KR20200000005A

KR20200000005A - 특정 진세노사이드의 회수율 증진방법

Info

Publication number: KR20200000005A
Application number: KR1020180071345A
Authority: KR
Inventors: 이경애; 이선행; 김지훈
Original assignee: 이경애
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2020-01-02

Abstract

본 발명은 인삼의 진세노사이드류로부터 효소반응을 통해 컴파운드 케이를 제조시 수용액 상과 유기용매 상으로 이루어진 2상 반응계를 이용하여 반응중 컴파운드 케이가 프로토파낙사디올로 전환되는 것을 억제함으로써 높은 효율로 컴파운드 케이를 제조할 수 있도록 한 제조방법 및 이에 의해 ?어진 산물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

특정 진세노사이드의 회수율 증진방법 {Method of increased recovery of specific ginsenoside}

본 발명은 인삼의 진세노사이드류로부터 효소반응을 통해 컴파운드 케이를 제조시 수용액 상과 유기용매 상으로 이루어진 2상 반응계를 이용하여 반응중 컴파운드 케이가 프로토파낙사디올로 전환되는 것을 억제함으로써 높은 효율로 컴파운드 케이를 제조할 수 있도록 한 2상 반응 시스템 및 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 식물 분류학상 오가피과(Panax)의 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있다. 예로부터 한국, 중국, 일본 등 국가에서 주로 항암, 면역 증강, 항 피로, 당뇨병 치료, 고혈압, 혈행개선 등에 효과를 보이는 성분으로 널리 사용되어왔다. 특히 인삼에 0.5~2.5% 포함되어 있는 사포닌은 인삼의 주된 약효를 나타내는 성분으로 알려져 있다. 인삼 사포닌을 경구 투여할 경우, 활성 성분은 인삼 사포닌 자체가 아니라 장내 대사산물이라는 것이 제시되었는데, 이는 인삼 사포닌을 경구 투여한 다음 혈액에서 검출되는 성분이 경구 투여된 사포닌이 아니라 장내 대사산물이기 때문이다. (H.Hasegawa, Main Ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria, Planta Med., 62, 453-457 (1996))

이런 인삼 사포닌의 장내 대사산물 중 가장 항암효과가 큰 물질이 진세노사이드 컴파운드 케이(Ginsenoside Compound K, 20(S)-프로토파낙사이다이올-20-0-베타-디-글루코피라노사이드, 화학식 1)이다.

컴파운드 케이의 알려진 활성으로는 암세포 증식 억제, 항암제의 활성 시너지 효과, 피부 보호활성, 모발 발모 촉진, 알러지 및 아토피 억제, 항당뇨 작용, 알코올의 혈중 농도 저하, 생식 능력 증진, 항피로, 항스트레스, 혈행개선 등이 있다.

이러한 컴파운드 케이를 제조하기 위해서 다양한 방법들이 제시되었다. 종래에 알려진 컴파운드 케이의 제조방법으로는 프로토파낙사다이올 계열 사포닌을 쥐에 경구투여 한 다음 대장에서 분해산물로 생성된 컴파운드 케이를 분리하는 방법이 있다(M. Karikura, Studies on absorption, distribution, excretion and metabolism of ginseng saponins, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 38(10), 2859 (1990)). 또한, 미생물을 배양하여 조배지액을 만든 후, 포함된 효소를 이용하는 컴파운드 케이를 제조하는 방법이 있다(Battaglino, Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 292(1991)), 대한민국 특허 10-2009-0037140). 그러나 이러한 단순 미생물을 이용하는 방법들은, 대부분 생성수율이 극히 낮을 뿐만 아니라 여러 가지 2차 대사산물이 생성되기 때문에 생산수율이 낮고, 진세노사이드 컴파운드 케이를 고순도로 제조할 수 없는 단점이 있다. 이를 개선하기 위하여 직접 효소를 제조하거니 상용 효소를 이용하여 반응함으로써 컴파운드 케이를 제조하는 방법들이 제시되었다 (대한민국 특허 10-0877489, 대한민국 특허 10-1156204, 대한민국 공개특허10-2017-0100342). 이들 효소를 이용하는 방법은 특별한 효소를 사용하는 경우 이외에는 효소사용량이 많고 반응산물의 조절이 되지않아 컴파운드 케이의 효율적 회수에 어려움이 있다.

한편, 본 연구자들은 인삼류, 특히 무공해 새싹인삼으로부터 다량 함유된 진세노사이드류의 컴파운드 케이로의 효율적 제조에 대해 연구하던 중, 상당수의 효소에서 효소의 조절되지 않는 반응에 의해 진세노사이드류가 컴파운드 케이 전환된 이후 다시 당이 분해되어 비당체(aglycone)인 프로토파낙사디올(protopanaxadiol, 화학식 2)로 추가 전환됨으로써 최종 컴파운드 케이의 획득이 저하됨 확인하였다.

이를 개선하기 위하여 반응된 컴파운드케이를 반응액중에서 제거하여 프로토파낙사디올로의 추가 반응을 억제는 여러 가지 방법을 적용하였으며, 컴파운드 케이의 수용해성이 극히 낮음을 이용하여 침전 시키는 방법은 실제 반응에 효과적으로 적용되지 않아 프로토파낙사디올로의 추가 반응을 억제하기 어려움을 확인하였다, 이를 극복하기 위한 또 다른 방법으로서 컴파운드 케이의 용해성 파라미터가 다수의 당이 결합된 대부분의 진세노사이드류와 다를 수 있음에 착안하여, 일반 수용액 상과 물과 섞이지 않는 유기용매 상으로 이루어진 2상 반응계를 이용하여 반응중 형성된 컴파운드 케이가 유기용매층으로 다른 진세노사이드류 보다 보다 빨리 이동함으로써 프로토파낙사디올로 효소 전환되는 것을 억제하여 높은 효율로 컴파운드 케이를 회수할 수 있음을 확인 함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 과제는 인삼류에 함유된 진세노사이드류를 효소반응에 의해 컴파운드 케이로의 제조 중, 효소의 조절되지 않는 반응에 의해 진세노사이드류가 컴파운드 케이 전환된 이후 다시 당이 분해되어 비당체인 프로토파낙사디올로 추가 전환되는 것을 억제함으로써 최종적으로 컴파운드 케이의 획득을 향상시키는데 있다.

상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명의 제 1의 형태는 (a) 효소 반응조에서 수용액상에서 진세노사이드를 당가수분해효소로 반응시키는 단계; (b) 상기 당가수분해효소 반응물을 유기용매가 수용된 추출반응조로 이동시키는 단계; (c) 추출반응조에서 당가수분해효소 반응물과 유기용매를 교반시킨 후 정치하여 수용액상과 유기용액상으로 층분리시키는 단계;(d) 상기 추출반응조의 수용액상을 효소반응조로 이동시키는 단계; 및 (e) 상기 유기용액상을 건조하는 단계를 포함하는 컴파운드 케이 제조 방법을 제공한다. 상기 (a) 내지 (d) 단계는 반복되어질 수 있으며, 반응이 종결될 때까지 연속적 또는 단속적으로 진행될 수 있다. 상기 (b) 단계에서 당가수분해물을 추출반응조로 이동시키는 것은 정속펌프를 통해 도관을 통하여 이동시킬 수도 있다. 가장 간편하게는 당가수분해물에 유기용매를 투여하여 이동이 별도의 이동이 없이 유기용매와 접촉하게 할 수도 있다. 이와 같이 한 반응용기에서 효소반응공정과 추출반응이 모두 일어나는 경우에는 (d)단계의 공정은 생략될 수 있다. 상기 (b) 단계는 (a) 단계의 반응과 동시, 또는 (a) 단계의 반응의 중간에 진행되어 이시적으로 진행되어질 수 있다. 바람직하게는 당가수분해 반응이 어느 정도 진행이 된 후에 유기용매로 추출이 될 수 있도록 이시적으로 진행하는 것이 바람직하다.

상기 진세노사이드는 이제 제한되는 것은 아니나, 인삼, 홍삼 또는 새싹인삼으로부터 제조되어 질 수 있다. 상기 당가수분해효소는 펙티나아제(Pectinase)이다. 상기 펙티나아제(Pectinase)는 천연유래효소, 유전자재조합효소, 또는 이들 효소가 고정된 고정화효소일 수 있다. 상용적으로 판매되고 있는 펙티나아제는 사이토라아제(Cytolase)^TM, 플랜타아제(Plantase)^TM, 수미자임(Sumizyme)^TM가 있다.

상기 유기용매는 에틸아세테이트, 부탄올. 디에틸에테르, 메틸렌클로라이드, 디이소프로필 에테르, 카본테트라글로라이드, 에틸렌디클로라이드, 톨루엔, 1,4-디옥산, 이소부틸메틸케톤, 헥산, 시클로헥산, 옥산, 데칸, 도데칸, 벤젠 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 추출반응조에서 수용액상과 유기용액상으로 층분리는 밀도차에 의한 자연적인 층분리이거나, 반투과성 소재를 통해 서로 연결되어 있으나 서로 혼합되지 않지 않도록 층분리되어 질 수 있다. 되는 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.

본 발명의 제 2 의 형태는 본 발명에 따라 제조된 컴파운드 케이 및 이를 포함하는 식품, 화장품 또는 의약품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법은 수용액상에서 진세노사이드의 당분해효소로 인해 생성되는 컴파운드 케이를 유기용매 상을 접촉하는 과정에서 유기용매 층으로 제거할 수 있으며, 이를 통해 수용액 상에서 효소의 지속적인 작용을 통해 프로토파낙사디올로 추가 반응되는 것을 억제할 수 있을 뿐 아니라 반응액 중의 진세노사이드와 효소 작용 반응을 높임으로써 효과적인 반응이 가능하게 한다. 이는 일반적인 수용액상에서 반응할 경우 최종산물인 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 비율이 50:50 정도 인데 반해, 2상 반응시스템을 이용한 반응공정의 경우 최종 산물인 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 비율이 83:17 정도로 바뀌어 효율적으로 컴파운드 케이를 획득하는 것이 가능하다.

또한 회수한 반응산물의 경우 잔류하는 수용해성이 높은 당류, 효소단백질 등 불순물이 많이 제거되어 추가적인 정제공정을 최소화할 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 2상 반응시스템의 모식도이다.
도 2는 일반적인 반응공정(비교예1)에 따른 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 생성을 나타낸 HPLC 자료이다.
도 3은 생성된 컴파운드 케이의 확인을 위한 LC-ESI-MS 분석자료이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 에 따른 2상 반응시스템에 의해 제조되는 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 생성을 나타낸 HPLC 자료이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 진세노사이드를 함유한 추출액과 반응효소가 용해되어 컴파운드 케이로 전환이 이루어지는 수용액 상과,

반응된 컴파운드케이 또는 미량 생성된 프로토파낙사디올을 회수하기 위한 물과 섞이지 않는 유기용매 상을 포함하고,

상기 유기용매 상과 수용액 상은 수용액에서의 일정 반응후 상호 연결되어 서로 순환되도록 구성되는 컴파운드 케이 제조를 위한 2상 반응 시스템을 제공한다.

상기 2상 반응 시스템은 친수성 물질은 수용액 상으로, 소수성 물질은 유기용매 상으로 분리하는 것이 가능하다는 특성이 있다. 따라서 효소반응 과정에서 발생하는 산물인 컴파운드 케이가 유기용매 상으로 빨리 이동함으로써 수용액 상에서의 추가 프로토파낙사디올로 추가 반응을 억제하여 컴파운드 케이 회수율을 극대화시킬 수 있다. 이러한 공정에서는 원료의 이용효율이 높아질 뿐만 아니라 반응이 완료된 유기용매 상에 수용성 불순물이 존재하지 않기 때문에 별도의 정제과정이 많이 필요하지 않아 경제적이다.

상기 유기용매 상과 수용액 상은 상호 연결되어 서로 순환되도록 구성된다. 즉, 유기용매 상과 수용액 상은 서로 구별될 수 있는 상태에서 접해 있다. 일 예로, 유기용매 상과 수용액 상은 하나의 반응용기 내에 순차적으로 층을 이루거나, 반투과성 소재를 사이에 두고 위치하여, 서로 연결되어 있으나 서로 혼합되지 않은 상태에 있을 수 있다. 이때 반응초기부터 유기용매 상과 수용액 상을 연결할 경우는 전환되지 않은 진세노사이드류도 일부 유기용매층으로 이동하여 반응률이 떨어질 수 있으므로 일정시간 수용액상에서 효소반응 후 유기용매 상과 수용액 상을 연결하는 것이 효과적이다.

상기 반응의 기질인 진세노사이드는 인산, 홍삼, 새싹인삼 등 인삼유래의 조추출물, 정제물 등이 가능하다.

상기 반응효소는 진세오사이드의 당류를 분해하여 컴파운드 케이를 형성하는 다양한 효소를 포함할 수 있다. 상용효소로서 Cytolase, Plantase, Sumizyme 등 컴파운드 케이의 제조에 사용되는 효소를 포함할 수 있으며, 바실러스(Bacillus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 락토바실러스(Lactobacillus) 등 미생물로부터 유도된 분해효소를 포함할 수 있고, 상기 기술된 효소나 미생물 이외 유래 효소 혹은 유전공학적으로 재조합된 효소 혹은 상기 효소들을 고정화하여 얻은 효소 도 사용할 수 있다.

상기 유기용매 상의 구성에 사용되는 유기용매는 물과 섞이지 않고 소수성 성분을 용해할 수 있는 에틸아세테이트, 부탄올 등의 용매 또는 이들의 혼합물이 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

비교예 1

건조한 새싹인삼 100g을 조분쇄하고 1000ml의 70% 에탄올로 40℃에서 72시간 추출하였다. 추출액은 여과후 에탄올을 증류하고 반응에 사용하였다. 반응액 대비 5%되도록 효소(Plantase)를 첨가하고 40℃에서 48시간 반응하였다. 반응종료후 4℃에서 보관후 원심분리하여 침전물을 회수하였다.

HPLC 분석은 Optimapak ODS C18 컬럼을 이용하여 203 nm에서, 물:아세토니트릴을 이용한 이동상으로 분석하였다 (water:acetonitrile, initial ratio 80:20, final ratio 20:80). 컴파운드 케이는 LC-ESI-MS 시스템을 이용하여 분석, 확인 하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 반응산물의 HPLC 분석 결과 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올가 모두 상당량 형성되는 것을 알 수 있었다. 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 비율은 50:50 이었다.

실시예 1

비교예 1과 동일하게 건조한 새싹인삼 100g을 조분쇄하고 1000ml의 70% 에탄올로 40℃에서 72시간 추출하였다. 추출액은 여과후 에탄올을 증류하고 반응에 사용하였다. 효소반응조에서 반응액 대비 5% 되도록 효소(Plantase)를 첨가하고 40℃에서 48시간 반응하였다. 이 때 반응 18시간 후 정량펌프를 이용하여 반응액을 노르말부탄올이 들어있는 신규 반응조로 이동하여 6시간 교반후 정치하여 수용액층과 유기용액층을 분리하고 물층을 다시 정량 펌프를 이용하여 상기 효소 반응조로 이동하여 6시간 동안 반응한 후 다시 노르말부탄올이 있는 반응조내 유기용매층으로 이동하는 것을 반응 종료시까지 3회 반복하였다. 이 때 수용액 층과 유기용매층이 분리된 상태에서 최대한 강하게(100-200 rpm) 교반되도록 하였다. 수용액층은 100℃ 5분간 가열하여 반응종료후 수용액 층은 4℃에서 보관후 원심분리하여 침전물을 회수하였고 유기용매층은 증류하여 잔여물을 회수하였다. 회수물은 혼합하여 분석에 사용하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따른 반응산물의 HPLC 분석 결과 전체 혼합 회수물에서 프로토파낙사디올의 함량이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었으며 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 비율은 83:17 이었다.

실시예 2

건조한 인삼 100g을 조분쇄하고 1000ml의 70% 에탄올로 40℃에서 72시간 추출하였다. 추출액은 여과후 에탄올을 증류하고 반응에 사용하였다. 반응액 대비 5%되도록 효소(Cytolase)를 첨가하고 40℃에서 48시간 반응하였다. 이 때 반응 18시간 후 정량펌프를 이용하여 반응액을 노르말부탄올이 들어있는 신규 반응조로 이동하여 6시간 교반후 정치하여 수용액층과 유기용액층을 분리하고 물층을 다시 정량 펌프를 이용하여 상기 효소 반응조로 이동하여 6시간 동안 반응한 후 다시 노르말부탄올이 있는 반응조내 유기용매층으로 이동하는 것을 반응 종료시까지 3회 반복하였다. 이 때 수용액 층과 유기용매층이 분리된 상태에서 최대한 강하게(100-200 rpm) 교반되도록 하였다. 수용액층은 100℃ 5분간 가열하여 반응종료후 수용액 층은 4℃에서 보관후 원심분리하여 침전물을 회수하였고 유기용매층은 증류하여 잔여물을 회수하였다. 회수물은 혼합하여 분석에 사용하였다.

반응산물의 분석 결과 역시 프로토파낙사디올의 함량이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었으며 컴파운드 케이와 프로토파낙사디올의 비율은 80:20 이었다.

상기 방법에 의해 제조된 컴파운드 케이 함유물은 식품, 화장품, 의약품 등에 다양하게 사용될 수 있다.

Claims

(a) 효소 반응조에서 수용액상에서 진세노사이드를 당가수분해효소로 반응시키는 단계;
(b) 상기 당가수분해효소 반응물을 유기용매가 수용된 추출반응조로 이동시키는 단계;
(c) 추출반응조에서 당가수분해효소 반응물과 유기용매를 교반시킨 후 정치하여 수용액상과 유기용액상으로 층분리시키는 단계;
(d) 상기 추출반응조의 수용액상을 효소반응조로 이동시키는 단계; 및
(e) 상기 유기용액상을 건조하는 단계를 포함하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 내지 (d) 단계가 반복되는 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제1항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진세노사이드는 인삼, 홍삼 또는 새싹인삼으로부터 제조된 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제1항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당가수분해효소는 펙티나아제(Pectinase)인 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 펙티나아제(Pectinase)는 천연유래효소, 유전자재조합효소, 또는 이들 효소가 고정된 고정화효소인 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제 4 항에 있어서 상기 펙티나아제는 사이토라아제(Cytolase)^TM, 플랜타아제(Plantase)^TM, 또는 수미자임(Sumizyme)^TM인 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 부탄올. 디에틸에테르, 메틸렌클로라이드, 디이소프로필 에테르, 카본테트라글로라이드, 에틸렌디클로라이드, 톨루엔, 1,4-디옥산, 이소부틸메틸케톤, 헥산, 시클로헥산, 옥산, 데칸, 도데칸, 벤젠 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 추출반응조에서 수용액상과 유기용액상으로 층분리는 밀도차에 의한 자연적인 층분리이거나, 반투과성 소재를 통해 서로 연결되어 있으나 서로 혼합되지 않지 않도록 층분리되는 것을 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계의 반응과 동시, 또는 (a) 단계의 반응의 중간에 진행되는 것은 특징으로 하는 컴파운드 케이 제조 방법.
제 1 항, 제 2 항, 제 7 항 내지 제 9항 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 생산된 컴파운드 케이.
제 10 항에 따른 컴파운드 케이를 포함하는 식품, 화장품 또는 의약품 조성물.