KR101777673B1

KR101777673B1 - 효소를 이용한 진세노사이드 Rd의 제조방법

Info

Publication number: KR101777673B1
Application number: KR1020150144410A
Authority: KR
Inventors: 오진환; 허율; 조영래
Original assignee: 주식회사 비티진
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2017-09-12
Also published as: KR20170044828A

Abstract

과제: 좀 더 안전하고 효율적인 진세노사이드 Rd 생산방법을 제공하고자 함.
해결방법: 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제를 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc (단일 또는 복합 진세노사이드) 또는 이들이 하나 이상 포함되어 있는 혼합물과 반응시켜 진세노사이드 Rd (ginsenoside Rd)를 높은 수율로 생산하는 것이다. 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제를 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc (단일 또는 복합)와 반응시키면 진세노사이드 Rd를 높은 전환율로 생산할 수 있다.

Description

효소를 이용한 진세노사이드 Rd의 제조방법 {Preparation method of ginsenoside-Rd using an enzyme}

본 발명은 효소를 이용하여 간단한 공정으로 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 또는 이들 성분이 하나 이상 포함된 혼합물로부터 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 진세노사이드 Rd로의 전환율이 높고, 효소반응으로 공정이 간단하며, 상온에서 1~2일간의 짧은 시간 안에 대부분의 반응이 완료되어 안전하고 깨끗한 조건에서 단시간에도 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.

진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리터페노이드를 기본구조로 하는 프로토파낙사다이올과 프로토파낙사트라이올의 어글리콘에 글루코스, 람노스, 아라비노스, 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물로서, 결합된 당의 종류와 수 그리고 결합위치에 따라 약리작용이 각각 다른 것으로 알려져 있다. 이들 유도체들 중 프로토파낙사다이올에 속하는 진세노사이드인 Rb1, Rb2 및 Rc 중 한 가지 이상을 원료로 사용하여 진세노사이드 Rd를 만들게 되는데 각각의 특성에 따라 당이 가수분해로 떨어지게 된다. 진세노사이드 Rd는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1 등과 함께 가장 널리 알려진 인삼 사포닌 중 하나이나, 그 함유량은 건삼기준 0.036% 정도로 매우 미미하여(최신고려인삼성분 및 효능편 1996, 한국인삼연초연구원) 다각도의 약리활성 연구나 상업적 활용이 충분히 이루어지지 못하고 그 구조만 밝혀져 있다.

기존에 진세노사이드 Rd의 약리활성으로는 신장보호효과 (Ren Fail. 2000 Mar;22(2):115-27, Nephron. 1999 Feb;81(2):200-7), 면역억제효과 (장기이식, J Surg Res. 2012 Jul;176(1):267-74), 간 보호효과 (항간암, 출원특허10-2010-0118722), 항산화효과 (J Pharm Pharmacol. 2004 Jan;56(1):107-13), 뇌신경세포 보호효과 (항알츠하이머, 항파킨슨병, Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 14395-14408, 항알츠하이머 Neurochem Res. 2012 Dec;37(12):2738-47, 신경세포보호 Neural Regen Res. 2014 Sep 15;9(18):1678-87) 등이 발표되어 상업적 (기능성 식품, 천연물 의약품 등)으로나 의학적으로 큰 잠재력이 있는 것으로 조명되고 있다.

종래 진세노사이드 Rd 제조에 사용된 방법에는 유전자 재조합기술로 고온성 세균 (Thermus Caldophilus)의 DNA를 클로닝하여 생산한 효소인 β-글루코시데이즈를 이용한 방법 (Biotechnol Lett (2008) 30:713716, 특허공개번호 10-2002-0029138)이 있다. 이 방법은 생산에 사용한 효소가 유전자 조작으로 얻은 효소이기 때문에 식품 가공에 제약이 있고, 재조합 효소의 생산단가가 높으며, 고온 (70~80℃)에서 반응시켜 작업 공정에 어려움이 있다.

효소를 이용한 또 다른 진세노사이드 Rd 제법으로는 역시 유전자 재조합기술로 토양미생물인 플라보박테리움 존소니애 (Flavobacterium johnsoniae)의 DNA를 클로닝하여 생산한 효소인 글루코시데이즈를 이용한 방법이 있다 (한국등록특허 1427882호). 이 방법도 생산에 사용한 효소가 유전자 조작으로 얻은 효소이기 때문에 식품 가공에 제약이 있고, 재조합 효소의 생산단가가 높다는 단점이 있다.

상기 문제점들을 해결하고, 좀 더 안전하고 좀 더 생산성이 높은 진세노사이드 Rd 제조방법을 제공하려는 것이 본 발명의 목적이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제를 이용하여 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc 또는 그 혼합물과의 효소 반응을 통해 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법을 발명하였다.

본 발명은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 중 한 성분 이상 또는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 중 한 성분 이상이 포함된 조성물을 기질로 이용하여 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제와 반응시켜 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 반응을 0 ~ 60℃의 온도에서 진행함을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 중 한 성분 이상이 포함된 조성물에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 바람직하게는 홍삼추출물, 홍삼농축액, 홍삼분말, 홍삼농축분말, 인삼추출물, 인삼농축액, 인삼분말, 인삼농축분말, 태극삼추출물, 태극삼농축액, 태극삼분말 또는 태극삼농축분말임을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 인삼이 인삼속(Panax species) 식물로서 특별한 한정은 없으나, 바람직하게는 한국삼 (Panaxa ginseng), 미국삼 (panax quinquefolium), 중국삼 (Panaxa notoginseng) 또는 일본삼 (Panax japonica)임을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법에 관한 것이다.

진세노사이드 Rd는 수삼이나 건삼과 같이 가공하지 않은 천연 인삼에도 존재하는 널리 알려진 성분이지만 정작 그 함량은 0.036% (건삼 기준)에 지나지 않아 그동안 약리활성 연구가 활발히 이루어지지 못하였고, 대량생산이 어려워 임상시험 같은 대규모 약리연구나 기능성 식품 개발 같은 상업화가 쉽지 않았다.

본 발명의 방법에 따르면, 혼합물부터 고순도의 진세노사이드 Rd까지 다양한 Rd 제품의 대량생산이 가능하다. 따라서 다각도의 약리활성규명과 이에 따른 기능성 식품 및 신약 개발 가능성이 커졌다고 할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 사용하는 효소의 양이 적을 뿐만 아니라 반응시간이 짧은 경우에도 90%를 상회하는 매우 높은 수율로 진세노사이드 Rd를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 의하여 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc (단일 또는 복합)가 진세노사이드 Rd로 전환되는 것을 나타낸 도면이다.
도 2a, 2b는 알파갈락토시다제에 의해 Rb1으로부터 전환된 Rd의 제조 결과에 대한 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석도이다. 2a는 반응 전 조성물에 대한 결과이고, 2b는 반응 후 조성물에 대한 결과이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1:

진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc가 혼합된 복합 사포닌 100mg을 기질로 하여 50 mM 시트르산-인산 (Cirtic acid-phosphate) 완충용액 (pH 4.5)에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제 (제품명: α-galactosidase DS30, 제조사: Amano, 일본) 50mg과 25℃ 항온수조에서 48시간 반응시켰다. 박층 크로마토그래피 (전개액: 클로로포름:메탄올:증류수 = 60:40:10)로 확인하여 기질이 소실되면 비등수에서 10분간 처리하여 효소활성을 없애고 부탄올 추출법으로 효소 및 당을 제거한 후 실리카젤 컬럼을 사용해 분리하여 진세노사이드 Rd를 78mg 얻었다.

실시예 2:

진세노사이드 Rb1 1g을 기질로 하여 50 mM 시트르산-인산 완충용액 (pH 4.5)에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제 (제품명: α-galactosidase DS30, 제조사: Amano, 일본) 50mg과 25℃ 항온수조에서 48시간 반응시켰다. 박층 크로마토그래피 (전개액: 클로로포름:메탄올:증류수 = 60:40:10)로 확인하여 기질이 소실되면 비등수에서 10분간 처리하여 효소활성을 없애고 부탄올 추출법으로 효소 및 당을 제거한 후 실리카젤 컬럼을 사용해 분리하여 진세노사이드 Rd를 81mg 얻었다.

실시예 3:

진세노사이드 Rb2 100mg을 기질로 하여 50 mM 시트르산-인산 완충용액 (pH 4.5)에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제 (제품명: α-galactosidase DS30, 제조사: Amano, 일본) 0.5g과 25℃ 항온수조에서 48시간 반응시켰다. 박층 크로마토그래피 (전개액: 클로로포름:메탄올:증류수 = 60:40:10)로 확인하여 기질이 소실되면 비등수에서 10분간 처리하여 효소활성을 없애고 부탄올 추출법으로 효소 및 당을 제거한 후 실리카젤 컬럼을 사용해 분리하여 진세노사이드 Rd를 0.79g 얻었다.

실시예 4:

진세노사이드 Rc 100mg을 기질로 하여 50 mM 시트르산-인산 완충용액 (pH 4.5)에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제 (제품명: α-galactosidase DS30, 제조사: Amano, 일본) 0.5g과 25℃ 항온수조에서 48시간 반응시켰다. 박층 크로마토그래피 (전개액: 클로로포름:메탄올:증류수 = 60:40:10)로 확인하여 기질이 소실되면 비등수에서 10분간 처리하여 효소활성을 없애고 부탄올 추출법으로 효소 및 당을 제거한 후 실리카젤 컬럼을 사용해 분리하여 진세노사이드 Rd를 80mg 얻었다.

실시예 5:

진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc가 함유되어 있는 인삼추출분말 (Rb1=102㎎, Rb2=31㎎, Rc=52㎎, Rd=9㎎, 기타) 1g을 기질로 하여 50 mM 시트르산-인산 완충용액 (pH 4.5)에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제 (제품명: α-galactosidase DS30, 제조사: Amano, 일본) 0.5g과 25℃ 항온수조에서 48시간 반응시켰다. 박층 크로마토그래피 (전개액: 클로로포름:메탄올:증류수 = 60:40:10)로 확인하여 기질이 소실되면 비등수에서 10분간 처리하여 효소활성을 없애고 부탄올 추출법으로 효소 및 당을 제거한 후 실리카젤 컬럼을 사용해 분리하여 진세노사이드 Rd가 다량 함유된 분말 0.5g을 얻었다. 이 분말 중 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함유량은 각각 Rb1=0㎎, Rb2=5㎎, Rc=9㎎, Rd=141㎎이었다.

실시예 6:

진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc가 함유되어 있는 홍삼추출분말 (Rb1=117㎎, Rb2=39㎎, Rc=50㎎, Rd=18㎎) 1g을 기질로 하여 50 mM 시트르산-인산 완충용액 (pH 4.5)에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제 (제품명: α-galactosidase DS30, 제조사: Amano, 일본) 0.5g과 25℃ 항온수조에서 48시간 반응시켰다. 박층 크로마토그래피 (전개액: 클로로포름:메탄올:증류수 = 60:40:10)로 확인하여 기질이 소실되면 비등수에서 10분간 처리하여 효소활성을 없애고 부탄올 추출법으로 효소 및 당을 제거한 후 실리카젤 컬럼을 사용해 분리하여 진세노사이드 Rd가 다량 함유된 분말 0.55g을 얻었다. 이 분말 중 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함유량은 각각 Rb1=0㎎, Rb2=6㎎, Rc=8㎎, Rd=172㎎이었다.

상기 표 1의 단위는 ㎎이다.

Claims

진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 중 한 성분 이상 또는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 중 한 성분 이상이 포함된 조성물을 기질로 하여 상온에서 아스퍼질러스 속 유래 알파갈락토시다제를 이용하여 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 중 한 성분 이상이 포함된 조성물은 홍삼추출물, 홍삼농축액, 홍삼분말, 홍삼농축분말, 인삼추출물, 인삼농축액, 인삼분말, 인삼농축분말, 태극삼추출물, 태극삼농축액, 태극삼분말 또는 태극삼농축분말임을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 인삼은 한국삼 (Panaxa ginseng), 미국삼 (panax quinquefolium), 중국삼 (Panaxa notoginseng) 또는 일본삼 (Panax japonica)임을 특징으로 하는 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법.
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