KR20220036435A

KR20220036435A - 신규한 아스퍼질러스 나이거 ag1 균주 및 이를 이용한 컴파운드 k의 제조 방법

Info

Publication number: KR20220036435A
Application number: KR1020200118244A
Authority: KR
Inventors: 신용철; 박철; 조현정; 장재혁; 윤영성; 김진석
Original assignee: 아미코젠주식회사
Priority date: 2020-09-15
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2022-03-23
Also published as: WO2022060057A1

Abstract

본 발명은 신규한 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-글루코시다아제 제조 방법 및 상기 균주로부터 유래한 베타-글루코시다아제를 기질에 접촉하는 단계를 포함하는 컴파운드 K의 제조 방법, 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 유래의 균주로서 식품에 적용이 가능하며, 기존의 효소들에 비해 진세노사이드를 컴파운드 K로 전환하는 전환율이 높아 컴파운드 K를 대량으로 생산할 수 있어 식품 산업 및 기능성 식품 산업에서 활용이 될 수 있다.

Description

신규한 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주 및 이를 이용한 컴파운드 K의 제조 방법{Novel Aspergillus niger AG1 and a method of producing compound K using the same}

본 발명은 신규한 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-글루코시다아제 제조 방법 및 상기 균주로부터 유래한 베타-글루코시다아제를 기질에 접촉하는 단계를 포함하는 컴파운드 K의 제조 방법, 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

β-글리코시다아제는 올리고당이나 배당체의 글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하여 글루코오스를 생성하는 효소를 의미한다. β-글리코시다아제는 인삼 추출물에서 글루코오스 및 아라비노스 부분을 가수분해 함으로 목적하는 진세노사이드를 생산하는데 사용될 수 있다.

진세노사이드는 인삼(ginseng)에서 분리된 배당체(glyco-side)란 의미로 붙여진 이름으로서, 기본 구조에 글루코스 (glucose)와 아라비노스(arabinose)와 같은 기타 당들이 결합된 구조를 가지고, 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)계열의 효소에 의해서 가수분해가 되어 유용한 물질들을 생산하는데 사용된다. 그 중 진세노사이드 컴파운드 K (화학식1)는 면역증강, 종양의 혈관 신생작용 억제, 암세포 성장 저해, 암세포 사멸 유도 등 여러 가지 우수한 효능이 있는 것으로 알려져 있어 이를 다량으로 생산하기 위한 연구가 계속되어 왔다.

[화학식 1]

기존에 재조합 효소를 이용한 컴파운드 K의 생산법(한국등록특허 제1855280호)과 미생물 균주를 이용한 컴파운드 K의 생산법(한국등록특허 제0377546호)은 보고가 되었으나, 이는 재조합 효소와 비식품용 균주의 특성상 화장품용과 의약용에 적용이 제한되어 있어서 식품에 직접적인 적용이 불가능하다. 현재 식품업계에서는 식품용 컴파운드 K를 생산하기 위해서 일반 셀룰라제 (cellulase), 펙티나아제(pectinase)를 사용하고 있지만 비특이성과 매우 낮은 전환율로 인해서 생산에 고비용을 필요로 하며 그 적용에 있어 매우 제한적인 실정이다.

한국등록특허공보 10-1855280호 한국등록특허공보 10-0377546호

이에 본 발명의 발명자들은 식품에 적용이 가능하며, 컴파운드 K를 고수율로 생산할 수 있는 균주를 동정하기 위해 지속적으로 노력한 결과, GRAS(Generally Recognized As Safe) 유래의 신규한 아스퍼질러스 나이거 AG1 (Asergillus niger AG1) 균주를 동정하였고, 이를 이용하여 고수율로 컴파운드 K를 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주(수탁번호 : KCTC 14272BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

i) 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주(KCTC 14272BP)를 배양시키는 단계; 및

ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양물에서 효소를 추출·여과하여 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 회수하는 단계를 포함하는 베타-글루코시다아제(β-glycosidase) 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

i) 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주(KCTC 14272BP)를 배양시키는 단계

ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양물에서 효소를 추출·여과하여 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 회수하는 단계

iii) 상기 단계 ⅱ)에서 회수한 β-글리코시다아제(β-glycosidase)를 기질에 접촉하여 반응시키는 단계; 및

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K)를 분리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 K의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 여드름, 당뇨병, 뇌졸중, 경도인지 장애, 노인성 치매 및 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주(수탁번호 : KCTC 14272BP)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양물에서 효소를 추출·여과하여 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 회수하는 단계를 포함하는 베타-글루코시다아제(β-glycosidase) 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

iii) 상기 단계 ⅱ)에서 추출한 β-글리코시다아제(β-glycosidase)를 기질에 접촉하여 반응시키는 단계; 및

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K)를 분리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 K의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 컴파운드 K 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 여드름, 당뇨병, 뇌졸중, 경도인지 장애, 노인성 치매 및 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주(수탁번호 : KCTC 14272BP)를 제공한다.

본 발명에 따른 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) AG1 균주는 누룩곰팡이 유래의 아스퍼질러스 나이거 신규 균주로서, 상기 균주들은 한국생명공학연구원에 2020년 8월 14일자로 기탁하였다.

본 발명의 용어 “아스퍼질러스 나이거”는 누룩곰팡이속(Aspergillus)에 속하며 검은 곰팡이의 원인이 되는 균주를 의미한다. 아밀라아제, 베타-글루코시다아제를 비롯하여 여러 종류의 효소를 만드는 데 도움을 줘서 효소 생산에 이용되고 있다.

본 발명의 용어 “베타-글루코시다아제”는 동식물 및 미생물 등에 다양하게 존재하며 글루코시드나 소당류의 글리코시드 결합을 가수분해 하여 당과 어글리콘을 생성하는 효소를 의미한다. 베타-글루코시다아제는 아릴, 아미노, 알킬기와 붙어있는 글루코시드나 시아노제닉 글루코시드, 그리고 올리고당 혹은 이당류를 가수분해하고 물질대사의 조절에 있어 탄수화물의 생성이나 파쇄 등의 기본적인 역할을 수행한다(Pack. et al., (2007) J. Microbiol. Biotechnol. 17, 454-460). 또한 인삼 등의 추출물에 함유된 진세노사이드를 가수분해하여 컴파운드 K 등을 생산하는데 사용되기도 한다(화학식 2 참조).

[화학식 2]

본 발명자들은 컴파운드 K를 고수율로 생산하는 베타-글루코시다아제를 발현하는 아스퍼질러스 균으로 아스퍼질러스 나이거에 속하는 신규한 균주를 하기와 같이 규명하였다.

본 발명의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) AG1 균주는 인삼 추출물 내의 진세노사이드를 컴파운드 K로 고수율, 고순도로 전환하는 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

이는 본 발명의 실시예에 잘 나타나 있다.

본 발명의 일실시예에서 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주에서 추출한 효소를 인삼추출물에 혼합하여 반응시킨 후 컴파운드 K를 분석한 결과, 투입된 진세노사이드로부터 85 % 이상의 전환 수율을 보였고, 최종 순도가 고형분 함량대비 28~44 %로 측정이 되어 고수율로 고순도의 컴파운드 K를 생산함을 확인할 수 있었다(실시예 3-2 및 도 4 참조).

또한 본 발명의 일실시예에서 아스퍼질러스 나이거 AG1 및 아스퍼질러스 나이거 KCTC 6461에서 추출한 효소 및 기존에 컴파운드 K를 생산하는 데 쓰이는 상용 효소인 플란타아제 C150P 를 인삼추출물에 혼합하여 반응시킨 후 각각 컴파운드 K를 분석한 결과, 다른 두 효소에 비해서 본 발명의 효소가 컴파운드 K 전환율이 월등히 우수함을 확인할 수 있었다(실시예 3-3 및 도 5 참조).

본 발명은

본 발명의 베타-글루코시다아제 제조방법을 각 단계로 구분하여 설명하면 다음과 같다.

상기 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주는 다양한 배지에서 발효시킬 수 있는데. 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주의 생육에 적합한 배지면 특별히 제한되지 않는다.

또한 회분식 배양, 반회분식 배양, 연속식 배양, 유가식 배양 등의 방법으로 배양 될 수 있다. 배지 중에 포함되는 동화성 탄소원으로는 당 및 이들의 중합체, 폴리알콜 등을 사용할 수 있으며, 동화성 질소원으로는 무기질소 화합물, 동물, 식물 및 미생물 기원의 물질 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 탄소원은 과당, 포도당, 갈락토스, 만니톨, 말토스, 글리세린, 덱스트린, 전분 등의 단독 또는 혼합물을 예로 들 수 있고, 질소원으로서는 효모추출물, 고기추출물, 대두분, 펩톤, 콘·스티프·리카, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 요소 등의 단독 또는 혼합물을 예로 들 수 있다. 또한, 배지는 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주의 생육을 촉진하는 유기물, 무기물, 비타민류 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 발효 중에 발포가 현저하게 나타낼 때는 소포제를 적절히 첨가할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 배양은 온도 15 ℃ 내지 45 ℃에서 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 20 ℃ 내지 30 ℃에서 수행하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 25 ℃에서 수행하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 일 실시예에서, 상기 배양은 습도 30% 내지 70%에서 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 습도 40% 내지 60%에서 수행하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 습도 50%에서 수행하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 일 실시예에서, 상기 배양은 배양기간이 1일 내지 12일 일 수 있고, 바람직하게는 4일 내지 9일 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5일 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “배양물”은 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주를 배지에 접종하여 배양한 결과물을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 배양물은 본 발명의 균주를 배지에서 배양한 배양물 자체(즉, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주, 배지 또는 균주의 대사생산물을 포함할 수 있음), 상기 배양물을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(예컨대, 원심분리한 상등액) 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양물은 이를 건조(예컨대, 동결 건조)한 후 분말화 한 것을 포함할 수 있다.

상기 추출에 사용되는 체의 mesh 수는 1 내지 200 mesh 일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 120 mesh 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 mesh 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 여과는 패드여과, MF여과, NF여과 일 수 있고, 가장 바람직하게는 패드여과 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은

본 발명의 컴파운드 K 제조방법을 각 단계로 구분하여 설명하면 다음과 같다.

ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양물에서 효소를 추출·여과하여 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 추출하는 단계

단계 ⅰ)과 단계 ⅱ)는 상기 베타-글루코시다아제 제조 방법에 기재한 것과 동일하다.

iii) 상기 단계 ⅱ)에서 추출한 β-글리코시다아제(β-glycosidase)를 기질에 접촉하여 반응시키는 단계

본 발명의 용어 “기질”이란 효소와 작용하여 화학 반응을 일으키는 물질을 말하는 것으로서, 본 발명에서 사용되는 기질은 삼을 여러 형태로 가공한 것이다.

상기 삼의 종류는 인삼, 홍삼, 산삼, 백삼, 피직삼, 태극삼, 곡삼일 수 있으며, 바람직하게는 인삼일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 삼의 가공 형태는 추출물 또는 분말일 수 있으며, 가장 바람직하게는 추출물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 추출물은 삼으로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액 뿐 아니라 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물 또는 상기의 농축물을 다시 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기, 유동엑기스 및 삼 중에 함유되어 주 효과를 발휘하는 화학 물질은 물론 식물 그 자체를 모두 포함한다.

상기 추출물은 용매 추출 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 상기 용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용한다. 이때, 추출온도는 10~80℃가 바람직하며, 3~24시간 동안 추출할 수 있다. 상기 추출온도 및 추출시간을 벗어나면 추출 효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다.

상기 분말은 상기 추출물을 감압건조 또는 동결건조하거나 삼 자체를 열풍으로 건조한 후 분쇄하는 방식으로 얻을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 ⅲ)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 pH 5.0에서 수행하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 ⅲ)의 반응은 온도 40 ℃ 내지 60 ℃에서 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 45 ℃ 내지 55 ℃에서 수행하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 ℃에서 수행하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K)를 분리하는 단계

본 발명의 용어 “진세노사이드 컴파운드 K”란 인삼 자체에는 존재하지 않으나, 인삼 또는 홍삼에 존재하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 사포닌이 비피더스 균과 같은 장내 미생물 또는 토양미생물의 작용에 의하여 체내에서 흡수가능한 형태로 전환된 사포닌을 의미한다.

본 발명은 상기 컴파운드 케이 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “GRAS(Generally Recognized As Safe)”는 미국 FDA에서 지정한 일반적으로 안전한 물질로 인정되는 화학적 물질의 목록을 의미하며, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 AG1은 상기 GRAS(Generally Recognized As Safe) 유래의 균주로서 식품에 적용이 가능하다.

상기 식품 조성물이 사용될 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스낵류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식품 조성물에 포함되는 컴파운드 K의 함량 역시 특별히 제한되지 않으며, 이는 당업자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명은 상기 컴파운드 케이 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “화장료”는 인체를 청결 또는 미화할 목적으로 도찰, 살포 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물질로서 인체에 대한 작용이 적은 것을 의미한다.

본 발명의 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 주름 개선, 미백, 보습, 피부 혈색 개선, 피지 조절 효과 등의 피부 상태 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

컴파운드 K는 피부 내에서 단백질과 점성 용액이나 겔을 형성하여 조직구조의 유지 및 윤활작용을 하는 히알루론산(hyaluronic acid)의 생성에 큰 영향을 주어 주름 개선 효과가 있음이 확인되었으며, 이 외에도 미백, 보습 개선 효과, 여드름 및 피부 트러블, 아토피 개선 효과, 피부 혈색 개선 효과, 피지 조절, 모공 수축 효과 등의 피부 상태 개선 효과를 나타냄이 확인되었다(‘The skin protective effects of compound K, a metabolite of ginsenoside Rb1 from Panax ginseng’, Joornal of Ginseng Research, 2017.03).

상기 화장료 조성물은 여러 제형으로 제형화될 수 있으며, 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 컨실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명은 상기 컴파운드 케이 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 여드름, 당뇨병, 뇌졸중, 경도인지 장애, 노인성 치매 및 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 암은 폐암, 간암, 유방암, 갑상선암, 대장암, 자궁경부암, 위암, 전립선암, 췌장암, 담낭암, 담도암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

컴파운드 K는 인슐린 분비 촉진 및 인슐린 내구성 증가 효과가 있어 당뇨병 치료 효과를 가지며(‘Compound K의 인슐린분비 및 탄수화물 대사에 미치는 영향’, Journal of Ginseng Research Vol.31 No.2, 2007.06),

중대뇌동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 뇌 경색 부피를 감소시켜 뇌졸중 치료 효과,(‘Anti-Inflammatory Mechanism of Compound K in Activated Microglia and Its Neuroprotective Effect on Experimental Stroke in Mice’, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2012.04), 경도인지 장애 및 노인성 치매 치료 효과도 가지는 것으로 확인되었다(‘Ginsenoside compound K ameliorates Alzheimer’s disease in HT22 cells by adjusting energy metabolism’, Molecular Biology Reports, 2019.07, ‘Ginsenoside Compound K Regulates Amyloid β via the Nrf2/Keap1 Signaling Pathway in Mice with Scopolamine Hydrobromide-Induced Memory Impairments’, Journal of Molecular Neuroscience, 2018.12, ‘Compound K derived from ginseng: neuroprotection and cognitive improvement’, Food & Function, 2016.07)

또한 컴파운드 K의 단백질합성촉진인자 ‘프로스티졸’이라는 성분이 면역능력을 높이고 암조직의 증식을 막아주는 역할을 하여 암세포 침윤 억제 및 암세포 증식 억제 등의 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 알려져 있다(‘Ginsenoside metabolite compound K enhances the efficacy of cisplatin in lung cancer cells’, Journal of thoracic disease, 2015.03, ‘Effects of compound K, an enteric microbiome metabolite of ginseng, in the treatment of inflammation associated colon cancer’, Oncology letters, 2018.04).

본 발명의 치료용 약학적 조성물은 여러 제형으로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 본 발명에서 사용되는 유효성분에 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제형화할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제형으로서는 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제형으로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 상법에 따라 실시함으로써, 유효성분을 용이하게 제형화할 수 있으며, 이 때 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 유효 성분의 투여 용량은 투여받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적당한 용량의 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 100mg/kg/일, 보다 구체적으로는 5mg/kg/일 내지 50mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명이 제공하는 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 유래의 균주로서 식품에 적용이 가능하며, 기존에 비해 진세노사이드를 컴파운드 K로 전환하는 전환율이 높아 컴파운드 K를 대량으로 생산할 수 있다.

도 1 은 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 (KCTC 14272BP) 의 계통 발생 트리를 나타낸 것이다.
도 2는 효소액의 제조 공정을 나타낸다.
도 3는 정제된 효소액을 이용한 CK 전환반응 공정을 나타낸다.
도 4는 효소액을 이용하여 주요 진세노사이드로부터 컴파운드 K (CK)의 전환을 시간별로 본 것이다.
도 5는 아스퍼질러스 나이거 AG1의 효소액을 아스퍼질러스 나이거 KCTC 6461 표준형의 효소액과 상용 효소인 플란타아제 C150P를 이용하여 컴파운드 K의 전환율을 비교 분석한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주의 동정

<1-1> 발효 식품 미생물의 분리

누룩곰팡이를 구입하여 Aspergillus niger 를 분리하였다. 발효 식품을 분쇄하여 생리 식염수로 현탁하여 상등액을 PDA(Poatao Dextrose Agar) 배지에 도말하여 25℃, 습도 70%에서 5~7일 배양하였다. 포자가 생긴 agar plate에 멸균 증류수 20 ml를 붓고 loop로 조심히 긁어냈다. 그 후 멸균된 거즈를 12~16겹으로 접어 긁어낸 액을 거르고 액량을 측정하였다(균사는 걸러지고 포자만 밑으로 떨어짐) 4℃, 12,000rpm, 15분 원심분리 한 후 상등액은 버리고 pellet에 20% 글리세롤을 원심분리 하기전의 액량만큼 넣어 펠렛을 풀어 액체질소탱크에 보관하였다.(Stock Solution)

<1-2> 분리 균주의 동정

Stock Solution을 PDA(Poatao Dextrose Agar) 배지에 도말하여 25℃, 70%에서 2일간 배양 후 서열 분석 전문기관인 ㈜마크로젠에 맡겨 동정을 하였다. 선별된 균주의 DNA를 추출하고 16s rRNA를 증폭시키고 분석한 서열정보를 BLAST를 이용하여 동정하여 phylogenetic tree를 작성하였다. 그 결과 본 발명의 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1을 동정할 수 있었다 (도 1).

실시예 2 : 컴파운드 K를 생산하는데 이용되는 베타-글루코시다아제 (β-glucosidase)의 발현을 증가시키기 위한 최적 발효

<2-1> 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1의 발효 조건의 확립

미강(20Kg), 셀룰로스 (5kg), 수분(30%)을 121℃에서 40분동안 증자시킨 후 Aspergillus niger를 25 x 10⁴/(밀기울)Kg 만큼 접종하여 25℃, 50%(습도)에서 5일간 발효 시켰다. 위 최적조건들을 확립하기 위해 수분(30~70%)과 AG1의 접종량(1 x 10⁴~ 1 x 10⁶(Spore)/ (밀기울)Kg)과 발효시간(1~12일)을 달리한 결과, 습도는 50%, AG1 접종량은 25 x 10⁴/(밀기울)Kg, 발효 5일차에서 가장 발효와 베타-글루코시다아제의 역가가 가장 높았다.

<2-2> 발효물에서 베타-글루코시다아제 추출 및 여과 조건의 확립

발효물(g)의 3배만큼의 물(g)을 넣어 교반하여 효소를 추출하였다. 추출액을 체(50 mesh)에 통과시킨 후 0.45 ㎛ 패드 여과하였다. 위 최적조건들을 확립하기 위해 체의 mesh 수(10~200 mesh), 원심분리기 사용여부, 여과방법(0.2 ㎛, 0.45 ㎛ 패드여과, MF여과)을 달리하여 실험한 결과 50 mesh의 체를 통과 시킨 후 원심분리를 사용하여 불순물들을 제거하고 0.45 ㎛ 패드여과후 가장 많은 베타-글루코시다아제를 회수할 수 있었다(도 2 참조).

<2-3> 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1에서 추출한 베타-글루코시다아제의 효소역가(활성) 측정

베타-글루코시다아제의 활성 측정을 위한 기질로서 4-nitrophenyl Beta-D-glucopyranoside (이하 pNP-Glu)을 이용하였다. 기질 희석과 반응을 위한 버퍼로서는 50 mM MC buffer(pH 5.0)를 이용하였다. 발색시약으로는 200 mg/mL Na₂C0₃용액을 이용하였따.

표준품의 정량을 위해서 2 mM 4-nitrophenol 용액을 제조하여 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mM로 희석하였다. 각각의 포인트에 100 ㎕의 발색시약 (200 mg/mL Na2CO3용액)을 첨가하여 Vortexing 후 UV-Spectrophotometer를 이용하여 A₄₅₀를 측정하였다.

효소 활성을 측정하기 위해서 예비실험을 통해 활성이 0.2~0.6이 되도록 희석하였다. 효소와 기질을 각각 500 ㎕로 하여 70 ℃에서 4분간 예열하였고, Pre-heating 된 효소 500 ㎕를 기질이 담긴 e-tube에 첨가하여 1분 반응 후, 100 ㎕의 발색시약을 더해 Vortexing 한 후 UV-Spectrophotometer를 이용하여 A₄₅₀에서 측정하였다. 효소 활성은 아래와 같이 계산하였다.

1 unit = 1분 동안 1 μmole 의 pNP를 기질로부터 release 시키는 효소의 양

U/mL = pNP μmol 수 / 효소부피(mL) * 희석배수

실시예 3 : 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1에서 추출한 베타-글루코시다아제를 이용한 컴파운드 K의 생산

<3-1> 추출

건조 인삼 세근에 75% EtOH을 원료무게대비 5배 넣어 80℃에서 16시간씩 8회 침지 추출한 후 진공 농축기를 이용하여 농축하였다 (액량 대비 5배).

<3-2> 추출된 진세노사이드의 전환반응

액상 효소를 [효소 투입역가 : 10U/(추출액고형분)g] 투입 후 최종 volume을 추출농축액 고형분의 50배로 하고 NaOH를 이용하여 pH 5.0로 보정하였다. 50℃에서 효소반응을 5일 진행 후 연속 원심분리기로 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 90% 에탄올로 녹여서 액상 크로마토그래피를 이용하여 정량하였다 (도 4 참조). 생산된 컴파운드 K는 투입된 진세노사이드로부터 85% 이상의 전환 수율을 확인할 수 있었다. 최종 순도는 고형분 함량대비 28 ~ 44 %로 측정이 되었다. 정량된 컴파운드 K를 살균처리 (80℃ 에서 30분) 후 동결건조 하였다.

<3-3> 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1에서 추출한 베타-글루코시다아제의 전환율 비교

본 발명의 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1이 생산하는 베타-글루코시다아제의 전환율의 우위성을 확인하기 위해서 아스퍼질러스 나이거 표준 균주인 KCTC 6461 균주와 상용 효소인 플란타아제 C150P를 이용하여 비교 분석을 하였다. 액상 효소 준비를 위해서 아스퍼질러스 나이거 KCTC 6461를 이용하여 아스퍼질러스 나이거 AG1와 동일한 방법으로 배양하여 효소를 추출하였다. 전환 반응의 비교 분석을 위해서 모두 동일 역가 10U을 사용하였다. 실시예 3-2와 같이 액상 효소를 [효소 투입역가: 10U/(추출액고형분)g] 투입 후 최종 volume을 추출농축액 고형분의 50배로 하고 NaOH를 이용하여 pH 5.0로 보정 후 50℃에서 효소반응을 5일 진행 후 연속 원심분리기로 침전물을 회수하여 컴파운드 K를 분석하였다 (도 5 참조). 분석 결과 본 발명의 신균주인 아스퍼질러스 나이거 AG1이 아스퍼질러스 나이거 표준형인 야생형 KCTC 6461과 상용 효소인 플란타아제에 비해서 월등히 우수함을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명이 제공하는 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 유래의 균주로서 식품에 적용이 가능하며, 기존에 비해 진세노사이드를 컴파운드 K로 전환하는 전환율이 높아 컴파운드 K를 대량으로 생산할 수 있어 식품 산업 및 기능성 식품 산업에 적용가능하므로, 산업상 이용 가능성이 크다.

한국생명공학연구원

KCTC14272BP

20200814

Claims

아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) AG1 균주(수탁번호 : KCTC 14272BP).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 컴파운드 K를 고수율로 생산하는 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 발현하는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주.
i) 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주(KCTC 14272BP)를 배양시키는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양물에서 효소를 추출·여과하여 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 회수하는 단계를 포함하는 베타-글루코시다아제(β-glycosidase) 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 i)의 배양은 습도 30% 내지 70%, 온도 15 ℃ 내지 45 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 베타-글루코시다아제(β-glycosidase) 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 i)의 배양은 배양기간이 1일 내지 12일 인 것을 특징으로 하는 베타-글루코시다아제(β-glycosidase) 제조 방법.
i) 아스퍼질러스 나이거 AG1 균주(KCTC-- )를 배양시키는 단계
ii) 상기 단계 i)에서 배양한 배양물에서 효소를 추출·여과하여 베타-글루코시다아제(β-glycosidase)를 회수하는 단계
iii) 상기 단계 ⅱ)에서 회수한 β-글리코시다아제(β-glycosidase)를 기질에 접촉하여 반응시키는 단계; 및
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K)를 분리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 K의 제조 방법.
제 6항에 있어서, 상기 기질은 인삼 추출물, 홍삼 추출물, 산삼 추출물, 인삼 분말, 홍삼 분말 및 산삼 분말로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 컴파운드 K의 제조 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는 컴파운드 K의 제조 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 ⅲ)의 반응은 40 ℃ 내지 60 ℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 컴파운드 K의 제조 방법.
제 6항의 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
제 6항의 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 개선, 미백, 보습, 피부 혈색 개선, 피지 조절 효과 등의 피부 상태 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 6항의 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 여드름, 당뇨병, 뇌졸중, 경도인지 장애, 노인성 치매 및 암 치료용 약학적 조성물.