CN109280686A - 一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷（stb）的方法 - Google Patents

一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷（stb）的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，属于天然甜味剂的生物合成技术领域，能够高效简便的制备高经济附加值的稀有甜菊糖苷。该方法首先从鲜茶叶中提取糖苷酶，再以已经工业化生产的甜菊苷(Stv)为初始原料，配制甜菊苷溶液，然后在一定工艺条件下，向甜菊苷溶液中加入糖苷酶，进行选择性催化水解反应，得到甜菊双糖苷(STB)。本发明制备甜菊双糖苷(STB)的方法的显著优点是工艺周期短，产率和选择性高，制备过程中的分离纯化简单，酶可以回收循环使用，且制备过程环境友好。

Description

一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法
技术领域
本发明属于天然甜味剂的生物合成技术领域，具体为用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法。
背景技术
甜菊糖苷是从甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)干叶中提取、精制的食品添加剂。国标GB8270-2014中列出甜菊糖苷包括9种糖苷，即甜菊苷(Stv)、瑞鲍迪苷A(Reb A)、瑞鲍迪苷B(Reb B)、瑞鲍迪苷C(Reb C)，瑞鲍迪苷D(Reb D)、瑞鲍迪苷F(Reb F)、杜克苷A(DA)、甜茶苷(Ru)和甜菊双糖苷(STB)，以上9种糖苷的化合物结构信息如图1所示。
甜菊糖苷具有高甜度低热值的特点，是理想的代糖甜味剂，已经广泛应用于食品，饮料，医药等行业。甜菊糖苷粗提物以甜菊苷(Stv)和瑞鲍迪苷A(Reb A)含量最高，一般占到整个甜菊糖苷的80％以上。工业上会进一步精制甜菊糖苷，得到95％以上的甜菊苷(Stv)和瑞鲍迪苷A(Reb A)。最新研究也开始关注除甜菊苷(Stv)和瑞鲍迪苷A(Reb A)以外稀有甜菊糖苷的提取和功能开发。甜菊糖苷还具有生物活性，可以辅助治疗“三高”，抑菌，免疫调节等(Onakpoya I J,et al.Eur J PrevCardiol,2015,22(12):1575-1587)，更可以作为先导化合物，用于合成一些具有特殊药理活性的衍生物(Momtazi-Borojeni AA,etal.Curr Pharm Design,2017,23(11):1616-1622)。如稀有糖苷瑞鲍迪苷M(甜菊糖苷粗提物含量小于1％)的口感明显优于前文提及的9种糖苷(US20180020709A1)。
甜菊双糖苷(STB)具有自身独特性质(JP58041808AK；hattab SN,et al.J FoodSci Technol,2017,54(1):185-195)，但它在甜菊糖苷粗提物含量也较小，主要是甜菊苷(Stv)提取过程中部分分解生成。其在自然界中含量低，工业化提取难度大，成本高，无法满足市场需求。因而基于分子结构相似性，目前很多研究就从含量较高的甜菊苷(Stv)(只比甜菊双糖苷(STB)多一个C19葡萄糖基，见表1)出发，利用化学和酶催化的方法选择性水解制备甜菊双糖苷(STB)。氢氧化钠作为催化剂水解甜菊苷(Stv)，再经酸中和即可得甜菊双糖苷(STB)(Khattab SN,et al.J Food Sci Technol,2017,54(1):185-195)。虽然化学法看似简便易行，但是制备过程中会产生大量废酸碱，环境污染大，对设备要求也高。毕赤酵母(Pichia pastoris)产的β-葡萄糖苷酶，来源于Kluyveromyces lactis的β-半乳糖苷酶和巨大芽孢杆菌J2(Bacillus megaterium J2)菌种发酵产酶均可催化甜菊苷(Stv)得到甜菊双糖苷(STB)(Chen JM,et al.Food Chem,2016,196,155-160；CN201210427408.8；CN201010170786.3)。
发明内容
与现有技术相比，本发明提供一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其利用来源于茶叶中的粗糖苷酶选择性催化水解甜菊苷(Stv)制备甜菊双糖苷(STB)，提供了一种新的途径制备稀有糖苷。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，利用茶叶中提取的糖苷酶选择性催化水解甜菊苷，得到甜菊双糖苷。
进一步优选地，利用茶叶中提取的糖苷酶选择性催化水解甜菊苷，得到甜菊双糖苷的具体流程包括：
步骤一：糖苷酶的提取；
步骤二：配制甜菊苷溶液；
步骤三：向甜菊苷溶液中加入糖苷酶，进行选择性催化水解反应；
步骤四：反应后的产物离心沉淀洗涤干燥后得到甜菊双糖苷。
进一步优选地，所述步骤一具体为：
称取50-5000g(优选100-1000g，进一步优选200-500g，最优选200g)将茶叶粉碎后，加入1-100g(优选10-50g，进一步优选20-40g)石英砂和10倍茶叶质量的4度PBS缓冲液后研磨均匀，然后放入到匀浆机中匀浆；经离心、脱盐浓缩后冷冻干燥，得到的粗酶粉，测定酶活后冰箱冷藏保存备用。
进一步优选地，测定酶活时，利用对硝基苯β-葡萄糖苷酶(PNPG)比色法测定粗酶粉的酶活在50U/g到220U/g之间；利用对硝基苯酚法(PNP)法测定β-樱草糖苷酶酶活在25U/g到100U/g之间；利用邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)比色法测定β-半乳糖苷酶酶活在5U/g到80U/g之间。
进一步优选地，所述步骤二利用pH值为6.5-9.0的PBS缓冲液配制浓度为1-100g/L(优选为20-80g/L，进一步优选为40-60g/L)的甜菊苷溶液。
进一步优选地，所述步骤三中糖苷酶的加入量为总酶活20-100U/g，优选60-80U/g，在40-60℃高选择性催化水解反应1天-3天。
进一步优选地，所述步骤四中反应后的产物经过1.6×103g离心，沉淀用去离子水洗涤三次，然后在60℃真空干燥，得甜菊双糖苷粉末，其纯度为85％-92％。
进一步优选地，所述步骤四离心沉淀洗涤干燥后得到的甜菊双糖苷经乙醇重结晶，纯度提高至98％以上。
进一步优选地，所述步骤一中茶叶为绿茶、白茶、乌龙茶或红茶。
进一步优选地，所述步骤三中分离甜菊双糖苷(STB)的剩余反应液测定酶活，降低了5％-15％，能够继续用于可继续用于催化甜菊苷制备甜菊双糖苷的反应。
本发明具有以下有益效果：
与化学法相比，本发明提供的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法其反应条件温和，无废酸废碱产生，对设备要求低。茶叶的糖苷酶水解甜菊苷只催化水解C19位得到甜菊双糖苷(STB)，不会影响C13位的糖基。另外，在制备过程中提取分离方便，采用过滤或者离心即可，并且本发明的糖苷酶来源是茶叶，资源丰富。
附图说明
图1是甜菊糖苷所包含的9种糖苷化合物结构信息。
图2是原料甜菊苷(Stv)a、本发明方法催化水解反应后的取样产物b和甜菊双糖苷(STB)标准品c的HPLC色谱图。
图3是水解产物(1)和STB标准品(2)质谱的对比。
图4是水解产物甜菊双糖苷(STB)的1HNMR。
图5是水解产物甜菊双糖苷(STB)的13CNMR。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，包括以下步骤：
步骤一：糖苷酶的提取
称取200g将新鲜茶叶(如绿茶，白茶，乌龙茶或红茶)粉碎后，加入石英砂(1g)和10倍于茶叶质量的4度PBS缓冲液(pH值控制在6.5-9.0，优选6.5)后研磨均匀，然后放入到4度匀浆机中匀浆5min；在1.6×103g、4度下离心10min，脱盐浓缩后冷冻干燥，得到的粗酶粉在测定酶活后1-4℃冰箱冷藏保存备用，得到糖苷酶。
测定酶活时，利用对硝基苯β-葡萄糖苷酶(PNPG)比色法测定粗酶粉的酶活在50U/g到220U/g之间；利用对硝基苯酚法(PNP)法测定β-樱草糖苷酶酶活在25U/g到100U/g之间；利用邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)比色法测定β-半乳糖苷酶酶活在5U/g到80U/g之间。测定酶活大小为后续催化反应中糖苷酶的具体添加量做依据。
步骤二：利用PBS缓冲液(pH值为6.5-9.0，优选6.5)配制甜菊苷(Stv)溶液(浓度为1-100g/L)。
步骤三：向配制甜菊苷(Stv)溶液中加入步骤一提取得到的糖苷酶，在一定温度下(40-60℃)高选择性催化水解反应1天-3天，加糖苷酶的量为20-100U/g底物(总酶活计)。反应过程中甜菊双糖苷(STB)能够自动从反应介质中析出。反应后甜菊苷(Stv)的转化率在80％-98％之间，甜菊双糖苷(STB)的产率可达75％-92％。
步骤四：反应后的产物经过1.6×103g离心，沉淀用去离子水洗涤三次，然后在60℃真空干燥，即可得甜菊双糖苷(STB)粉末，其纯度为85％-92％，乙醇重结晶纯度提高至98％左右，其中杂质为甜菊苷(Stv)，甜菊醇和甜菊单糖苷总含量低于2％，收率为75％-90％。
本发明制备得到的产物通过外标法用HPLC进行定量分析(如图2所示)，用质谱(如图3所示)、核磁(如图4和图5所示)与已报道的甜菊双糖苷(STB)数据进行对比(Khattab SN,et al.J Food Sci Technol,2017,54(1):185-195)，确认本发明的产物确为甜菊双糖苷(STB)。
优选地，本发明步骤三分离甜菊双糖苷(STB)的剩余反应液测定酶活，降低了5％-15％，可继续用于可继续用于催化甜菊苷制备甜菊双糖苷的反应，继续反应的条件同前。
实施例：
以下各实施例对应的糖苷酶的提取过程对照采用以下步骤
分别将市售的绿茶、白茶、乌龙茶或红茶200g将新鲜茶叶粉碎后，加入石英砂(1g)和10倍量的4度PBS缓冲液(pH控制在6.5)后研磨均匀，然后放入到4度匀浆机中匀浆5min；在1.6×103g，4度下离心10min，脱盐浓缩后冷冻干燥，得到的粗酶粉，具体实验结果见表1。
表1 茶叶中糖苷酶的提取实验结果
实施例1
本实施例提供一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，
步骤一：采用上面表1中的绿茶，从其中提取粗酶粉；
步骤二：利用PBS缓冲液(pH值为6.5)配制甜菊苷(Stv)溶液，浓度为1g/L；
步骤三：向配制甜菊苷(Stv)溶液中加入步骤一提取得到的糖苷酶，40℃条件下高选择性催化水解反应1天，加糖苷酶量为总酶活20U/g底物(总酶活计)，甜菊苷(Stv)转化率和甜菊双糖苷(STB)的产率分别为80％和75％。
步骤四：反应后的产物离心沉淀洗涤干燥后得到甜菊双糖苷。
实施例2
同实施例1，将用白茶提取粗酶粉，替代绿茶提取粗酶粉，保持其他条件不变，最终甜菊苷(Stv)的转化率和甜菊双糖苷(STB)的产率分别为75％和71％。
实施例3
同实施例1，将用乌龙茶提取粗酶粉，替代绿茶提取粗酶粉，保持其他条件不变，最终甜菊苷(Stv)的转化率和甜菊双糖苷(STB)的产率分别为55％和35％。
实施例4
同实施例1，将用红茶提取粗酶粉替代绿茶提取粗酶粉，保持其他条件不变，最终甜菊苷(Stv)的转化率和甜菊双糖苷(STB)的产率分别为68％和65％。
实施例5
同实施例1，确定步骤二中最佳甜菊苷(Stv)溶液浓度，甜菊苷(Stv)溶液浓度筛选范围为1、10、20、30、60、80和100g/L，其他条件不变，最终确定最佳甜菊苷(Stv)溶液为20g/L。
实施例6
同实施例1，确定步骤三中最佳反应温度，反应温度筛选范围为35、40、45、50、55、60和65℃，其他条件不变，最终确定最佳反应温度为55℃。
实施例7
同实施例1，确定步骤三中最佳反应时间，反应时间筛选范围为1天、2天、3天、4天和5天，其他条件不变，最终确定最佳反应时间为3天。
实施例8
同实施例1，确定步骤三中最佳加糖苷酶量，加糖苷酶量筛选范围为20、40、60、80、100、120U/g底物(总酶活计)，其他条件不变，最终确定最佳加糖苷酶量为80U/g。
实施例9
同实施例1，并在步骤三中按照实施例6～8确定的最佳反应条件(最佳反应温度为55℃、最佳反应时间为3天、最佳加糖苷酶量为总酶活80U/g底物)，制备甜菊双糖苷(STB)，最终甜菊苷(Stv)的转化率98％，甜菊双糖苷(STB)的产率为92％，并在步骤四完成后进行提纯，乙醇重结晶收率为90％，甜菊双糖苷(STB)的纯度为98％，其中甜菊醇含量为1.2％。
实施例10
在实施例9反应之后测定剩余反应液酶活，降低了13％，继续进行催化甜菊苷(Stv)制备甜菊双糖苷(STB)反应，反应条件同实施例9(即反应温度为55℃、反应时间为3天、加糖苷酶量为总酶活80U/g底物)，此次继续反应的甜菊苷(Stv)转化率为85％，甜菊双糖苷(STB)的产率为81％。
实施例11
在实施例10反应之后测定剩余反应液酶活，降低了15％，继续进行催化甜菊苷(Stv)制备STB反应，反应条件同实施例9(即反应温度为55℃、反应时间为3天、加糖苷酶量为总酶活80U/g底物)，此次继续反应的甜菊苷(Stv)转化率为55％，甜菊双糖苷(STB)的产率为46％。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，利用茶叶中提取的糖苷酶选择性催化水解甜菊苷，得到甜菊双糖苷。
2.根据权利要求1所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，利用茶叶中提取的糖苷酶选择性催化水解甜菊苷，得到甜菊双糖苷的具体流程包括：
步骤一：糖苷酶的提取；
步骤二：配制甜菊苷溶液；
步骤三：向甜菊苷溶液中加入糖苷酶，进行选择性催化水解反应；
步骤四：反应后的产物离心沉淀洗涤干燥后得到甜菊双糖苷。
3.根据权利要求2所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，所述步骤一具体为：
称取50-5000g将茶叶粉碎后，加入1-100g石英砂和10倍茶叶质量的4度PBS缓冲液后研磨均匀，然后放入到匀浆机中匀浆；经离心、脱盐浓缩后冷冻干燥，得到的粗酶粉，测定酶活后冰箱冷藏保存备用。
4.根据权利要求3所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，测定酶活时，利用对硝基苯β-葡萄糖苷酶(PNPG)比色法测定粗酶粉的酶活在50U/g到220U/g之间；利用对硝基苯酚法(PNP)法测定β-樱草糖苷酶酶活在25U/g到100U/g之间；利用邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)比色法测定β-半乳糖苷酶酶活在5U/g到80U/g之间。
5.根据权利要求2所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，所述步骤二利用pH值为6.5-9.0的PBS缓冲液配制浓度为1-100g/L的甜菊苷溶液。
6.根据权利要求2所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，所述步骤三中糖苷酶的加入量为总酶活20-100U/g，在40-60℃高选择性催化水解反应1天-3天。
7.根据权利要求2所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷的方法，其特征在于，所述步骤四中反应后的产物经过1.6×103g离心，沉淀用去离子水洗涤三次，然后在60℃真空干燥，得甜菊双糖苷粉末，其纯度为85％-92％。
8.根据权利要求2或7所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，所述步骤四离心沉淀洗涤干燥后得到的甜菊双糖苷经乙醇重结晶，纯度提高至98％以上。
9.根据权利要求2所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，所述步骤一中茶叶为绿茶、白茶、乌龙茶或红茶。
10.根据权利要求2所述的用茶叶中提取的糖苷酶制备甜菊双糖苷(STB)的方法，其特征在于，所述步骤三中分离甜菊双糖苷的剩余反应液测定酶活，降低了5％-15％，能够继续用于可继续用于催化甜菊苷制备甜菊双糖苷的反应。
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