RU2775697C2 - Гидролиз стевиоловых гликозидов с помощью бета-глюкозидазы - Google Patents
Гидролиз стевиоловых гликозидов с помощью бета-глюкозидазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2775697C2 RU2775697C2 RU2020102899A RU2020102899A RU2775697C2 RU 2775697 C2 RU2775697 C2 RU 2775697C2 RU 2020102899 A RU2020102899 A RU 2020102899A RU 2020102899 A RU2020102899 A RU 2020102899A RU 2775697 C2 RU2775697 C2 RU 2775697C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reb
- ser
- steviol
- steviol glycoside
- ala
- Prior art date
Links
- 235000019202 steviosides Nutrition 0.000 title claims abstract description 147
- 239000004383 Steviol glycoside Substances 0.000 title claims abstract description 113
- 235000019411 steviol glycoside Nutrition 0.000 title claims abstract description 112
- 150000008144 steviol glycosides Chemical class 0.000 title claims abstract description 112
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title description 50
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims abstract description 49
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims abstract description 38
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 61
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 61
- OMHUCGDTACNQEX-OSHKXICASA-N Steviolbioside Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O OMHUCGDTACNQEX-OSHKXICASA-N 0.000 claims description 52
- QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N Steviol Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N 0.000 claims description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 49
- UEDUENGHJMELGK-VESORUSYSA-N Stevioside Natural products O=C(O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 UEDUENGHJMELGK-VESORUSYSA-N 0.000 claims description 36
- UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N Stevioside Chemical group O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N 0.000 claims description 35
- 229940013618 stevioside Drugs 0.000 claims description 34
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 33
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 claims description 27
- 229940032084 steviol Drugs 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N Rubusoside Chemical group O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 claims description 16
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 167
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 50
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 47
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 39
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 38
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 38
- RLLCWNUIHGPAJY-RYBZXKSASA-N Rebaudioside E Natural products O=C(O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)[C@]1(C)[C@@H]2[C@@](C)([C@@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@@H]5[C@@H](O[C@@H]6[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 RLLCWNUIHGPAJY-RYBZXKSASA-N 0.000 description 32
- RPYRMTHVSUWHSV-CUZJHZIBSA-N Rebaudioside D Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RPYRMTHVSUWHSV-CUZJHZIBSA-N 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 description 28
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 description 28
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N Stevioside A3 Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 description 28
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 description 28
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 19
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 18
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- DRSKVOAJKLUMCL-UHFFFAOYSA-N Rebaudioside B Chemical compound C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(O)=O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC(C1OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O DRSKVOAJKLUMCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 17
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 14
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 14
- GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Threonine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 13
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 12
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 11
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 11
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 10
- 240000001132 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 10
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 10
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 9
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 9
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 9
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 9
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 9
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 8
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 8
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 8
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 8
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 8
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 7
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 7
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 7
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 7
- -1 rebaudioside M Chemical compound 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 6
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 6
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 6
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 6
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 6
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 6
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 6
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 6
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(1-carboxy-2-phenylethyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 210000000172 Cytosol Anatomy 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Threonine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 5
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 5
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 5
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 5
- MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 5
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 5
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 5
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 5
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 5
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 4
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 4
- CANAPGLEBDTCAF-MORBOXIVSA-N Dulcoside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@H]2[C@](C)([C@@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@@H]6[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 CANAPGLEBDTCAF-MORBOXIVSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 4
- HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 4
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 4
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 4
- UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Lysine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN UWBDLNOCIDGPQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 4
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N Rebaudioside C Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]1(CC[C@H]2[C@@]3(C)[C@@H]([C@](CCC3)(C)C(=O)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)CC3)C(=C)C[C@]23C1 QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N 0.000 description 4
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 4
- 229960004793 Sucrose Drugs 0.000 description 4
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 4
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 4
- CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 4
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 4
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 4
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 4
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 4
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 4
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 4
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 4
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N (2S)-1-[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2,5-diamino-5-oxopentanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N (4S)-4-amino-5-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 3
- KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HKTRDWYCAUTRRL-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[[1-carboxy-2-(1H-imidazol-5-yl)ethyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 3
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- OMSMPWHEGLNQOD-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Phenylalanine Chemical compound NC(=O)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Cysteine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- VBIIZCXWOZDIHS-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS VBIIZCXWOZDIHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 3
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 3
- KLAONOISLHWJEE-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Glutamine Chemical compound NC(=O)CCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 KLAONOISLHWJEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 3
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 3
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 3
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-α-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 3
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 3
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 3
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 3
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 3
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 3
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 3
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 3
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N (2S)-1-[2-[[(2S)-2-azaniumyl-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-4-carboxybutanoyl)amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- JQDFGZKKXBEANU-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Cysteine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Asparagine Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N Arginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCNC(N)=N XNSKSTRGQIPTSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N Asn-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- ZARXTZFGQZBYFO-JQWIXIFHSA-N Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZARXTZFGQZBYFO-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 2
- SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Asparagine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Aspartyl-L-proline Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101700028102 BAGBG Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 239000001776 FEMA 4720 Substances 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CLSDNFWKGFJIBZ-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O CLSDNFWKGFJIBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108091022077 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000019483 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- CTCFZNBRZBNKAX-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Glutamine Chemical compound NC(=O)CCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 CTCFZNBRZBNKAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CNPNWGHRMBQHBZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 2
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 2
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- 101710038792 PALG1 Proteins 0.000 description 2
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N Pro-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 206010039447 Salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Arginine Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfizole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N Thr-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BWUHENPAEMNGQJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Asparagine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 PEEAINPHPNDNGE-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 2
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 2
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N gly pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine zwitterion Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013615 non-nutritive sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N pro glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Arginine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N OPINTGHFESTVAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O DXJZITDUDUPINW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Serine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N (2R)-2-[[(2S,3S)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BAQAVOSOZGMPRM-JVFSCRHWSA-N (2R,3R,4R,5R,6R)-2-[(2S,3R,4R,5R)-2,5-bis(chloromethyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]oxy-5-chloro-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4-diol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](Cl)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@]1(CCl)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CCl)O1 BAQAVOSOZGMPRM-JVFSCRHWSA-N 0.000 description 1
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N (2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N (2S)-1-[(2S)-2-azaniumyl-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N (2S)-1-[2-[[(2S)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- CGHXMODRYJISSK-NHCYSSNCSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CGHXMODRYJISSK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VHGIWFGJIHTASW-FXQIFTODSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VHGIWFGJIHTASW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N (2S)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N (2S)-2-[[2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NIZKGBJVCMRDKO-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-4-(carboxymethylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N (3S)-3-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-(carboxymethylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 2-((2,6-Dichlorophenyl)imino)imidazolidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-sulfanylpropanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-GAWUUDPSSA-N 9-β-D-XYLOFURANOSYL-ADENINE Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-GAWUUDPSSA-N 0.000 description 1
- IFLVGRRVGPXYON-UHFFFAOYSA-N ADCI Chemical compound C12=CC=CC=C2C2(C(=O)N)C3=CC=CC=C3CC1N2 IFLVGRRVGPXYON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035676 ANALGESICS Drugs 0.000 description 1
- 229960004998 Acesulfame potassium Drugs 0.000 description 1
- WBZFUFAFFUEMEI-UHFFFAOYSA-N Acesulfame potassium Chemical compound [K+].CC1=CC(=O)NS(=O)(=O)O1 WBZFUFAFFUEMEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-SXVXDFOESA-N Adenosine Natural products Nc1ncnc2c1ncn2[C@@H]3O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]3O OIRDTQYFTABQOQ-SXVXDFOESA-N 0.000 description 1
- FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N Ala-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UFBFGSQYSA-N Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UFBFGSQYSA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N Alanyl-Arginine Chemical compound CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000005781 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQTUDDBANZYMAR-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O IQTUDDBANZYMAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N Aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 Aspartame Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000188595 Brassica sinapistrum Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940112822 Chewing Gum Drugs 0.000 description 1
- 229920002759 Circular DNA Polymers 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 description 1
- HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CS HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGTVXXNMOGHRAY-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Arginine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N RGTVXXNMOGHRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVNMAAGSAUGNIC-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Histidine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 LVNMAAGSAUGNIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Phenylalanine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYVKPHCYMTWUCW-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS WYVKPHCYMTWUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS OELDIVRKHTYFNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 241000235035 Debaryomyces Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000602080 Dracaena fragrans Species 0.000 description 1
- 235000019749 Dry matter Nutrition 0.000 description 1
- 206010013911 Dysgeusia Diseases 0.000 description 1
- 108010066133 EC 1.5.1.11 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 1
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 1
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 1
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 1
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 102100011343 GLB1 Human genes 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 1
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- XIPZDANNDPMZGQ-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Cysteine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O XIPZDANNDPMZGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHLZDSUANXBJHW-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Phenylalanine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VHLZDSUANXBJHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710007246 H3-3A Proteins 0.000 description 1
- 101700009603 HIS3 Proteins 0.000 description 1
- 240000006669 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Arginine Chemical compound NC(=N)NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDXZDKMBEXLFMB-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 IDXZDKMBEXLFMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)CC BCVIOZZGJNOEQS-XKNYDFJKSA-N 0.000 description 1
- TUYOFUHICRWDGA-CIUDSAMLSA-N Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC TUYOFUHICRWDGA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Aspartate Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine zwitterion Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N L-tyrosyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003750 Lower Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N Lys-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O OAPNERBWQWUPTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- XBZOQGHZGQLEQO-IUCAKERBSA-N Lys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XBZOQGHZGQLEQO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-ZFWWWQNUSA-N Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N Met-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N Met-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000035633 Metabolized Effects 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000589344 Methylomonas Species 0.000 description 1
- 241000589354 Methylosinus Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 239000004384 Neotame Substances 0.000 description 1
- HLIAVLHNDJUHFG-HOTGVXAUSA-N Neotame Chemical compound CC(C)(C)CCN[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 HLIAVLHNDJUHFG-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N Phenylalanyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N Pro-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- HXNYBZQLBWIADP-UHFFFAOYSA-N Prolyl-Cysteine Chemical compound OC(=O)C(CS)NC(=O)C1CCCN1 HXNYBZQLBWIADP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- HYLAUKAHEAUVFE-XKDJHBDXSA-N Rebaudioside F Natural products O=C(O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HYLAUKAHEAUVFE-XKDJHBDXSA-N 0.000 description 1
- HYLAUKAHEAUVFE-AVBZULRRSA-N Rebaudioside F Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HYLAUKAHEAUVFE-AVBZULRRSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N Rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 241000191025 Rhodobacter Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 210000003705 Ribosomes Anatomy 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N Ribulose-1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N Saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 Saccharin Drugs 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 240000003670 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 241000544066 Stevia Species 0.000 description 1
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000004376 Sucralose Substances 0.000 description 1
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 1
- 210000000538 Tail Anatomy 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Lysine Chemical compound CC(O)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C([O-])=O)=CNC2=C1 OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- KBUBZAMBIVEFEI-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Histidine Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 KBUBZAMBIVEFEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DXYQIGZZWYBXSD-UHFFFAOYSA-N Tryptophyl-Proline Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DXYQIGZZWYBXSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N Tyr-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 GJNDXQBALKCYSZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Cysteine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960003487 Xylose Drugs 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1CO[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000005296 abrasive Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 235000010358 acesulfame potassium Nutrition 0.000 description 1
- 239000000619 acesulfame-K Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic Effects 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 1
- 229920002847 antisense RNA Polymers 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010038850 arginyl-isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 235000008984 brauner Senf Nutrition 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 108091000086 chlorophyll binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive Effects 0.000 description 1
- 108010054812 diprotin A Proteins 0.000 description 1
- 150000004141 diterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229930004069 diterpenes Natural products 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- KGNSGRRALVIRGR-UHFFFAOYSA-N gln-tyr Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KGNSGRRALVIRGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- KFVUFODCZDRVSS-XGBBNYNSSA-N iso-steviol Chemical compound C([C@]12C[C@@](C(C2)=O)(CC[C@H]11)C)C[C@H]2[C@@]1(C)CCC[C@@]2(C)C(O)=O KFVUFODCZDRVSS-XGBBNYNSSA-N 0.000 description 1
- 108010060857 isoleucyl-valyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large scale production Methods 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010030617 leucyl-phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 101710030587 ligN Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 101700077585 ligd Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010076718 lysyl-glutamyl-tryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000005445 natural product Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural products Natural products 0.000 description 1
- 235000021096 natural sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 108010070257 neotame Proteins 0.000 description 1
- 235000019412 neotame Nutrition 0.000 description 1
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 108010058453 phenylalanyl-glutamyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing Effects 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000019408 sucralose Nutrition 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010014563 tryptophyl-cysteinyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010029384 tryptophyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010079202 tyrosyl-alanyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SIGGQAHUPUBWNF-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O SIGGQAHUPUBWNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Proline Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQFAGNFSIZZYBA-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CCC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZQFAGNFSIZZYBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающий: a) подвергание первого стевиолового гликозида воздействию бета–глюкозидазы из вида Pichia в течение периода времени, достаточного для образования второго стевиолового гликозида посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого стевиолового гликозида; и b) сбор указанного второго стевиолового гликозида. Изобретение позволяет с высокой степенью эффективности изменять гликозилирование стевиолового гликозида. 31 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 8 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно параграфу 119(e) раздела 35 кодекса США по предварительной заявке на патент США № 62/527482, поданной 30 июня 2017 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[002] Область техники настоящего изобретения относится к способам и процессам, которые делают получение требуемых стевиоловых гликозидов более эффективным и менее дорогостоящим. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению гидролиза с помощью бета-глюкозидазы для обеспечения получения представляющих интерес стевиоловых гликозидов посредством биоконверсии.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[003] Настоящее изобретение направлено на превращение идентифицированных субстратов в представляющие интерес стевиоловые гликозиды. В частности, настоящее изобретение частично относится к более эффективному получению ребаудиозида M ("Reb M") посредством применения бета-глюкозидазы ("B-glu1") с осуществлением гидролиза конкретных субстратов, присутствующих в разрушенных рекомбинантных клетках, таких как рекомбинантные микробные клетки.
[004] Стевиоловые гликозиды представляют собой природные вещества, выделенные из листьев Stevia rebaudiana, и широко используются в качестве высокоинтенсивных низкокалорийных подсластителей в продуктах питания, кормах и напитках. Встречающиеся в природе стевиоловые гликозиды имеют одинаковую основную каркасную структуру дитерпена (стевиол), однако отличаются по количеству и структуре модификаций углеводных остатков (например, остатков глюкозы, рамнозы и ксилозы) в положениях C13 и C19 каркаса стевиола. Стевиоловые гликозиды с известными структурами включают стевиозид, ребаудиозид A, ребаудиозид B, ребаудиозид C, ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид F, ребаудиозид M и дулкозид A. С точки зрения коммерческого применения ребаудиозид M обычно считается безопасным (со статусом 'GRAS'), но его крайне трудно получать в ходе осуществления способов экстракции, и он требует значительных модификаций микробов для получения посредством только микробной биоконверсии.
[005] В пересчете на сухую массу, стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид С и дулкозид А составляют соответственно 9,l, 3,8, 0,6 и 0,30 процента от общего веса стевиоловых гликозидов в листьях Stevia дикого типа, тогда как другие стевиоловые глюкозиды, такие как Reb M, присутствуют в значительно меньших количествах. Применение рекомбинантных микробных клеток для получения представляющих интерес стевиоловых гликозидов известно, однако, учитывая диапазон биохимической активности конкретных ферментов, это может приводить к тому, что можно получить ряд разнообразных стевиоловых гликозидов из такого микробного штамма. В этих ситуациях разрушенные клетки таких штаммов могут содержать большие количества стевиозида (№ по CAS 57817-89-7), ребаудиозида A (№ по CAS 58543-16-1) или других стевиоловых гликозидов, среди которых Reb M представляет собой требуемый продукт. Количества данных соединений находятся в диапазоне от приблизительно 10-20% в случае стевиозида и приблизительно 5-10% в случае ребаудиозида A с другими незначительными компонентами, присутствующими в смеси.
[006] Как природные подсластители, различные стевиоловые гликозиды характеризуются различной степенью сладости, "вкусовыми ощущениями" и специфическими привкусами, связанными с каждым тестируемым видом ребаудиозидов. По сравнению со столовым сахаром (т. е. "сахарозой") сладость стевиоловых гликозидов значительно выше. Например, стевиозид в 100-150 раз слаще сахарозы, но имеет горький привкус, как отмечалось в тестах на вкус, тогда как сладость у ребаудиозидов А и Е в 250-450 раз выше, чем у сахарозы, но привкус, который намного менее заметен, чем у стевиозида, однако все еще присутствует. Соответственно, на вкусовые профили любых экстрактов stevia сильно влияет относительное содержание стевиоловых гликозидов в экстракте, что в свою очередь может зависеть от условий окружающей среды, в которых находятся основные растения, а также от применяемого способа экстракции. Такие различия в получении растений, погодных условиях и условиях экстракции могут приводить к непостоянным композициям стевиоловых гликозидов в экстрактах stevia, так что вкусовой профиль сильно варьируется между различными партиями продуктов экстракции. На вкусовой профиль экстрактов stevia также могут влиять загрязняющие вещества растительного происхождения или из окружающей среды (такие как пигменты, липиды, белки, фенольные смолы и сахариды), которые остаются в продукте после процесса экстракции. Эти загрязняющие вещества обычно имеют свои собственные неприятные запахи, нежелательные для применения экстракта stevia в качестве подсластителя в потребительских продуктах.
[007] Кроме того, стоимость выделения отдельных или конкретных комбинаций стевиоловых гликозидов, которые являются немногочисленными в экстрактах stevia, является чрезмерно затратной и ресурсоемкой. Получение стевиоловых гликозидов из стевиозида и Reb A небиологическими способами является затруднительным. Кислотный гидролиз стевиозида является проблематичным, поскольку в кислотных условиях получаемый стевиол подвергается перегруппировке в изостевиол. Учитывая ограниченное качество и доступность некоторых конкретных стевиоловых гликозидов, коммерческое получение может быть в большей степени удовлетворено с помощью биоконверсии, при этом природные ферменты или конкретные микробы могут быть модифицированы для переноса необходимых ферментов и применения коммерчески значимых способов ферментации для значительного увеличения получения гликозидов, представляющих интерес. Например, ранее сообщалось о биоконверсии стевиозида в Reb E (см. Mao et al., публикация заявки на патент США номер US2016/0207954, Некалорийный подсластитель) посредством пути ферментации с помощью модифицированных микробов. Как альтернатива, для разработки стевиоловых гликозидов, представляющих интерес, можно использовать другие инструменты, отличные от биосинтетических.
[008] С биологической точки, зрения все стевиоловые гликозиды образуются в результате серии реакций гликозилирования стевиола, которые обычно катализируются ферментами UDP-гликозилтрансферазы (UGT) с использованием уридин-5'-дифосфоглюкозы (UDP-глюкозы) в качестве донора фрагмента сахара. У растений UGT представляют собой очень разнородную группу ферментов, которые переносят остаток глюкозы из UDP-глюкозы в стевиол. В таких реакциях стевиозид часто является промежуточным звеном в биосинтезе различных ребаудиозидных соединений. Например, гликозилирование стевиозида в положении C-3' в С-13-О-глюкозе стевиозида дает в результате ребаудиозид А; тогда как гликозилирование в положении C-2' в 19-O-глюкозе стевиозида дает в результате ребаудиозид Е.
[009] В соответствии с настоящим изобретением практический подход для улучшения вкусовых качеств экстрактов stevia состоит в том, чтобы увеличить выход тех ребаудиозидных соединений, которые в целом имеют более желательные вкусовые характеристики, и осуществить это посредством более продуктивного пути синтеза и связанных с ним способов. Считается, что из таких протестированных стевиоловых гликозидов Reb M обладает наиболее желательным вкусом и химическими характеристиками для применения в пищевых продуктах и напитках. Однако, как указывалось выше, растение содержит чрезвычайно малые количества этого соединения, присутствующего в его листьях, а следовательно, необходимы альтернативные способы для обеспечения возможности крупномасштабного производства этого гликозида и содействия ему, а также предоставления альтернативных подсластителей для пищевой промышленности и производства напитков.
[0010] Соответственно, существует необходимость в разработке стевиоловых гликозидов с лучшими и более постоянными вкусовыми профилями в качестве коммерческих продуктов и обеспечении возможности применения в таких стевиоловых гликозидах соответствующего общего исходного субстрата, такого как более распространенные стевиоловые гликозиды в качестве исходной молекулы, таким образом, чтобы такое получение требуемых гликозидов могло быть коммерчески настолько эффективным, насколько это возможно. В настоящем изобретении предусмотрен способ улучшения получения необходимых стевиоловых гликозидов.
[0011] Новые способы получения также необходимы для снижения затрат на получение стевиоловых гликозидов и уменьшения воздействия крупномасштабного культивирования и переработки в отношении окружающей среды (Yao et al., 1994). Одним из таких потенциальных решений является применение технологии ферментационной биоконверсии, которая обеспечивает получение в определенных видах микробов или других рекомбинантных клетках, что повышает селективность, количество и чистоту требуемых стевиоловых гликозидов, доступных для коммерческой деятельности, и увеличение присутствующего количества требуемого ребаудиозида путем применения гидролитического фермента для обеспечения такого получения в клеточном лизате из культур модифицированных микробов или других культур модифицированных клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] Частично настоящее изобретение охватывает способ получения повышенных количеств ребаудиозида M (Reb M) из различных стевиоловых гликозидов посредством применения гидролитической активности бета-глюкозидазы. Более конкретно, в настоящем изобретении предусмотрен улучшенный способ получения требуемых стевиоловых гликозидов из разрушенных рекомбинантных клеток (например, рекомбинантных микробных клеток), содержащих представляющие интерес субстраты. При этом такие клетки (например, микробы) были модифицированы, чтобы нести гены, способные к обеспечению продуцирования представляющих интерес стевиоловых гликозидов, в том числе ребаудиозида A (Reb A), ребаудиозида E (Reb E) и/или стевиозида. В данном варианте осуществления способ включает стадии получения материала из разрушенных клеток (например, микробных клеток) и проведения ферментативного гидролиза стевиозидов, присутствующих в указанных продуктах жизнедеятельности, для увеличения получения Reb M.
[0013] Что касается продукта/коммерческого применения, то в Соединенных Штатах на рынке имеется несколько десятков продуктов, содержащих стевиоловые гликозиды, и их можно использовать в составе чего угодно - от анальгетиков до репеллентов против вредителей, а также в продуктах питания и в пищевых добавках. Продукты, содержащие представляющие интерес стевиоловые гликозиды, могут включать аэрозоли, жидкости или гранулированные составы.
[0014] Что касается клеточной системы согласно настоящему изобретению, то она выбрана из группы, состоящей из бактерий, дрожжей и их комбинации, или любой клеточной системы, которая дала бы возможность осуществить генетическую трансформацию с помощью выбранных генов, а затем биосинтетическое получение требуемых стевиоловых гликозидов из стевиола. В наиболее предпочтительной микробной системе для получения требуемых соединений стевиоловых гликозидов применяют E. coli с проведением впоследствии гидролиза посредством бета-глюкозидазы.
[0015] Бета-глюкозидазы представляют собой конститутивные ферменты, часто присутствующие в нижних отделах желудочно-кишечных трактов животных, и применимы в качестве средства, способствующего пищеварению и всасыванию пищевого материала. В соответствии с настоящим изобретением B-glu1 применяют для осуществления гидролиза стевиозида, ребаудиозида E (Reb E), ребаудиозида A (Reb A), ребаудиозида I (Reb I), ребаудиозида D (Reb D), ребаудиозида G (Reb G) и рубузозида. Гидролиз протекает посредством образования в начале стевиолбиозида с образованием стевиола в качестве конечного продукта гидролиза.
[0016] Соответственно, в аспектах настоящего изобретения предусматриваются способы изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающие a) обеспечение рекомбинантной клетки (например, клетки микроба, водоросли или растения), модифицированной с обеспечением продуцирования первого субстрата; b) разрушение указанной рекомбинантной клетки с высвобождением ее клеточного цитозоля, где такой цитозоль содержит указанный первый субстрат; c) получение цитозоля из указанной рекомбинантной клетки; d) подвергание указанного цитозоля воздействию бета-глюкозидазы, где такая бета-глюкозидаза характеризуется гидролитической активностью в течение периода времени, достаточного для образования второго представляющего интерес субстрата посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого субстрата; и e) сбор указанного второго представляющего интерес субстрата.
[0017] В некоторых вариантах осуществления указанный первый субстрат представляет собой стевиоловый гликозид. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb M. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb B. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb A. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субстрат представляют собой субстраты, описанные в таблице 1 или на фигуре в данном документе (например, фиг. 9).
[0018] В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 указанного стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 указанного стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы либо в положении C19 указанного стевиолового гликозида, либо в положении C13 указанного стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы как в положении C19 указанного стевиолового гликозида, так и в положении C13 указанного субстрата.
[0019] В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 рубузозида с получением стевиол-13-глюкозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb E с получением стевиолбиозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb I с получением Reb A. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb A с получением Reb B.
[0020] В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 стевиол-13-глюкозида с получением стевиола. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 Reb D с получением Reb B или Reb A. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 и в положении C13 Reb G с получением стевиол-13-глюкозида.
[0021] Способы, представленные в данном документе, в некоторых аспектах дополнительно включают применение ферментов бета-галактозидазы или пектиназы для увеличения скорости ферментативного гидролиза. В некоторых вариантах осуществления способы, представленные в данном документе, дополнительно включают обеспечение экспрессии стевиолового гликозида в трансформированной клеточной системе; выращивание клеточной системы в среде и получение указанного второго представляющего интерес субстрата.
[0022] В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 6 часов.
[0023] В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 12 часов. В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 18 часов. В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 24 часа. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой стевиоловый гликозид.
[0024] В некоторых вариантах осуществления бета-глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% (например, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%) идентичностью с SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления бета-глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95% (например, на по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%) идентична SEQ ID NO:3.
[0025] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка выбрана из группы, состоящей из бактерии, дрожжей, нитчатого гриба, водоросли, представляющей собой цианобактерию, и растительной клетки. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка (например, микроб) выбрана из группы, состоящей из Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Yarrowia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium и Clostridium acetobutylicum.
[0026] В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой стевиоловый гликозид. В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb E. В некоторых вариантах осуществления указанный второй субстрат представляет собой смесь Reb E, Reb D4 и Reb M. В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb D4. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой смесь стевиоловых гликозидов, а содержание стевиоловых гликозидов из данной смеси в совокупности выше, чем любых других компонентов полученного из цитозоля концентрата по весу в пересчете на сухое вещество.
[0027] В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес субстрат на стадии e) представляет собой неочищенный продукт, и стадия e) дополнительно включает i) очистку указанного неочищенного продукта и ii) удаление растворителей под вакуумом с получением концентрированного продукта.
[0028] В некоторых вариантах осуществления очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью колоночной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью кислотно-щелочной экстракции. В некоторых вариантах очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью вакуумной перегонки.
[0029] Способы, представленные в данном документе, в некоторых вариантах осуществления дополнительно включают очистку концентрированного продукта с применением полупрепаративной HPLC.
[0030] Несмотря на то, что настоящее изобретение допускает различные модификации и альтернативные формы, его конкретные варианты осуществления показаны в виде примера в графических материалах и будут подробно описаны в данном документе. Однако следует понимать, что графические материалы и подробное описание, представленные в данном документе, не предназначены для ограничения настоящего изобретения описанным конкретным вариантом осуществления, а напротив - намерение состоит в том, чтобы охватить все модификации, эквиваленты и альтернативы, соответствующие духу и объему настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[0031] Другие признаки и преимущества данного изобретения станут очевидными из следующего подробного описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, взятых со ссылкой на прилагаемые графические материалы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0032] На фиг. 1 показан гидролиз рубузозида посредством фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia. A: профили HPLC продуктов гидролиза рубузозида, a: стандарт стевиола ("S"); b: стандарт рубузозида ("Rub"); c-d: рубузозид расщепляли с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c) и 3 часа (d); e-f: рубузозид подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 1 час (e) и 6 часов (f). B: путь гидролиза рубузозида, катализируемого B-glu1. Рубузозид подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиол-13-глюкозида ("S-13-G") и стевиола.
[0033] На фиг. 2 показан гидролиз стевиозида посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза стевиозида, a: стандарт стевиозида ("ST"); b: стандарт стевиолбиозида ("SB"); c-e: стевиозид подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c), 6 часов (d) и 24 часа (e). B: путь гидролиза стевиозида, катализируемого B-glu1. Стевиозид подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением стевиолбиозида.
[0034] На фиг. 3 показан гидролиз ребаудиозида E посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида E. a: стандарт стевиолбиозида ("SB"); b: стандарт ребаудиозида E ("E"); c-e: ребаудиозид E подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c), 6 часов (d) и 24 часа (e). B: путь гидролиза ребаудиозида E, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид E подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением стевиолбиозида.
[0035] На фиг. 4 показан гидролиз ребаудиозида A посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида A, a: стандарт ребаудиозида A ("Reb A"); b: стандарт ребаудиозида B ("Reb B"); c-d: ребаудиозид A подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c) и 6 часов (d). B: путь гидролиза ребаудиозида A, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид A подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением ребаудиозида B.
[0036] На фиг. 5 показан гидролиз ребаудиозида I посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида I, a: стандарт ребаудиозида A ("Reb A"); b: стандарт ребаудиозида B ("Reb B"); c: стандарт ребаудиозида I ("Reb I"), d-f: ребаудиозид I подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (d), 6 часов (e) и 24 часа(f). B: путь гидролиза ребаудиозида I, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид I подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида A и ребаудиозида B.
[0037] На фиг. 6 показан гидролиз ребаудиозида D посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида D, a: стандарт ребаудиозида B ("Reb B"); b: стандарт ребаудиозида D ("Reb D"); c-e: ребаудиозид D подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c), 6 часов (d) и 24 часа (e). B: путь гидролиза ребаудиозида D, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид D подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида A и ребаудиозида B.
[0038] На фиг. 7 показан гидролиз ребаудиозида G посредством фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида G, a: стандарт стевиола ("Стевиол"), стевиол-13-глюкозида ("S-13-G"); b: стандарт ребаудиозида G ("G"); b-d: ребаудиозид G подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 0,5 часа (c), 1 час (d) и 6 часов (e); f: ребаудиозид G подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа (f). B: путь гидролиза ребаудиозида G, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид G подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением стевиол-13-глюкозида ("S-13-G") и стевиола.
[0039] На фиг. 8 показан гидролиз стевиоловых гликозидов с помощью разрушенных клеток pichia, a: стандарт стевиолбиозида ("SB"); b: стандарт ребаудиозида B ("B"); c: стевиозид подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; d: ребаудиозид E ("E") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; e: ребаудиозид A ("A") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; f: ребаудиозид I ("I") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; g: ребаудиозид D ("D") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа.
[0040] На фиг. 9 показано, что B-Glu1 может осуществлять гидролиз различных субстратов, представляющих собой стевиоловые гликозиды. Черная линия: гликозилирование; пунктирная линия: гидролиз.
[0041] На фиг. 10 показан путь синтеза для получения Reb M и Reb WB2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Объяснение терминов, используемых в данном документе
[0042] Стевиоловые гликозиды представляют собой класс химических соединений, отвечающих за сладкий вкус листьев южноамериканского растения Stevia rebaudiana (Asteraceae), и могут использоваться в качестве подсластителей в пищевых продуктах, кормах и напитках.
Определения
[0043] Клеточная система представляет собой любые клетки, которые обеспечивают экспрессию эктопических белков. Такая система предусматривает бактерии, дрожжи, растительные клетки и животные клетки. Она включает как прокариотические, так и эукариотические клетки. Она также обеспечивает экспрессию белков in vitro на основе клеточных компонентов, таких как рибосомы.
[0044] Термин кодирующая последовательность представлен в своем обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и используется без ограничения для обозначения последовательности ДНК, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность.
[0045] Выращивание клеточной системы. Выращивание включает предоставление соответствующей среды, которая дала бы возможность клеткам размножаться и делиться. Оно также предусматривает предоставление ресурсов для того, чтобы клетки или клеточные компоненты могли транслироваться и производить рекомбинантные белки.
[0046] Экспрессия белка. Выработка белка может происходить после экспрессии гена. Она предусматривает стадии, после того, как ДНК была транскрибирована в матричную РНК (mRNA). Затем mRNA транслируется в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в белки. ДНК присутствует в клетках в результате трансфекции - процесса намеренного введения нуклеиновых кислот в клетки. Термин часто используется для невирусных способов в эукариотических клетках. Данный термин может также относиться к другим способам и типам клеток, хотя предпочтительными являются другие термины: "трансформация" чаще используется для описания невирусного переноса ДНК в бактериях, эукариотических клетках неживотного происхождения, в том числе растительных клетках. Для животных клеток трансфекция является предпочтительным термином, поскольку трансформация также используется для обозначения прогрессирования до ракового состояния (канцерогенеза) в этих клетках. Термин трансдукция часто используется для описания вирус-опосредованного переноса ДНК. Трансформация, трансдукция и вирусная инфекция включены в определение трансфекции для данного применения.
[0047] Дрожжи. В соответствии с настоящим изобретением, дрожжи, заявленные в данном документе, представляют собой эукариотические одноклеточные микроорганизмы, классифицированные как представители царства грибов. Дрожжи представляют собой одноклеточные организмы, которые произошли от многоклеточных предков, однако некоторые виды, применимые в настоящем изобретении, представляют собой такие, которые обладают способностью развивать многоклеточные характеристики путем образования цепочек связанных почкующихся клеток, известных как псевдогифы или ложные гифы.
[0048] Названия ферментов UGT, применяемых в настоящем изобретении для получения различных стевиоловых гликозидов, соответствуют системе номенклатуры, принятой Комитетом по номенклатуре UGT (Mackenzie et al., "The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence," Pharmacogenetics, 1997, vol. 7, pp. 255-269), который классифицирует гены UGT посредством комбинации номера семейства, буквы, обозначающей подсемейство, и номера для отдельного гена. Например, название "UGT76Gl" относится к ферменту UGT, кодируемому геном, принадлежащим к семейству UGT № 76 (растительного происхождения), подсемейству G и гену l.
Структурные термины
[0049] Используемые в данном документе формы существительных единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, если контекст ясно не указывает на иное.
[0050] В той степени, в которой термин "включать", "иметь" или т. п. используется в описании или формуле изобретения, подразумевается, что такой термин предназначен для включения, аналогичным образом как термин "содержать", так как термин "содержать" интерпретируется при использовании как переходное слово в формуле.
[0051] Слово "примерный" используется в данном документе для обозначения "служащий примером, образцом или иллюстрацией". Любой вариант осуществления, описанный в данном документе как "примерный", не обязательно должен рассматриваться как предпочтительный или преимущественный по сравнению с другими вариантами осуществления.
[0052] Термин "комплементарный" приведен в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и используется без ограничения для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, которые способны гибридизироваться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, применяемая технология также подразумевает выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными полным последовательностям, как указано в прилагаемом перечне последовательностей, а также эти по существу сходные последовательности нуклеиновых кислот.
[0053] Термины "нуклеиновая кислота" и "нуклеотид" представлены в соответствии с их обычными и общепринятыми значениями для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для обозначения дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов и их полимеров в одно- или двухнитевой форме. Если не указаны конкретные ограничения, то данный термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают свойствами связывания, сходными с эталонной нуклеиновой кислотой, и метаболизируются способом, сходным со встречающимися в природе нуклеотидами. Если не указано иное, то конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает консервативно модифицированные или вырожденные варианты (например, замены вырожденного кодона) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность.
[0054] Термин "выделенный" приведен в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники, и при использовании в контексте выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, посредством производимых человеком манипуляций, существуют отдельно от его природной среды, а следовательно не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид может существовать в очищенной форме или может существовать в ненативной среде, например, такой как трансгенная клетка-хозяин.
[0055] Термины "инкубирование" и "инкубация", используемые в данном документе, означают способ смешивания двух или больше химических или биологических объектов (таких как химическое соединение и фермент) и предоставление им возможности взаимодействовать в условиях, благоприятных для получения композиции стевиоловых гликозидов.
[0056] Термин "вырожденный вариант" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей остаточную последовательность, которая отличается от контрольной последовательности нуклеиновой кислоты по одной или нескольким вырожденным заменам кодонов. Замены вырожденных кодонов могут быть достигнуты путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещено остатками смешанного основания и/или дезоксиинозина. Последовательность нуклеиновой кислоты и все ее вырожденные варианты будут экспрессировать одну и ту же аминокислоту или полипептид.
[0057] Термины "полипептид", "белок" и "пептид" представлены в соответствии с их обычными и общепринятыми значениями для специалиста в данной области техники; эти три термина иногда взаимозаменяемы и используются без ограничения для обозначения полимера аминокислот или аналогов аминокислот, независимо от их размера или функции. Хотя термин "белок" зачастую используется при ссылке на относительно большие полипептиды, а термин "пептид" зачастую используется при ссылке на небольшие полипептиды, - использование этих терминов в уровне техники перекрывается и варьирует. Используемый в данном документе термин "полипептид" относится к пептидам, полипептидам и белкам, если не указано иное. Термины "белок", "полипептид" и "пептид" используются в данном документе взаимозаменяемо в случае ссылки на полинуклеотидный продукт. Таким образом, полипептиды включают полинуклеотидные продукты, встречающиеся в природе полипептиды, гомологи, ортологи, паралоги, фрагменты и другие эквиваленты, варианты и аналоги вышеуказанных.
[0058] Термины "полипептидный фрагмент" и "фрагмент", в случае использования в отношении эталонного полипептида, представлены в их обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для ссылки на полипептид, в котором аминокислотные остатки удалены по сравнению с самим эталонным полипептидом, но где оставшаяся аминокислотная последовательность обычно идентична соответствующим положениям в эталонном полипептиде. Такие делеции могут происходить на амино-конце и карбокси-конце эталонного полипептида или, как альтернатива, на обоих.
[0059] Термин "функциональный фрагмент" полипептида или белка относится к пептидному фрагменту, который является частью полноразмерного полипептида или белка и характеризуется практически такой же биологической активностью или выполняет по существу ту же функцию, что и полноразмерный полипептид или белок (например, проведение той же ферментативной реакции).
[0060] Термины "вариантный полипептид", "модифицированная аминокислотная последовательность" или "модифицированный полипептид", которые используются взаимозаменяемо, относятся к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонного полипептида одной или несколькими аминокислотами, например, одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями и/или добавлениями. В одном аспекте вариант представляет собой "функциональный вариант", который сохраняет некоторые или все способности эталонного полипептида.
[0061] Термин "функциональный вариант" дополнительно включает консервативно замещенные варианты. Термин "консервативно замещенный вариант" относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от эталонного пептида одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами и сохраняет некоторую или всю активность эталонного пептида. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену аминокислотного остатка функционально подобным остатком. Примеры консервативных замен включают замену одного неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой; замену одного заряженного или полярного (гидрофильного) остатка на другой, как например, между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, между треонином и серином; замену одного основного остатка, такого как лизин или аргинин, на другой; или замену одного кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, на другой; или замена одного ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин или триптофан, на другой. Ожидается, что такие замены будут проявлять незначительный эффект или вообще не будут проявлять эффекта в отношении кажущейся молекулярной массы или изоэлектрической точки белка или полипептида. Фраза "консервативно замещенный вариант" также подразумевает пептиды, в которых остаток заменен химически дериватизированным остатком, при условии, что полученный пептид сохраняет часть или всю активность эталонного пептида, как описано в данном документе.
[0062] Термин "вариант" в связи с полипептидами согласно заявленной технологии дополнительно включает функционально активный полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, на по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже на 100% идентичной аминокислотной последовательности эталонного полипептида.
[0063] Термин "гомологичный" во всех его грамматических формах и вариациях правописания относится к связи между полинуклеотидами или полипептидами, которые имеют "общее эволюционное происхождение", в том числе полинуклеотидами или полипептидами из суперсемейств и гомологичными полинуклеотидами или белками из разных видов (Reeck et al., Cell 50:667, 1987). Такие полинуклеотиды или полипептиды характеризуются гомологией последовательностей, что отражается в сходстве их последовательностей, будь то в отношении процентов идентичности или присутствия конкретных аминокислот или мотивов в консервативных положениях. Например, два гомологичных полипептида могут иметь аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 900 по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92% , по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже на 100% идентичны.
[0064] Термин "подходящие регуляторные последовательности" представлен в своем обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники, и он используется без ограничения для обозначения нуклеотидных последовательностей, расположенных выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, и которые могут оказывать влияние на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или на трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать в себя промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны и последовательности распознавания полиаденилирования.
[0065] Термин "промотор" представлен в своем обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники, и он используется без ограничения для обозначения последовательности ДНК, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Как правило, кодирующая последовательность расположена на 3'-конце относительно промоторной последовательности. Промоторы могут быть получены полностью из нативного гена или могут состоять из разных элементов, полученных из разных промоторов, обнаруживаемых в природе, или даже содержать сегменты синтетической ДНК. Специалисты в данной области техники поймут, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, на различных стадиях развития или в ответ на различные условия окружающей среды. Промоторы, которые обуславливают экспрессию генов в большинстве типов клеток в большинстве случаев, чаще всего обычно называют "конститутивными промоторами". Кроме того, известно, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не были полностью определены, то ДНК-фрагменты с разными значениями длины могут характеризоваться идентичной промоторной активностью.
[0066] Термин "функционально связанный" относится к ассоциации последовательностей нуклеиновой кислоты на одном фрагменте нуклеиновой кислоты таким образом, что функция одной регулируется другой. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен влиять на экспрессию данной кодирующей последовательности (т.e. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.
[0067] Используемый в данном документе термин "экспрессия" должен пониматься в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и использоваться без ограничения для обозначения транскрипции и стабильного накопления смысловой (mRNA) или антисмысловой РНК, происходящей из фрагмента нуклеиновой кислоты согласно заявленной технологии. "Сверхэкспрессия" относится к выработке генного продукта в трансгенных или рекомбинантных организмах, которая превышает уровни выработки в нормальных или нетрансформированных организмах.
[0068] Термин "трансформация" должен пониматься в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и использоваться без ограничения для обозначения переноса полинуклеотида в клетку-мишень. Перенесенный полинуклеотид может быть включен в геном или хромосомную ДНК клетки-мишени, что приводит к генетически стабильному наследованию, или он может реплицироваться независимо от хромосомы хозяина. Организмы-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновой кислоты, называются "трансгенными" или
[0069] Термины "трансформированный", "трансгенный" и "рекомбинантный", в случае использования в данном документе в связи с клетками-хозяевами, представлены в их соответствующих обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения в отношении клетки организма-хозяина, такой как растительная или микробная клетка, в которую была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном клетки-хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть самореплицирующейся. Под трансформированными клетками, тканями или субъектами понимают не только конечный продукт процесса трансформации, но и его трансгенное потомство.
[0070] Термины "рекомбинантный", "гетерологичный" и "экзогенный", в случае использования в данном документе в связи с полинуклеотидами, представлены в их обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для обозначения полинуклеотида (например, последовательности ДНК или гена), который происходит из источника, чужеродного по отношению к конкретной клетке-хозяину, или, если из того же источника, то модифицированного относительно своей первоначальной формы. Таким образом, гетерологичный ген в клетке-хозяине предусматривает ген, который является эндогенным для конкретной клетки-хозяина, однако был модифицирован, например, с помощью применения сайт-направленного мутагенеза или других рекомбинантных методов. Термины также включают не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности ДНК. Таким образом, термины относятся к сегменту ДНК, который является чужеродным или гетерологичным по отношению к клетке, или гомологичным по отношению к клетке, но в положении или форме внутри клетки-хозяина, в которой элемент обычно не обнаруживается.
[0071] Аналогично, термины "рекомбинантный", "гетерологичный" и "экзогенный", в случае использования в данном документе в связи с полипептидной или аминокислотной последовательностью, означают полипептидную или аминокислотную последовательность, которая происходит из источника, чужеродного по отношению к конкретной клетке-хозяину, или, если из того же источника, то модифицированного относительно своей первоначальной формы. Таким образом, рекомбинантные сегменты ДНК могут быть экспрессированы в клетке-хозяине с образованием рекомбинантного полипептида.
[0072] Термины "плазмида", "вектор" и "кассета" представлены в их соответствующих обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для обозначения дополнительного хромосомного элемента, часто несущего гены, которые не являются частью центрального метаболизма клетки, и, как правило, в виде кольцевых двухнитевых молекул ДНК. Такие элементы могут представлять собой автономно реплицирующиеся последовательности, интегрируемые в геном последовательности, фаговые или нуклеотидные последовательности, линейные или кольцевые, одно- или двухнитевые ДНК или РНК, полученные из любого источника, в которых число нуклеотидных последовательностей было объединено или рекомбинировано в уникальную конструкцию, которая обладает способностью введения в клетку промоторного фрагмента и последовательности ДНК для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3'-нетранслируемой последовательностью.
[0073] "Кассета для трансформации" относится к конкретному вектору, содержащему чужеродный ген и имеющему элементы, в дополнение к чужеродному гену, которые способствуют трансформации конкретной клетки-хозяина.
[0074] "Кассета экспрессии" относится к конкретному вектору, содержащему чужеродный ген и содержащему элементы, в дополнение к чужеродному гену, которые обеспечивают усиленную экспрессию этого гена в чужеродном хозяине.
[0075] Настоящее изобретение относится к получению представляющего интерес стевиолового гликозида с помощью фермента B-glu1.
Биология синтеза
[0076] Применяемые в данном документе стандартные методики рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (далее в данном документе "Maniatis"); и в Silhavy, T.J., Bennan, M.L. and Enquist, L.W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; и в Ausubel, F.M. et al., In Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987; (полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки).
[0077] Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту обычной квалификации в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже будут описаны предпочтительные способы и материалы.
[0078] Гликозилирование часто считают убиквитарной реакцией, контролирующей биологическую активность и хранение растительных природных продуктов. Гликозилирование небольших молекул катализируется посредством суперсемейства трансфераз у большинства видов растений, которые были изучены до настоящего времени. Указанные гликозилтрансферазы (GT) были классифицированы на более чем 60 семейств. Из них семейство ферментов GT, также известных как UDP-гликозилтрансферазы (UGT), переносит UDP-активированные фрагменты сахара на специфические акцепторные молекулы. Они представляют собой молекулы, которые переносят такие фрагменты сахара в стевиоловых гликозидах для создания различных ребаудиозидов. Каждая из таких UGT имеет свой собственный профиль активности и предпочтительные структурные месторасположения, куда они переносят свои активированные фрагменты сахара.
Системы для получения
[0079] Экспрессия белков в прокариотах чаще всего осуществляется в бактериальной клетке-хозяине в присутствии векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, направляющие экспрессию слитых или не слитых белков. Слитые векторы добавляют некоторое количество аминокислот к белку, который они кодируют, обычно к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат трем целям: 1) увеличить экспрессию рекомбинантного белка; 2) повысить растворимость рекомбинантного белка и 3) помочь в очистке рекомбинантного белка, действуя в качестве лиганда в аффинной очистке. Часто в участок соединения слитого фрагмента и рекомбинантного белка вводят сайт протеолитического расщепления для обеспечения отделения рекомбинантного белка от слитого фрагмента после очистки слитого белка. Такие векторы находятся в пределах объема настоящего изобретения.
[0080] В одном варианте осуществления вектор экспрессии включает в себя указанные генетические элементы для экспрессии рекомбинантного полипептида в бактериальных клетках. Элементы для транскрипции и трансляции в бактериальной клетке могут включать в себя промотор, кодирующую область для белкового комплекса и терминатор транскрипции.
[0081] Специалист в данной области техники должен быть знаком с методами молекулярной биологии, доступными для получения векторов экспрессии. Полинуклеотид, используемый для включения в вектор экспрессии согласно заявленной технологии, описанной выше, может быть получен обычными методами, такими как полимеразная цепная реакция (ПЦР).
[0082] Разработан ряд методов молекулярной биологии для функционального связывания ДНК с векторами посредством комплементарных липких концов. В одном варианте осуществления к молекуле нуклеиновой кислоты для вставки в векторную ДНК могут быть добавлены комплементарные гомополимерные участки. Вектор и молекула нуклеиновой кислоты затем соединяются посредством водородных связей между комплементарными гомополимерными хвостами с образованием молекул рекомбинантной ДНК.
[0083] В альтернативном варианте осуществления для функционального связывания полинуклеотида согласно заявленной технологии с вектором экспрессии используют синтетические линкеры, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, В одном варианте осуществления полинуклеотид получают путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой. В одном варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты обрабатывают ДНК-полимеразой бактериофага T4 или ДНК-полимеразой I E. coli, ферментами, которые удаляют выступающие 3'-однонитевые концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями, и заполняют углубленными 3'-концами с их полимеризующими активностями, с получением тем самым сегментов ДНК с тупыми концами. Затем сегменты с тупыми концами инкубируют с большим молярным избытком молекул линкера в присутствии фермента, который способен катализировать лигирование молекул ДНК с тупыми концами, такого как ДНК-лигаза бактериофага T4. Таким образом, продуктом реакции является полинуклеотид, несущий на своих концах полимерные линкерные последовательности. Такие полинуклеотиды затем расщепляются с помощью соответствующего рестрикционного фермента и лигируются с вектором экспрессии, который расщепляется с помощью фермента, образующего концы, совместимые с таковыми у полинуклеотида.
[0084] Как альтернатива, можно использовать вектор, содержащий сайты безлигазного клонирования (LIC). Необходимый полинуклеотид, амплифицированный с помощью ПЦР, может быть затем клонирован в вектор LIC без рестрикционного расщепления или лигирования (Aslanidis and de Jong, Nucl. Acid. Res. 18 6069-74, (1990), Haun, et al, Biotechniques 13, 515-18 (1992), который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме в такой степени, что он не противоречит настоящему документу).
[0085] В одном варианте осуществления для выделения и/или модификации полинуклеотида, представляющего интерес, для вставки в выбранную плазмиду целесообразно использовать ПЦР. Для использования при получении последовательности посредством ПЦР могут быть разработаны подходящие праймеры для выделения необходимой кодирующей области молекулы нуклеиновой кислоты, добавления рестрикционных эндонуклеаз или сайтов LIC, размещения кодирующей области в требуемой рамке считывания.
[0086] В одном варианте осуществления полинуклеотид для включения в вектор экспрессии согласно заявленной технологии получен путем применения ПЦР с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Кодирующая область амплифицируется, тогда как сами праймеры включены в амплифицированный продукт последовательности. В одном варианте осуществления праймеры для амплификации содержат сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые дают возможность клонировать амплифицированный продукт последовательности в соответствующий вектор.
[0087] Векторы экспрессии могут быть введены в рекомбинантную клетку-хозяина (например, растительные или микробные клетки-хозяева) с помощью традиционных методик трансформации или трансфекции. Трансформация подходящих клеток с помощью вектора экспрессии согласно заявленной технологии осуществляется с помощью способов, известных из уровня техники, и обычно зависит как от типа вектора, так и от клетки. Подходящие методы включают совместное осаждение фосфата кальция или хлорида кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, липофекцию, химиопорацию или электропорацию.
[0088] Успешно трансформированные клетки, т. е. те клетки, которые содержат вектор экспрессии, можно идентифицировать с помощью способов, хорошо известных из уровня техники. Например, клетки, трансфицированные посредством вектора экспрессии согласно заявленной технологии, можно культивировать для получения полипептидов, описанных в данном документе. Клетки можно исследовать на наличие ДНК вектора экспрессии с помощью методик, хорошо известных из уровня техники.
[0089] Клетки-хозяева могут содержать одну копию описанного ранее вектора экспрессии, или, как альтернатива, несколько копий вектора экспрессии.
[0090] В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка представляет собой животную клетку, клетку насекомого, растительную клетку, клетку водорослей, клетку гриба или дрожжевую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой растительную клетку, выбранную из группы, состоящей из растительной клетки канолы, растительной клетки рапса, растительной клетки пальмы, растительной клетки подсолнечника, растительной клетки хлопка, растительной клетки кукурузы, растительной клетки арахиса, растительной клетки льна, растительной клетки кунжута, растительной клетки сои и растительной клетки петунии.
[0091] Микробная клетка-хозяин и другие системы экспрессии на основе клеток-хозяев и векторы экспрессии, содержащие регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию высоких уровней чужеродных белков, хорошо известны специалистам в данной области техники. Любые из них можно использовать для конструирования векторов для экспрессии рекомбинантного полипептида согласно заявленной технологии в микробной клетке-хозяине. Такие векторы могут затем быть введены в соответствующие микроорганизмы посредством трансформации для обеспечения высокого уровня экспрессии рекомбинантного полипептида согласно заявленной технологии.
[0092] Векторы или кассеты, используемые для трансформации подходящих микробных клеток-хозяев и других клеток-хозяев, хорошо известны из уровня техники. Обычно вектор или кассета содержит последовательности, управляющие транскрипцией и трансляцией соответствующего полинуклеотида, селектируемый маркер и последовательности, обеспечивающие автономную репликацию или интеграцию в хромосому. Подходящие векторы содержат 5'-область полинуклеотида, которая несет элементы, управляющие инициацией транскрипции, и 3'-область ДНК фрагмента, которая управляет терминацией транскрипции. Предпочтительно, чтобы обе контрольных области были получены из генов, гомологичных трансформированной клетке-хозяину, хотя следует понимать, что такие контрольные области не должны быть получены из генов, нативных по отношению к конкретным видам, выбранным в качестве хозяина.
[0093] Контролирующие инициацию области или промоторы, которые подходят для управления экспрессией рекомбинантного полипептида в требуемой микробной клетке-хозяине или другой клетке-хозяине, многочисленны и знакомы специалистам в данной области техники. Фактически любой промотор, способный управлять этими генами, подходит для заявленной технологии, в том числе без ограничения CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI (подходит для экспрессии в Saccharomyces); AOXI (подходит для экспрессии в Pichia); а также lac, trp, JPL, IPR, T7, tac и trc (подходят для экспрессии в Escherichia coli).
[0094] Области управления терминацией также можно получить из различных генов, нативных по отношению к предпочтительной клетке-хозяину. Сайт терминации необязательно может быть включен для микробных хозяев, описанных в данном документе.
[0095] В растительных клетках векторы экспрессии согласно заявленной технологии могут включать в себя кодирующую область, функционально связанную с промоторами, способными направлять экспрессию рекомбинантного полипептида согласно заявленной технологии в требуемых тканях на требуемой стадии развития. Для удобства, экспрессируемые полинуклеотиды могут содержать промоторные последовательности и лидерные последовательности трансляции, полученные из одного и того же полинуклеотида. Также должны присутствовать 3'-некодирующие последовательности, кодирующие сигналы терминации транскрипции. Векторы экспрессии также могут содержать один или несколько интронов для облегчения экспрессии полинуклеотидов.
[0096] Для растительных клеток-хозяев любая комбинация любого промотора и любого терминатора, способных индуцировать экспрессию кодирующей области, может использоваться в векторных последовательностях согласно заявленной технологии. Некоторые подходящие примеры промоторов и терминаторов включают гены нопалинсинтазы (nos), октопинсинтазы (ocs) и вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Одним типом эффективного промотора растения, который можно использовать, является высокоэффективный промотор растения. Такие промоторы в функциональной связи с вектором экспрессии согласно заявленной технологии должны быть способны стимулировать экспрессию вектора. Высокоэффективные растительные промоторы, которые можно использовать в заявленной технологии, включают промотор малой субъединицы(субъединиц) рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы, например, из сои (Berry-Lowe et al., J. Molecular and App. Gen., 1:483 498 (1982), полное содержание которого включено в данный документ в том объеме, в котором оно согласуется с ним), и промотор хлорофилл-связывающего белка. Известно, что эти два промотора индуцируются светом в растительных клетках (см., например, Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, N.Y. (1983), страницы 29 38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological Chemistry, 258: 1399 (1983) и Dunsmuir, P. et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 2:285 (1983), полное содержание которого включено в данный документ в том объеме, в котором оно согласуется с ним).
Способы разрушения клеток
[0097] Разрушение клеток представляет собой совокупность методик, применяемых для высвобождения представляющих интерес биомолекул из клетки. Многие получаемые биотехнологическим способом соединения являются внутриклеточными и подлежат высвобождению из клеток перед выделением. Эффективное выделение продуктов требует проведения разрушения клеток, которое может быть достигнуто с помощью различных способов и технологий, способов, являющихся либо механическими, либо немеханическими, в зависимости от представляющей интерес биомолекулы и применяемой клеточной системы. Следует отметить, что все способы разрушения будут обеспечивать высвобождение представляющих интерес молекул, в данном случае стевиоловых гликозидов, и других молекул, которые могут вызвать расщепление представляющих интерес белков в лизате. Для предотвращения этого необходимо принимать меры, если активность белка является важной для последующих операций. Лизирование образцов в высокоденатурирующих растворах или при высоком значении pH минимизирует ферментативную активность. Проведение разрушения на льду или при более низких температурах будет также способствовать минимизации деградации образцов. Таким образом, одной из методик подавления протеазной активности является обеспечение присутствия смеси ингибиторов основных типов фосфатаз в лизате после проведения разрушения.
Известные методики разрушения, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением
[0098] Стандартные способы разрушения включают механическую гомогенизацию, пресс Френча, воздействие ультразвуком, гомогенизацию посредством гранул, растирание, лизис замораживанием-оттаиванием, лизис посредством обработки детергентом, ферментативный лизис и осмотический лизис.
[0099] Механическая гомогенизация включает применение ручного устройства, такого как гомогенизатор Даунса, или чего-то наподобие блендера для гомогенизации ткани. Данный способ является применимым для типа растительного материала, не относящегося к семенам, или для мягких тканей (т. е. ткани печени).
[00100] В прессе Френча применяется сила сдвига для гомогенизации ткани. Примером этого будет служить взятие суспензии клеток и проталкивание ее через шприц малого диаметра с применением цилиндра и поршня шприца. Данный способ эффективен в отношении бактерий, дрожжей, грибов, водорослей и культуры клеток млекопитающих, но является трудным для масштабирования.
[00101] При воздействии ультразвуком применяют короткие импульсы ультразвуковых волн для разрушения ткани. Данный способ приводит к образованию большого количества тепла и, как правило, его нужно будет выполнять на льду для сохранения белка. Данный способ также эффективен в отношении бактерий, дрожжей, грибов, водорослей и культуры клеток млекопитающих и является предпочтительным способом для настоящего изобретения.
[00102] Гомогенизация посредством гранул предусматривает применение стеклянных или металлических гранул для обеспечения мягкого абразивного действия при их перемешивании на вортексе вместе с тканью или суспензией клеток. Растирание предусматривает применение ступки и пестика для гомогенизации образца ткани. Наиболее распространенным способом является замораживание и растирание образца с применением жидкого азота. Лизис замораживанием-оттаиванием фактически соответствует своему названию, при котором применяют жидкий азот или морозильную камеру для замораживания клеток, а затем обеспечивают их оттаивание. Когда клетки замораживают, вода внутри клеток расширяется по мере своего замораживания, обуславливая разрыв клеток. Данный способ эффективен в отношении клеток млекопитающих.
[00103] Ферментативный лизис включает суспендирование клеток в изоосмотических буферах, содержащих ферменты, которые способны расщеплять клеточную стенку (т. е. зимолиазу для дрожжевых клеток). Данный способ лизиса часто применяют в сочетании с другой методикой разрушения (обычно воздействием ультразвуком) для обеспечения полного лизиса образца. Данная методика эффективна в отношении бактерий, дрожжей, грибов, водорослей, не относящегося к семенам растительного материала и культуры клеток млекопитающих и является методикой, которая также предусмотрена для применения в настоящем изобретении.
[00104] Лизис посредством обработки детергентом предусматривает суспендирование клеток в растворе детергента для растворения клеточной мембраны с высвобождением содержимого клеток. В данном способе также обычно применяют другой способ лизиса, такой как воздействие ультразвуком, для обеспечения полного лизиса. Данный способ эффективен в отношении культуры клеток млекопитающих.
[00105] Осмотический лизис предусматривает суспендирование клеток в гипотоническом (с низким содержанием соли) растворе. Это вызывает набухание и впоследствии разрыв клеток с высвобождением содержимого клеток для дальнейшего использования.
[00106] Как правило, в способе in vitro согласно заявленной технологии весовое отношение рекомбинантного полипептида к субстрату в пересчете на сухой вес составляет от приблизительно 1:100 до приблизительно 1:5, предпочтительно от приблизительно 1:50 до приблизительно 1:10, более предпочтительно от приблизительно 1:25 до приблизительно 1:15.
[00107] Как правило, температура реакции в способе in vitro составляет от приблизительно 20°С до приблизительно 40°С, в подходящем случае от 25°С до приблизительно 37°С, в более подходящем случае от 28°С до приблизительно 32°С.
[00108] Специалист в данной области поймет, что композиция стевиоловых гликозидов, полученная с помощью описанного в данном документе способа, может быть дополнительно очищена и смешана с другими стевиоловыми гликозидами, ароматизаторами или подсластителями с получением требуемого вкуса или композиции подсластителя. Например, композицию, обогащенную ребаудиозидом D4 или ребаудиозидом M, полученным, как описано в данном документе, можно смешивать с природным экстрактом стевии, содержащим ребаудиозид А как преобладающий стевиоловый гликозид, или с другими синтетическими или природными стевиол-гликозидными продуктами с получением требуемой композиции подсластителя. Как альтернатива, практически очищенный стевиоловый гликозид (например, ребаудиозид D4 или ребаудиозид M), полученный из композиции стевиоловых гликозидов, описанной в данном документе, можно объединять с другими подсластителями, такими как сахароза, мальтодекстрин, аспартам, сукралоза, неотам, ацесульфам калия и сахарин. Количество стевиолового гликозида относительно других подсластителей можно регулировать для получения требуемого вкуса, как известно из уровня техники. Описанная в данном документе композиция стевиоловых гликозидов (включающая ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид D4, ребаудиозид M или их комбинацию) может быть включена в пищевые продукты (такие как напитки, безалкогольные напитки, мороженое, молочные продукты, кондитерские изделия, крупы, жевательная резинка, хлебобулочные изделия и др.), биологически активные добавки, лечебное питание, а также фармацевтические продукты.
Анализ сходства последовательностей с использованием оценки идентичности
[00109] Используемый в данном документе термин "идентичность последовательности" относится к степени, в которой две оптимально выровненные полинуклеотидные или пептидные последовательности являются инвариантными во всем окне выравнивания компонентов, например нуклеотидов или аминокислот. "Доля идентичности" для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее число компонентов в сегменте эталонной последовательности, т. е. всей эталонной последовательности или определенной меньшей части эталонной последовательности.
[00110] Используемый в данном документе термин "процентная идентичность последовательности" или "процентная идентичность" относится к проценту идентичных нуклеотидов в линейной полинуклеотидной последовательности эталонной ("запрашиваемой") молекулы полинуклеотида (или ее комплементарной нити) по сравнению с тестовой ("субъект") полинуклеотидной молекулой (или ее комплементарной нитью), когда две последовательности оптимально выровнены (с соответствующими вставками нуклеотидов, делециями или гэпами, составляющими в общем итоге менее 20 процентов эталонной последовательности в окне сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может осуществляться с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана, алгоритм гомологичного выравнивания Нидлмана и Вунша, способ поиска подобия Персона и Липмана, и предпочтительно с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступных как часть GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Берлингтон, Массачусетс). "Доля идентичности" для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее число компонентов в сегменте эталонной последовательности, т. е. всей эталонной последовательности или определенной меньшей части эталонной последовательности. Процент идентичности последовательностей представлен как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей можно осуществлять с полноразмерной полинуклеотидной последовательностью или ее частью или с более длинной полинуклеотидной последовательностью. Для целей настоящего изобретения "процент идентичности" также можно определить с использованием BLASTX версии 2.0 для транслированных нуклеотидных последовательностей и BLASTN версии 2.0 для полинуклеотидных последовательностей.
[00111] Процент идентичности последовательностей предпочтительно определяют с использованием программы "Best Fit" или "Gap" Sequence Analysis Software Package™ (версия 10; Genetics Computer Group, Inc., Мадисон, Висконсин). В "Gap" используется алгоритм Нидлмана и Вунша (Needleman and Wunsch, Journal of Molecular Biology 48:443-453, 1970), чтобы найти выравнивание двух последовательностей, который доводит до максимума число совпадений и сводит к минимуму число гэпов. В "BestFit" выполняют оптимальное выравнивание наилучшего сегмента сходства между двумя последовательностями и вставляют гэпы, чтобы максимизировать количество совпадений, с использованием алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Research 11:2205-2220, 1983). Процент идентичности наиболее предпочтительно определяется с помощью программы "Best Fit".
[00112] Подходящие способы для определения идентичности последовательностей также раскрыты в программах Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), которые общедоступны в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) в Национальной медицинской библиотеке, Национальный институт здравоохранения, Бетесда, Мэриленд. 20894; см. BLAST Manual, Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); версия 2.0 или выше программ BLAST позволяет вводить гэпы (удаления и вставки) в выравнивания; для пептидной последовательности BLASTX может использоваться для определения идентичности последовательностей и для полинуклеотидной последовательности BLASTN может использоваться для определения идентичности последовательностей.
[00113] Используемый в данном документе термин "существенная процентная идентичность последовательности" относится к процентной идентичности последовательностей, составляющей по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательностей, по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательностей, по меньшей мере приблизительно 85% идентичность, по меньшей мере приблизительно 90% идентичность последовательностей или даже большую идентичность последовательностей, такую как приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичность последовательностей. Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой полинуклеотидную молекулу, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности или даже большей идентичностью последовательности, такой как приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичностью последовательности с полинуклеотидной последовательностью, описанной в данном документе. Полинуклеотидные молекулы, которые характеризуются активностью генов бета-глюкозидазы по настоящему изобретению, способны направлять выработку различных стевиоловых гликозидов и характеризуются значительной процентной идентичностью последовательностей с полинуклеотидными последовательностями, представленными в данном документе, и охвачены объемом настоящего изобретения.
Идентичность и сходство
[00114] Идентичность представляет собой долю аминокислот, которые являются одинаковыми между парой последовательностей после выравнивания последовательностей (что может быть выполнено с использованием только информации о последовательности, или структурной информации, или некоторой другой информации, но обычно она основана только на информации о последовательности), и сходство представляет собой оценку, назначаемую на основе выравнивания с использованием некоторой матрицы сходства. Индекс сходства может быть любым из следующих BLOSUM62, PAM250 или GONNET, или любой матрицей, используемой специалистом в данной области техники для выравнивания последовательностей белков.
[00115] Идентичность представляет собой степень соответствия между двумя подпоследовательностями (без гэпов между последовательностями). Идентичность 25% или выше подразумевает сходство функций, тогда как 18-25% подразумевает сходство структуры или функции. Следует иметь в виду, что две совершенно не связанные или случайные последовательности (которые составляют больше 100 остатков) могут характеризоваться идентичностью, составляющей более 20%. Сходство представляет собой степень подобия между двумя последовательностями при их сравнении. Это зависит от их идентичности.
[00116] Как очевидно из предшествующего описания, определенные аспекты настоящего изобретения не ограничены конкретными деталями примеров, проиллюстрированных в данном документе, и поэтому предполагается, что другие модификации и применения или их эквиваленты будут иметь место для специалистов в данной области техники. Соответственно, предполагается, что формула изобретения должна охватывать все такие модификации и применения, которые не выходят за пределы сущности и объема настоящего изобретения.
[00117] Кроме того, если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные, или эквивалентные, или описанные в данном документе, могут использоваться при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, причем предпочтительные способы и материалы описаны выше.
[00118] Хотя для целей понимания вышеизложенное изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера, специалистам в данной области техники будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены на практике. Следовательно, описание и примеры не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения, который установлен приложенной формулой изобретения.
[00119] В соответствии с настоящим изобретением бета-глюкозидаза ("B-glu1") может применяться для осуществления гидролиза стевиоловых гликозидов и снижения получения нежелательных стевиоловых гликозидов согласно новому способу. Присутствие нежелательных стевиоловых гликозидов в экстракте или продуктах ферментации стевии негативно влияет на общий вкусовой профиль и применимость стевиоловых гликозидов. Посредством сокращения стадий получения настоящее изобретение обеспечит снижение стоимости как очистки, так и получения требуемых стевиоловых гликозидов в неочищенном экстракте стевии.
[00120] Настоящее изобретение станет более понятным при рассмотрении следующих неограничивающих примеров. Следует понимать, что примеры ниже, несмотря на то, что указываются предпочтительные варианты осуществления заявленной технологии, приведены только для наглядности. Из вышеприведенного обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники сможет установить существенные характеристики заявленной технологии и не отклоняясь от его идеи и объема сможет осуществить различные изменения и модификации заявленной технологии для адаптации его к различным видам применения и условиям.
Пример 1. Идентификация бета-гликозидазы в Pichia pastoris
[00121] В соответствии с настоящим изобретением проводили анализ генома Pichia pastoris и идентифицировали несколько кандидатных генов бета-гликозидазы. Полноразмерные фрагменты ДНК всех кандидатных генов бета-глюкозидазы коммерчески синтезировали. Практически все кодоны cDNA заменяли на таковые, являющиеся предпочтительными для E. coli (Genscript, Нью-Джерси). Синтезированную ДНК клонировали в бактериальный вектор экспрессии pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). Такие же эксперименты можно выполнять в отношении Yarrowia lipolytica с использованием последовательностей, оптимизированных для такого применения.
[00122] Каждую экспрессионную конструкцию трансформировали в E. coli BL21 (DE3), которую впоследствии выращивали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 37°С до достижения OD600 0,8-1,0. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и культуру дополнительно выращивали при 16°C в течение 22 часов. Клетки собирали с помощью центрифугирования (3000 х g; 10 мин; 4°С). Клеточный осадок собирали и использовали сразу или хранили при -80°С.
[00123] Клеточный осадок, как правило, ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,2, 25 мкг/мл лизоцима, 5 мкг/мл ДНКазы I, 20 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 0,4% Triton Х-100). Клетки разрушали с помощью ультразвука при 4°С, и клеточный дебрис отделяли с помощью центрифугирования (18000 x g; 30 мин). Надосадочную жидкость загружали в уравновешенную аффинную колонку (уравновешивающий буфер: 50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,2, 20 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 10% глицерин) Ni-NTA (Qiagen). После загрузки образца белка колонку промывали уравновешивающим буфером для удаления несвязанных загрязняющих белков. His-меченые рекомбинантные полипептиды бета-глюкозидазы элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 250 мМ имидазол.
[00124] Очищенные кандидатные рекомбинантные полипептиды бета-глюкозидазы анализировали в отношении дегликозилирующей активности с применением различных стевиоловых гликозидов в качестве субстрата. Как правило, рекомбинантный полипептид (10 мкг) тестировали в 300 мкл реакционной системы in vitro. Реакционная система содержит 50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2, 1 мг/мл стевиолового гликозида. Реакцию проводили при 30-37°C, и в 50 мкл реакционной смеси реакцию прекращали путем добавления 200 мкл 1-бутанола в разные моменты времени. Образцы экстрагировали трижды с помощью 200 мкл 1-бутанола. Объединенную фракцию высушивали и растворяли в 100 мкл 80% метанола для анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
[00125] Клетки Pichia суспендировали в буфере для экстракции (50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2; 150 мМ NaCl). После воздействия ультразвуком супернатант (неочищенный экстракт) собирали путем центрифугирования с параметрами 12000 g при 4℃. Полученный в результате неочищенный белок (50 мкг) тестировали в 300 мкл реакционной системы in vitro. Реакционная система содержит 50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2, 1 мг/мл стевиолового гликозида. Реакцию проводили при 30-37°C, и в 50 мкл реакционной смеси реакцию прекращали путем добавления 200 мкл 1-бутанола в разные моменты времени. Образцы экстрагировали трижды с помощью 200 мкл 1-бутанола. Объединенную фракцию высушивали и растворяли в 100 мкл 80% метанола для анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
[00126] Затем осуществляли HPLC-анализ с применением системы Dionex UPLC ultimate 3000 (Саннивейл, Калифорния), включающей в себя четвертичный насос, отсек колонки с регулируемой температурой, автоматический пробоотборник и датчик поглощения УФ-излучения. Колонку Synergi Hydro-RP (Phenomenex) с защитной колонкой использовали для получения характеристик стевиоловых гликозидов в объединенных образцах. Ацетонитрил в воде использовали в качестве подвижной фазы в HPLC-анализе. Длина волны детектирования, применяемая в HPLC-анализе, составляла 210 нм. После проведения скрининга активности авторы настоящего изобретения обнаружили, что бета-глюкозидаза (B-glu1, SEQ: 1) обладает сильной активностью в отношении расщепления соответствующих стевиоловых гликозидов и, следовательно, является применимым инструментом в получении представляющих интерес стевиоловых гликозидов.
Пример 2. Гидролиз рубузозида с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00127] Рубузозид можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиол-13-глюкозида. Полученный стевиол-13-глюкозид можно подвергать последующему гидролизу с получением стевиола (фиг. 1B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л рубузозида в качестве субстрата. Как показано на фиг. 1A, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 рубузозида с получением стевиол-13-глюкозида (фиг. 1A - c). Полученный стевиол-13-глюкозид (S-13-G) будет подвергнут превращению в стевиол в более поздний момент времени (фиг. 1A - d). B-glu1 обеспечивает удаление другой глюкозильной группы в положении C13 стевиол-13-глюкозида. Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза рубузозида до стевиол-13-глюкозида и впоследствии получения стевиола непрерывным образом (фиг. 1A - e и f).
Пример 3. Гидролиз стевиозида с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00128] Стевиозид можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиолбиозида (фиг. 2B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л стевиозида в качестве субстрата. Как показано на фиг. 2, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида (фиг. 2A - c и d). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенные клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза стевиозида до стевиолбиозида (фиг. 8C).
Пример 4. Гидролиз ребаудиозида E с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00129] Ребаудиозид E можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением стевиолбиозида (фиг. 3B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида E в качестве субстрата. Как показано на фиг. 3, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 ребаудиозида E с получением стевиозида и стевиолбиозида (фиг. 3A, c-e). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида E до стевиолбиозида (фиг. 8D).
Пример 5. Гидролиз ребаудиозида A с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00130] Ребаудиозид A можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида B (фиг. 4B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида A в качестве субстрата. Как показано на фиг. 4, B-glu1 способна обеспечивать удаление глюкозильных групп в положении C19 ребаудиозида A с получением ребаудиозида B (фиг. 4A, c-d). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида A до ребаудиозида B (фиг. 8e).
Пример 6. Гидролиз ребаудиозида I с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00131] Ребаудиозид I можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида A, а полученный ребаудиозид A можно подвергать гидролизу с получением ребаудиозида B (фиг. 5B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида I в качестве субстрата. Как показано на фиг. 5, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 ребаудиозида I с получением ребаудиозида A и последовательно удалять другую глюкозильную группу в положении C19 ребаудиозида A с получением ребаудиозида B (фиг. 5A, d-f). Ребаудиозид I может быть полностью превращен в ребаудиозид A к моменту времени 24 ч. (фиг.5A, f). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида I до ребаудиозида B (фиг. 8, f).
Пример 7. Гидролиз ребаудиозида D с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00132] Ребаудиозид D можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида B (фиг. 6B) и Reb A. Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида D в качестве субстрата. Как показано на фиг. 6, B-glu1 способна обеспечивать удаление глюкозильных групп в положении C19 ребаудиозида D с получением ребаудиозида (фиг. 6A, c-e). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида D до ребаудиозида B (фиг. 8g).
Пример 8. Гидролиз ребаудиозида G с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia
[00133] Ребаудиозид G можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиол-13-глюкозида. Полученный стевиол-13-глюкозид может быть непрерывным образом подвергнут последующему гидролизу с получением стевиола (фиг. 7B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида G в качестве субстрата. Как показано на фиг. 7A, B-glu1 способна обеспечивать удаление глюкозильных групп в положениях C13 и C19 ребаудиозида G с получением стевиол-13-глюкозида (фиг. 7A, b-c). Полученный стевиол-13-глюкозид (S-13-G) будет подвергнут превращению в стевиол (фиг. 7A). Полученный стевиол-13-глюкозид будет полностью превращен в стевиол к моменту времени 24 ч. (фиг. 7A, d). B-glu1 обеспечивает удаление другой глюкозильной группы в положении C13 стевиол-13-глюкозида. Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида G до стевиол-13-глюкозида и впоследствии получения стевиола непрерывным образом (фиг.7A, e).
[00134] В соответствии с настоящим изобретением авторы настоящего изобретения идентифицировали и количественно определили ферментативную активность бета-глюкозидазы в отношении клеточного лизата Pichia pastoris. Данный фермент характеризуется специфической активностью, которая позволяет ему осуществлять гидролиз конкретных стевиоловых гликозидов (таблица 1). Со ссылкой на фиг. 7, Reb G гидролизируется ферментом B-glu1 и разрушенными клетками Pichia. HPLC показывает продукты гидролиза Reb G. В ходе этой работы получали стевиол ("S"); стевиол-13-глюкозид ("S-13-G"); рубузозид ("Rub"). Временная динамика представляла собой серию моментов времени на протяжении 24 часов. Стевиол-13-глюкозид ("S-13-G") и стевиол получали с помощью культур рекомбинантной Pichia pastoris.
[00135] Применяя данную методику, авторы настоящего изобретения осуществили гидролиз Reb M с удалением Reb A, Reb D3, Reb D4, Reb W, Reb V, Reb E, Reb I и Reb D для увеличения эффективности очистки (фиг. 9). Данная методика предусматривает применение стевиозида и Reb A с получением стевиола, стевиол-13-O-глюкозида, стевиолбиозида и Reb B посредством бета-глюкозидазной биоконверсии. Со ссылкой на фиг. 8, стевиоловые гликозиды подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток Pichia pastoris. Образцы включали стандарт стевиолбиозида ("SB") и ребаудиозида B ("B"). В ходе проведенных авторами настоящего изобретения экспериментов стевиозид гидролизовали с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 24 часа; Reb E и Reb A гидролизировали с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 24 часа. Аналогичным образом, Reb I и Reb D гидролизовали с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 24 часа (фиг. 8).
[00136] В другом варианте осуществления настоящего изобретения авторы настоящего изобретения могут применять бета-глюкозидазу для контроля путей получения стевиоловых гликозидов. (например, Reb M из Reb W) (фиг. 10).
[00137] В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения бета-глюкозидаза может применяться для осуществления гидролиза дополнительных стевиоловых гликозидов, в том числе Reb V, Reb W, Reb Z1, Reb Z2, Reb D3 и Reb D4, с обеспечением получения из них представляющих интерес стевиоловых гликозидов (фиг. 9). После этого авторы настоящего изобретения могут разделять, собирать и концентрировать гидролизованные продукты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения авторы настоящего изобретения применяют дефицитный по бета-глюкозидазе штамм, который обеспечит снижение получения побочных продуктов согласно способу биоконверсии авторов настоящего изобретения.
Таблица 1. Обобщенные результаты гидролиза стевиоловых гликозидов с помощью B-glu1 | |
Субстрат | Продукты |
Rub | Стевиол-13-O-глюкозид (S-13-G), стевиол |
Стевиозид | Стевиолбиозид (SB) |
Reb E | Стевиозид, стевиолбиозид (SB) |
Reb A | Reb B |
Reb I | Reb A, Reb B |
Reb D | Reb B |
Reb G | Стевиол-13-O-глюкозид (S-13-G), стевиол |
Reb B | Расщепление не происходит |
Reb M | Расщепление не происходит |
ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРОМЫШЛЕННОЙ ПРИМЕНИМОСТИ/ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[00138] Настоящее изобретение применимо в областях промышленности, связанных с производством продуктов питания, кормов, напитков, а также в фармакологической промышленности. Настоящее изобретение в целом относится к способу биосинтеза стевиоловых гликозидов посредством гидролиза бета-глюкозидазой.
Литературные источники, процитированные и включенные посредством ссылки
1. Brandle, J. E. et al., (1998). Stevia Rebaudiana: Its Agricultural, Biological, and Chemical Properties, Canadian J. Plant Science. 78 (4): 527-36.
2. Ceunen, S., and J.M. C. Geuns, Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function, J. Nat. Prod., 2013, 76 (6), pp 1201-28 (2013).
3. Du J et al., (2011), Engineering microbial factories for synthesis of value-added products, J Ind Microbiol Biotechnol. 38: 873-90.
4. GRAS Notices, USA Food and Drug Administration, United States Health & Human Services. (2016) (относится к стевиоловым гликозидам и полигликозидам).
6. Prakash I., et al.; Isolation and Characterization of a Novel Rebaudioside M Isomer from a Bioconversion Reaction of Rebaudioside A and NMR Comparison Studies of Rebaudioside M Isolated from Stevia rebaudiana Bertoni and Stevia rebaudiana Morita, Biomolecules, 2014 Jun; 4(2): 374-89. (Опубликован онлайн 31 марта 2014 г. 2014).
7. Prakash I., et al., Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, Foods, 2014, 3:162-175.
8. Shockey JM. Et a., (2003), Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes: phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme A synthetases. Plant Physiol 132 1065-76.
Последовательности, представляющие интерес
Последовательности
B-glu1
Аминокислотная последовательность B-glu1 (SEQ ID NO: 1) Pichia pastoris (GS115)
Mtqldvesliqeltlnekvqllsgsdfwhttpvrrlgipkmrlsdgpngvrgtkffngvptacfpcgtglgatfdkellkeagslmadeakakaasvvlgptaniargpnggrgfesfgedpvvnglssaaminglqgkyiaatmkhyvcndlemdrncidaqvshralrevyllpfqiavrdanpraimtaynkangehvsqskflldevlrkewgwdgllmsdwfgvydakssitngldlempgppqcrvhsatdhainsgeihindvdervrsllslinychqsgvteedpetsdnntpetieklrkisresivllkdddrnrsilplkksdkiavignnakqaaycgggsasvlsyhtttpfdsiksrledsntpaytigadayknlpplgpqmtdsdgkpgfdakffvgsptskdrklidhfqltnsqvflvdyyneqipenkefyvdvegqfipeedgtynfgltvfgtgrlfvddklvsdssqnqtpgdsffglaaqevigsihlvkgkaykikvlygssvtrtyeiaasvafeggaftfgaakqrnedeeiaraveiakandkvvlciglnqdfesegfdrpdikipgatnkmvsavlkanpntvivnqtgtpvempwasdapvilqawfggseagtaiadvlfgdynpsgkltvtfplrfednpaylnfqsnkqacwygedvyvgyryyetidrpvlfpfghglsftefdftdmfvrleeenlevevvvrntgkydgaevvqlyvapvspslkrpikelkeyakiflasgeaktvhlsvpikyatsffdeyqkkwcsekgeytillgsssadikvsqsitlekttfwkgl
ДНК B-glu1 (SEQ ID NO: 2) (оптимизированная по кодонам для E. coli)
ATGACCCAACTGGATGTGGAGAGCCTGATTCAAGAGCTGACCCTGAACGAAAAGGTGCAACTGCTGAGCGGTAGCGACTTCTGGCATACCACCCCGGTTCGTCGTCTGGGCATCCCGAAGATGCGTCTGAGCGACGGTCCGAACGGCGTTCGTGGTACCAAATTCTTTAACGGTGTTCCGACCGCGTGCTTCCCGTGCGGTACCGGTCTGGGCGCGACCTTTGACAAGGAACTGCTGAAAGAGGCGGGTAGCCTGATGGCGGATGAAGCGAAAGCGAAAGCGGCGAGCGTGGTTCTGGGTCCGACCGCGAACATTGCGCGTGGTCCGAACGGTGGCCGTGGCTTCGAGAGCTTCGGCGAGGACCCGGTGGTTAACGGTCTGAGCAGCGCGGCGATGATCAACGGCCTGCAGGGCAAGTACATTGCGGCGACCATGAAACACTATGTTTGCAACGATCTGGAAATGGACCGTAACTGCATTGACGCGCAAGTTAGCCACCGTGCGCTGCGTGAGGTGTACCTGCTGCCGTTCCAAATCGCGGTGCGTGATGCGAACCCGCGTGCGATTATGACCGCGTATAACAAGGCGAACGGCGAACACGTTAGCCAGAGCAAATTCCTGCTGGACGAAGTGCTGCGTAAGGAGTGGGGCTGGGATGGTCTGCTGATGAGCGACTGGTTTGGTGTTTACGATGCGAAAAGCAGCATCACCAACGGCCTGGACCTGGAGATGCCGGGTCCGCCGCAGTGCCGTGTGCACAGCGCGACCGATCACGCGATCAACAGCGGCGAAATCCACATTAACGATGTTGACGAGCGTGTGCGTAGCCTGCTGAGCCTGATTAACTACTGCCACCAAAGCGGTGTTACCGAGGAAGATCCGGAAACCAGCGACAACAACACCCCGGAAACCATCGAGAAGCTGCGTAAAATCAGCCGTGAGAGCATTGTGCTGCTGAAGGACGATGACCGTAACCGTAGCATTCTGCCGCTGAAGAAAAGCGACAAAATCGCGGTTATTGGTAACAACGCGAAACAAGCGGCGTATTGCGGTGGCGGTAGCGCGAGCGTGCTGAGCTATCACACCACCACCCCGTTCGACAGCATCAAGAGCCGTCTGGAAGATAGCAACACCCCGGCGTACACCATTGGTGCGGACGCGTATAAAAACCTGCCGCCGCTGGGTCCGCAAATGACCGATAGCGACGGCAAGCCGGGTTTTGATGCGAAATTCTTTGTTGGCAGCCCGACCAGCAAGGATCGTAAACTGATCGACCACTTCCAGCTGACCAACAGCCAAGTTTTTCTGGTGGACTACTATAACGAACAGATCCCGGAAAACAAGGAGTTCTACGTTGACGTGGAGGGTCAATTTATTCCGGAGGAAGATGGCACCTATAACTTCGGTCTGACCGTGTTTGGTACCGGCCGTCTGTTCGTTGATGACAAACTGGTTAGCGACAGCAGCCAGAACCAAACCCCGGGCGATAGCTTCTTTGGTCTGGCGGCGCAGGAAGTGATCGGCAGCATTCACCTGGTGAAGGGTAAAGCGTACAAGATCAAAGTTCTGTATGGCAGCAGCGTGACCCGTACCTACGAAATTGCGGCGAGCGTTGCGTTTGAGGGCGGTGCGTTCACCTTTGGTGCGGCGAAACAGCGTAACGAAGACGAGGAAATCGCGCGTGCGGTGGAGATTGCGAAGGCGAACGACAAAGTGGTTCTGTGCATCGGCCTGAACCAAGATTTCGAAAGCGAGGGTTTTGATCGTCCGGACATCAAGATTCCGGGCGCGACCAACAAAATGGTTAGCGCGGTGCTGAAGGCGAACCCGAACACCGTTATTGTGAACCAGACCGGTACCCCGGTTGAGATGCCGTGGGCGAGCGATGCGCCGGTGATCCTGCAAGCGTGGTTTGGCGGTAGCGAGGCGGGTACCGCGATTGCGGATGTTCTGTTTGGCGACTACAACCCGAGCGGCAAGCTGACCGTGACCTTCCCGCTGCGTTTTGAGGATAACCCGGCGTACCTGAACTTCCAGAGCAACAAACAAGCGTGCTGGTATGGCGAAGACGTTTACGTGGGTTATCGTTACTATGAGACCATCGATCGTCCGGTGCTGTTCCCGTTTGGTCACGGCCTGAGCTTCACCGAGTTCGATTTTACCGACATGTTTGTTCGTCTGGAGGAAGAGAACCTGGAAGTTGAGGTGGTTGTGCGTAACACCGGCAAGTACGACGGTGCGGAAGTGGTGCAGCTGTATGTTGCGCCGGTTAGCCCGAGCCTGAAACGTCCGATCAAGGAACTGAAAGAGTACGCGAAAATTTTCCTGGCGAGCGGTGAAGCGAAGACCGTTCACCTGAGCGTGCCGATCAAATACGCGACCAGCTTCTTTGATGAGTATCAAAAGAAATGGTGCAGCGAAAAGGGCGAGTATACCATTCTGCTGGGTAGCAGCAGCGCGGACATCAAAGTTAGCCAAAGCATCACCCTGGAAAAAACCACCTTCTGGAAAGGTCTGTAA
Аминокислотная последовательность B-glu2 (SEQ ID NO: 3) Pichia pastoris (GS115)
MKSQLIFMALASLVASAPLEHQQQHHKHEKRAVVTQTVTVAAGQTAAAGSAQAVVTSSAAPASVASSAAASASSSSSSYTSGASGDLSSFKDGTIKCSEFPSGDGVVSVSWLGFGGWSSIMNLQGGTSESCENGYYCSYACEAGYSKTQWPSNQPSDGRSVGGLLCKDGLLYRSNTAFDTLCVPGKGTASVENNVSKGISICRTDYPGSENMCVPTWVDAGNSNTLTVVDEDNYYEWQGLKTSAQYYVNNAGVSVEDGCIWGDESSGVGNWAPLVLGAGSTGGLTYLSLIPNPNNKKAPNFNVKIVATDGSSINGDCKYENGIFVGSSTDGCTVTVTSGSAKLVFY
Последовательность ДНК B-glu2 (SEQ ID NO: 4) Pichia pastoris (GS115)
atgaaaagccagctgatctttatggctttggcctcccttgtagcaagtgcaccgctggaacaccagcagcagcatcataaacatgagaaacgcgccgtagttacgcagacagtaactgttgcggcgggccagacagcagcagcgggttccgcccaggcagttgttacctcaagcgcggcgccagcatccgttgcttcaagtgcggccgcgtctgctagctcatcttcttccagctatacctctggcgcttcaggcgatcttagtagtttcaaagatggtactattaaatgttcagaattcccatcaggggatggcgtggtgtccgtctcttggttaggcttcggcggctggtctagtattatgaatctgcagggtggtacttcagagagttgtgagaacggctattattgttcatatgcatgtgaagccggttatagcaaaacacagtggccatctaaccagccgtcagatgggagatcagtgggagggttgctgtgtaaagatggcctgttatatcgctccaatacagcgttcgatacattatgtgtgcctggaaaaggtacagcatccgtggagaataatgtgtctaaaggtatttccatttgtagaacggattatccggggtctgaaaacatgtgcgtcccgacgtgggtcgatgccggtaactcaaacaccttgacagtggtagatgaagataattattatgaatggcagggccttaaaactagtgctcagtattatgtgaataacgccggtgttagtgttgaagatgggtgcatctggggcgatgagtccagcggcgttggaaactgggcgccgttggttttgggggccggttccacggggggtctgacctatctgtctctgattccgaatccaaacaacaaaaaagcaccgaattttaacgtaaaaatcgtggccacggatggaagttcaattaacggagattgcaaatatgaaaatgggatctttgtcggttcttcaaccgatggctgcacggtaactgttacctcaggtagtgcaaaactggttttttattaa
Аминокислотная последовательность B-glu3 (SEQ ID NO: 5) Pichia pastoris (GS115)
Mqvksivnlllacslavarplehahhqhdkrgvvvvtktivvdgstveataaaqvqehaetfaestpsavvssssapssassasapassgsfsagtkgvtyspyqagggcktaeevasdlsqltgyeiirlygvdcnqvenvfkakapgqklflgiffvdaiesgvsaiasavksygswddvhtvsvgnelvnngeatvsqigqyvstaksalrsagftgpvlsvdtfiavinnpglcdfadeyvavnahaffdggiaasgagdwaaeqiqrvssacggkdvlivesgwpskgdtngaavpsksnqqaavqslgqkigssciafnafndywkadgpfnaekywgilds
Последовательность ДНК B-glu3 (SEQ ID NO: 6) Pichia pastoris (GS115)
Atgcaggttaaatctattgttaatttactgcttgcctgttccttggctgtggcgcgtccgttggaacacgctcaccatcagcatgataaacgcggcgttgtagtagtaacgaaaaccatcgtcgttgatggtagcacagttgaggctaccgccgctgctcaggtgcaggagcatgcagaaacctttgcagaatcaaccccgtcagccgtcgtttccagttcatccgccccttcatcagcaagctcagcttccgctccagctagttcaggttctttttcagctggtaccaaaggcgtgacatattctccatatcaggccggtggtgggtgtaaaacagcggaagaagtggcatccgatctgtcacagcttaccggttatgaaattattcggctttatggcgtagattgcaaccaggttgagaacgtgtttaaagccaaagcccctggccagaaactttttttgggtatcttttttgtggatgccatcgagtctggcgtatcagctatcgcaagtgccgttaaatcctatggttcttgggatgatgtacacactgtatctgttggcaacgagctggtgaacaatggcgaagccactgttagccagattggacagtatgttagtacggccaaatcagccttacgctctgccggtttcacagggccagtattgtctgttgatacttttattgcagtgattaacaatccggggctgtgtgatttcgcggatgaatatgttgctgtgaacgcccatgcgttcttcgatgggggtattgctgcctcaggggcgggcgattgggcggcagagcagatccagcgcgtctccagtgcgtgcggcgggaaagatgtcttaattgtagaaagcggttggccgtctaaaggagatacgaacggcgccgcagtgccgtcaaaatccaatcagcaggctgcagtccagagtcttggccagaaaattgggagctcatgcattgcctttaacgcatttaatgattattggaaagccgatggtccgttcaacgccgaaaaatattgggggatccttgatagttaa
Аминокислотная последовательность B-glu4 (SEQ ID NO: 7) Pichia pastoris (GS115)
mlstilnifilllfiqaslqapipvvtkyvtegiavvtetnvrvvtktipivqvlisdgatythtlttvstaeengnfqpitttsivnkevvvptsvtpntqqtrptqvdttqnnadtpaaptpspttssnngvfttysttrsvvtsvvvvgpdgspientgqtanptttapttsttaarttsststtptasstpggnhprsivyspysdssqckdattietdlefiaskgisavriygndcnyltvvlpkcaslglkvnqgfwigpsgvdsiddavqefiqavngnngfnwdlfelitvgneaisagyvsassliskikevssilssagytgpittaeppnvyedygdlcstdvmsivgvnahsyfntlfaasdsgsfvksqievvqkacsrsditiietgypsqgatngknvpskenqktaifsifevvgtdvtilstyddlwkdpgpygieqffgaidlfs
Последовательность ДНК B-glu4 (SEQ ID NO: 8) Pichia pastoris (GS115)
atgctgtccacaattctgaatatttttattcttctgttattcatccaggcgtctcttcaggcgcctattccggtggtgaccaaatatgtgaccgaaggtattgccgttgtgactgaaaccaatgtgcgggttgttactaaaaccattccgattgtgcaggtgctgatctccgatggtgcaacctatactcataccctgacgacagtgtcaacggcggaagaaaatggcaacttccagcctattaccacgacatctattgtcaacaaagaagttgtagtaccaacaagcgtaaccccgaatacccagcagacgcgtccgacccaggtagataccacacagaacaatgcggatacaccagcggcgcctacaccatcacctactactagttcaaacaacggcgtgttcaccacatattccacaacacgtagcgtagtcactagtgtagtcgtagtcggaccggatggaagccctattgaaaatactggacagacagcaaaccctactacaactgccccaactacaagcactactgctgcccggaccacaagcagtacgtccaccacacctaccgctagctctacgccaggaggtaatcatccacgtagcatcgtctattctccatattccgatagcagtcagtgtaaagatgcgacaacgatcgaaaccgatcttgagttcattgcctctaaaggcatcagcgcggtacgtatttatggcaatgattgtaactatcttacagttgttttgcctaaatgtgccagtctgggattaaaagtgaatcagggcttttggattggtccaagtggagtagatagcatcgatgatgcagtacaggagtttattcaggcagtcaacggcaacaacggctttaattgggatttattcgaattaattaccgtcggaaacgaagcaatcagtgccggttatgtttcagcgagctccctgatttccaaaattaaagaagtatctagcattctgagctccgcgggttatactggtccaattaccacagccgaaccgcctaacgtatatgaggattatggcgatctgtgctcaaccgatgtaatgtccatcgtgggtgtaaacgcgcattcctattttaataccctttttgcggcctccgattcaggttcatttgtgaaatcacagatcgaagtagtccagaaagcatgctcacgttccgatattactattattgaaaccgggtatccgtcccagggagctaccaatggaaaaaacgttcctagtaaagagaatcagaaaacagcgattttttcaatctttgaggtcgttggaacagatgtaactattcttagtacttatgatgatttgtggaaagatcctggaccgtatgggattgaacagttttttggtgcgatcgatcttttttcttaa
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Conagen Inc.
<120> ГИДРОЛИЗ СТЕВИОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ С ПОМОЩЬЮ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ
<130> C1497.70026WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/527,482
<151> 2017-06-30
<160> 8
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 839
<212> БЕЛОК
<213> Pichia pastoris
<400> 1
Met Thr Gln Leu Asp Val Glu Ser Leu Ile Gln Glu Leu Thr Leu Asn
1 5 10 15
Glu Lys Val Gln Leu Leu Ser Gly Ser Asp Phe Trp His Thr Thr Pro
20 25 30
Val Arg Arg Leu Gly Ile Pro Lys Met Arg Leu Ser Asp Gly Pro Asn
35 40 45
Gly Val Arg Gly Thr Lys Phe Phe Asn Gly Val Pro Thr Ala Cys Phe
50 55 60
Pro Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ala Thr Phe Asp Lys Glu Leu Leu Lys
65 70 75 80
Glu Ala Gly Ser Leu Met Ala Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser
85 90 95
Val Val Leu Gly Pro Thr Ala Asn Ile Ala Arg Gly Pro Asn Gly Gly
100 105 110
Arg Gly Phe Glu Ser Phe Gly Glu Asp Pro Val Val Asn Gly Leu Ser
115 120 125
Ser Ala Ala Met Ile Asn Gly Leu Gln Gly Lys Tyr Ile Ala Ala Thr
130 135 140
Met Lys His Tyr Val Cys Asn Asp Leu Glu Met Asp Arg Asn Cys Ile
145 150 155 160
Asp Ala Gln Val Ser His Arg Ala Leu Arg Glu Val Tyr Leu Leu Pro
165 170 175
Phe Gln Ile Ala Val Arg Asp Ala Asn Pro Arg Ala Ile Met Thr Ala
180 185 190
Tyr Asn Lys Ala Asn Gly Glu His Val Ser Gln Ser Lys Phe Leu Leu
195 200 205
Asp Glu Val Leu Arg Lys Glu Trp Gly Trp Asp Gly Leu Leu Met Ser
210 215 220
Asp Trp Phe Gly Val Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ile Thr Asn Gly Leu
225 230 235 240
Asp Leu Glu Met Pro Gly Pro Pro Gln Cys Arg Val His Ser Ala Thr
245 250 255
Asp His Ala Ile Asn Ser Gly Glu Ile His Ile Asn Asp Val Asp Glu
260 265 270
Arg Val Arg Ser Leu Leu Ser Leu Ile Asn Tyr Cys His Gln Ser Gly
275 280 285
Val Thr Glu Glu Asp Pro Glu Thr Ser Asp Asn Asn Thr Pro Glu Thr
290 295 300
Ile Glu Lys Leu Arg Lys Ile Ser Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Lys
305 310 315 320
Asp Asp Asp Arg Asn Arg Ser Ile Leu Pro Leu Lys Lys Ser Asp Lys
325 330 335
Ile Ala Val Ile Gly Asn Asn Ala Lys Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Ala Ser Val Leu Ser Tyr His Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ser
355 360 365
Ile Lys Ser Arg Leu Glu Asp Ser Asn Thr Pro Ala Tyr Thr Ile Gly
370 375 380
Ala Asp Ala Tyr Lys Asn Leu Pro Pro Leu Gly Pro Gln Met Thr Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Lys Pro Gly Phe Asp Ala Lys Phe Phe Val Gly Ser Pro
405 410 415
Thr Ser Lys Asp Arg Lys Leu Ile Asp His Phe Gln Leu Thr Asn Ser
420 425 430
Gln Val Phe Leu Val Asp Tyr Tyr Asn Glu Gln Ile Pro Glu Asn Lys
435 440 445
Glu Phe Tyr Val Asp Val Glu Gly Gln Phe Ile Pro Glu Glu Asp Gly
450 455 460
Thr Tyr Asn Phe Gly Leu Thr Val Phe Gly Thr Gly Arg Leu Phe Val
465 470 475 480
Asp Asp Lys Leu Val Ser Asp Ser Ser Gln Asn Gln Thr Pro Gly Asp
485 490 495
Ser Phe Phe Gly Leu Ala Ala Gln Glu Val Ile Gly Ser Ile His Leu
500 505 510
Val Lys Gly Lys Ala Tyr Lys Ile Lys Val Leu Tyr Gly Ser Ser Val
515 520 525
Thr Arg Thr Tyr Glu Ile Ala Ala Ser Val Ala Phe Glu Gly Gly Ala
530 535 540
Phe Thr Phe Gly Ala Ala Lys Gln Arg Asn Glu Asp Glu Glu Ile Ala
545 550 555 560
Arg Ala Val Glu Ile Ala Lys Ala Asn Asp Lys Val Val Leu Cys Ile
565 570 575
Gly Leu Asn Gln Asp Phe Glu Ser Glu Gly Phe Asp Arg Pro Asp Ile
580 585 590
Lys Ile Pro Gly Ala Thr Asn Lys Met Val Ser Ala Val Leu Lys Ala
595 600 605
Asn Pro Asn Thr Val Ile Val Asn Gln Thr Gly Thr Pro Val Glu Met
610 615 620
Pro Trp Ala Ser Asp Ala Pro Val Ile Leu Gln Ala Trp Phe Gly Gly
625 630 635 640
Ser Glu Ala Gly Thr Ala Ile Ala Asp Val Leu Phe Gly Asp Tyr Asn
645 650 655
Pro Ser Gly Lys Leu Thr Val Thr Phe Pro Leu Arg Phe Glu Asp Asn
660 665 670
Pro Ala Tyr Leu Asn Phe Gln Ser Asn Lys Gln Ala Cys Trp Tyr Gly
675 680 685
Glu Asp Val Tyr Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr Glu Thr Ile Asp Arg Pro
690 695 700
Val Leu Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser Phe Thr Glu Phe Asp Phe
705 710 715 720
Thr Asp Met Phe Val Arg Leu Glu Glu Glu Asn Leu Glu Val Glu Val
725 730 735
Val Val Arg Asn Thr Gly Lys Tyr Asp Gly Ala Glu Val Val Gln Leu
740 745 750
Tyr Val Ala Pro Val Ser Pro Ser Leu Lys Arg Pro Ile Lys Glu Leu
755 760 765
Lys Glu Tyr Ala Lys Ile Phe Leu Ala Ser Gly Glu Ala Lys Thr Val
770 775 780
His Leu Ser Val Pro Ile Lys Tyr Ala Thr Ser Phe Phe Asp Glu Tyr
785 790 795 800
Gln Lys Lys Trp Cys Ser Glu Lys Gly Glu Tyr Thr Ile Leu Leu Gly
805 810 815
Ser Ser Ser Ala Asp Ile Lys Val Ser Gln Ser Ile Thr Leu Glu Lys
820 825 830
Thr Thr Phe Trp Lys Gly Leu
835
<210> 2
<211> 2520
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 2
atgacccaac tggatgtgga gagcctgatt caagagctga ccctgaacga aaaggtgcaa 60
ctgctgagcg gtagcgactt ctggcatacc accccggttc gtcgtctggg catcccgaag 120
atgcgtctga gcgacggtcc gaacggcgtt cgtggtacca aattctttaa cggtgttccg 180
accgcgtgct tcccgtgcgg taccggtctg ggcgcgacct ttgacaagga actgctgaaa 240
gaggcgggta gcctgatggc ggatgaagcg aaagcgaaag cggcgagcgt ggttctgggt 300
ccgaccgcga acattgcgcg tggtccgaac ggtggccgtg gcttcgagag cttcggcgag 360
gacccggtgg ttaacggtct gagcagcgcg gcgatgatca acggcctgca gggcaagtac 420
attgcggcga ccatgaaaca ctatgtttgc aacgatctgg aaatggaccg taactgcatt 480
gacgcgcaag ttagccaccg tgcgctgcgt gaggtgtacc tgctgccgtt ccaaatcgcg 540
gtgcgtgatg cgaacccgcg tgcgattatg accgcgtata acaaggcgaa cggcgaacac 600
gttagccaga gcaaattcct gctggacgaa gtgctgcgta aggagtgggg ctgggatggt 660
ctgctgatga gcgactggtt tggtgtttac gatgcgaaaa gcagcatcac caacggcctg 720
gacctggaga tgccgggtcc gccgcagtgc cgtgtgcaca gcgcgaccga tcacgcgatc 780
aacagcggcg aaatccacat taacgatgtt gacgagcgtg tgcgtagcct gctgagcctg 840
attaactact gccaccaaag cggtgttacc gaggaagatc cggaaaccag cgacaacaac 900
accccggaaa ccatcgagaa gctgcgtaaa atcagccgtg agagcattgt gctgctgaag 960
gacgatgacc gtaaccgtag cattctgccg ctgaagaaaa gcgacaaaat cgcggttatt 1020
ggtaacaacg cgaaacaagc ggcgtattgc ggtggcggta gcgcgagcgt gctgagctat 1080
cacaccacca ccccgttcga cagcatcaag agccgtctgg aagatagcaa caccccggcg 1140
tacaccattg gtgcggacgc gtataaaaac ctgccgccgc tgggtccgca aatgaccgat 1200
agcgacggca agccgggttt tgatgcgaaa ttctttgttg gcagcccgac cagcaaggat 1260
cgtaaactga tcgaccactt ccagctgacc aacagccaag tttttctggt ggactactat 1320
aacgaacaga tcccggaaaa caaggagttc tacgttgacg tggagggtca atttattccg 1380
gaggaagatg gcacctataa cttcggtctg accgtgtttg gtaccggccg tctgttcgtt 1440
gatgacaaac tggttagcga cagcagccag aaccaaaccc cgggcgatag cttctttggt 1500
ctggcggcgc aggaagtgat cggcagcatt cacctggtga agggtaaagc gtacaagatc 1560
aaagttctgt atggcagcag cgtgacccgt acctacgaaa ttgcggcgag cgttgcgttt 1620
gagggcggtg cgttcacctt tggtgcggcg aaacagcgta acgaagacga ggaaatcgcg 1680
cgtgcggtgg agattgcgaa ggcgaacgac aaagtggttc tgtgcatcgg cctgaaccaa 1740
gatttcgaaa gcgagggttt tgatcgtccg gacatcaaga ttccgggcgc gaccaacaaa 1800
atggttagcg cggtgctgaa ggcgaacccg aacaccgtta ttgtgaacca gaccggtacc 1860
ccggttgaga tgccgtgggc gagcgatgcg ccggtgatcc tgcaagcgtg gtttggcggt 1920
agcgaggcgg gtaccgcgat tgcggatgtt ctgtttggcg actacaaccc gagcggcaag 1980
ctgaccgtga ccttcccgct gcgttttgag gataacccgg cgtacctgaa cttccagagc 2040
aacaaacaag cgtgctggta tggcgaagac gtttacgtgg gttatcgtta ctatgagacc 2100
atcgatcgtc cggtgctgtt cccgtttggt cacggcctga gcttcaccga gttcgatttt 2160
accgacatgt ttgttcgtct ggaggaagag aacctggaag ttgaggtggt tgtgcgtaac 2220
accggcaagt acgacggtgc ggaagtggtg cagctgtatg ttgcgccggt tagcccgagc 2280
ctgaaacgtc cgatcaagga actgaaagag tacgcgaaaa ttttcctggc gagcggtgaa 2340
gcgaagaccg ttcacctgag cgtgccgatc aaatacgcga ccagcttctt tgatgagtat 2400
caaaagaaat ggtgcagcga aaagggcgag tataccattc tgctgggtag cagcagcgcg 2460
gacatcaaag ttagccaaag catcaccctg gaaaaaacca ccttctggaa aggtctgtaa 2520
<210> 3
<211> 346
<212> БЕЛОК
<213> Pichia pastoris
<400> 3
Met Lys Ser Gln Leu Ile Phe Met Ala Leu Ala Ser Leu Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Pro Leu Glu His Gln Gln Gln His His Lys His Glu Lys Arg Ala
20 25 30
Val Val Thr Gln Thr Val Thr Val Ala Ala Gly Gln Thr Ala Ala Ala
35 40 45
Gly Ser Ala Gln Ala Val Val Thr Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ser Val
50 55 60
Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr
65 70 75 80
Ser Gly Ala Ser Gly Asp Leu Ser Ser Phe Lys Asp Gly Thr Ile Lys
85 90 95
Cys Ser Glu Phe Pro Ser Gly Asp Gly Val Val Ser Val Ser Trp Leu
100 105 110
Gly Phe Gly Gly Trp Ser Ser Ile Met Asn Leu Gln Gly Gly Thr Ser
115 120 125
Glu Ser Cys Glu Asn Gly Tyr Tyr Cys Ser Tyr Ala Cys Glu Ala Gly
130 135 140
Tyr Ser Lys Thr Gln Trp Pro Ser Asn Gln Pro Ser Asp Gly Arg Ser
145 150 155 160
Val Gly Gly Leu Leu Cys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Thr
165 170 175
Ala Phe Asp Thr Leu Cys Val Pro Gly Lys Gly Thr Ala Ser Val Glu
180 185 190
Asn Asn Val Ser Lys Gly Ile Ser Ile Cys Arg Thr Asp Tyr Pro Gly
195 200 205
Ser Glu Asn Met Cys Val Pro Thr Trp Val Asp Ala Gly Asn Ser Asn
210 215 220
Thr Leu Thr Val Val Asp Glu Asp Asn Tyr Tyr Glu Trp Gln Gly Leu
225 230 235 240
Lys Thr Ser Ala Gln Tyr Tyr Val Asn Asn Ala Gly Val Ser Val Glu
245 250 255
Asp Gly Cys Ile Trp Gly Asp Glu Ser Ser Gly Val Gly Asn Trp Ala
260 265 270
Pro Leu Val Leu Gly Ala Gly Ser Thr Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Ser
275 280 285
Leu Ile Pro Asn Pro Asn Asn Lys Lys Ala Pro Asn Phe Asn Val Lys
290 295 300
Ile Val Ala Thr Asp Gly Ser Ser Ile Asn Gly Asp Cys Lys Tyr Glu
305 310 315 320
Asn Gly Ile Phe Val Gly Ser Ser Thr Asp Gly Cys Thr Val Thr Val
325 330 335
Thr Ser Gly Ser Ala Lys Leu Val Phe Tyr
340 345
<210> 4
<211> 1041
<212> ДНК
<213> Pichia pastoris
<400> 4
atgaaaagcc agctgatctt tatggctttg gcctcccttg tagcaagtgc accgctggaa 60
caccagcagc agcatcataa acatgagaaa cgcgccgtag ttacgcagac agtaactgtt 120
gcggcgggcc agacagcagc agcgggttcc gcccaggcag ttgttacctc aagcgcggcg 180
ccagcatccg ttgcttcaag tgcggccgcg tctgctagct catcttcttc cagctatacc 240
tctggcgctt caggcgatct tagtagtttc aaagatggta ctattaaatg ttcagaattc 300
ccatcagggg atggcgtggt gtccgtctct tggttaggct tcggcggctg gtctagtatt 360
atgaatctgc agggtggtac ttcagagagt tgtgagaacg gctattattg ttcatatgca 420
tgtgaagccg gttatagcaa aacacagtgg ccatctaacc agccgtcaga tgggagatca 480
gtgggagggt tgctgtgtaa agatggcctg ttatatcgct ccaatacagc gttcgataca 540
ttatgtgtgc ctggaaaagg tacagcatcc gtggagaata atgtgtctaa aggtatttcc 600
atttgtagaa cggattatcc ggggtctgaa aacatgtgcg tcccgacgtg ggtcgatgcc 660
ggtaactcaa acaccttgac agtggtagat gaagataatt attatgaatg gcagggcctt 720
aaaactagtg ctcagtatta tgtgaataac gccggtgtta gtgttgaaga tgggtgcatc 780
tggggcgatg agtccagcgg cgttggaaac tgggcgccgt tggttttggg ggccggttcc 840
acggggggtc tgacctatct gtctctgatt ccgaatccaa acaacaaaaa agcaccgaat 900
tttaacgtaa aaatcgtggc cacggatgga agttcaatta acggagattg caaatatgaa 960
aatgggatct ttgtcggttc ttcaaccgat ggctgcacgg taactgttac ctcaggtagt 1020
gcaaaactgg ttttttatta a 1041
<210> 5
<211> 348
<212> БЕЛОК
<213> Pichia pastoris
<400> 5
Met Gln Val Lys Ser Ile Val Asn Leu Leu Leu Ala Cys Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ala Arg Pro Leu Glu His Ala His His Gln His Asp Lys Arg Gly
20 25 30
Val Val Val Val Thr Lys Thr Ile Val Val Asp Gly Ser Thr Val Glu
35 40 45
Ala Thr Ala Ala Ala Gln Val Gln Glu His Ala Glu Thr Phe Ala Glu
50 55 60
Ser Thr Pro Ser Ala Val Val Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ser Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Ser Gly Ser Phe Ser Ala Gly Thr
85 90 95
Lys Gly Val Thr Tyr Ser Pro Tyr Gln Ala Gly Gly Gly Cys Lys Thr
100 105 110
Ala Glu Glu Val Ala Ser Asp Leu Ser Gln Leu Thr Gly Tyr Glu Ile
115 120 125
Ile Arg Leu Tyr Gly Val Asp Cys Asn Gln Val Glu Asn Val Phe Lys
130 135 140
Ala Lys Ala Pro Gly Gln Lys Leu Phe Leu Gly Ile Phe Phe Val Asp
145 150 155 160
Ala Ile Glu Ser Gly Val Ser Ala Ile Ala Ser Ala Val Lys Ser Tyr
165 170 175
Gly Ser Trp Asp Asp Val His Thr Val Ser Val Gly Asn Glu Leu Val
180 185 190
Asn Asn Gly Glu Ala Thr Val Ser Gln Ile Gly Gln Tyr Val Ser Thr
195 200 205
Ala Lys Ser Ala Leu Arg Ser Ala Gly Phe Thr Gly Pro Val Leu Ser
210 215 220
Val Asp Thr Phe Ile Ala Val Ile Asn Asn Pro Gly Leu Cys Asp Phe
225 230 235 240
Ala Asp Glu Tyr Val Ala Val Asn Ala His Ala Phe Phe Asp Gly Gly
245 250 255
Ile Ala Ala Ser Gly Ala Gly Asp Trp Ala Ala Glu Gln Ile Gln Arg
260 265 270
Val Ser Ser Ala Cys Gly Gly Lys Asp Val Leu Ile Val Glu Ser Gly
275 280 285
Trp Pro Ser Lys Gly Asp Thr Asn Gly Ala Ala Val Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Asn Gln Gln Ala Ala Val Gln Ser Leu Gly Gln Lys Ile Gly Ser Ser
305 310 315 320
Cys Ile Ala Phe Asn Ala Phe Asn Asp Tyr Trp Lys Ala Asp Gly Pro
325 330 335
Phe Asn Ala Glu Lys Tyr Trp Gly Ile Leu Asp Ser
340 345
<210> 6
<211> 1047
<212> ДНК
<213> Pichia pastoris
<400> 6
atgcaggtta aatctattgt taatttactg cttgcctgtt ccttggctgt ggcgcgtccg 60
ttggaacacg ctcaccatca gcatgataaa cgcggcgttg tagtagtaac gaaaaccatc 120
gtcgttgatg gtagcacagt tgaggctacc gccgctgctc aggtgcagga gcatgcagaa 180
acctttgcag aatcaacccc gtcagccgtc gtttccagtt catccgcccc ttcatcagca 240
agctcagctt ccgctccagc tagttcaggt tctttttcag ctggtaccaa aggcgtgaca 300
tattctccat atcaggccgg tggtgggtgt aaaacagcgg aagaagtggc atccgatctg 360
tcacagctta ccggttatga aattattcgg ctttatggcg tagattgcaa ccaggttgag 420
aacgtgttta aagccaaagc ccctggccag aaactttttt tgggtatctt ttttgtggat 480
gccatcgagt ctggcgtatc agctatcgca agtgccgtta aatcctatgg ttcttgggat 540
gatgtacaca ctgtatctgt tggcaacgag ctggtgaaca atggcgaagc cactgttagc 600
cagattggac agtatgttag tacggccaaa tcagccttac gctctgccgg tttcacaggg 660
ccagtattgt ctgttgatac ttttattgca gtgattaaca atccggggct gtgtgatttc 720
gcggatgaat atgttgctgt gaacgcccat gcgttcttcg atgggggtat tgctgcctca 780
ggggcgggcg attgggcggc agagcagatc cagcgcgtct ccagtgcgtg cggcgggaaa 840
gatgtcttaa ttgtagaaag cggttggccg tctaaaggag atacgaacgg cgccgcagtg 900
ccgtcaaaat ccaatcagca ggctgcagtc cagagtcttg gccagaaaat tgggagctca 960
tgcattgcct ttaacgcatt taatgattat tggaaagccg atggtccgtt caacgccgaa 1020
aaatattggg ggatccttga tagttaa 1047
<210> 7
<211> 464
<212> БЕЛОК
<213> Pichia pastoris
<400> 7
Met Leu Ser Thr Ile Leu Asn Ile Phe Ile Leu Leu Leu Phe Ile Gln
1 5 10 15
Ala Ser Leu Gln Ala Pro Ile Pro Val Val Thr Lys Tyr Val Thr Glu
20 25 30
Gly Ile Ala Val Val Thr Glu Thr Asn Val Arg Val Val Thr Lys Thr
35 40 45
Ile Pro Ile Val Gln Val Leu Ile Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr His
50 55 60
Thr Leu Thr Thr Val Ser Thr Ala Glu Glu Asn Gly Asn Phe Gln Pro
65 70 75 80
Ile Thr Thr Thr Ser Ile Val Asn Lys Glu Val Val Val Pro Thr Ser
85 90 95
Val Thr Pro Asn Thr Gln Gln Thr Arg Pro Thr Gln Val Asp Thr Thr
100 105 110
Gln Asn Asn Ala Asp Thr Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ser Pro Thr Thr
115 120 125
Ser Ser Asn Asn Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser Thr Thr Arg Ser Val
130 135 140
Val Thr Ser Val Val Val Val Gly Pro Asp Gly Ser Pro Ile Glu Asn
145 150 155 160
Thr Gly Gln Thr Ala Asn Pro Thr Thr Thr Ala Pro Thr Thr Ser Thr
165 170 175
Thr Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Pro Thr Ala Ser
180 185 190
Ser Thr Pro Gly Gly Asn His Pro Arg Ser Ile Val Tyr Ser Pro Tyr
195 200 205
Ser Asp Ser Ser Gln Cys Lys Asp Ala Thr Thr Ile Glu Thr Asp Leu
210 215 220
Glu Phe Ile Ala Ser Lys Gly Ile Ser Ala Val Arg Ile Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Asp Cys Asn Tyr Leu Thr Val Val Leu Pro Lys Cys Ala Ser Leu Gly
245 250 255
Leu Lys Val Asn Gln Gly Phe Trp Ile Gly Pro Ser Gly Val Asp Ser
260 265 270
Ile Asp Asp Ala Val Gln Glu Phe Ile Gln Ala Val Asn Gly Asn Asn
275 280 285
Gly Phe Asn Trp Asp Leu Phe Glu Leu Ile Thr Val Gly Asn Glu Ala
290 295 300
Ile Ser Ala Gly Tyr Val Ser Ala Ser Ser Leu Ile Ser Lys Ile Lys
305 310 315 320
Glu Val Ser Ser Ile Leu Ser Ser Ala Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Thr
325 330 335
Thr Ala Glu Pro Pro Asn Val Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Leu Cys Ser
340 345 350
Thr Asp Val Met Ser Ile Val Gly Val Asn Ala His Ser Tyr Phe Asn
355 360 365
Thr Leu Phe Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Phe Val Lys Ser Gln Ile
370 375 380
Glu Val Val Gln Lys Ala Cys Ser Arg Ser Asp Ile Thr Ile Ile Glu
385 390 395 400
Thr Gly Tyr Pro Ser Gln Gly Ala Thr Asn Gly Lys Asn Val Pro Ser
405 410 415
Lys Glu Asn Gln Lys Thr Ala Ile Phe Ser Ile Phe Glu Val Val Gly
420 425 430
Thr Asp Val Thr Ile Leu Ser Thr Tyr Asp Asp Leu Trp Lys Asp Pro
435 440 445
Gly Pro Tyr Gly Ile Glu Gln Phe Phe Gly Ala Ile Asp Leu Phe Ser
450 455 460
<210> 8
<211> 1395
<212> ДНК
<213> Pichia pastoris
<400> 8
atgctgtcca caattctgaa tatttttatt cttctgttat tcatccaggc gtctcttcag 60
gcgcctattc cggtggtgac caaatatgtg accgaaggta ttgccgttgt gactgaaacc 120
aatgtgcggg ttgttactaa aaccattccg attgtgcagg tgctgatctc cgatggtgca 180
acctatactc ataccctgac gacagtgtca acggcggaag aaaatggcaa cttccagcct 240
attaccacga catctattgt caacaaagaa gttgtagtac caacaagcgt aaccccgaat 300
acccagcaga cgcgtccgac ccaggtagat accacacaga acaatgcgga tacaccagcg 360
gcgcctacac catcacctac tactagttca aacaacggcg tgttcaccac atattccaca 420
acacgtagcg tagtcactag tgtagtcgta gtcggaccgg atggaagccc tattgaaaat 480
actggacaga cagcaaaccc tactacaact gccccaacta caagcactac tgctgcccgg 540
accacaagca gtacgtccac cacacctacc gctagctcta cgccaggagg taatcatcca 600
cgtagcatcg tctattctcc atattccgat agcagtcagt gtaaagatgc gacaacgatc 660
gaaaccgatc ttgagttcat tgcctctaaa ggcatcagcg cggtacgtat ttatggcaat 720
gattgtaact atcttacagt tgttttgcct aaatgtgcca gtctgggatt aaaagtgaat 780
cagggctttt ggattggtcc aagtggagta gatagcatcg atgatgcagt acaggagttt 840
attcaggcag tcaacggcaa caacggcttt aattgggatt tattcgaatt aattaccgtc 900
ggaaacgaag caatcagtgc cggttatgtt tcagcgagct ccctgatttc caaaattaaa 960
gaagtatcta gcattctgag ctccgcgggt tatactggtc caattaccac agccgaaccg 1020
cctaacgtat atgaggatta tggcgatctg tgctcaaccg atgtaatgtc catcgtgggt 1080
gtaaacgcgc attcctattt taataccctt tttgcggcct ccgattcagg ttcatttgtg 1140
aaatcacaga tcgaagtagt ccagaaagca tgctcacgtt ccgatattac tattattgaa 1200
accgggtatc cgtcccaggg agctaccaat ggaaaaaacg ttcctagtaa agagaatcag 1260
aaaacagcga ttttttcaat ctttgaggtc gttggaacag atgtaactat tcttagtact 1320
tatgatgatt tgtggaaaga tcctggaccg tatgggattg aacagttttt tggtgcgatc 1380
gatctttttt cttaa 1395
<---
Claims (37)
1. Способ изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающий:
a) подвергание первого стевиолового гликозида воздействию бета–глюкозидазы из вида Pichia в течение периода времени, достаточного для образования второго стевиолового гликозида посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого стевиолового гликозида; и
b) сбор указанного второго стевиолового гликозида.
2. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 указанного первого стевиолового гликозида.
3. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 указанного первого стевиолового гликозида.
4. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы либо в положении C19 указанного первого стевиолового гликозида, либо в положении C13 указанного первого стевиолового гликозида.
5. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы как в положении C19 указанного первого стевиолового гликозида, так и в положении C13 указанного первого стевиолового гликозида.
6. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 рубузозида с получением стевиол–13–глюкозида.
7. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида.
8. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb E с получением стевиолбиозида.
9. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb I с получением Reb A.
10. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb A с получением Reb B.
11. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 стевиол–13–глюкозида с получением стевиола.
12. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 Reb D с получением Reb B или Reb A.
13. Способ по п. 4, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 и в положении C13 Reb G с получением стевиол–13–глюкозида.
14. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb M.
15. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb B.
16. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb A.
17. Способ по любому из пп. 1–16, дополнительно включающий применение ферментов, представляющих собой бета–галактозидазу или пектиназу, для увеличения скорости ферментативного гидролиза.
18. Способ по любому из пп. 1–17, дополнительно включающий:
обеспечение экспрессии стевиолового гликозида в трансформированной клеточной системе;
выращивание клеточной системы в среде и
получение указанного второго стевиолового гликозида.
19. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 6 часов.
20. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 12 часов.
21. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 18 часов.
22. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 24 часа.
23. Способ по любому из пп. 1–22, где бета–глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1.
24. Способ по любому из пп. 1–22, где бета–глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 3.
25. Способ по п. 1, где второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb E.
26. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой смесь Reb E, Reb D4 и Reb M.
27. Способ по п. 1, где второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb D4.
28. Способ по любому из пп. 1–27, где второй стевиоловый гликозид на стадии b) представляет собой неочищенный продукт, и стадия b) дополнительно включает: i) очистку указанного неочищенного продукта и ii) удаление растворителей под вакуумом с получением концентрированного продукта.
29. Способ по п. 28, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии.
30. Способ по п. 28, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью кислотно–щелочной экстракции.
31. Способ по п. 28, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью вакуумной перегонки.
32. Способ по п. 28, дополнительно предусматривающий очистку концентрированного продукта с применением полупрепаративной HPLC.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762527482P | 2017-06-30 | 2017-06-30 | |
US62/527,482 | 2017-06-30 | ||
PCT/US2018/040193 WO2019006244A1 (en) | 2017-06-30 | 2018-06-29 | HYDROLYSIS OF STEVIOL GLYCOSIDES BY BETA-GLUCOSIDASE |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020102899A RU2020102899A (ru) | 2021-07-30 |
RU2020102899A3 RU2020102899A3 (ru) | 2021-11-09 |
RU2775697C2 true RU2775697C2 (ru) | 2022-07-06 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102925518A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 江南大学 | 一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法 |
US20140329281A1 (en) * | 2011-08-08 | 2014-11-06 | Jens Houghton-Larsen | Recombinant Production of Steviol Glycosides |
WO2016043926A1 (en) * | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
RU2599166C2 (ru) * | 2011-12-19 | 2016-10-10 | Дзе Кока-Кола Компани | Способы очистки стевиоловых гликозидов и их применение |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140329281A1 (en) * | 2011-08-08 | 2014-11-06 | Jens Houghton-Larsen | Recombinant Production of Steviol Glycosides |
RU2599166C2 (ru) * | 2011-12-19 | 2016-10-10 | Дзе Кока-Кола Компани | Способы очистки стевиоловых гликозидов и их применение |
CN102925518A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 江南大学 | 一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法 |
WO2016043926A1 (en) * | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2764803C2 (ru) | Биосинтетическое получение стевиолового гликозида ребаудиозида d4 из ребаудиозида e | |
RU2741103C2 (ru) | Рекомбинантное получение стевиол-гликозидов | |
US11414689B2 (en) | Hydrolysis of steviol glycosides by beta-glucosidase | |
JP7365707B2 (ja) | ステビオール配糖体レバウジオシドj及びレバウジオシドnの生合成による製造 | |
RU2775697C2 (ru) | Гидролиз стевиоловых гликозидов с помощью бета-глюкозидазы | |
US20220205007A1 (en) | Biosynthetic production of steviol glycoside rebaudioside i via variant enzymes |