가수분해 활성이 Reb G의 C19 위치 및 C13 위치로부터 글루코실기를 제거하여 스테비올-13-글루코시드를 제조하는 기능을 하는, 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 관심 제2 기질이 Reb M인, 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 관심 제2 기질이 Reb B인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 관심 제2 기질이 Reb A인, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 효소적 가수분해의 속도를 증가시키기 위해 베타-갈락토시다제 또는 펙티나제 효소를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    스테비올 글리코시드를 형질전환된 세포계에서 발현하는 단계;
    세포계를 배지에서 성장시키는 단계; 및
    상기 관심 제2 기질을 제조하는 단계.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간이 적어도 6시간인, 방법.
21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간이 적어도 12시간인, 방법.
22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간이 적어도 18시간인, 방법.
23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기질에 대한 베타-글루코시다제 노출을 위한 상기 기간이 적어도 24시간인, 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 관심 제2 기질이 스테비올 글리코시드인, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-글루코시다제가 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 방법.
26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-글루코시다제가 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물, 조류 또는 식물 세포가 박테리아, 효모, 필라멘트성 진균, 시아노박테리아 조류 및 식물 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 미생물이 에스케리치아(Escherichia); 살모넬라(Salmonella); 바실러스(Bacillus); 아시네토박터(Acinetobacter); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 코리네박테리움(Corynebacterium); 메틸로사이누스(Methylosinus); 메틸로모나스(Methylomonas); 로도코쿠스(Rhodococcus); 슈도모나스(Pseudomonas); 로도박터(Rhodobacter); 시네코시스티스(Synechocystis); 사카로마이세스(Saccharomyces); 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces); 칸디다(Candida); 한세눌라(Hansenula); 데바리오마이세스(Debaryomyces); 무코르(Mucor); 피치아(Pichia); 토룰롭시스(Torulopsis); 아스페르길러스(Aspergillus); 아르트로보틀리스(Arthrobotlys); 브레비박테리아(Brevibacteria); 마이크로박테리움(Microbacterium); 아르트로박터(Arthrobacter); 시트로박터(Citrobacter); 에스케리치아(Escherichia); 야로위아(Yarrowia); 클렙시엘라(Klebsiella); 판토에아(Pantoea); 살모넬라 코리네박테리움(Salmonella Corynebacterium); 클로스트리듐(Clostridium); 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
29. 제1항에 있어서, 관심 제2 기질이 Reb E인, 방법.
30. 제1항에 있어서, 상기 제2 기질이 Reb E, Reb D4 및 Reb M의 혼합물인, 방법.
31. 제1항에 있어서, 관심 제2 기질이 Reb D4인, 방법.
32. 제1항에 있어서, 상기 관심 제2 기질이 스테비올 글리코시드 혼합물이며 조합된 상기 혼합물의 스테비올 글리코시드 함량이 건조물 기준으로 시토졸 유래 농축물의 임의의 다른 성분의 중량보다 큰, 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)에서 관심 제2 기질이 미정제 산물이며, 단계 e)가 i) 상기 미정제 산물을 정제하는 단계; 및 ii) 진공 하에 용매를 제거하여 농축 산물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 미정제 산물이 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되는, 방법.
35. 제33항에 있어서, 상기 미정제 산물이 산-염기 추출에 의해 정제되는, 방법.
36. 제33항에 있어서, 상기 미정제 산물이 진공 증류에 의해 정제되는, 방법.
37. 제33항에 있어서, 반-분취용 HPLC를 사용하여 농축 산물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

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