BR112019027992A2 - hidrólise de glicosídeos de esteviol pela beta-glicosidase - Google Patents

Abstract

A presente divulgação proporciona um método para produzir quantidades aumentadas de rebaudiosídeo M (Reb M) a partir de vários glicosídeos de esteviol utilizando a atividade hidrolítica da beta-glicosidase. Mais especificamente, a presente divulgação proporciona um processo melhorado para produzir glicosídeos de esteviol desejados a partir de células recombinantes rompidas (por exemplo, células microbianas recombinantes) contendo substratos de interesse. Este é o local onde tais células (por exemplo, micróbios) foram modificadas para transportar genes capazes de gerar glicosídeos de esteviol de interesse, incluindo rebaudiosídeo A (Reb A), rebaudiosídeo E (Reb E) e/ou esteviosídeo. Nesta modalidade, o processo compreende as etapas de obter o material de células rompidas (por exemplo, células microbianas) e realizar a hidrólise enzimática nos esteviosídeos presentes no referido produto residual para aumentar a produção de Reb M. Além disso, são proporcionadas composições de glicosídeo de esteviol produzidas pelos métodos aqui descritos.

Description

HIDRÓLISE DE GLICOSÍDEOS DE ESTEVIOL PELA BETA-GLICOSIDASE REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade, ao abrigo de 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 62/527,482, depositado em 30 de junho de 2017, cujos conteúdos são incorporados aqui na sua totalidade por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] O campo da invenção se relaciona com métodos e processos que tornam a produção de glicosídeos de esteviol desejáveis mais eficiente e menos dispendiosa. Mais especificamente, a presente divulgação se relaciona com o uso de hidrólise pela beta-glicosidase para dirigir a produção de glicosídeos de esteviol de interesse via bioconversão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A presente divulgação é focada na conversão de substratos identificados em glicosídeos de esteviol de interesse. Em particular, a presente divulgação se relaciona, em parte, com a produção mais eficiente de rebaudiosídeo M ("Reb M") através do uso de beta-glicosidase ("B-GLU1") para hidrolisar substratos específicos presentes em células recombinantes rompidas, tais como células microbianas recombinantes.

[004] Os glicosídeos de esteviol são produtos naturais isolados de folhas de Stevia rebaudiana e são amplamente usados como edulcorantes de alta intensidade e baixa caloria em comida, ração e bebidas. Glicosídeos de esteviol de ocorrência natural têm a mesma base estrutural de diterpeno (esteviol), mas diferem no número e na estrutura de modificações de resíduos de carboidrato (por exemplo, resíduos de glicose, ramnose e xilose) nas posições C13 e C19 da estrutura principal de esteviol. Os glicosídeos de esteviol com estruturas conhecidas incluem esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M e dulcosídeo A. Em termos de utilização comercial, o próprio rebaudiosídeo M tem sido geralmente considerado seguro (status 'GRAS') mas é extremamente difícil de obter de processos de extração e requer modificações microbianas significativas para produzir apenas através da bioconversão microbiana.

[005] Com base no peso seco, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo C e dulcosídeo A são responsáveis por 9,1, 3,8, 0,6 e 0,30 por cento do peso total dos glicosídeos de esteviol nas folhas de Stevia do tipo selvagem, respectivamente, enquanto os outros glicosídeos de esteviol, como Reb M, estão presentes em quantidades significativamente menores. É conhecido o uso de células microbianas recombinantes para produzir glicosídeos de esteviol de interesse, no entanto, dada a gama de atividade bioquímica de enzimas específicas pode ocorrer que uma variedade de glicosídeos de esteviol possa ser produzida dessa cepa microbiana. Nestas situações, as células rompidas destas cepas podem conter quantidades elevadas de esteviosídeo (no. CAS 57817-89-7), rebaudiosídeo A (no. CAS 58543-16-1) ou outros glicosídeos de esteviol onde Reb M é o produto desejado. As quantidades destes compostos variam entre cerca de 10-20% para esteviosídeo e cerca de 5-10% para o rebaudiosídeo A, com outros constituintes menores estando presentes na mistura.

[006] Como edulcorantes naturais, diferentes glicosídeos de esteviol têm diferentes graus de doçura, "sensação na boca" e sabores residuais específicos associados a cada espécie de rebaudiosídeo testada. Em relação ao açúcar de mesa (ou seja, "sacarose"), a doçura dos glicosídeos de esteviol é significativamente maior. Por exemplo, o esteviosídeo é 100-150 vezes mais doce do que a sacarose, mas tem um sabor residual amargo depois - como observado em testes de sabor, enquanto rebaudiosídeos A e E são 250-450 vezes mais doces do que a sacarose tendo sabor residual muito melhor do que esteviosídeo, no entanto, um sabor residual perceptível ainda está presente. Desse modo, os perfis gustativos de quaisquer extratos de stevia são profundamente afetados pelo teor relativo dos glicosídeos de esteviol no extrato, que por sua vez podem ser afetados pelas condições ambientais experimentadas pelas plantas subjacentes e pelo processo de extração usado. Estas variações na produção de plantas, condições climáticas e condições de extração podem levar a composições inconsistentes dos glicosídeos de esteviol nos extratos de stevia, de tal forma que o perfil de sabor varia fortemente entre diferentes lotes de produtos de extração. O perfil de sabor dos extratos de stevia também pode ser afetado por contaminantes derivados de plantas ou derivados do ambiente (como pigmentos, lipídeos, proteínas, fenólicos e sacarídeos) que permanecem no produto após o processo de extração. Estes contaminantes têm tipicamente os seus próprios sabores desagradáveis indesejados para o uso do extrato de stevia como edulcorante em produtos de consumo.

[007] Além disso, o custo de isolar combinações individuais ou específicas de glicosídeos de esteviol que não são abundantes em extratos de stevia é proibitivo em termos de custo e recursos. A produção não biológica de glicosídeos de esteviol a partir de esteviosídeo e Reb A é difícil. A hidrólise ácida do esteviosídeo é problemática porque sob condições ácidas o esteviol produzido é rearranjado em isosteviol. Dado que há uma qualidade e disponibilidade limitada de alguns glicosídeos de esteviol específicos, a oferta comercial pode ser melhor abordada por bioconversão, onde enzimas naturais ou micróbios específicos podem ser modificados para transportar as enzimas necessárias e usar processos de fermentação comercialmente significativos para aumentar especificamente a produção de glicosídeos de interesse. Por exemplo, a bioconversão de esteviosídeo em Reb E foi relatada anteriormente (ver, Mao et al., Publicação de Pedido de Patente dos EUA Número US2016/0207954, “A Non-Caloric Sweetener”) via uma via de fermentação com micróbios modificados. Alternativamente, outros meios sintéticos não biológicos podem ser usados para desenvolver glicosídeos de esteviol de interesse.

[008] A partir de uma perspectiva biológica, todos os glicosídeos de esteviol são formados por uma série de reações de glicosilação de esteviol, que tipicamente são catalisadas por enzimas UDP-glicosiltransferase (UGT) usando uridina 5'-difosfoglicose (UDP-glicose) como um doador da porção de açúcar. Nas plantas, as UGTs são um grupo muito diferente de enzimas que transferem um resíduo de glicose da UDP-glicose para o esteviol. Nestas reações, o esteviosídeo é frequentemente um intermediário na biossíntese de vários compostos rebaudiosídeos. Por exemplo, a glicosilação de esteviosídeo no C-3' na C-13-O-glicose de esteviosídeo produz rebaudiosídeo A; enquanto a glicosilação no C-2' na posição de 19-0-glicose do esteviosídeo produz rebaudiosídeo E.

[009] De acordo com a presente divulgação, uma abordagem prática para melhorar a qualidade do sabor dos extratos de estévia é aumentar o rendimento dos compostos de rebaudiosídeo que têm características de sabor mais desejáveis em geral e tornar esta via uma via sintética e processos associados mais produtivos. Desses glicosídeos de esteviol testados, muitos acreditam que Reb M tem o sabor e características químicas mais desejáveis para uso em alimentos e bebidas. Como afirmado acima, no entanto, a planta tem quantidades extremamente pequenas deste composto presentes em suas folhas e, portanto, são necessários processos alternativos para permitir e auxiliar na produção em larga escala deste glicosídeo, bem como para proporcionar edulcorantes alternativos para a indústria alimentar e de bebidas.

[0010] Dessa forma, existe uma necessidade de glicosídeos de esteviol com perfis de sabor melhores e mais consistentes para serem desenvolvidos como produtos comerciais e para tais glicosídeos de esteviol utilizarem um substrato de partida relativamente comum, tal como glicosídeos de esteviol mais abundantes como molécula de partida, de modo que tal produção de glicosídeos desejáveis possa ser comercialmente tão rentável quanto possível. A presente divulgação proporciona um método para aumentar a produção dos glicosídeos de esteviol desejados.

[0011] Novos métodos de produção também são necessários para reduzir os custos da produção de glicosídeos de esteviol e diminuir o impacto ambiental do cultivo e processamento em larga escala (Yao et al., 1994). Uma dessas potenciais soluções é o uso da tecnologia de fermentação de bioconversão que permite a produção em certas espécies microbianas ou outras células recombinantes que aumenta a seletividade, abundância e pureza dos glicosídeos de esteviol disponíveis para a comercialização e aumenta a presença de um rebaudiosídeo desejado usando uma enzima hidrolítica para dirigir essa produção em lisado celular a partir de culturas microbianas modificadas ou outras culturas celulares modificadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] A presente divulgação abrange, em parte, um método para produzir quantidades aumentadas de rebaudiosídeo M (Reb M) a partir de vários glicosídeos de esteviol, utilizando a atividade hidrolítica da beta-glicosidase. Mais especificamente, a presente invenção proporciona um processo melhorado para produzir glicosídeos de esteviol desejados a partir de células recombinantes rompidas (por exemplo, células microbianas recombinantes) contendo substratos de interesse. Este é o local onde tais células (por exemplo,

micróbios) foram modificadas para transportar genes capazes de gerar glicosídeos de esteviol de interesse, incluindo rebaudiosídeo A (Reb A), rebaudiosídeo E (Reb E) e/ou esteviosídeo. Nesta modalidade, o processo compreende as etapas de obter o material de células rompidas (por exemplo, células microbianas) e realizar a hidrólise enzimática nos esteviosídeos presentes no referido produto residual para aumentar a produção de Reb M.

[0013] Em termos de produto/utilidade comercial, existem várias dezenas de produtos contendo glicosídeos de esteviol no mercado nos Estados Unidos e podem ser usados em tudo, desde analgésicos a repelentes de pragas, bem como em alimentos e como suplementos dietéticos. Os produtos contendo glicosídeos de esteviol de interesse podem incluir aerossóis, líquidos ou formulações granulares.

[0014] Quanto ao sistema celular da presente divulgação, ele é selecionado do grupo que consiste em bactérias, leveduras e uma sua combinação, ou qualquer sistema celular que permita a transformação genética com os genes selecionados e, posteriormente, a produção biossintética dos glicosídeos de esteviol desejados a partir de esteviol. Em um sistema microbiano mais preferencial, E. coli são usadas para produzir os compostos glicosídeos de esteviol desejados mais tarde expostos a hidrólise por beta- glicosidase.

[0015] As beta-glicosidases são enzimas constitutivas frequentemente presentes nos tratos gastrointestinais inferiores dos animais e são úteis como auxiliares na digestão e absorção de material alimentar. De acordo com a presente divulgação, B-glu1 é usada para hidrolisar esteviosídeo, rebaudiosídeo E (Reb E), rebaudiosídeo A (Reb A), rebaudiosídeo I (Reb I), rebaudiosídeo D (Reb D), rebaudiosídeo G (Reb G) e rubusosídeo. A hidrólise procede via formação inicial de esteviolbiosídeo com esteviol como o produto final da hidrólise.

[0016] Consequentemente, aspectos da divulgação proporcionam métodos para alterar a glicosilação de um glicosídeo de esteviol compreendendo a) proporcionar uma célula recombinante (por exemplo, um micróbio, alga ou célula vegetal) modificada para produzir um primeiro substrato; b) romper a referida célula recombinante para liberar o seu citosol celular, em que tal citosol contém o referido primeiro substrato; c) obter o citosol da referida célula recombinante; d) expor o referido citosol a uma beta- glicosidase em que tal beta-glicosidase possui atividade hidrolítica durante tempo suficiente para gerar um segundo substrato de interesse através da remoção de pelo menos um grupo glicosil do referido primeiro substrato; e, e) recolher o referido segundo substrato de interesse.

[0017] Em algumas modalidades, o referido primeiro substrato é um glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, o referido segundo substrato de interesse é Reb M. Em algumas modalidades, o referido segundo substrato de interesse é Reb B. Em algumas modalidades, o referido segundo substrato de interesse é Reb A. Em algumas modalidades, o primeiro e segundo substrato são os descritos na Tabela 1 ou em uma Figura no presente documento (por exemplo, FIG. 9).

[0018] Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do referido glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C13 do referido glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do referido glicosídeo de esteviol ou da posição C13 do referido glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do referido glicosídeo de esteviol e da posição C13 do referido substrato.

[0019] Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do rubusosídeo para produzir esteviol-13- gliosídeo. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do esteviosídeo para produzir esteviolbiosídeo. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do Reb E para produzir esteviolbiosídeo. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do Reb I para produzir Reb A. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do Reb A para produzir Reb B.

[0020] Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C13 do esteviol-13-gliosídeo para produzir esteviol. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C13 do Reb D para produzir Reb B ou Reb A. Em algumas modalidades, a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 e da posição C13 do Reb G para produzir esteviol-13-glicosídeo.

[0021] Os métodos aqui proporcionados, em alguns aspectos, compreendem adicionalmente o uso de enzimas beta- galactosidase ou pectinase para aumentar a velocidade da hidrólise enzimática. Em algumas modalidades, os métodos aqui proporcionados compreendem adicionalmente a expressão de um glicosídeo de esteviol em um sistema celular transformado; crescimento do sistema celular em um meio; e, produção do referido segundo substrato de interesse.

[0022] Em algumas modalidades, o referido período de tempo para a exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é de, pelo menos, 6 horas.

[0023] Em algumas modalidades, o referido período de tempo para a exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é de, pelo menos, 12 horas. Em algumas modalidades, o referido período de tempo para a exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é de, pelo menos, 18 horas. Em algumas modalidades, o referido período de tempo para a exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é de, pelo menos, 24 horas. Em algumas modalidades, o referido segundo substrato de interesse é um glicosídeo de esteviol.

[0024] Em algumas modalidades, a beta-glicosidase tem uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 90% (por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) de identidade com a SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a beta-glicosidase tem uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 95% (por exemplo, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO:3.

[0025] Em algumas modalidades, a célula recombinante é selecionada do grupo consistindo em: uma bactéria, uma levedura, um fungo filamentoso, uma alga cianobactéria e uma célula vegetal. Em algumas modalidades, a célula recombinante (por exemplo, micróbio) é selecionada do grupo consistindo em: Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Yarrowia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium; e Clostridium acetobutylicum.

[0026] Em algumas modalidades, o referido segundo substrato de interesse é um glicosídeo de esteviol. Em algumas modalidades, o segundo substrato de interesse é Reb E. Em algumas modalidades, o referido segundo substrato é uma mistura de Reb E, Reb D4 e Reb M. Em algumas modalidades, o segundo substrato de interesse é Reb D4. Em algumas modalidades, o referido segundo substrato de interesse é uma mistura de glicosídeo de esteviol e o teor de glicosídeo de esteviol desta mistura combinada é maior do que quaisquer outros componentes do concentrado derivado de citosol por peso em uma base seca.

[0027] Em algumas modalidades, o segundo substrato de interesse na etapa e) é um produto em bruto e a etapa e) compreende adicionalmente i) purificar o referido produto em bruto; e, ii) remover solventes sob vácuo para proporcionar um produto concentrado.

[0028] Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por extração ácido-base. Em algumas modalidades, o referido produto em bruto é purificado por destilação sob vácuo.

[0029] Os métodos aqui proporcionados, em algumas modalidades, compreendem adicionalmente a purificação do produto concentrado usando uma HPLC semi-preparativa.

[0030] Embora a divulgação seja susceptível a várias modificações e formas alternativas, modalidades específicas são mostradas a título de exemplo nos desenhos e serão aqui descritas em detalhe. Deve ser entendido, no entanto, que os desenhos e descrição detalhada aqui apresentados não pretendem limitar a divulgação a modalidades particulares divulgadas, mas, pelo contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas que se enquadram na essência e âmbito da presente divulgação como definido pelas reivindicações anexas.

[0031] Outras características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes na seguinte descrição detalhada de modalidades preferidas da presente invenção, tomadas com referência aos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] FIG. 1 mostra que o rubusosídeo é hidrolisado pela enzima B-glu1 e pelas células de Pichia rompidas. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de rubusosídeo. a: padrão de esteviol ("S"); b: padrão de rubusosídeo ("Rub"); c-d: O rubusosídeo foi clivado pela enzima B-glu1 recombinante em 1 hora (c) e 3 horas (d); e-f: O rubusosídeo foi hidrolisado por células de Pichia rompidas em 1 hora (e) e 6 horas (f). B: Via da hidrólise de rubusosídeo catalisada por B-glu1. O rubusosídeo foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas para produzir esteviol-13-glucosídeo ("S-13-G") e esteviol.

[0033] FIG. 2 mostra que o esteviosídeo é hidrolisado pela enzima B-glu1. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de esteviosídeo. a: padrão de esteviosídeo ("ST"); b: padrão de esteviolbiosídeo ("SB"); c-e: O esteviosídeo foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante em 1 hora (c), 6 horas (d) e 24 horas (e). B: Via da hidrólise de esteviosídeo catalisada por B-glu1. O esteviosídeo é hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de pichia rompidas para produzir esteviolbiosídeo.

[0034] FIG. 3 mostra que o rebaudiosídeo E é hidrolisado pela enzima B-glu1. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de rebaudiosídeo E. a: padrão de esteviolbiosídeo ("SB"); b: padrão de rebaudiosídeo E ("E"); c-e: O rebaudiosídeo E foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante em 1 hora (c), 6 horas (d) e 24 horas (e). B: Via da hidrólise de rebaudiosídeo E catalisada por B-glu1. O rebaudiosídeo E é hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de pichia rompidas para produzir esteviolbiosídeo.

[0035] FIG. 4 mostra que o rebaudiosídeo A é hidrolisado pela enzima B-glu1. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de rebaudiosídeo A. a: padrão de rebaudiosídeo A ("Reb A"); b: padrão de rebaudiosídeo B ("Reb B"); c-d: O rebaudiosídeo A foi hidrolisado pela enzima B- glu1 recombinante em 1 hora (c) e 6 horas (d). B: Via da hidrólise de rebaudiosídeo A catalisada por B-glu1. O rebaudiosídeo A é hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de pichia rompidas para produzir Rebaudiosídeo B.

[0036] FIG. 5 mostra que o rebaudiosídeo I é hidrolisado pela enzima B-glu1. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de rebaudiosídeo I. a: padrão de rebaudiosídeo A ("Reb A"); b: padrão de rebaudiosídeo B ("Reb B"); c: padrão de rebaudiosídeo I ("Reb I"); d-f: O rebaudiosídeo I foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante em 1 hora (d), 6 horas (e) e 24 horas (f). B: Via da hidrólise de rebaudiosídeo I catalisada por B-glu1. O rebaudiosídeo I é hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante para produzir rebaudiosídeo A e rebaudiosídeo B.

[0037] FIG. 6 mostra que o rebaudiosídeo D é hidrolisado pela enzima B-glu1. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de rebaudiosídeo D. a: padrão de rebaudiosídeo B ("Reb B"); b: padrão de rebaudiosídeo D ("Reb D"); c-e: O rebaudiosídeo D foi hidrolisado pela enzima B- glu1 recombinante em 1 hora (c), 6 horas (d) e 24 horas (e). B: Via da hidrólise de rebaudiosídeo D catalisada por B- glu1. O rebaudiosídeo D é hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante para produzir rebaudiosídeo A e rebaudiosídeo B.

[0038] FIG. 7 mostra que o rebaudiosídeo G é hidrolisado pela enzima B-glu1 e pelas células de pichia rompidas. A: Perfis de HPLC dos produtos da hidrólise de rebaudiosídeo G. a: padrão de esteviol ("Esteviol"), esteviol-13-glicosídeo ("S-13-G"); b: padrão de rebaudiosídeo G ("G"); b-d: O rebaudiosídeo G foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante em 0,5 horas (c), 1 hora (d) e 6 horas (e); f: O rebaudiosídeo G foi hidrolisado por células de pichia rompidas em 24 horas (f). B: Via da hidrólise de rebaudiosídeo G catalisada por B-glu1. O rebaudiosídeo G foi hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de pichia rompidas para produzir esteviol-13-glucosídeo ("S-13-G") e esteviol.

[0039] FIG. 8 mostra que os glicosídeos de esteviol são hidrolisados por células de pichia rompidas. a: padrão de esteviolbiosídeo ("SB"); b: padrão de rebaudiosídeo B ("B"); c: O esteviosídeo foi hidrolisado por células de pichia rompidas em 24 horas; d: O rebaudiosídeo E ("E") foi hidrolisado por células de pichia rompidas em 24 horas; e: O rebaudiosídeo A ("A") foi hidrolisado por células de pichia rompidas em 24 horas; f: O rebaudiosídeo I ("I") foi hidrolisado por células de pichia rompidas em 24 horas; g:

O rebaudiosídeo D ("D") foi hidrolisado por células de pichia rompidas em 24 horas.

[0040] FIG. 9 mostra que B-Glu1 pode hidrolisar diferentes substratos de glicosídeo de esteviol. Linha a preto: glicosilação; Linha a tracejado: hidrólise.

[0041] FIG. 10 mostra uma via sintética para produzir Reb M e Reb WB2.

DESCRIÇÃO DETALHADA Explicação dos Termos Aqui Usados:

[0042] Os glicosídeos de esteviol são uma classe de compostos químicos responsáveis pelo sabor doce das folhas da planta sul-americana Stevia rebaudiana (Asteraceae) e podem ser usados como edulcorantes em alimentos, rações e bebidas. Definições:

[0043] Sistema celular é qualquer célula que fornece a expressão de proteínas ectópicas. Este inclui bactérias, leveduras, células vegetais e células animais. Este inclui células procarióticas e eucarióticas. Este inclui também a expressão in vitro de proteínas baseadas em componentes celulares, como os ribossomos.

[0044] Sequência codificante é para ser dado o seu significado normal e habitual para um perito na técnica, e é usado, sem limitação, para se referir a uma sequência de DNA que codifica para uma sequência de aminoácidos específica.

[0045] Crescer o Sistema Celular. O crescimento inclui proporcionar um meio adequado que permita que as células se multipliquem e se dividam. Também inclui proporcionar recursos para que células ou componentes celulares possam traduzir e produzir proteínas recombinantes.

[0046] Expressão de Proteína. A produção de proteínas pode ocorrer após a expressão de genes. Consiste nas etapas após o DNA ter sido transcrito para o RNA mensageiro (mRNA). O mRNA é então traduzido em cadeia de polipeptídeos, que são finalmente dobradas em proteínas. O DNA está presente nas células por meio da transfecção - um processo de introdução deliberada de ácidos nucléicos nas células. O termo é frequentemente usado para métodos não virais em células eucarióticas. Pode também se referir a outros métodos e tipos de células, embora outros termos sejam preferidos: "transformação" é mais frequentemente usada para descrever a transferência de DNA não viral em bactérias, células eucarióticas não animais, incluindo células vegetais. Nas células animais, a transfecção é o termo preferido, uma vez que transformação é também usada para referir a progressão para um estado canceroso (carcinogênese) nestas células. A transdução é frequentemente usada para descrever a transferência de DNA mediada por vírus. Transformação, transdução e infecção viral estão incluídas na definição de transfecção para este pedido.

[0047] Levedura. De acordo com a presente divulgação, uma levedura como aqui reivindicada são microrganismos eucarióticos unicelulares classificados como membros do reino dos fungos. Leveduras são organismos unicelulares que evoluíram de ancestrais multicelulares, mas com algumas espécies úteis para a presente divulgação sendo aquelas que têm a capacidade de desenvolver características multicelulares pela formação de cadeias de células gemuladas conectadas conhecidas como pseudo-hifas ou hifas falsas.

[0048] Os nomes das enzimas UGT usados na presente divulgação para a produção de vários glicosídeos de esteviol são consistentes com o sistema de nomenclatura adotado pelo Comitê de Nomenclatura de UGT (Mackenzie et al., "The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence," PHARMACOGENETICS, 1997, vol. 7, pp. 255-269), que classifica os genes UGT pela combinação de um número para a família, uma letra indicando uma subfamília e um número para um gene individual. Por exemplo, o nome "UGT76Gl" se refere a uma enzima UGT codificada por um gene pertencente à família UGT número 76 (que é de origem vegetal), subfamília G e número de gene l. Termos Estruturais:

[0049] Como usado no presente documento, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o conteúdo dite claramente o contrário.

[0050] Na medida em que o termo "incluir", "ter" ou semelhante é usado na descrição ou nas reivindicações, tal termo pretende ser inclusivo de uma maneira semelhante ao termo "compreende" como "compreende" é interpretado quando empregue como uma palavra de transição em uma reivindicação.

[0051] A palavra "exemplificativo" é usada aqui para significar "servir como um exemplo, exemplo ou ilustrativo". Qualquer modalidade aqui descrita como "exemplificativa" não é necessariamente para ser interpretada como preferida ou vantajosa em relação a outras modalidades.

[0052] Ao termo "complementar" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado sem limitação para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar entre si. Por exemplo, com respeito ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Da mesma forma, a tecnologia em questão também inclui fragmentos de ácido nucleico isolados que são complementares às sequências completas como relatado na Listagem de Sequências anexa, bem como às sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes.

[0053] Aos termos "ácido nucleico" e "nucleotídeo" devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referirem a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros quer na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos de ocorrência natural que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular também engloba implicitamente variantes modificadas ou degeneradas de forma conservativa (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada.

[0054] Ao termo "isolado" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e quando usado no contexto de um ácido nucleico isolado ou de um polipeptídeo isolado, é usado sem limitação para se referir a um ácido nucleico ou polipeptídeo que, pela mão do homem, existe separado do seu ambiente nativo e, portanto, não é um produto da natureza. Um ácido nucleico ou polipeptídeo isolado pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira transgênica.

[0055] Os termos "incubar" e "incubação" como aqui usados significam um processo de mistura de duas ou mais entidades químicas ou biológicas (tal como um composto químico e uma enzima) e permitindo estas interagir em condições favoráveis para produzir uma composição de glicosídeo de esteviol.

[0056] O termo "variante degenerada" se refere a uma sequência de ácido nucleico possuindo uma sequência de resíduos que difere de uma sequência de ácido nucleico de referência por uma ou mais substituições de códons degenerados. Substituições de códons degenerados podem ser conseguidas gerando-se sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxi-inosina. Uma sequência de ácido nucleico e todas as suas variantes degeneradas irão expressar o mesmo aminoácido ou polipeptídeo.

[0057] Aos termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica; os três termos são por vezes usados indistintamente e são usados sem limitação para se referirem a um polímero de aminoácidos, ou análogos de aminoácidos, independentemente do seu tamanho ou função. Embora "proteína" seja frequentemente usado em referência a polipeptídeos relativamente grandes, e "peptídeo" seja frequentemente usado em referência a polipeptídeos pequenos, a utilização destes termos na técnica se sobrepõe e varia. O termo "polipeptídeo", tal como aqui usado, se refere a peptídeos, polipeptídeos e proteínas, salvo indicação em contrário. Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são aqui indistintamente usados quando se refere a um produto polinucleotídeo. Assim, polipeptídeos exemplificativos incluem produtos de polinucleotídeos, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes e análogos dos anteriormente mencionados.

[0058] Os termos "fragmento de polipeptídeo" e "fragmento", quando usados em referência a um polipeptídeo de referência, são para ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referir a um polipeptídeo em que os resíduos de aminoácidos são eliminados em comparação com o próprio polipeptídeo de referência, mas onde a sequência de aminoácidos restante é normalmente idêntica às posições correspondentes no polipeptídeo de referência. Tais deleções podem ocorrer no terminal amino ou no terminal carboxi do polipeptídeo de referência, ou alternativamente em ambos.

[0059] O termo "fragmento funcional" de um polipeptídeo ou proteína se refere a um fragmento de peptídeo que é uma porção do polipeptídeo ou proteína completa, e tem substancialmente a mesma atividade biológica, ou desempenha substancialmente a mesma função que o polipeptídeo ou proteína completa (por exemplo, realizando a mesma reação enzimática).

[0060] Os termos "polipeptídeo variante", "sequência de aminoácidos modificada" ou "polipeptídeo modificado", que são usados indistintamente, se referem a uma sequência de aminoácidos que é diferente do polipeptídeo de referência por um ou mais aminoácidos, por exemplo, por uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos. Em um aspecto, uma variante é uma "variante funcional" que retém alguma ou toda a capacidade do polipeptídeo de referência.

[0061] O termo "variante funcional" inclui ainda variantes conservativamente substituídas. O termo "variante conservativamente substituída" se refere a um peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos que difere de um peptídeo de referência por uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas, e mantém alguma ou toda a atividade do peptídeo de referência. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é uma substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo funcionalmente semelhante. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro; a substituição de um resíduo carregado ou polar (hidrofílico)

por outro tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre treonina e serina; a substituição de um resíduo básico tal como lisina ou arginina por outro; ou a substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro; ou a substituição de um resíduo aromático, tal como fenilalanina, tirosina ou triptofano por outro. É esperado que tais substituições tenham pouco ou nenhum efeito no peso molecular aparente ou ponto isoelétrico da proteína ou polipeptídeo. A frase "variante conservativamente substituída" também inclui peptídeos em que um resíduo é substituído por um resíduo quimicamente derivado, desde que o peptídeo resultante mantenha alguma ou toda a atividade do peptídeo de referência como aqui descrito.

[0062] O termo "variante", em conexão com os polipeptídeos da tecnologia em questão, inclui ainda um polipeptídeo funcionalmente ativo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, e mesmo 100% idêntico à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência.

[0063] O termo "homólogo" em todas as suas formas gramaticais e variações de grafia se refere à relação entre polinucleotídeos ou polipeptídeos que possuem uma "origem evolutiva comum", incluindo polinucleotídeos ou polipeptídeos de superfamílias e polinucleotídeos ou proteínas homólogas de diferentes espécies (Reeck et al., CELL 50:667, 1987). Tais polinucleotídeos ou polipeptídeos têm homologia de sequência, tal como refletido pela sua similaridade de sequência, seja em termos de percentagem de identidade ou da presença de aminoácidos ou motivos específicos em posições conservadas. Por exemplo, dois polipeptídeos homólogos podem ter sequências de aminoácidos que são pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 900, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% e mesmo 100% idênticas.

[0064] Às "sequências reguladoras adequadas" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado, sem limitação, para se referir a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências 5' não codificantes), dentro ou a jusante (sequências 3' não codificantes) de uma sequência codificante, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou a tradução da sequência codificante associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, íntrons e sequências de reconhecimento de poliadenilação.

[0065] "Promotor" é para ser dado o seu significado normal e habitual para um perito na técnica, e é usado sem limitação para se referir a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificante está localizada 3' em relação a uma sequência promotora. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles peritos na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes etapas de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores, que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células na maioria das vezes, são comumente referidos como "promotores constitutivos". É adicionalmente reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos as fronteiras exatas de sequências reguladoras não foram completamente definidas, os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.

[0066] O termo "operacionalmente ligado" se refere à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando tem capacidade de afetar a expressão daquela sequência codificante (ou seja, que a sequência codificante está sob o controle de transcrição do promotor). As sequências codificantes podem ser operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[0067] Ao termo "expressão", tal como aqui usado, deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e é usado, sem limitação para se referir à transcrição e acumulação estável de RNA senso (mRNA) ou antissenso derivado do fragmento de ácido nucleico da tecnologia em questão. "Sobreexpressão" se refere à produção de um produto de um gene em organismos transgênicos ou recombinantes que excede os níveis de produção em organismos normais ou não transformados.

[0068] A "transformação" deve ser dado o seu significado ordinário e habitual de um perito na técnica, e é usado, sem limitação, para se referir à transferência de um polinucleotídeo para uma célula alvo. O polinucleotídeo transferido pode ser incorporado no genoma ou DNA cromossômico de uma célula alvo, resultando em herança geneticamente estável, ou pode-se replicar independentemente do cromossomo do hospedeiro. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados como "transgênicos" ou

[0069] Aos termos "transformado", "transgênico" e "recombinante", quando aqui usados em ligação com células hospedeiras, são para ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referir a uma célula de um organismo hospedeiro, tal como uma célula de planta ou microbiana, na qual foi introduzida uma molécula de ácido nucleico heterólogo. A molécula de ácido nucleico pode ser estavelmente integrada no genoma da célula hospedeira ou a molécula de ácido nucleico pode estar presente como uma molécula extracromossômica. Uma tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. Células, tecidos ou sujeitos transformados são entendidos como englobando não só o produto final de um processo de transformação, mas também a sua progênie transgênica.

[0070] Aos termos "recombinante", "heterólogo" e "exógeno", quando aqui usados em ligação com polinucleotídeos, devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referirem a um polinucleotídeo (por exemplo, uma sequência de DNA ou um gene) que se origina de uma fonte estranha à célula hospedeira particular ou, se da mesma fonte, é modificada a partir da sua forma original. Assim, um gene heterólogo em uma célula hospedeira inclui um gene que é endógeno à célula hospedeira particular, mas foi modificado através, por exemplo, do uso de mutagênese dirigida ao sítio ou outras técnicas recombinantes. Os termos também incluem cópias múltiplas de ocorrência não natural de uma sequência de DNA de ocorrência natural. Assim, os termos se referem a um segmento de DNA que é estranho ou heterólogo à célula, ou homólogo à célula, mas em uma posição ou forma dentro da célula hospedeira na qual o elemento não é normalmente encontrado.

[0071] De um modo semelhante, os termos "recombinante", "heterólogo" e "exógeno", quando aqui usados em ligação com um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos, significam um polipeptídeo ou sequência de aminoácidos que se origina a partir de uma fonte estranha à célula hospedeira particular ou, se da mesma fonte, é modificada da sua forma original. Assim, os segmentos de DNA recombinante podem ser expressos em uma célula hospedeira para produzir um polipeptídeo recombinante.

[0072] Aos termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" devem ser dados os seus significados ordinários e habituais de uma pessoa de habilidade comum na técnica, e são usados sem limitação para se referir a um elemento extra cromossômico frequentemente transportando genes que não fazem parte do metabolismo central da célula, e geralmente na forma de moléculas de DNA de fita dupla circulares. Tais elementos podem ser sequências autonomamente replicantes, sequências integrantes do genoma, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, nas quais um número de sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em um construto único que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado em conjunto com sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula.

[0073] "Cassete de transformação" se refere a um vetor específico que contém um gene estranho e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica.

[0074] "Cassete de expressão" se refere a um vetor específico que contém um gene estranho e que tem elementos adicionalmente ao gene estranho que permitem a expressão melhorada daquele gene em um hospedeiro estranho.

[0075] A presente divulgação se relaciona com a produção de um glicosídeo de esteviol de interesse pela enzima B-glu1. Biologia Sintética

[0076] As técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padrão usadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NI, 1989 (daqui em diante "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W. EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.I., 1984; e por Ausubel, F. M. et al., EM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, publicado por GREENE PUBLISHING E WILEY-INTERSCIENCE, 1987; (a totalidade de cada uma das quais é aqui incorporada por referência).

[0077] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aquele com habilidade comum na técnica à qual a divulgação pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os materiais e métodos preferidos são descritos abaixo.

[0078] A glicosilação é frequentemente considerada uma reação ubíqua que controla a bioatividade e o armazenamento de produtos naturais de plantas. A glicosilação de moléculas pequenas é catalisada por uma superfamília de transferases na maioria das espécies de plantas que foram estudadas até à data. Estas glicosiltransferases (GTs) foram classificadas em mais de 60 famílias. Destas, as enzimas da família da GT, também conhecidas como as UDP-glicosiltransferases (UGTs), transferem frações de açúcar ativadas por UDP para moléculas aceitadoras específicas. Estas são as moléculas que transferem essas frações de açúcar nos glicosídeos de esteviol para criar vários rebaudiosídeos. Cada uma destas UGTs tem seu próprio perfil de atividade e localizações na estrutura preferidas onde transferem as suas frações de açúcar ativadas. Sistemas de Produção

[0079] A expressão de proteínas em procariotos é mais frequentemente realizada em uma célula hospedeira bacteriana com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão de proteínas quer de fusão ou de não fusão. Os vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos a uma proteína aí codificada, normalmente ao terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente três finalidades: l) para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante ao atuar como um ligando na purificação por afinidade. Frequentemente, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e da proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais vetores estão dentro do escopo da presente divulgação.

[0080] Em uma modalidade, o vetor de expressão inclui os elementos genéticos para a expressão do polipeptídeo recombinante em células bacterianas. Os elementos para transcrição e tradução na célula bacteriana podem incluir um promotor, uma região codificante para o complexo de proteína e um terminador transcricional.

[0081] Um perito na técnica estará ciente das técnicas de biologia molecular disponíveis para a preparação de vetores de expressão. O polinucleotídeo usado para incorporação no vetor de expressão da tecnologia em questão, tal como descrito acima, pode ser preparado por técnicas de rotina, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0082] Várias técnicas de biologia molecular foram desenvolvidas para ligar operacionalmente o DNA a vetores via terminais coesivos complementares. Em uma modalidade, podem ser adicionados tratos homopoliméricos complementares à molécula de ácido nucleico a ser inserida no vetor de DNA. O vetor e a molécula de ácido nucleico são então ligados por ligação de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.

[0083] Em uma modalidade alternativa, ligantes sintéticos proporcionados contendo um ou mais locais de restrição são usados para ligar operacionalmente o polinucleotídeo da tecnologia em questão ao vetor de expressão. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é gerado por digestão com endonucleases de restrição. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é tratada com polimerase de DNA de bacteriófago T4 ou polimerase de DNA I de E. coli, enzimas que removem saliências, terminal de fita simples 3' com as suas atividades exonucleolíticas 3'-5', e preenchem o recuo dos terminais 3' com as suas atividades de polimerização, gerando assim segmentos de DNA de extremidades cegas. Os segmentos de extremidades cegas são então incubados com um grande excesso molar de moléculas ligantes na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de DNA de extremidades cegas, tal como ligase de DNA de bacteriófago T4. Assim, o produto da reação é um polinucleotídeo que transporta sequências ligantes poliméricas nas suas extremidades. Estes polinucleotídeos são então clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vetor de expressão que foi clivado com uma enzima que produz terminais compatíveis com os do polinucleotídeo.

[0084] Alternativamente, pode ser usado um vetor possuindo sítios de clonagem independentes de ligação (LIC). O polinucleotídeo necessário amplificado por PCR pode então ser clonado no vetor LIC sem digestão de restrição ou ligação (Aslanidis e de Jong, NUCL. ACID. RES. 18 6069-74, (1990), Haun, et al, BIOTECHNIQUES 13, 515-18 (1992), que é incorporada aqui por referência na medida em que é consistente com esta).

[0085] Em uma modalidade, de modo a isolar e/ou modificar o polinucleotídeo de interesse para inserção no plasmídeo escolhido, é adequado usar PCR. Os iniciadores apropriados para uso na preparação de PCR da sequência podem ser concebidos para isolar a região codificante necessária da molécula de ácido nucleico, adicionar endonuclease de restrição ou sítios LIC, colocar a região codificante na grelha de leitura desejada.

[0086] Em uma modalidade, um polinucleotídeo a ser incorporado em um vetor de expressão da tecnologia em questão é preparado através do uso de PCR usando iniciadores oligonucleotídeos apropriados. A região codificante é amplificada, enquanto os próprios iniciadores são incorporados no produto da sequência amplificada. Em uma modalidade, os iniciadores da amplificação contêm sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição, que permitem que o produto da sequência amplificada seja clonado em um vetor apropriado.

[0087] Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras recombinantes (por exemplo, células hospedeiras vegetais ou microbianas) por técnicas convencionais de transformação ou transfecção. A transformação de células apropriadas com um vetor de expressão da tecnologia em questão é realizada por métodos conhecidos na técnica e tipicamente depende tanto do tipo de vetor como da célula. As técnicas adequadas incluem co- precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, quimoporação ou eletroporação.

[0088] As células transformadas com sucesso, isto é, as células que contêm o vetor de expressão, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as células transfectadas com um vetor de expressão da tecnologia em questão podem ser cultivadas para produzir polipeptídeos aqui descritos. As células podem ser examinadas para determinar a presença do DNA do vetor de expressão por meio de técnicas bem conhecidas na técnica.

[0089] As células hospedeiras podem conter uma única cópia do vetor de expressão descrito anteriormente ou, alternativamente, múltiplas cópias do vetor de expressão,

[0090] Em algumas modalidades, a célula transformada é uma célula animal, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de alga, uma célula de fungo ou uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de planta selecionada do grupo que consiste em: célula de planta de canola, uma célula de planta de colza, uma célula de planta de palma, uma célula de planta de girassol, uma célula de planta de algodão, uma célula de planta de milho, uma célula de planta de amendoim, uma célula de planta de linho, uma célula de planta de gergelim, uma célula de planta de soja e uma célula de planta de petúnia.

[0091] Sistemas de expressão de células hospedeiras microbianas e outras células hospedeiras e vetores de expressão contendo sequências reguladoras que dirigem a expressão de alto nível de proteínas estranhas são bem conhecidos dos peritos na técnica. Qualquer um destes pode ser usado para construir vetores para a expressão do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão em uma célula hospedeira microbiana. Estes vetores podem então ser introduzidos em microrganismos apropriados via transformação para permitir a expressão de alto nível do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão.

[0092] Vetores ou cassetes úteis para a transformação de células hospedeiras microbianas e outras células hospedeiras adequadas são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou cassete contêm sequências que direcionam a transcrição e tradução do polinucleotídeo relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados compreendem uma região 5' do polinucleotídeo que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. É preferido que ambas as regiões de controle sejam derivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada, embora deva ser entendido que tais regiões de controle não precisam de ser derivadas dos genes nativos das espécies específicas escolhidas como hospedeiro.

[0093] Regiões ou promotores de controle da iniciação, que são úteis para conduzir a expressão do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira microbiana ou outras células hospedeiras desejadas, são numerosos e familiares aos peritos na técnica. Praticamente qualquer promotor capaz de dirigir estes genes é adequado para a tecnologia em questão, incluindo, mas não limitado a CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOXI (útil para expressão em Pichia); e lac, trp, JPL, IPR, T7, tac, e trc (útil para expressão em Escherichia coli).

[0094] As regiões de controle da terminação também podem ser derivadas de vários genes nativos aos hospedeiros microbianos. Pode ser incluído opcionalmente um local de terminação para os hospedeiros microbianos aqui descritos.

[0095] Em células de plantas, os vetores de expressão da tecnologia em questão podem incluir uma região codificante operacionalmente ligada a promotores capazes de dirigir a expressão do polipeptídeo recombinante da tecnologia em questão nos tecidos desejados no estágio de desenvolvimento desejado. Por razões de conveniência, os polinucleotídeos a serem expressos podem compreender sequências de promotor e sequências líder de tradução derivadas do mesmo polinucleotídeo. As sequências não codificantes 3' que codificam sinais de terminação da transcrição também devem estar presentes. Os vetores de expressão podem também compreender um ou mais íntrons de modo a facilitar a expressão de polinucleotídeos.

[0096] Para células hospedeiras de planta, qualquer combinação de qualquer promotor e qualquer terminador capaz de induzir a expressão de uma região codificante pode ser usada nas sequências do vetor da tecnologia em questão. Alguns exemplos adequados de promotores e terminadores incluem os genes da nopalina sintase (nos), octopina sintetase (ocs) e vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Um tipo de promotor de planta eficiente que pode ser usado é um promotor de plantas de alto nível. Tais promotores, em ligação operacional com um vetor de expressão da tecnologia em questão, devem ser capazes de promover a expressão do vetor. Promotores de plantas de alto nível que podem ser usados na tecnologia em questão incluem o promotor da subunidade pequena (ss) da ribulose-l,5-bifosfato carboxilase, por exemplo, de soja (Berry-Lowe et al., J. MOLECULAR AND APP. GEN., 1:483 498 (1982), cuja totalidade é aqui incorporada na medida em que é consistente com esta) e o promotor da proteína de ligação à clorofila alb. Estes dois promotores são conhecidos por serem induzidos pela luz em células de plantas (ver, por exemplo, GENETIC ENGINEERING OF PLANTS, AN AGRICULTURAL PERSPECTIVE, A. Cashmore, Plenum, N.I. (1983), páginas 29-38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological CHEMISTRY, 258: 1399 (1983), e Dunsmuir, P. et al., JOURNAL OF MOLECULAR AND APPLIED GENETICS, 2:285 (1983), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na medida em que são consistentes com esta). Técnicas de Disrupção Celular

[0097] Disrupção celular é uma coleção de técnicas usadas para liberar biomoléculas de interesse do interior da célula. Muitos compostos produzidos biotecnologicamente são intracelulares e devem ser liberados das células antes da recuperação. A recuperação eficiente dos produtos requer a disrupção das células, o que pode ser conseguido usando diferentes métodos e tecnologias, métodos mecânicos ou não mecânicos, dependendo da biomolécula de interesse e do sistema celular usado. De notar que todos os métodos de disrupção irão liberar moléculas de interesse, aqui glicosídeos de esteviol, e outras moléculas que podem causar a quebra de proteínas de interesse dentro do lisado. Considerações devem ser feitas para evitar isto se a atividade da proteína é importante para o trabalho a jusante. A lise de amostras em soluções altamente desnaturantes ou pH elevado minimiza a atividade enzimática. Realizar a disrupção no gelo ou a temperaturas mais baixas também ajudará a minimizar a degradação das amostras. Assim, uma técnica para inibir a atividade da protease é ter um coquetel de inibidores da fosfatase geral disponível para o lisado uma vez rompido. Técnicas de Disrupção Conhecidas que podem ser Usadas de Acordo com a Presente Divulgação

[0098] A disrupção padrão consiste em homogeneização mecânica, prensa francesa, sonicação, homogeneização com esferas, moagem, lise com congelamento-descongelamento, lise com detergente, lise enzimática e lise osmótica.

[0099] A homogeneização mecânica inclui o uso de um dispositivo manual, como um homogeneizador Dounce, ou algo como um liquidificador para homogeneizar o tecido. Este método é útil para material de planta diferente de semente ou tecidos moles (isto é, tecido hepático).

[00100] A prensa francesa usa força de cisalhamento para homogeneizar o tecido. Um exemplo disso seria tomar uma suspensão de células e forçá-la através de uma seringa de calibre reduzido usando um tambor de seringa e êmbolo. Isso funciona bem com bactérias, leveduras, fungos, algas e cultura de células de mamíferos, mas é difícil de ampliar.

[00101] A sonicação usa rajadas curtas de ondas ultrassônicas para romper o tecido. Este método gera muito calor e normalmente terá que ser realizado em gelo para manter a proteína. Este método também é eficaz para bactérias, leveduras, fungos, algas e cultura de células de mamíferos e é o método preferido para a divulgação corrente.

[00102] A homogeneização com esferas envolve o uso de esferas de vidro ou de metal para aplicar abrasão suave enquanto usando um vórtice nestas com a suspensão de tecido ou célula. A moagem envolve o uso de um almofariz e pilão para homogeneizar a amostra de tecido. O método mais comum é congelar e moer a amostra usando nitrogênio líquido. A lise com congelamento-descongelamento é mais ou menos o que parece, usando nitrogênio líquido ou um congelador para congelar as células e então permitir que elas descongelem. Quando as células são congeladas, a água dentro das células se expande à medida que congela, fazendo com que as células rebentem. Este método é eficaz para células de mamíferos.

[00103] A lise enzimática consiste em suspender as células em tampões isosmóticos contendo enzimas que podem digerir a parede celular (isto é, Zimoliase para células de levedura). Este método de lise é frequentemente usado em conjunto com outra técnica de disrupção (geralmente sonicação) para garantir a lise completa da amostra. Esta técnica é eficaz com bactérias, leveduras, fungos, algas, material de planta diferente de semente e cultura de células de mamíferos e é uma técnica que também é incorporada na presente divulgação.

[00104] A lise com detergente envolve a suspensão das células em uma solução detergente para solubilizar a membrana celular, liberando o conteúdo da célula. Este método também usa geralmente outro método de lise, como a sonicação para garantir a lise completa. Este método é eficaz com cultura de células de mamíferos.

[00105] A lise osmótica envolve a suspensão de células em solução hipotônica (baixo teor de sal). Isso faz com que as células inchem e eventualmente rebentem, liberando o conteúdo das células para uso posterior.

[00106] Tipicamente, no método in vitro da tecnologia em questão, a razão em peso do polipeptídeo recombinante para o substrato, em uma base de peso seco, é de cerca de 1:100 a cerca de 1:5, preferencialmente de cerca de 1:50 a cerca de 1:10, mais preferencialmente de cerca de 1:25 a cerca de 1:15.

[00107] Tipicamente, a temperatura da reação do método in vitro é de cerca de 20 °C a cerca de 40 °C, adequadamente de 25 °C a cerca de 37 °C, mais adequadamente de 28 °C a cerca de 32 °C.

[00108] Um perito na técnica reconhecerá que a composição de glicosídeo de esteviol produzida pelo método aqui descrito pode ser purificada adicionalmente e misturada com outros glicosídeos de esteviol, aromatizantes ou edulcorantes, para obter um sabor desejado ou composição edulcorante. Por exemplo, uma composição enriquecida com rebaudiosídeo D4 ou rebaudiosídeo M produzida como aqui descrita pode ser misturada com um extrato natural de estévia contendo rebaudiosídeo A como o glicosídeo de esteviol predominante, ou com outros produtos de glicosídeo de esteviol sintéticos ou naturais para fazer uma composição edulcorante desejada. Alternativamente, um glicosídeo de esteviol substancialmente purificado (por exemplo, rebaudiosídeo D4 ou rebaudiosídeo M) obtido da composição de glicosídeo de esteviol aqui descrita pode ser combinado com outros edulcorantes, tais como sacarose, maltodextrina, aspartamo, sucralose, neotamo, acesulfame de potássio e sacarina. A quantidade de glicosídeo de esteviol em relação a outros edulcorantes pode ser ajustada para se obter um sabor desejado, como é conhecido na técnica. A composição de glicosídeo de esteviol aqui descrita (incluindo rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo D4, rebaudiosídeo M ou uma sua combinação) pode ser incluída em produtos alimentares (tais como bebidas, refrigerantes, gelados, produtos lácteos, produtos de confeitaria, cereais, gomas de mascar, produtos assados, etc.), suplementos dietéticos, nutrição médica, bem como produtos farmacêuticos. Análise da Similaridade de Sequências Usando o Escore de Identidade

[00109] Como usada aqui, "identidade de sequências" se refere à extensão à qual duas sequências de polinucleotídeos ou peptídeos otimamente alinhadas são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos. Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, a sequência de referência inteira ou uma parte definida menor da sequência de referência.

[00110] Como usado aqui, o termo "percentagem de identidade de sequência" ou "percentagem de identidade" se refere à percentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência de polinucleotídeos linear de uma molécula de polinucleotídeos de referência ("consulta") (ou sua fita complementar) em comparação com uma molécula de polinucleotídeo de teste ("objeto") (ou sua fita complementar) quando as duas sequências estão otimamente alinhadas (com inserções, deleções, ou espaços apropriados totalizando menos do que 20 por cento da sequência de referência ao longo da janela de comparação). O alinhamento ótimo de sequências para alinhamento em uma janela de comparação é bem conhecido daqueles peritos na técnica e pode ser conduzido por ferramentas tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, o método de procura por similaridade de Pearson e Lipman e preferencialmente por implementações computadorizadas destes algoritmos tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA disponíveis como parte do GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Burlington, MA). Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, a sequência de referência inteira ou uma parte definida mais pequena da sequência de referência. A percentagem de identidade de sequência é representada como a fração de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais sequências de polinucleotídeos pode ser com uma sequência de polinucleotídeos de comprimento total ou uma sua porção ou com uma sequência de polinucleotídeos mais longa. Para propósitos desta divulgação, "percentagem de identidade" pode ser também determinada usando BLASTX versão

2.0 para sequências de nucleotídeos traduzidas e BLASTN versão 2.0 para sequências de polinucleotídeos.

[00111] A percentagem de identidade de sequências é preferencialmente determinada usando o programa "Best Fit" ou "Gap" do Sequence Analysis Software Package™ (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., Madison, WI). "Gap" emprega o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY 48:443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos. "BestFit" realiza um alinhamento ótimo do melhor segmento de similaridade entre duas sequências e insere espaços para maximizar o número de correspondências usando o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman, ADVANCES IN APPLIED MATHEMATICS, 2:482-489, 1981, Smith et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH 11:2205-2220, 1983). A percentagem de identidade é mais preferencialmente determinada usando o programa "Best Fit".

[00112] Métodos úteis para determinação de identidade de sequência são também divulgados nos programas Ferramenta Básica de Busca de Alinhamentos Locais (BLAST), que são publicamente disponibilizados pelo National Center Biotechnology Information (NCBI) na National Library of Medicine, National Institute of Health, Bethesda, Md. 20894; ver "BLAST Manual", Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. MOL. BIOL. 215:403-410 (1990); a versão 2.0 ou superior de programas BLAST permite a introdução de intervalos (deleções e inserções) nos alinhamentos; para sequências peptídicas pode ser usado BLASTX para determinar a identidade de sequência e para sequências de polinucleotídeos pode ser usado BLASTN para determinar a identidade de sequência.

[00113] Como aqui usado, o termo "percentagem substancial de identidade de sequência" se refere a uma percentagem de identidade de sequência de pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ou ainda maior identidade de sequência, tal como cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade de sequência. Assim, uma modalidade da divulgação é uma molécula de polinucleotídeos que tem pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ou ainda maior identidade de sequência tal como cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade de sequência com uma sequência de polinucleotídeos aqui descrita. As moléculas de polinucleotídeos que têm a atividade dos genes de beta-glicosidase da presente divulgação são capazes de dirigir a produção de uma variedade de glicosídeos de esteviol e têm uma percentagem substancial de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos aqui proporcionadas e são englobadas dentro do âmbito desta divulgação. Identidade e Similaridade

[00114] Identidade é a fração de aminoácidos que são idênticos entre um par de sequências após um alinhamento das sequências (o que pode ser feito usando apenas informação da sequência ou informação estrutural ou alguma outra informação, mas geralmente é baseado somente na informação de sequência), e similaridade é a pontuação atribuída com base em um alinhamento usando alguma matriz de similaridade. O índice de similaridade pode ser qualquer um dos seguintes BLOSUM62, PAM250 ou GONNET, ou qualquer matriz usada por um perito na técnica para o alinhamento de sequências de proteínas.

[00115] Identidade é o grau de correspondência entre duas subsequências (sem espaços entre as sequências). Uma identidade de 25% ou superior implica similaridade de função, enquanto 18-25% implica similaridade de estrutura ou função. Deve-se ter em mente que duas sequências completamente independentes ou aleatórias (que são maiores que 100 resíduos) podem ter mais de 20% de identidade. Similaridade é o grau de semelhança entre duas sequências quando elas são comparadas. Isto é dependente da sua identidade.

[00116] Como é evidente a partir da descrição anterior, certos aspectos da presente divulgação não são limitados pelos detalhes particulares dos exemplos aqui ilustrados, e é por isso contemplado que outras modificações e aplicações, ou seus equivalentes, ocorrerão aos peritos na técnica. Por conseguinte, é pretendido que as reivindicações abranjam todas as modificações e aplicações que não se afastam do espírito e escopo da presente divulgação.

[00117] Além do mais, a menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por aquele com habilidade comum na técnica à qual a divulgação pertence.

Apesar de quaisquer métodos e materiais semelhantes a ou equivalentes aos descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste da presente divulgação, os métodos e materiais preferidos são descritos acima.

[00118] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe através de ilustrações e exemplos para propósitos de compreensão, será evidente para aqueles peritos na técnica que certas alterações e modificações podem ser praticadas. Por conseguinte, a descrição e exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção, que é delineado pelas reivindicações anexas.

[00119] De acordo com a presente divulgação, a beta- glicosidase ("B-glu1") pode ser usada para hidrolisar glicosídeos de esteviol e reduzir a produção de glicosídeos de esteviol indesejados por um método inovador. A presença de glicosídeos de esteviol indesejáveis no extrato de estévia ou produções de fermentação afetam o perfil de sabor global e a utilidade dos glicosídeos de esteviol. Ao reduzir os passos de produção, a presente divulgação reduzirá o custo de purificação e de produção dos glicosídeos de esteviol desejados no extrato em bruto de estévia.

[00120] A divulgação será mais completamente compreendida após consideração dos seguintes Exemplos não limitativos. Deve ser entendido que os Exemplos abaixo, enquanto indicando modalidades preferidas da tecnologia em questão, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um perito na técnica pode determinar características essenciais da tecnologia em questão, e sem se afastar do espírito e do escopo da mesma,

pode fazer várias mudanças e modificações da tecnologia em questão para adaptar a mesma para vários usos e condições. Exemplo 1: Identificação de beta-glicosidase em Pichia Pastoris

[00121] De acordo com a presente divulgação, a análise do genoma de Pichia pastoris foi completada e foram identificados vários genes candidatos de beta-glicosidase. Fragmentos de DNA de comprimento total de todos os genes candidatos de beta-glicosidase foram comercialmente sintetizados. Quase todos os códons do cDNA foram alterados para aqueles preferidos para E. coli (Genscript, NJ). O DNA sintetizado foi clonado em um vetor de expressão bacteriana pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). Estas mesmas experiências podem ser realizadas em Yarrowia lipolytica com sequências optimizadas para esse uso.

[00122] Cada construto de expressão foi transformado em BL21 de E. coli (DE3), que foi subsequentemente cultivado em meio LB contendo 50 µg/mL de canamicina a 37 °C até atingir uma OD600 de 0,8-1,0. A expressão de proteína foi induzida por adição de β-D-1-tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG) a 1 mM e a cultura cresceu adicionalmente em 16 °C durante 22 h. As células foram recolhidas por centrifugação (3.000 x g; 10 min; 4 °C). Os sedimentos de células foram recolhidos e foram usados imediatamente ou armazenados a -80 °C.

[00123] Os sedimentos de células tipicamente foram ressuspensos em tampão de lise (tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, lisozima a 25 µg/mL, DNase I a 5 µg/mL, imidazol a 20 mM, NaCl a 500 mM, glicerol a 10% e Triton X-

100 a 0,4%). As células foram rompidas por sonicação abaixo de 4 °C e os resíduos celulares foram clarificados por centrifugação (18.000 x g; 30 min). Sobrenadante foi carregado em uma coluna de afinidade Ni-NTA (Qiagen) equilibrada (tampão de equilibração: tampão de fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, imidazol a 20 mM, NaCl a 500 mM, glicerol a 10%). Após o carregamento da amostra de proteína, a coluna foi lavada com tampão de equilibração para remover proteínas contaminantes não ligadas. Os polipeptídeos recombinantes beta-glicosidase marcados com His foram eluídos pelo tampão de equilíbrio contendo imidazol a 250 mM.

[00124] Os polipeptídeos recombinantes de beta- glicosidase candidatos purificados foram testados para a atividade de desglicosilação usando vários glicosídeos de esteviol como substrato. Tipicamente, o polipeptídeo recombinante (10 µg) foi testado em um sistema reacional in vitro de 300 µL. O sistema reacional contém tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, glicosídeo de esteviol a 1 mg/mL. A reação foi realizada a 30-37 °C e a reação de 50 µL foi terminada pela adição de 200 µL de 1-butanol em vários pontos temporais. As amostras foram extraídas três vezes com 200 µL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 100 µL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[00125] Células de Pichia foram suspensas em tampão de extração (tampão de fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2; NaCl a 150mM). Após sonicação, o sobrenadante (extrato em bruto) foi recolhido por centrifugação ajustada a 12.000g a

4 ℃. A proteína em bruto resultante (50 µg) foi testada em um sistema reacional in vitro de 300 µL. O sistema reacional contém tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,2, glicosídeo de esteviol a 1 mg/mL. A reação foi realizada a 30-37 °C e a reação de 50 µL foi terminada pela adição de 200 µL de 1- butanol em vários pontos temporais. As amostras foram extraídas três vezes com 200 µL de 1-butanol. A fração reunida foi seca e dissolvida em 100 µL de metanol a 80% para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[00126] A análise por HPLC foi então realizada usando um sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), incluindo uma bomba quaternária, um compartimento de coluna com temperatura controlada, um amostrador automático e um detector de absorvância no UV. Uma coluna Synergi Hydro-RP (Phenomenex) com coluna de proteção foi usada para a caracterização dos glicosídeos de esteviol nas amostras reunidas. Acetonitrila em água foi a fase móvel usada na análise de HPLC. O comprimento de onda de detecção usado na análise de HPLC foi de 210 nm. Após a análise de atividade, observamos que Beta-glicosidase (B-glu1, SEQ: 1) tem forte atividade para clivar glicosídeos de esteviol relacionados e é, portanto, uma ferramenta útil na produção de glicosídeos de esteviol de interesse. Exemplo 2: Hidrólise do rubusosídeo pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00127] O rubusosídeo pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas para produzir esteviol-13-glucosídeo. O esteviol-13-glucosídeo produzido pode ser subsequentemente hidrolisado para produzir esteviol (FIG. 1B). As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Rubusosídeo a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 1A, B-glu1 pode remover um grupo glicosil da posição C19 do rubusosídeo para produzir esteviol-13-gliosídeo (FIG. 1A - c). O esteviol-13-glucosídeo (S-13-G) produzido será convertido em esteviol em ponto temporal posterior (FIG. 1A - d). B-glu1 remove outro grupo glicosil da posição C13 do esteviol-13-glucosídeo. Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B-glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o rubusosídeo para esteviol-13- glicosídeo e continuamente para produzir esteviol (FIG.1A - e e f). Exemplo 3: Hidrólise do esteviosídeo pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00128] O esteviosídeo pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas para produzir esteviolbiosídeo (FIG. 2B). As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Esteviosídeo a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 2, B-glu1 pode remover um grupo glicosil da posição C19 do esteviosídeo para produzir esteviolbiosídeo (FIG. 2A c e d). Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B- glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o esteviosídeo para esteviolbiosídeo (FIG. 8C). Exemplo 4: Hidrólise do rebaudiosídeo E pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00129] O rebaudiosídeo E pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante para produzir esteviolbiosídeo (FIG. 3B). As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Rebaudiosídeo E a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 3, B-glu1 pode remover o grupo glicosil da posição C19 do rebaudiosídeo E para produzir esteviosídeo e esteviolbiosídeo (FIG. 3A c-e). Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B-glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o rebaudiosídeo E para esteviolbiosídeo (FIG. 8D). Exemplo 5: Hidrólise do rebaudiosídeo A pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00130] O rebaudiosídeo A pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante para produzir rebaudiosídeo B (FIG. 4B). As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Rebaudiosídeo A a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 4, B-glu1 pode remover os grupos glicosil da posição C19 do rebaudiosídeo A para produzir rebaudiosídeo B (FIG. 4A c-d). Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B-glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o rebaudiosídeo A para rebaudiosídeo B (FIG. 8e). Exemplo 6: Hidrólise do rebaudiosídeo I pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00131] O rebaudiosídeo I pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante para produzir rebaudiosídeo A e o A produzido pode ser hidrolisado para produzir rebaudiosídeo B (FIG. 5B). As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Rebaudiosídeo I a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 5, B-glu1 pode remover um grupo glicosil da posição C19 do rebaudiosídeo I para produzir rebaudiosídeo A e subsequentemente remover outro grupo glicosil da posição C19 do rebaudiosídeo A para produzir rebaudiosídeo B (FIG. 5A d- f). O rebaudiosídeo I pode ser convertido completamente para o rebaudiosídeo A em 24 h (Fig. 5A f). Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B-glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o rebaudiosídeo I para rebaudiosídeo B (FIG. 8 f). Exemplo 7: Hidrólise do rebaudiosídeo D pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00132] O rebaudiosídeo D pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante para produzir rebaudiosídeo B (FIG. 6B) e Reb A. As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Rebaudiosídeo D a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 6, B-glu1 pode remover os grupos glicosil da posição C19 do rebaudiosídeo D para produzir rebaudiosídeo (FIG. 6A c-e). Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B-glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o rebaudiosídeo D para rebaudiosídeo B (FIG. 8g). Exemplo 8: Hidrólise do rebaudiosídeo G pelo uso de B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas

[00133] O rebaudiosídeo G pode ser hidrolisado pela enzima B-glu1 recombinante e células de Pichia rompidas para produzir esteviol-13-glucosídeo. O esteviol-13-glucosídeo produzido pode ser continuamente hidrolisado para produzir esteviol (FIG. 7B). As reações foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Rebaudiosídeo G a 1 g/L foi adicionado como substrato na reação. Como mostrado na FIG. 7A, B-glu1 pode remover os grupos glicosil da posição C13 e C19 do rebaudiosídeo G para produzir esteviol-13-glucosídeo (FIG. 7A b-c). O esteviol-13-glucosídeo (S-13-G) produzido será convertido em esteviol (FIG. 7A). O esteviol-13-glucosídeo produzido será convertido completamente em esteviol em 24 h (FIG. 7A d). B-glu1 remove outro grupo glicosil da posição C13 do esteviol-13-glucosídeo. Como a B-glu1 é uma enzima intercelular em células de Pichia, as células de Pichia rompidas liberam a enzima B-glu1, que tem a mesma atividade enzimática para hidrolisar o rebaudiosídeo G para esteviol- 13-glicosídeo e continuamente para produzir esteviol (FIG.7A e).

[00134] De acordo com a presente divulgação, identificamos e quantificamos a atividade enzimática da beta-glicosidase em um lisado celular de Pichia pastoris. Esta enzima tem atividade específica que permite hidrolisar glicosídeos de esteviol específicos (Tabela 1). Referindo a FIG. 7, Reb G é hidrolisado pela enzima B-glu1 e pelas células de Pichia rompidas. A HPLC mostra os produtos da hidrólise de Reb G. Nesta tentativa foram produzidos esteviol ("S"); esteviol-13-glicosídeo ("S-13-G"); rubusosídeo ("Rub"). O curso temporal foi uma série de pontos temporais ao longo de 24 horas. Esteviol-13-glicosídeo ("S-13-G") e esteviol foram produzidos por culturas recombinantes de Pichia pastoris.

[00135] Usando esta técnica, hidrolizamos Reb M para remover Reb A, Reb D3, Reb D4, Reb W, Reb V, Reb E, Reb I e Reb D para aumentar a eficácia da purificação (FIG. 9). Esta técnica envolve o uso de esteviosídeo e Reb A para produzir esteviol, esteviol-13-O-glicosídeo, esteviolbiosídeo e Reb B através da bioconversão da beta-glicosidase. Referindo a FIG. 8, glicosídeos de esteviol foram hidrolisados pelas células de Pichia pastoris rompidas. As amostras incluíram um padrão de esteviolbiosídeo ("SB") e rebaudiosídeo B ("B"). Nas nossas experiências, o esteviosídeo foi hidrolisado por células de Pichia rompidas em 24 horas; Reb E e Reb A foram hidrolisados por células de Pichia rompidas em 24 horas. Da mesma forma, Reb I e Reb D foram hidrolisados por células de Pichia rompidas em 24 horas (FIG. 8).

[00136] Em outra modalidade da presente divulgação, podemos usar beta-glicosidase para controlar as vias de produção de glicosídeo de esteviol. (Exemplo: Reb M a partir de Reb W) (FIG. 10).

[00137] De acordo com modalidades preferidas da presente divulgação, a beta-glicosidase pode ser usada para hidrolisar glicosídeos de esteviol adicionais incluindo Reb V, Reb W, Reb Z1, Reb Z2, Reb D3 e Reb D4 para conduzi-los a glicosídeos de esteviol de interesse (FIG. 9). Depois disso, podemos separar, coletar e concentrar os produtos hidrolisados. Em outra modalidade da presente divulgação, usamos uma cepa deficiente em beta-glicosidase, que reduzirá a produção secundária no nosso processo de bioconversão. Tabela 1: Resumo da hidrólise de glicosídeos de esteviol por B-glu1.

Substrato Produtos Esteviol-13-O-glucosídeo (S-13-G), Rub esteviol Esteviosídeo Esteviolbiosídeo (SB) Reb E Esteviosídeo, Esteviolbiosídeo (SB) Reb A Reb B Reb I Reb A, Reb B Reb D Reb B Esteviol-13-O-glucosídeo (S-13-G), Reb G esteviol Reb B Nenhuma clivagem Reb M Nenhuma clivagem DECLARAÇÃO DE APLICABILIDADE INDUSTRIAL / CAMPO TÉCNICO

[00138] Esta divulgação tem aplicabilidade nas indústrias de alimentos, rações, bebidas e farmacológicas. Esta divulgação se refere em geral a um método para a biossíntese de glicosídeos de esteviol via a hidrólise de beta glicosidase. Literatura Citada e Incorporado por Referência:

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8. Shockey JM. Et a., (2003), Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes: phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme A synthetases. PLANT PHYSIOL 132 1065–76. Sequências de Interesse: Sequências: B-glu1: Sequência de aminoácidos de B-glu1: (SEQ ID NO: 1) de Pichia pastoris (GS115) Mtqldvesliqeltlnekvqllsgsdfwhttpvrrlgipkmrlsdgpngvrgtkffngv ptacfpcgtglgatfdkellkeagslmadeakakaasvvlgptaniargpnggrgfesf gedpvvnglssaaminglqgkyiaatmkhyvcndlemdrncidaqvshralrevyllpf qiavrdanpraimtaynkangehvsqskflldevlrkewgwdgllmsdwfgvydakssi tngldlempgppqcrvhsatdhainsgeihindvdervrsllslinychqsgvteedpe tsdnntpetieklrkisresivllkdddrnrsilplkksdkiavignnakqaaycgggs asvlsyhtttpfdsiksrledsntpaytigadayknlpplgpqmtdsdgkpgfdakffv gsptskdrklidhfqltnsqvflvdyyneqipenkefyvdvegqfipeedgtynfgltv fgtgrlfvddklvsdssqnqtpgdsffglaaqevigsihlvkgkaykikvlygssvtrt yeiaasvafeggaftfgaakqrnedeeiaraveiakandkvvlciglnqdfesegfdrp dikipgatnkmvsavlkanpntvivnqtgtpvempwasdapvilqawfggseagtaiad vlfgdynpsgkltvtfplrfednpaylnfqsnkqacwygedvyvgyryyetidrpvlfp fghglsftefdftdmfvrleeenlevevvvrntgkydgaevvqlyvapvspslkrpike lkeyakiflasgeaktvhlsvpikyatsffdeyqkkwcsekgeytillgsssadikvsq sitlekttfwkgl DNA de B-glu1: (SEQ ID NO: 2) (códon otimizado para E. coli)

ATGACCCAACTGGATGTGGAGAGCCTGATTCAAGAGCTGACCCTGAACGAAAAGGTGCA ACTGCTGAGCGGTAGCGACTTCTGGCATACCACCCCGGTTCGTCGTCTGGGCATCCCGA AGATGCGTCTGAGCGACGGTCCGAACGGCGTTCGTGGTACCAAATTCTTTAACGGTGTT CCGACCGCGTGCTTCCCGTGCGGTACCGGTCTGGGCGCGACCTTTGACAAGGAACTGCT GAAAGAGGCGGGTAGCCTGATGGCGGATGAAGCGAAAGCGAAAGCGGCGAGCGTGGTTC TGGGTCCGACCGCGAACATTGCGCGTGGTCCGAACGGTGGCCGTGGCTTCGAGAGCTTC GGCGAGGACCCGGTGGTTAACGGTCTGAGCAGCGCGGCGATGATCAACGGCCTGCAGGG CAAGTACATTGCGGCGACCATGAAACACTATGTTTGCAACGATCTGGAAATGGACCGTA ACTGCATTGACGCGCAAGTTAGCCACCGTGCGCTGCGTGAGGTGTACCTGCTGCCGTTC CAAATCGCGGTGCGTGATGCGAACCCGCGTGCGATTATGACCGCGTATAACAAGGCGAA CGGCGAACACGTTAGCCAGAGCAAATTCCTGCTGGACGAAGTGCTGCGTAAGGAGTGGG GCTGGGATGGTCTGCTGATGAGCGACTGGTTTGGTGTTTACGATGCGAAAAGCAGCATC ACCAACGGCCTGGACCTGGAGATGCCGGGTCCGCCGCAGTGCCGTGTGCACAGCGCGAC CGATCACGCGATCAACAGCGGCGAAATCCACATTAACGATGTTGACGAGCGTGTGCGTA GCCTGCTGAGCCTGATTAACTACTGCCACCAAAGCGGTGTTACCGAGGAAGATCCGGAA ACCAGCGACAACAACACCCCGGAAACCATCGAGAAGCTGCGTAAAATCAGCCGTGAGAG CATTGTGCTGCTGAAGGACGATGACCGTAACCGTAGCATTCTGCCGCTGAAGAAAAGCG ACAAAATCGCGGTTATTGGTAACAACGCGAAACAAGCGGCGTATTGCGGTGGCGGTAGC GCGAGCGTGCTGAGCTATCACACCACCACCCCGTTCGACAGCATCAAGAGCCGTCTGGA AGATAGCAACACCCCGGCGTACACCATTGGTGCGGACGCGTATAAAAACCTGCCGCCGC TGGGTCCGCAAATGACCGATAGCGACGGCAAGCCGGGTTTTGATGCGAAATTCTTTGTT GGCAGCCCGACCAGCAAGGATCGTAAACTGATCGACCACTTCCAGCTGACCAACAGCCA AGTTTTTCTGGTGGACTACTATAACGAACAGATCCCGGAAAACAAGGAGTTCTACGTTG ACGTGGAGGGTCAATTTATTCCGGAGGAAGATGGCACCTATAACTTCGGTCTGACCGTG TTTGGTACCGGCCGTCTGTTCGTTGATGACAAACTGGTTAGCGACAGCAGCCAGAACCA AACCCCGGGCGATAGCTTCTTTGGTCTGGCGGCGCAGGAAGTGATCGGCAGCATTCACC TGGTGAAGGGTAAAGCGTACAAGATCAAAGTTCTGTATGGCAGCAGCGTGACCCGTACC TACGAAATTGCGGCGAGCGTTGCGTTTGAGGGCGGTGCGTTCACCTTTGGTGCGGCGAA ACAGCGTAACGAAGACGAGGAAATCGCGCGTGCGGTGGAGATTGCGAAGGCGAACGACA AAGTGGTTCTGTGCATCGGCCTGAACCAAGATTTCGAAAGCGAGGGTTTTGATCGTCCG GACATCAAGATTCCGGGCGCGACCAACAAAATGGTTAGCGCGGTGCTGAAGGCGAACCC GAACACCGTTATTGTGAACCAGACCGGTACCCCGGTTGAGATGCCGTGGGCGAGCGATG CGCCGGTGATCCTGCAAGCGTGGTTTGGCGGTAGCGAGGCGGGTACCGCGATTGCGGAT GTTCTGTTTGGCGACTACAACCCGAGCGGCAAGCTGACCGTGACCTTCCCGCTGCGTTT TGAGGATAACCCGGCGTACCTGAACTTCCAGAGCAACAAACAAGCGTGCTGGTATGGCG AAGACGTTTACGTGGGTTATCGTTACTATGAGACCATCGATCGTCCGGTGCTGTTCCCG TTTGGTCACGGCCTGAGCTTCACCGAGTTCGATTTTACCGACATGTTTGTTCGTCTGGA GGAAGAGAACCTGGAAGTTGAGGTGGTTGTGCGTAACACCGGCAAGTACGACGGTGCGG AAGTGGTGCAGCTGTATGTTGCGCCGGTTAGCCCGAGCCTGAAACGTCCGATCAAGGAA CTGAAAGAGTACGCGAAAATTTTCCTGGCGAGCGGTGAAGCGAAGACCGTTCACCTGAG CGTGCCGATCAAATACGCGACCAGCTTCTTTGATGAGTATCAAAAGAAATGGTGCAGCG AAAAGGGCGAGTATACCATTCTGCTGGGTAGCAGCAGCGCGGACATCAAAGTTAGCCAA

AGCATCACCCTGGAAAAAACCACCTTCTGGAAAGGTCTGTAA Sequência de aminoácidos de B-glu2: (SEQ ID NO: 3) de Pichia pastoris (GS115)

MKSQLIFMALASLVASAPLEHQQQHHKHEKRAVVTQTVTVAAGQTAAAGSAQAVVTSSA APASVASSAAASASSSSSSYTSGASGDLSSFKDGTIKCSEFPSGDGVVSVSWLGFGGWS SIMNLQGGTSESCENGYYCSYACEAGYSKTQWPSNQPSDGRSVGGLLCKDGLLYRSNTA FDTLCVPGKGTASVENNVSKGISICRTDYPGSENMCVPTWVDAGNSNTLTVVDEDNYYE WQGLKTSAQYYVNNAGVSVEDGCIWGDESSGVGNWAPLVLGAGSTGGLTYLSLIPNPNN

KKAPNFNVKIVATDGSSINGDCKYENGIFVGSSTDGCTVTVTSGSAKLVFY Sequência de DNA de B-glu2 (SEQ ID NO: 4) de Pichia pastoris (GS115) atgaaaagccagctgatctttatggctttggcctcccttgtagcaagtgcaccgctgga acaccagcagcagcatcataaacatgagaaacgcgccgtagttacgcagacagtaactg ttgcggcgggccagacagcagcagcgggttccgcccaggcagttgttacctcaagcgcg gcgccagcatccgttgcttcaagtgcggccgcgtctgctagctcatcttcttccagcta tacctctggcgcttcaggcgatcttagtagtttcaaagatggtactattaaatgttcag aattcccatcaggggatggcgtggtgtccgtctcttggttaggcttcggcggctggtct agtattatgaatctgcagggtggtacttcagagagttgtgagaacggctattattgttc atatgcatgtgaagccggttatagcaaaacacagtggccatctaaccagccgtcagatg ggagatcagtgggagggttgctgtgtaaagatggcctgttatatcgctccaatacagcg ttcgatacattatgtgtgcctggaaaaggtacagcatccgtggagaataatgtgtctaa aggtatttccatttgtagaacggattatccggggtctgaaaacatgtgcgtcccgacgt gggtcgatgccggtaactcaaacaccttgacagtggtagatgaagataattattatgaa tggcagggccttaaaactagtgctcagtattatgtgaataacgccggtgttagtgttga agatgggtgcatctggggcgatgagtccagcggcgttggaaactgggcgccgttggttt tgggggccggttccacggggggtctgacctatctgtctctgattccgaatccaaacaac aaaaaagcaccgaattttaacgtaaaaatcgtggccacggatggaagttcaattaacgg agattgcaaatatgaaaatgggatctttgtcggttcttcaaccgatggctgcacggtaa ctgttacctcaggtagtgcaaaactggttttttattaa Sequência de aminoácidos de B-glu3 (SEQ ID NO: 5) de Pichia pastoris (GS115) Mqvksivnlllacslavarplehahhqhdkrgvvvvtktivvdgstveataaaqvqeha etfaestpsavvssssapssassasapassgsfsagtkgvtyspyqagggcktaeevas dlsqltgyeiirlygvdcnqvenvfkakapgqklflgiffvdaiesgvsaiasavksyg swddvhtvsvgnelvnngeatvsqigqyvstaksalrsagftgpvlsvdtfiavinnpg lcdfadeyvavnahaffdggiaasgagdwaaeqiqrvssacggkdvlivesgwpskgdt ngaavpsksnqqaavqslgqkigssciafnafndywkadgpfnaekywgilds Sequência de DNA de B-glu3 (SEQ ID NO: 6) de Pichia pastoris (GS115) Atgcaggttaaatctattgttaatttactgcttgcctgttccttggctgtggcgcgtcc gttggaacacgctcaccatcagcatgataaacgcggcgttgtagtagtaacgaaaacca tcgtcgttgatggtagcacagttgaggctaccgccgctgctcaggtgcaggagcatgca gaaacctttgcagaatcaaccccgtcagccgtcgtttccagttcatccgccccttcatc agcaagctcagcttccgctccagctagttcaggttctttttcagctggtaccaaaggcg tgacatattctccatatcaggccggtggtgggtgtaaaacagcggaagaagtggcatcc gatctgtcacagcttaccggttatgaaattattcggctttatggcgtagattgcaacca ggttgagaacgtgtttaaagccaaagcccctggccagaaactttttttgggtatctttt ttgtggatgccatcgagtctggcgtatcagctatcgcaagtgccgttaaatcctatggt tcttgggatgatgtacacactgtatctgttggcaacgagctggtgaacaatggcgaagc cactgttagccagattggacagtatgttagtacggccaaatcagccttacgctctgccg gtttcacagggccagtattgtctgttgatacttttattgcagtgattaacaatccgggg ctgtgtgatttcgcggatgaatatgttgctgtgaacgcccatgcgttcttcgatggggg tattgctgcctcaggggcgggcgattgggcggcagagcagatccagcgcgtctccagtg cgtgcggcgggaaagatgtcttaattgtagaaagcggttggccgtctaaaggagatacg aacggcgccgcagtgccgtcaaaatccaatcagcaggctgcagtccagagtcttggcca gaaaattgggagctcatgcattgcctttaacgcatttaatgattattggaaagccgatg gtccgttcaacgccgaaaaatattgggggatccttgatagttaa Sequência de aminoácidos de B-glu4 (SEQ ID NO: 7) de Pichia pastoris (GS115) mlstilnifilllfiqaslqapipvvtkyvtegiavvtetnvrvvtktipivqvlisdg atythtlttvstaeengnfqpitttsivnkevvvptsvtpntqqtrptqvdttqnnadt paaptpspttssnngvfttysttrsvvtsvvvvgpdgspientgqtanptttapttstt aarttsststtptasstpggnhprsivyspysdssqckdattietdlefiaskgisavr iygndcnyltvvlpkcaslglkvnqgfwigpsgvdsiddavqefiqavngnngfnwdlf elitvgneaisagyvsassliskikevssilssagytgpittaeppnvyedygdlcstd vmsivgvnahsyfntlfaasdsgsfvksqievvqkacsrsditiietgypsqgatngkn vpskenqktaifsifevvgtdvtilstyddlwkdpgpygieqffgaidlfs Sequência de DNA de B-glu4 (SEQ ID NO: 8) de Pichia pastoris (GS115) atgctgtccacaattctgaatatttttattcttctgttattcatccaggcgtctcttca ggcgcctattccggtggtgaccaaatatgtgaccgaaggtattgccgttgtgactgaaa ccaatgtgcgggttgttactaaaaccattccgattgtgcaggtgctgatctccgatggt gcaacctatactcataccctgacgacagtgtcaacggcggaagaaaatggcaacttcca gcctattaccacgacatctattgtcaacaaagaagttgtagtaccaacaagcgtaaccc cgaatacccagcagacgcgtccgacccaggtagataccacacagaacaatgcggataca ccagcggcgcctacaccatcacctactactagttcaaacaacggcgtgttcaccacata ttccacaacacgtagcgtagtcactagtgtagtcgtagtcggaccggatggaagcccta ttgaaaatactggacagacagcaaaccctactacaactgccccaactacaagcactact gctgcccggaccacaagcagtacgtccaccacacctaccgctagctctacgccaggagg taatcatccacgtagcatcgtctattctccatattccgatagcagtcagtgtaaagatg cgacaacgatcgaaaccgatcttgagttcattgcctctaaaggcatcagcgcggtacgt atttatggcaatgattgtaactatcttacagttgttttgcctaaatgtgccagtctggg attaaaagtgaatcagggcttttggattggtccaagtggagtagatagcatcgatgatg cagtacaggagtttattcaggcagtcaacggcaacaacggctttaattgggatttattc gaattaattaccgtcggaaacgaagcaatcagtgccggttatgtttcagcgagctccct gatttccaaaattaaagaagtatctagcattctgagctccgcgggttatactggtccaa ttaccacagccgaaccgcctaacgtatatgaggattatggcgatctgtgctcaaccgat gtaatgtccatcgtgggtgtaaacgcgcattcctattttaataccctttttgcggcctc cgattcaggttcatttgtgaaatcacagatcgaagtagtccagaaagcatgctcacgtt ccgatattactattattgaaaccgggtatccgtcccagggagctaccaatggaaaaaac gttcctagtaaagagaatcagaaaacagcgattttttcaatctttgaggtcgttggaac agatgtaactattcttagtacttatgatgatttgtggaaagatcctggaccgtatggga ttgaacagttttttggtgcgatcgatcttttttcttaa

Claims (37)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para alterar a glicosilação de um glicosídeo de esteviol caracterizado pelo fato de que compreende: a) Proporcionar um micróbio, alga ou célula vegetal recombinante modificado para produzir um primeiro substrato; b) Romper o referido micróbio, alga ou célula vegetal recombinante para liberar o seu citosol celular, em que tal citosol contém o referido primeiro substrato; c) Obter o citosol do referido micróbio, alga ou célula vegetal recombinante; d) Expor o referido citosol a uma beta-glicosidase em que tal beta-glicosidase tem atividade hidrolítica durante um tempo suficiente para gerar um segundo substrato de interesse através da remoção de, pelo menos, um grupo glicosil do referido primeiro substrato; e, e) Recolher o referido segundo substrato de interesse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro substrato é um glicosídeo de esteviol.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do referido glicosídeo de esteviol.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C13 do referido glicosídeo de esteviol.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do referido glicosídeo de esteviol ou da posição C13 do referido glicosídeo de esteviol.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil tanto da posição C19 do referido glicosídeo de esteviol como da posição C13 do referido substrato.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do rubusosídeo para produzir esteviol-13-gliosídeo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do esteviosídeo para produzir esteviolbiosídeo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do Reb E para produzir esteviolbiosídeo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do Reb I para produzir Reb A.

11. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 do Reb A para produzir Reb B.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C13 do esteviol-13-gliosídeo para produzir esteviol.

13. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C13 do Reb D para produzir Reb B ou Reb A.

14. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida atividade hidrolítica funciona para remover um grupo glicosil da posição C19 e da posição C13 do Reb G para produzir esteviol-13- glicosídeo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segundo substrato de interesse é Reb M.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segundo substrato de interesse é Reb B.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segundo substrato de interesse é Reb A.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o uso de enzimas beta-galactosidase ou pectinase para aumentar a velocidade da hidrólise enzimática.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: expressar um glicosídeo de esteviol em um sistema celular transformado; crescer o sistema celular em um meio; e, produzir o referido segundo substrato de interesse.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, caracterizado pelo fato de que o referido período de tempo para exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é, pelo menos, 6 horas.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, caracterizado pelo fato de que o referido período de tempo para exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é, pelo menos, 12 horas.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, caracterizado pelo fato de que o referido período de tempo para exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é, pelo menos, 18 horas.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, caracterizado pelo fato de que o referido período de tempo para exposição da beta-glicosidase ao referido primeiro substrato é, pelo menos, 24 horas.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segundo substrato de interesse é um glicosídeo de esteviol.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, caracterizado pelo fato de que a beta-glicosidase tem uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 90% de identidade com a SEQ ID NO:1.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, caracterizado pelo fato de que a beta-glicosidase tem uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 95% idêntica a SEQ ID NO:3.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26, caracterizado pelo fato de que o micróbio, alga ou célula vegetal recombinante é selecionado do grupo consistindo em: uma bactéria, uma levedura, um fungo filamentoso, uma alga cianobactéria e uma célula vegetal.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26, caracterizado pelo fato de que o micróbio recombinante é selecionado do grupo consistindo em: Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Yarrowia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium; e Clostridium acetobutylicum.

29. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo substrato de interesse é Reb E.

30. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segundo substrato é uma mistura de Reb E, Reb D4 e Reb M.

31. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo substrato de interesse é Reb D4.

32. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido segundo substrato de interesse é uma mistura de glicosídeo de esteviol e o teor de glicosídeo de esteviol desta mistura combinada é maior do que quaisquer outros componentes do concentrado derivado de citosol por peso em uma base seca.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 e 32, caracterizado pelo fato de que o segundo substrato de interesse na etapa e) é um produto em bruto e a etapa e) compreende adicionalmente: i) purificar o referido produto em bruto; e, ii) remover solventes sob vácuo para proporcionar um produto concentrado.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido produto em bruto é purificado por extração ácido-base.

36. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido produto em bruto é purificado por destilação sob vácuo.

37. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a purificação do produto concentrado usando uma HPLC semi-preparativa.