CN102925518A - 一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用填充床酶促水解甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法。该方法包括用水或磷酸盐缓冲液溶解甜菊苷或甜叶菊提取物，其溶液通过固定化β-葡萄糖苷酶填充柱，含有甜菊双糖苷的部分合并，再浓缩与重结晶，得到甜菊双糖苷。现有技术制备甜菊双糖苷需要5天，其β-葡萄糖苷酶重复使用4次后其转化活性只是其原活性的57.72%。本发明使用固定化β-葡萄糖苷酶制备甜菊双糖苷只需要12h，并且使用5次后其甜菊苷的转化率仍达到84%以上。因此，本发明方法的生产周期短，生产效率高，易于实现连续化生产，具有非常广泛的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于有机化合物生物合成技术领域。更具体地，本发明涉及一种利用填充床酶促水解甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法。
【背景技术】
甜菊糖是从甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶子中提取的多种双萜糖苷的混合物，是一种天然强力甜味剂，其主要成分是甜菊苷(Stevioside,St)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)，其中莱鲍迪苷A甜味纯正，而甜菊苷有一定的后苦涩味，目前大量研究主要用酶促转糖基反应改变甜菊苷结构以改善其甜味特性。此外有研究表明，通过酶法水解可以将甜菊苷转化成甜味特性不好，但是具有一定生理活性的甜菊双糖苷，而且甜菊双糖苷可以作为中间产物进一步衍生化成其他生理活性更好的物质。
与甜菊苷相比，甜菊双糖苷在19位少一个葡萄糖基，Wood H.B.等人在题为“The structure of the glucose moieties”（J.Org.Chem.，20，p875-883，1955）中指出通过碱水解方法可以获得甜菊双糖苷，但是，这种化学法水解还可能破坏其化学结构。与化学法水解相比，酶法水解具有反应条件温和、选择性高、环保等优点。Nakano H.等人在Bioscience,biotechnology,andbiochemistry，64(2)，p333-340（2000）与Journal of Fermentation andBioengineering,85(2)，p162-168（1998）中分别描述了来源于Clavibactermichiganense和Flavobacterium johnsonae的β-葡萄糖苷酶可以将甜菊苷水解成甜菊双糖苷，但是筛选出的两种酶选择性较差，而且在水解甜菊苷的同时，还会将莱鲍迪苷A水解成莱鲍迪苷B(Rebaudioside B,RB)，此外游离β-葡萄糖苷酶贮存稳定性差，分离回收困难。为此，人们研究出一种适用的固化酶方法，例如刘虎等人在食品工业科技第4期（2011）和CN201010170786中描述了用海藻酸钠作为包埋材料，对巨大芽孢杆菌所产的β-葡萄糖苷酶进行包埋固定处理，并将其固定β-葡萄糖苷酶应用于水解甜菊苷，制备得到甜菊双糖苷。但是，这些现有技术制备甜菊双糖苷的反应时间需要5天，其反应时间太长，而且采用包埋方法固定的β-葡萄糖苷酶在重复使用4次后，其转化活性只是其原活性的57.72%，这种固定β-葡萄糖苷酶使用寿命过短。
因此，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量的实验研究，终于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法。
本发明使用由诺维信公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在本发明提供的使用条件下，它具有很高的选择性，对甜叶菊提取物中的其他甜菊苷衍生物不具有水解活性。使用壳聚糖-戊二醛交联固定化的β-葡萄糖苷酶，采用填充床式反应装置可以连续地将甜菊苷酶催化水解成甜菊双糖苷，提高了该酶的热稳定性，具有很高的经济价值。
该制备方法的步骤如下：
用水或磷酸盐缓冲液溶解甜菊苷或含有甜菊苷的甜叶菊提取物得到甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度30-50℃下预热0.5-1.0小时；然后将此预热溶液以恒定的流速通过装有固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，让外循环水通过填充柱夹套，以便将其反应温度控制在30-50℃,所述预热溶液与所述填充柱的体积比是1-6；用高效液相色谱检测从所述填充柱底部流出的溶液并用峰面积归一化法计算各组分含量，待甜菊苷转化率不再升高时，开始收集并合并流出液，然后进行蒸发浓缩，所得到的粗甜菊双糖苷经过重结晶后纯度达到98%以上。
根据本发明的一种优选实施方式，所述磷酸盐缓冲液是由KH2PO4与K2HPO4组成的pH值为5.7-8.0的0.01-0.2M磷酸盐缓冲液。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述甜菊苷溶液的甜菊苷浓度是2-20mg/mL。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的甜菊苷溶液以速度1-6mL/h通过所述的填充柱。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的粗甜菊双糖苷在无水甲醇或乙醇中在室温下进行重结晶。
在本发明的方法中，所述的固定化β-葡萄糖苷酶是采用下述步骤制备得到的︰
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖重量与以mL计乙酸水溶液体积的比0.2-0.5︰16-24，将壳聚糖溶于1-5重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去该溶液中的气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶；
B、制备壳聚糖微球
把在步骤A得到的透明壳聚糖凝胶滴加到一种凝结液中，然后在温度2-6℃下进行硬化10-16小时，得到一种壳聚糖微球，接着用去离子水将所述微球洗涤至中性，在温度3-5℃下保存过夜；
所述的凝结液是由8-12重量%NaOH水溶液与92-98重量%乙醇水溶液按照体积比3-5︰1组成的；
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以克计壳聚糖微球与以毫升计戊二醛水溶液的比0.8-1.2︰20-30，将步骤B得到的壳聚糖微球加到戊二醛水溶液中，在温度20-40℃下振荡交联0.5-8.0小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球为1000-2000U游离β-葡萄糖苷酶的比例，再加入游离β-葡萄糖苷酶，在温度15-35℃下振荡固定2-12小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的戊二醛水溶液的浓度是0.1-5.0重量%。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的壳聚糖微球与戊二醛的交联时间是2.0-5.0h。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的游离β-葡萄糖苷酶的固定时间是5.0-9.0h。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法。
该制备方法的步骤如下：
用水或磷酸盐缓冲液将甜菊苷或含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解得到一种甜菊苷溶液。
甜菊苷为白色或微黄色粉末，易溶于水、乙醇和甲醇，不溶于苯、醚、氯仿等有机溶剂，其甜度约为蔗糖的200倍，略带后涩味。甜菊苷在一般食品加工的条件下对热、酸、碱、盐稳定，在pH大于9或小于3时，长时间加热（100℃）会使甜菊苷分解，甜味降低。甜菊苷具有非发酵性，只是少数几种酶能使甜菊苷水解。本发明使用的甜菊苷是目前在市场上广泛销售的产品，例如湖北大仝生物化工科技有限公司、上海西宝生物科技有限公司、宁波亿诺化学品有限公司销售的产品。
甜叶菊提取物带有明显的苦涩味、甜味刺激缓慢、味觉延绵。甜叶菊糖具有降血压、强壮身体、治糠尿病等药用价值，对人体没有任何不良的影响。本发明使用的甜叶菊提取物是目前在市场上广泛销售的产品，例如陕西康威生物工程有限公司、湖南大自然制药有限公司、珠海甜菊糖科技发展有限公司。
所述磷酸盐缓冲液是由KH2PO4与K2HPO4组成的pH值为5.7-8.0的0.01-0.2M磷酸盐缓冲液。
优选地，所述磷酸盐缓冲液是由KH2PO4与K2HPO4组成的pH值为6.2-7.5的0.05-0.15M磷酸盐缓冲液。
更优选地，所述磷酸盐缓冲液是由KH2PO4与K2HPO4组成的pH值为6.6-7.2的0.08-0.12M的磷酸盐缓冲液。
所述甜菊苷溶液的甜菊苷浓度是2-20mg/mL。在本发明中，如果所述的甜菊苷浓度小于2mg/mL，生产效率会显著下降；如果所述的甜菊苷浓度高于20mg/mL，则会发生填充床堵塞现象；因此，甜菊苷浓度为2-20mg/mL是合适的。
优选地，所述甜菊苷溶液的甜菊苷浓度是8-12mg/mL。
所述的甜菊苷溶液在摇床中在温度30-50℃的条件下预热0.5-1.0小时，然后将预热溶液以恒定的流速通过装有固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套内通外循环水控制反应温度在30-50℃,所述预热溶液与所述填充床的体积比是1-6。
优选地，所述的甜菊苷溶液在温度38-42℃的条件下预热0.6-0.8小时。
所述的甜菊苷溶液以速度1-6mL/h通过所述的填充柱。优选地，所述的甜菊苷溶液以速度2-4mL/h通过所述的填充柱。
在本发明中，如果所述预热溶液与所述填充床的体积比小于1或者大于6，生产效率会显著下降；因此，所述预热溶液与所述填充床的体积比为1-6是合适的。优选地，所述预热溶液与所述填充床的体积比为2-4。
所述的固定化β-葡萄糖苷酶是采用下述步骤制备得到的︰
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖重量与以mL计乙酸水溶液体积的比0.2-0.5︰16-24，将壳聚糖溶于1-5重量%的乙酸水溶液中，然后用超声波除去溶液中的气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
壳聚糖(chitosan)为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展
优选地，以重量计的壳聚糖与以体积计的乙酸水溶液的比为0.2-0.4︰18-22。
更优选地，以重量计的壳聚糖与以体积计的乙酸水溶液的比为0.3︰20。
乙酸水溶液浓度优选地是2-4重量%。
本发明使用的超声波设备是目前市场上销售的普通实验设备，没有特别限制。
B、制备壳聚糖微球
把经步骤A得到的透明壳聚糖凝胶用滴管滴加到一种凝结液中，然后在温度2-6℃下硬化10-16小时，得到一种壳聚糖微球，接着用去离子水洗涤所述微球至中性，在温度3-5℃下保存过夜；
所述的凝结液是由8-12重量%NaOH水溶液与92-98重量%乙醇水溶液按照体积比3-5︰1组成的。
优选地，所述的凝结液是由10重量%NaOH水溶液与95重量%乙醇水溶液按照体积比4︰1组成的。
所述的透明壳聚糖凝胶在凝结液中硬化时间优选地为12-14小时。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以克计壳聚糖微球与以毫升计戊二醛水溶液的比0.8-1.2︰20-30，将步骤B得到的壳聚糖微球加到戊二醛水溶液中，在温度20-40℃下振荡交联0.5-8小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球为1000-2000U游离β-葡萄糖苷酶，再加入游离β-葡萄糖苷酶，在温度15-35℃下振荡固定2-12小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶。。
本发明使用的游离β-葡萄糖苷酶是由诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶。
优选地，按照以克计壳聚糖微球与以毫升计戊二醛水溶液的比为1.0︰25。
所述戊二醛水溶液的浓度是0.1-5.0重量%。如果所述戊二醛水溶液的浓度小于0.1重量%或高于5.0重量%，该交联反应会不充分或过度进行，对固定化酶的比活和回收率有不良影响；因此，所述戊二醛水溶液浓度0.1-5.0重量%是合适的，优选地是1-4重量%，更优选地是1.5-3.0重量%。
在本发明中，如果壳聚糖微球与戊二醛进行交联的温度低于20℃，则交联反应会不充分；如果壳聚糖微球与戊二醛进行交联的温度高于40℃，则会过度交联；因此，壳聚糖微球与戊二醛进行交联的温度为20-40℃是合适的，优选地是25-35℃，更优选地是28-32℃。
所述的壳聚糖微球与戊二醛在温度20-40℃下交联时间若不到0.5小时，则交联反应会不充分；如果交联时间超过8小时，则只是浪费时间；因此在温度20-40℃下交联时间0.5-8.0小时是合适的，优选地是2.0-5.0h，更优选地是3.0-4.0h。
在本发明中，如果所述游离β-葡萄糖苷酶的固定温度低于15℃或高于35℃，则固定不充分或者不均匀；因此，所述的固定温度为15-35℃是合适的，优选地是28-32℃，更优选地是30℃。
在本发明中，如果所述游离β-葡萄糖苷酶在温度15-35℃下固定时间低于2小时，则固定不充分；如果所述游离β-葡萄糖苷酶的固定时间多于12小时，则只是浪费时间；因此，所述游离β-葡萄糖苷酶在温度15-35℃下固定时间为2-12小时是合适的，优选地是5-9h，更优选地是6-8h。
本发明装有固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱装置见附图1。该反应装置由恒温水浴槽1、蠕动泵2、填充柱3、循环水泵4与结晶槽5组成。反应原料混合物在恒温水浴槽1中预热后通过蠕动泵2送到填充柱3的上端，所述反应原料混合物通过装有固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱3，所述原料在其中进行酶解反应，从所述填充柱底部流出的溶液采用高效液相色谱（HPLC）进行检测，待甜菊苷转化率不再升高时，开始收集并合并流出液。
本发明采用的高效液相色谱法是一种常规的高效液相色谱分析方法。本发明使用的高效液相色谱仪是目前市场上销售的产品，例如Waters、Agilent、岛津等品牌的高效液相色谱仪。高效液相色谱分析在下述条件下进行︰
高效液相色谱柱为Lichospher C18柱，它是美国Waters公司销售的产品，250mm×4.6mm，填料粒径5μm，流动相为乙腈:水=30:70(0min)-47.5:52.5(10min)-30:70(20min)(v/v)；流速1.0mL/min;柱温40℃；检测波长210nm，进样量10μL。
用高效液相色谱法（HPLC）进行检测，确定甜菊苷转化率不再升高时，合并并蒸发浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。
本发明进行蒸发浓缩的条件为普通条件，没有限制。考虑到产品色泽和操作经济性，推荐选择在温度88-92℃与真空0.002-0.008MPa下进行蒸发。本发明使用的蒸发浓缩设备是目前市场上销售的普通产品，没有特殊要求，例如杭州圣亚机械有限公司、杭州惠合机械设备有限公司、浙江森力机械科技有限公司销售的产品。
得到的粗甜菊双糖苷一般纯度在95重量%以上，但还需要进行重结晶，以便得到的结晶产物为纯度98重量%以上的甜菊双糖苷。
所述的重结晶是让所述的粗甜菊双糖苷在无水甲醇或乙醇中在室温下再次进行结晶。为了加快或促进甜菊双糖苷晶体生长，在重结晶时可以添加甜菊双糖苷晶种，甜菊双糖苷晶种的添加量是以所述的粗甜菊双糖苷重量计5-8%。
本发明固定化β-葡萄糖苷酶连续水解甜菊苷的稳定性试验见附图2，该图显示，在反应温度40℃、甜菊苷浓度5mg/mL、流速3.0mL/h、pH 7.0、加酶量3195U的条件下，甜菊苷转化率和甜菊双糖苷生产强度随时间的变化。
本发明采用壳聚糖-戊二醛交联固定化可以大大提高酶的热稳定性，在温度40℃下连续使用5次后，其甜菊苷的转化率仍达到84%以上。本发明只是需要12h就可以将甜菊苷完全水解，因此生产周期大大缩短。采用本发明的填充柱制备甜菊双糖苷的生产效率高，易于实现甜菊双糖苷的连续化生产，具有非常广泛的应用前景。
[有益效果]
本发明具有下述有益效果：
现有技术制备甜菊双糖苷的反应时间需要5天，其β-葡萄糖苷酶在温度40℃下重复使用4次后其转化活性只是其原活性的57.72%。本发明使用固定化β-葡萄糖苷酶制备甜菊双糖苷的反应时间只是需要12h，并且在温度40℃下连续使用5次后其甜菊苷的转化率仍达到84%以上。因此，本发明方法的生产周期短，生产效率高，易于实现连续化生产，具有非常广泛的应用前景。
【附图说明】
图1表示本发明制备甜菊双糖苷时使用的固定化β-葡萄糖苷酶填充柱装置。
图2是本发明固定化β-葡萄糖苷酶连续水解甜菊苷的稳定性试验。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖重量与以mL计乙酸水溶液体积的比0.3︰20，将壳聚糖溶于2重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度4℃下进行硬化14小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度4℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由10重量%NaOH水溶液与95重量%乙醇水溶液按照体积比4︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.0︰25，将步骤B得到的壳聚糖微球加到3重量%戊二醛水溶液（pH 6.5）中，在温度28℃下振荡交联5小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1700U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度20℃下振荡固定8小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1500U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用水将湖北大仝生物化工科技有限公司销售的甜菊苷溶解，得到浓度为8mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度42℃下预热0.6小时，然后将预热溶液以2mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在42℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是4；用高效液相色谱检测从所述填充柱底部流出的溶液，5小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液在温度90℃与真空度0.004MPa下浓缩，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水甲醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.0重量%。
高效液相色谱在下述条件下检测甜菊双糖苷︰
高效液相色谱仪：Waters 2965
测定条件︰Lichospher C18柱，它是美国Waters公司销售的产品，250mm×4.6mm，填料粒径5μm，流动相为乙腈:水=30:70(0min)-47.5:52.5(10min)-30:70(20min)(v/v)；流速1.0mL/min;柱温40℃；检测波长210nm，进样量10μL。
实施例2：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.2︰24，将壳聚糖溶于5重量%乙酸水溶液中，然后采用超声波方法除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度2℃下进行硬化16小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度3℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由8重量%NaOH水溶液与98重量%乙醇水溶液按照体积比3︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.8︰30，将步骤B得到的壳聚糖微球加到5重量%戊二醛水溶液（pH 6.6）中，在温度40℃下振荡交联0.5小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比2000U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度15℃下振荡固定12小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1750U/g。
其次，制备甜菊双糖苷
用0.1M KH2PO4与0.1M K2HPO4组成的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液，将陕西康威生物工程有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到浓度为20mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度30℃下预热1.0小时，然后将预热溶液以1mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在30℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是1；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，10小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度88℃与真空0.002MPa下浓缩，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水乙醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.4重量%。
实施例3：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.5︰16，将壳聚糖溶于1重量%乙酸水溶液中，然后采用超声波方法除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度6℃下进行硬化10小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度3℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由12重量%NaOH水溶液与92重量%乙醇水溶液按照体积比5︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.2︰20，将步骤B得到的壳聚糖微球加到0.1重量%戊二醛水溶液（pH 6.2）中，在温度20℃下振荡交联8小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1000U游离β-葡萄糖苷酶，再加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度25℃下振荡固定2小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为900U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用由0.01M KH2PO4与0.01M K2HPO4组成的pH值为8.0的磷酸盐缓冲液溶解，将上海西宝生物科技有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到一种甜菊苷浓度为2mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度50℃下预热0.5小时，然后将预热溶液以6mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在50℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是6；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，3小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度91℃与真空0.01MPa下浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。这种粗甜菊双糖苷再在无水甲醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.2重量%。
实施例4：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.4︰18，将壳聚糖溶于4重量%乙酸水溶液中，然后采用超声波方法除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度5℃下进行硬化12小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度5℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由9重量%NaOH水溶液与96重量%乙醇水溶液按照体积比3︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.0︰28，将步骤B得到的壳聚糖微球加到1.0重量%戊二醛水溶液（pH 6.6）中，在温度36℃下振荡交联2.0小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1200U游离β-葡萄糖苷酶，再加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度18℃下振荡固定5小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1080U/g。
其次，制备甜菊双糖苷
用0.2M KH2PO4与0.2M K2HPO4组成的pH值为5.7的磷酸盐缓冲液，将陕西康威生物工程有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到一种甜菊苷浓度为16mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度36℃下预热0.8小时，然后将预热溶液以4mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，所述预热溶液与所述填充床的体积比是2；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，8小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度92℃与真空0.006MPa下浓缩流出液50min，得到粗甜菊双糖苷。这种粗甜菊双糖苷再在无水乙醇中在室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.8重量%。
实施例5：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.2︰16，将壳聚糖溶于3.5重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度6℃下硬化11小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度3℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由8重量%NaOH水溶液与98重量%乙醇水溶液按照体积比3︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.8︰28，将步骤B得到的壳聚糖微球加到0.3重量%戊二醛水溶液（pH 6.5）中，在温度25℃下振荡交联1小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1300U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度35℃下振荡固定6小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1150U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用0.08M KH2PO4与0.08M K2HPO4组成的pH值为6.0的磷酸盐缓冲液，将陕西康威生物工程有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到浓度为4mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度45℃下预热0.7小时，然后将预热溶液以3mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在45℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是5；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，5小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度88℃与真空度0.002MPa下浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水甲醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.2重量%。
实施例6：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.5︰24，将壳聚糖溶于2.5重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度4℃下硬化15小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度5℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由12重量%NaOH水溶液与92重量%乙醇水溶液按照体积比5︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.8︰20，将步骤B得到的壳聚糖微球加到4.5重量%戊二醛水溶液（pH 6.5）中，在温度35℃下振荡交联7小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1500U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度30℃下振荡固定4小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1320U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用0.17M KH2PO4与0.17M K2HPO4组成的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液，将上海西宝生物科技有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到浓度为10mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度35℃下预热0.9小时，然后将预热溶液以5mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在35℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是3；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，8小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度92℃与真空度0.008MPa下浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水乙醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.4重量%。
实施例7：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.3︰18，将壳聚糖溶于4.5重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度3℃下硬化13小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度4℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由10重量%NaOH水溶液与95重量%乙醇水溶液按照体积比4︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.2︰30，将步骤B得到的壳聚糖微球加到3.5重量%戊二醛水溶液（pH 6.5）中，在温度30℃下振荡交联3小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1600U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度28℃下振荡固定10小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1400U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用0.03M KH2PO4与0.03M K2HPO4组成的pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，将陕西康威生物工程有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到浓度为14mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度40℃下预热0.8小时，然后将预热溶液以1mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在40℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是3；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，6.5小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度90℃与真空度0.005MPa下浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水甲醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.1重量%。
实施例8：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.4︰20，将壳聚糖溶于1.5重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度5℃下硬化12小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度5℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由9重量%NaOH水溶液与94重量%乙醇水溶液按照体积比3︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.0︰20，将步骤B得到的壳聚糖微球加到1.5重量%戊二醛水溶液（pH 6.5）中，在温度20℃下振荡交联8小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1800U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度33℃下振荡固定2小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1530U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用0.2M KH2PO4与0.2M K2HPO4组成的pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，将上海西宝生物科技有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到浓度为6mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度30℃下预热1小时，然后将预热溶液以3mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在30℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是2；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，4小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度89℃与真空度0.006MPa下浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水甲醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.5重量%。
实施例9：制备甜菊双糖苷
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.5︰22，将壳聚糖溶于3重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
将步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度2℃下硬化16小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度3℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由11重量%NaOH水溶液与93重量%乙醇水溶液按照体积比5︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.0︰30，将步骤B得到的壳聚糖微球加到2.5重量%戊二醛水溶液（pH 6.5）中，在温度40℃下振荡交联5小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1100U游离β-葡萄糖苷酶，加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度25℃下振荡固定12小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为990U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
用0.1M KH2PO4与0.1M K2HPO4组成的pH值为7.7的磷酸盐缓冲液，将陕西康威生物工程有限公司销售的含有甜菊苷的甜叶菊提取物溶解，得到浓度为10mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度50℃下预热0.5小时，然后将预热溶液以2mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夹套水温维持在50℃，所述预热溶液与所述填充床的体积比是6；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，4小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定，然后收集流出液并在温度89℃与真空度0.006MPa下浓缩流出液，得到粗甜菊双糖苷。粗制甜菊双糖苷再在无水甲醇中于室温下进行重结晶，得到的结晶产物中甜菊双糖苷的纯度（HPLC）为99.2重量%。
实施例10：固定化β-葡萄糖苷酶转化稳定性试验
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.3︰20，将壳聚糖溶于4重量%乙酸水溶液中，然后采用超声波方法除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
把步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度3℃下进行硬化14小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度4℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由10重量%NaOH水溶液与95重量%乙醇水溶液按照体积比4︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.0︰25，将步骤B得到的壳聚糖微球加到4重量%戊二醛水溶液（pH 6.2）中，在温度30℃下振荡交联4小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1400U游离β-葡萄糖苷酶，再加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度20℃下振荡固定8小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1250U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
使用0.15M KH2PO4与0.15M K2HPO4组成的pH值为6.8的磷酸盐缓冲液，将上海西宝生物科技有限公司销售的甜菊苷溶解，得到一种甜菊苷浓度为8mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度42℃下预热0.6小时，然后将预热溶液以2mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，所述预热溶液与所述填充床的体积比是4；用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，6小时后由色谱图峰面积归一化法计算得知甜菊苷转化率已经恒定。
该试验持续进行4天，每隔12h取样进行高效液相色谱法分析，96h时甜菊苷的转化率仍达到70%。
实施例11：固定化β-葡萄糖苷酶水解甜菊苷选择性试验
该实施例的实施步骤如下：
首先制备固定化β-葡萄糖苷酶。
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比0.4︰22，将壳聚糖溶于3重量%乙酸水溶液中，然后采用超声波方法除去气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶。
B、制备壳聚糖微球
把步骤A得到的透明壳聚糖凝胶加到一种凝结液中，然后在温度5℃下进行硬化16小时，接着用去离子水洗涤至中性，在温度4℃下保存过夜，得到一种壳聚糖微球。
所述的凝结液是由12重量%NaOH水溶液与95重量%乙醇水溶液按照体积比4︰1组成的。
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以g计壳聚糖微球重量与以mL计戊二醛水溶液体积的比1.1︰23，将步骤B得到的壳聚糖微球加到0.6重量%戊二醛水溶液（pH 6.2）中，在温度40℃下振荡交联6小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球配比1900U游离β-葡萄糖苷酶，再加入诺维信（中国）生物技术有限公司提供的来自毕赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在温度22℃下振荡固定10小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶，其比活性为1520U/g。
然后，制备甜菊双糖苷。
使用0.05M KH2PO4与0.05M K2HPO4组成的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液，将湖北大仝生物化工科技有限公司销售的甜菊苷(90重量%St，5重量%RA)溶解，得到一种甜菊苷浓度为18mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度40℃下预热0.8小时，然后将预热溶液以4mL/h的流速通过装有前面制备的固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，所述预热溶液与所述填充床的体积比是4；在转化反应进行第3h时，用高效液相色谱在实施例1描述的条件下检测从所述填充柱底部流出的溶液，甜菊苷的转化率达60%，莱鲍迪苷A的转化率小于5%。
对比实施例1：现有技术的固定化β-葡萄糖苷酶稳定性试验按照刘虎等人在《食品工业科技》，第4期（2011）中描述的方法进行，100mL 1重量%甜菊苷水溶液中加入20g用海藻酸钠作包埋材料的固定化β-葡萄糖苷酶(来源于bacillus megaterium)，在温度40℃与200r/min的条件下转化5天后，采用HPLC法检测原料液中甜菊苷的转化率。上述固定化β-葡萄糖苷酶经4次重复使用，甜菊苷的转化率由96.45%降到55.72%。
Claims (9)
1.一种用甜菊苷制备甜菊双糖苷的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
用水或磷酸盐缓冲液溶解甜菊苷或含有甜菊苷的甜叶菊提取物，得到甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在温度30-50℃下预热0.5-1.0小时；然后将此预热溶液以恒定的流速通过装有固定化β-葡萄糖苷酶的填充柱，让外循环水通过填充柱夹套，以便将其反应温度控制在30-50℃,所述预热溶液与所述填充柱的体积比是1-6；用高效液相色谱检测从所述填充柱底部流出的溶液并用峰面积归一化法计算各组分含量，待甜菊苷转化率不再升高时，开始收集并合并流出液，然后蒸发浓缩，所得到的粗甜菊双糖苷经过重结晶后纯度达到98%以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液是由KH2PO4与K2HPO4组成的pH值为5.7-8.0的0.01-0.2M磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述甜菊苷溶液的甜菊苷浓度是2-20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的甜菊苷溶液以速度1-6mL/h通过所述的填充柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的粗甜菊双糖苷在无水甲醇或乙醇中于室温下进行重结晶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化β-葡萄糖苷酶是采用下述步骤制备得到的：
A、配制透明凝胶
按照以g计壳聚糖重量与以mL计乙酸水溶液体积的比0.2-0.5︰16-24，将壳聚糖溶于1-5重量%乙酸水溶液中，然后用超声波除去该溶液中的气泡，得到一种透明壳聚糖凝胶；
B、制备壳聚糖微球
把在步骤A得到的透明壳聚糖凝胶滴加到一种凝结液中，然后在温度2-6℃下进行硬化10-16小时，得到一种壳聚糖微球，接着用去离子水将所述微球洗涤至中性，在温度3-5℃下保存过夜；
所述的凝结液是由8-12重量%NaOH水溶液与92-98重量%乙醇水溶液按照体积比3-5︰1组成的；
C、β-葡萄糖苷酶固定化
按照以克计壳聚糖微球与以毫升计戊二醛水溶液的比0.8-1.2︰20-30，将步骤B得到的壳聚糖微球加到戊二醛水溶液中，在温度20-40℃下振荡交联0.5-8.0小时，再用水洗涤除去过量的戊二醛；然后，按照每克壳聚糖微球为1000-2000U游离β-葡萄糖苷酶的比例，再加入游离β-葡萄糖苷酶，在温度15-35℃下振荡固定2-12小时，用水洗涤除去未被固定的游离β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β-葡萄糖苷酶。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的戊二醛水溶液的浓度是0.1-5.0重量%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的壳聚糖微球与戊二醛的交联时间是2.0-5.0小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的游离β-葡萄糖苷酶的固定时间是5.0-9.0小时。
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