KR20150055703A - 저분자 진세노사이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은, 특정 발효효소와 알코올발효균주(이하 '효모'라 약칭하는 경우가 있음)를 이용하여 저분자 진세노사이드의 제조수율 및 함유량을 높이고, 필요에 따라서 유기산 처리하여 선택적으로 특정 저분자 진세노사이드 성분의 제조수율 및 함유량을 높이는 방법을 제시하고, 이러한 저분자 진세노사이드를 포함하는 발효삼을 제조하는 방법을 제공하는 것이고, 이를 위하여, 고분자 진세노사이드의 분자구조로부터 당을 분리시켜서 저분자화시키는 발효효소 또는 상기 발효효소를 내는 발효균주를 투입하여 발효반응시키는, 저분자 진세노사이드의 제조방법에 있어서, 상기 발효반응에 의하여 분리된 당을 이용하여 알코올을 생성하는 알코올발효균주를 투입하고, 상기 저분자화 과정에서 생기는 중간산물 중 저용해도의 물질을 상기 알코올에 용해시켜서, 침전을 억제함을 특징으로 한다.

Description

저분자 진세노사이드의 제조방법{Manufacturing method of small molecule Ginsenoside}

본 발명은, 저분자 진세노사이드의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세히는, 진세노사이드를 고분자 구조에서 저분자 구조로 전환시킴에 있어서, 고효율 구조전환을 유도하는 특이 균주를 이용하는 구조전환방법 및 저분자 진세노사이드와 이를 포함하는 발효인삼이나 발효홍삼 등의 발효삼을 제조하는 방법에 관한 것이다.

인삼은, 식물분류학상 오가피과의 인삼속에 속하는 다년생의 숙근초로서, 지구상에 약 11종이 알려져 있고, 많은 연구 결과물과 의학 고전에 의하여 지질과산화 억제, 혈압조절효과, 혈류개선, 심장기능 개선, 항혈전, 항스트레스, 항산화, 세포독소 및 암 억제, 항당뇨, 해독, 간세포 효소 증가, 천식 치료, 항염증, 진통작용, 생식능력 증진, 뇌기능 활성, 항알러지, 면역력증강, 항피로 효과 등의 여러 약리활성을 가지는 것으로 알려져 있는, 매우 중요하게 여겨지고 있는 약재 중 하나이다.

20세기 들어, 이런 인삼 및 그 가공물인 홍삼, 그리고 장뇌삼이나 산삼(이하, '삼'이라 약칭하는 경우가 있음)의 약리활성의 주체에 대한 연구로부터, 삼의 성분 중 인삼사포닌 성분, 다시 말해 진세노사이드라 일컬어지는 성분이 삼의 주 약리활성 성분이라는 것이 밝혀졌고, 최근에는 이들 진세노사이드 성분의 체내 흡수율의 증가와 이에 따른 진세노사이드의 체내 대사물질, 즉 저분자 진세노사이드의 중요성이 더욱 부각되고 있다.

그런데, 진세노사이드는, 삼에 함유된 채로 존재하는 상태에서는 당이 진세노사이드 기본골격에 붙어 있어서 다당류의 형태를 취하고, 이는 곧바로 체내 흡수가 되기 어려우며, 장내에서 다당류가 단당류로 가수분해된 후, 즉 고분자에서 저분자로 전환된 후에 비로소 흡수된다. 따라서, 체내의 흡수율을 높이기 위해서는, 진세노사이드의 저분자화가 선행될 필요가 있음이 알려져 있다.

종래에는, 진세노사이드를 저분자 형태로 전환하여 체내 흡수율을 증가시키기 위하여, 장내 미생물을 이용하여 삼을 발효(특허문헌 1)하거나, 유산균 및 여러 균주를 이용하여 삼을 발효(특허문헌 2, 특허문헌 3)하거나, 효모를 이용하여 삼을 발효(특허문헌 4)하는 방법 등이 사용되고 있다. 이하, 장내 미생물이나 유산균 등 삼을 발효시키는 것을 발효균주라 하고, 이러한 발효균주는 발효효소를 내는 것으로 한다.

특허공개 제10-2003-0061756호 특허 제10-0752154호 특허 제10-0789678호 특허 제10-1218275호

그러나, 이러한 종래의 발효에 의한 공정을 이용하면, Compound-K와 같은 유용한 단당체의 저분자 진세노사이드가 생성되는 것으로 그 효과를 기재하고 있지만, 실제로 실험을 해보면 특허문헌에 제시된 그래프나 표와는 달리, 실질적으로 전혀 반응이 일어나지 않거나, 반응이 느리거나, 반응이 진행되는 듯하다가 중간에 멈추는 경우가 많다. 그리고, 반응이 이루어진 경우에도, 진세노사이드 중 고분자 형태에서 저분자 형태로의 구조전환 중의 중간단계의 발효산물인 중간산물이 반응결과물의 거의 대부분을 차지하고 있어서, 발효공정의 최종산물(목표로 하는 단당체의 저분자 진세노사이드)의 함유량이 극히 미흡하다는 약점이 있음이 알려져 있다. 이는 고분자 진세노사이드가 이당류 등의 저분자 형태의 중간산물로 전환될수록 물에 대한 용해도가 급격히 감소해서, 이 발효의 중간산물이 모두 침전되어버려서, 더 이상 중간산물로부터 최종산물로의 발효의 기회를 잃게 되기 때문(도 6 참조)이라고 생각된다.

물론 삼의 발효시에 의도적인 물이나 알코올의 과량 첨가가 상기 문제점을 어느 정도 해결할 수 있기는 하지만, 투여할 물이나 알코올의 양과 시기를 알 수 없으므로 근원적인 해결책이 될 수는 없고, 게다가, 발효공정이 완료된 후에는 이 첨가된 물이나 알코올을 없애기 위한 농축과정에 시간이 과도하게 소요된다는 점에서, 발효완료시까지의 시간소요가 과도하다는 단점이 상존한다.

본 발명의 목적은, 특정 발효효소와 알코올발효균주(이하, '효모'라 약칭하는 경우가 있음)를 이용하여 저분자 진세노사이드의 제조수율 및 함유량을 높이고, 필요에 따라서 유기산 처리하여 선택적으로 특정 저분자 진세노사이드 성분의 제조수율 및 함유량을 높이는 방법을 제시하고, 이러한 저분자 진세노사이드를 포함하는 발효삼을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명의 발명자들은, 발효 중간단계의 산물인 중간산물의 침전을 억제하고, 발효의 최종산물의 생산 수율 및 함유량을 높일 수 있는 방법을 연구하던 중, 저분자화를 위한 발효용의 발효효소와 함께 알코올발효균주, 특히 자낭균강(子囊菌綱; Ascomycetes)의 효모를 이용하여 인삼이나 홍삼, 장뇌삼, 산삼을 발효시킬 경우, 발효효소에 의한 산물로서의 포도당 분자가 효모에 의하여 알코올로 전환되면서 알코올을 함유하게 되고, 함유된 알코올에 의하여 발효 중간산물이 그대로 용액에 용해되어 있는 형태가 되어, 최종산물에까지 높은 수율로 전환되는 기술을 발명하게 되었다. 또한, 경우에 따라서는, 발효가 완료되는 시점에 유기산을 처리하여, 선택적으로 특정성분의 최종산물(저분자 진세노사이드)를 생산해내도록 할 수도 있는 기술을 발명하였다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 발효삼의 제조방법은, 삼에 발효효소와 알코올발효균주(효모)를 접종하여 5℃~55℃, 보다 바람직하게는 45℃온도 조건 하에서 72~170시간, 보다 바람직하게는 120시간 동안 발효하는 단계와, 상기 단계 후에 경우에 따라서, 발효된 삼을 농축하여 생성된 발효 알코올을 제거한 후에 유기산을 첨가하여 40℃~80℃, 보다 바람직하게는 70℃의 온도조건 하에서 12~72시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 교반 하에 반응시키는 단계를 포함한다.

본 발명은, 미처리된 삼에 발효효소와 알코올발효균주(효모)를 접종하여 이 삼에 함유된 고분자 진세노사이드를 고효율로 효소발효 처리하여 저분자화하고, 경우에 따라서는 더욱 유기산 처리하여, 사포닌 기본골격에 결합되어 있는 당 분자들이 가수분해되도록 하여, 특정 진세노사이드 분해물 즉, 저분자 진세노사이드 성분의 전환수율 및 함유량을 높이고, 올리고당이 함유된 발효삼의 제조방법이다.

따라서, 본 발명의 방법은, 고분자 진세노사이드의 분자구조로부터 당을 분리시켜서 저분자화시키는 발효효소 또는 상기 발효효소를 내는 발효균주를 투입하여 발효반응시키는, 저분자 진세노사이드의 제조방법에 있어서, 상기 발효반응에 의하여 분리된 당을 이용하여 알코올을 생성하는 알코올발효균주를 투입하고, 상기 저분자화 과정에서 생기는 중간산물 중 저용해도의 물질을 상기 알코올에 용해시켜서, 침전을 억제함을 특징으로 한다.

여기서, 상기 발효효소는, 베타 글루코시다아제, 락타아제, 및 알파 갈락토시다아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상임이 바람직하다.

또한, 상기 알코올발효균주는, 자낭균강(子囊菌綱; Ascomycetes)의 효모임이 바람직하고, 보다 구체적으로는, 상기 효모는, Saccharomycoideae과의 Saccharomyces Cerevisiae 효모, Saccharomyces Carlsbergensis 효모, Sachizoccharomycoideae과의 Sachizoccharomyces Octosporus 효모, 및 Sachizoccharomyces Pombe 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상임이 바람직하다.

그리고, 상기 발효반응의 최종산물은, ginsenoside-F1, ginsenoside-F2, 및 Compound-K 중의 적어도 하나를 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 상기 발효반응의 종료 후에, 상기 알코올발효균주에 의하여 생성된 알코올을 제거하고, 그 잔존물에 유기산에 의한 처리를 더욱 시행하여, 상기 유기산에 의하여 결정되는 종류의 저분자 진세노사이드를 선택적으로 생산하는 것이 바람직하다.

이때, 상기 유기산에 의하여 결정되는 종류의 저분자 진세노사이드는, ginsenoside-Rh1, ginsenoside-Rh2, PPT, 및 PPD 중의 적어도 하나를 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 인삼, 홍삼, 장뇌삼, 또는 산삼이나 그 추출물, 분말에 상기 저분자 진세노사이드의 제조방법을 적용하여, 저분자 진세노사이드가 함유된 발효삼을 제조할 수 있다.

본 발명에 의하면, 특정 발효효소와 알코올발효균주를 이용한 특정 진세노사이드 성분의 전환수율을 높인 저분자 진세노사이드 또는 이를 포함하는 발효삼을 제조하고, 경우에 따라서 유기산을 처리하여, 선택적으로 특정 저분자 진세노사이드를 고수율로 생산해내는 기술이 제공된다.

[도 1] 진세노사이드 표준품(Standards)의 HPLC 그래프,
[도 2] 홍삼농축액의 HPLC 그래프,
[도 3] 효소첨가 발효 홍삼농축액의 HPLC 그래프,
[도 4] 본 발명의 효소 및 효모첨가 발효 홍삼농축액의 HPLC 그래프,
[도 5] 효소첨가 발효 홍삼농축액과 효소 및 효모첨가 발효 홍삼농축액의 TLC(박층 크로마토그래피) 비교도, 여기서,
A : 홍삼농축액
B : 효소첨가 발효 홍삼농축액
C : 효소 및 효모첨가 발효 홍삼농축액
[도 6] 진세노사이드의 발효시 성분변화 과정 (프로토파낙스디올 계) 설명도

이하, 본 발명에 의한 저분자 진세노사이드의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

<제1 단계 : 효모를 이용한 발효단계>

본 발명에 따른 발효삼의 제조에 사용되는 인삼 또는 홍삼, 장뇌삼, 산삼(이하, '삼'이라 약칭하는 경우가 있음)은, 그 종류, 원산지 및 형태가 특별히 한정되지 않는다. 즉, 본 발명에 사용되는 인삼의 종류로는, 수삼, 백삼, 및 홍삼의 사용이 모두 가능하다. 여기서, 수삼이라 함은, 밭에서 수확 후 가공하지 아니한 상태의 생삼을 말하고, 백삼은 수삼을 건조한 것을 말하며, 홍삼은 수삼을 표피를 제거하지 않은 상태에서 증기로 쪄서 건조시킨 암적색 또는 적갈색 인삼을 말한다.

또한, 본 발명에 따른 발효삼의 제조에 사용되는 삼의 가공형태는, 추출액, 농축액, 농축액분말, 분말 모두 적용가능하다. 추출액이라 함은, 삼을 물, 주정알코올, 또는 물과 주정알코올의 혼합용액으로 추출한 후 생성된 상징액을 말하고, 농축액은, 삼의 추출액을 농축한 겔 상태의 액상을 말하며, 농축액분말은, 삼의 농축액을 분말화한 것을 말하고, 분말은, 삼의 건조물을 분쇄기를 이용 분쇄함으로써 제조된 가루를 말한다.

또한, 본 발명에 따른 발효삼의 제조에 사용되는 삼의 원산지는, 사포닌을 함유하고 있는 인삼류라면, 원산지에 상관없이 모두 적용가능하다. 예컨대, 한국이 원산지인 고려인삼(Panax ginseng), 서양이 원산지인 서양삼(Panax quinquefolium), 중국 원남지방이 원산지인 전칠삼(Panax notoginseng), 일본이 원산지인 죽절삼(Panax japonicum) 등의 인삼이 모두 적용 가능하다.

나아가, 본 발명에서 사용되는 인삼은, 인삼의 뿌리, 잎 및 줄기 중에서 선택된 것일 수 있고, 홍삼은, 홍세미 및 홍삼근 중 선택된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서의 발효효소와 효모(알코올발효균주)를 이용한 삼의 발효는, 상술한 삼에 효모를 접종하고, 효소와 효모의 적당한 발효온도인 5℃~55℃에서 72~170시간 동안 배양함으로써 수행되어 진다. 보다 바람직하게는, 발효의 기질이 분말일 경우에는, 분말 1kg을 물 1~2ℓ에 현탁하여 1시간에서 1시간30분 동안 침지시킨 후 효소와 효모를 접종할 수 있고, 농축액일 경우에는, 농축액 1kg에 물 0.5ℓ를 첨가하여 희석시킨 후 효소와 효모를 접종할 수 있으며, 농축액분말일 경우에는, 농축액분말 1kg에 물 1~1.5ℓ를 첨가하여 용해시킨 후 효소와 효모를 접종할 수 있고, 추출액일 경우에는, 그 상태로 효소와 효모를 접종할 수 있다. 상기에서 효소와 효모의 접종량은, 기질의 전체 질량에 대하여, 효소는 3~7% (w/w), 효모는 1~10% (w/w) 인 것이 바람직하다.

상기 효소로는, 베타 글루코시다아제, 락타아제, 알파 갈락토시다아제로 이루어진 그룹 중에서 1종 이상을 사용할 수 있고, 상기 효모로는, 바람직하게는 Saccharomycoideae과의 Saccharomyces Cerevisiae 효모, Saccharomyces Carlsbergensis 효모, Sachizoccharomycoideae과의 Sachizoccharomyces Octosporus 효모, Sachizoccharomyces Pombe 효모로 이루어진 그룹 중에서 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 효모는 OVERSEAL NATURAL INGREDIENTS 社(영국)나 Homebrew Heaven 社 (미국)를 통해 구입하여 사용가능하다.

상기 제1 단계에 의하여, 발효효소에 의한 고분자에서 저분자로의 진세노사이드의 가수분해 도중에, 당이 분리되고, 이 당은, 알코올발효균주인 효모에 의하여 알코올로 변환된다. 그리고, 상기 발효효소에 의한 중간산물 중에서 용해도가 낮은 것이 상기 알코올에 용해된 상태로 유지하게 된다. 즉, 침전이 저해된다. 따라서, 출발물질인 고분자 진세노사이드로부터 중간산물로, 중간산물로부터 최종산물인 저분자 진세노사이드로, 용해도의 저하에 의한 침전없이 매끄럽게 반응이 유지되므로, 발효의 최종산물로서의 ginsenoside-F1, ginsenoside-F2, Compound-K 등의 저분자 진세노사이드가 대량 함유되어 있는 발효삼(도 6, 표 1 참조)이 얻어진다.

<제2 단계 : 유기산 처리단계>

상기 제1 단계에서의 최종산물에 유기산을 처리하여, ginsenoside-Rh1, ginsenoside-Rh2, PPT, PPD 등과 같은 다른 저분자 진세노사이드들이 함유되어 있는 발효삼을 제조할 수 있다.

이때, 유기산으로서는, 식품용 목초산, 구연산, 초산 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 구연산 50~100% 농도의 유기산을 0.01~0.5%(w/v)로 첨가할 수 있다.

이때, 제1 단계에서 발효된 삼에는 발효산물로서 알코올이 상존하는 상태이므로, 유기산의 첨가에 앞서, 이 알코올을 농축을 통해 제거해야 한다. 즉 감압증류를 통해 알코올을 증발시켜 발효된 삼에 알코올이 5~10% 이하일 때, 유기산을 상기 조건 하에서 첨가하도록 한다.

유기산을 첨가한 후에는, 40℃~80℃, 보다 바람직하게는 70℃의 온도조건 하에서 12~72시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 교반 하에 반응시킨 후, 박층 크로마토그래피나, 고성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 반응종료 시점을 지정한다.

<제3 단계 : 후처리단계>

본 발명의 발효된 삼의 제조방법은, 상기 제1 단계의 종료시점에서, 또는 경우에 따라 제2 단계를 시행할 경우에는 상기 2단계의 종료시점에서, 95℃~130℃, 보다 바람직하게는 121℃의 온도조건 하에 1.5기압 조건에서 15분간 가압처리하여 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 발효된 삼의 제조방법은, 상기 제1 단계의 종료 후에, 또는 경우에 따라 제2 단계를 시행할 경우에는 상기 제2 단계의 종료 후에, 물 또는 주정을 첨가하고 80℃~100℃로 가온하여 추출한 후 여과 및 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이때, 주정은 50~95% 주정을 사용할 수 있고, 여과는 막 필터 또는 원심분리기를 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 상기 방법으로 수득된 농축액은, 열풍분무건조, 동결건조, 또는 분무건조에 의해 건조 및 분말화할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하는데, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

<실시예 1>

인삼분말을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효인삼의 제조

국내산 인삼분말(panax ginseng, 4년근, 금산인삼시장) 50g을 물 100ml에 1시간 동안 침지시키고, 잡균제거를 위해 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 고압증기 멸균기로 멸균하였다. 멸균액을 30℃로 냉각한 다음, 알파 갈락토시다아제와 Saccharomyces Cerevisiae 효모를 각각 0.5g, 0.7g 접종하고, 45℃ 항온 배양기에서 5일간 발효하였다. 발효가 완료되고, 이를 여과하고 농축하여, 발효인삼 농축액 65brix로 42g을 수득하였다.

이에 물을 20brix까지 희석될 수 있도록 첨가한 후, 구연산 0.42g을 첨가하여 70℃ 온도조건 하에 48시간 교반하여 반응한 후, 농축하여 65brix의 농도로 농축액 38.7g을 획득하였다.

<실시예 2>

홍삼분말을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효홍삼의 제조

국내산 홍삼분말(panax ginseng, 5-6년근 금산인삼시장) 1kg을 50℃의 물 2L에 넣어 교반하였다. 이를 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 고압증기 멸균기로 멸균한 다음 30℃로 냉각하였다. 여기에 알파 갈락토시다아제와 Saccharomyces Cerevisiae 효모를 각각 50g, 70g 접종하고, 45℃ 항온 배양기에서 5일간 발효시켰다. 발효가 완료된 후 50% 주정을 첨가하고, 원심분리하여 여과한 다음, 상기 여과액을 발효홍삼 농축액 65brix로 680g을 수득하였다.

<실시예 3>

미국산 인삼분말을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효인삼의 제조

미국산 인삼분말(quinquefolim, 경동시장) 50g을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하여, 발효인삼농축액 65brix로 38g을 수득하였다.

<실시예 4>

중국산 인삼분말을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효인삼의 제조

중국산 인삼분말(notoginseng, 경동시장) 50g을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하여, 발효인삼농축액 65brix로 45g을 수득하였다.

<실시예 5>

히말라야 인삼분말을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효인삼의 제조

히말라야 인삼분말(pseudo-ginseng, 경동시장) 50g을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하여, 발효인삼농축액 65brix로 28g을 수득하였다.

<실시예 6>

베트남 인삼분말을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효인삼의 제조

베트남 인삼분말(vietnamensis, 경동시장) 50g을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하여, 발효인삼농축액 65brix로 30g을 수득하였다.

<실시예 7>

인삼잎을 이용한 본 발명의 방법에 따른 발효인삼의 제조

국내산 인삼잎(panax ginseng, 금산인삼시장) 1kg을 물 2L에 침지시킨 후, 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 멸균하고 30℃로 냉각하였다. 여기에 알파 갈락토시다아제와 Saccharomyces Cerevisiae 효모를 각각 50g, 70g 접종하고, 45℃ 항온 배양기에서 5일간 발효시켰다. 발효가 완료된 후 50% 주정을 첨가하고, 원심분리하여 여과한 다음, 상기 여과액을 발효홍삼 농축액 65brix로 520g을 수득하였다.

<실시예 8>

홍삼 엑기스를 이용한 본 발명에 따른 발효홍삼의 제조

국내산 홍삼 엑기스(panax ginseng, 6년근, 65brix. 다이식품) 200g을 50℃의 물 2L에 넣고 교반하였다. 이를 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 멸균하고 30℃로 냉각하였다. 여기에 알파 갈락토시다아제와 Saccharomyces Cerevisiae 효모를 각각 50g, 70g 접종하고, 45℃ 항온 배양기에서 5일간 발효시켰다. 발효가 완료된 후 50% 주정을 첨가하고, 원심분리하여 여과한 다음, 상기 여과액을 발효홍삼 농축액 65brix로 184g을 수득하였다.

<실시예 9>

인삼 엑기스를 이용한 본 발명에 따른 발효인삼의 제조

국내산 인삼 엑기스(panax ginseng, 6년근, 바산) 200g을 이용하여 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 발효인삼을 제조함으로써, 발효인삼 농축액을 65brix로 192g을 수득하였다.

<수율 및 함량분석 실험>

이하, HPLC를 이용한 발효인삼의 사포닌 함량 분석을 위한 실험을 행하였다.

이를 위해 먼저, 실시예 2의 발효홍삼(단, 실시예1~9의 어느 발효삼을 이용하더라도, 수율의 향상이 판정됨), 비교예로서 발효홍삼, 발효하지 않은 인삼 및 홍삼을 각각 80% 주정에 넣고, 50℃에서 중탕하여 조사포닌을 추출하고, 이 추출물을 감압 농축하였다. 유리 컬럼에 물로 팽윤시킨 HP-20 (일본 Diaion 사)을 충진하고, 여기에 상기 감압 농축된 조사포닌 추출물을 통과시켜, 상기 추출물이 HP-20에 흡착되도록 하였다. 여기에, 충진제의 2-3배의 물을 첨가하여 세척함으로써, 흡착된 사포닌 외의 성분을 제거한 후, 흡착된 사포닌을 주정을 이용하여 탈착하여 회수하였다. 회수된 조사포닌 추출물을 농축한 후, 부탄올을 이용하여 층 분리하고, 부탄올 층을 감압 농축하였다. 상기 각각의 부탄올 층을 HPLC로 분석하였다.

HPLC 분석조건으로는, Agilent 1100 series HPLC 시스템(독일 Agilent 사)을 사용하였고, 컬럼은 Agilent XDB-C18(4.6×150mm, 5micron), 컬럼의 오븐온도는 30℃, 샘플의 로딩양은 20㎕로 하였다. 이동상으로는 20% 아세코니트릴에서 80% 아세토니트럴을 135분간 농도구배 하였다. 유속은 분당 1ml로 하였으며, 컬럼 세척은 100℃ 아세토니트릴로 10분간 세척하였고, 203nm에서 검출하였다.

<최종산물의 종류>

본 발명의 방법으로 제조된 발효삼은, 발효 혹은 발효와 산 처리에 의해 당이 가수분해된 저분자 진세노사이드를 함유한다.

상기 저분자 사포닌으로는, 20S-프로토파낙스디올 3,20-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxdiol 3,20-O-β-D-glucopyraniside; 이하 F2), 20S-프로토파낙스트리올 20-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxtriol 20-O-β-D-glucopyraniside; 이하 F1), 20S-프로토파낙스트리올 3-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxtriol 3-O-β-D-glucopyraniside; 이하 Rh1), 20S-프로토파낙스디올 3-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxtriol 3-O-β-D-glucopyraniside; 이하 Rh2), 20S-프로토파낙스디올 20-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxdiol 20-O-β-D-glucopyraniside; 이하 컴파운드 K), 20S-프로토파낙스디올 (20S-protopanaxdiol ; 이하 PPD), 20S-프로토파낙스디올 (20S-protopanaxtriol ; 이하 PPT) 등이 포함될 수 있다. 이들 화합물은 항암, 혈압조절, 항당뇨, 콜레스테롤저하, 인지기능향상, 성기능개선, 항알러지, 면역증강 활성 등의 약리활성을 갖고 있음이 많은 연구 결과를 통해 보고되고 있다.

<수율 또는 함유량>

또한, 본 발명에 따른 발효삼은, 바람직하게는 상기 저분자 진세노사이드 함량이 전체 진세노사이드 함량에 대해 50~80%의 양으로 함유(표 1 참조)되어 있는 것을 특징으로 한다.

그리고, 본 발명의 발효삼 제조방법을 이용하여 제조된 발효홍삼(도 4)의 진세노사이드 함량을, 박층 크로마토그래피와 고성능 액체 크로마토그래피(도 5 참조)를 이용하여, 발효하지 않은 인삼 및 홍삼(도 2)과 기존의 발효홍삼(도 3)과 비교하였다(표 1). 그 결과, 발효하지 않은 인삼 및 홍삼(도 2)과 기존의 발효홍삼(도 3)에는, 전혀 함유되어 있지 않거나 혹은 함유되어 있더라도 미량만 함유되어 있는 상기 유용한 저분자 진세노사이드의 함량이, 본원발명을 이용한 방법에 의한 최종산물(도 4)에서는, 증가되었음을 확인할 수 있었다.

<HPLC 분석>

이어서 실험 결과물을 HPLC를 이용하여 분석하기 위하여 진세노사이드의 표준품을 HPLC로 분석하고 이를 이용 정량분석(도 1)한다.

실시예 2에서 홍삼분말을 이용하여 본 발명의 방법에 따라 제조한 발효홍삼(도 4)의 사포닌 함량과 비교예로서 일반적인 발효홍삼(도 3)과 발효하지 않은 인삼, 홍삼(도 2)의 사포닌 함량을 HPLC로 분석하여 비교하였다.

실험 결과, 본 발명에 따른 발효홍삼(도 4)의 경우, 발효하지 않은 인삼 또는 홍삼(도 2)에 비해 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re, Rf의 농도는 감소한 반면, 발효하지 않은 인삼 또는 홍삼(도 2)에 미량으로만 함유되어 있었던 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rh2 및 프로토파낙사디올의 농도는 크게 증가(도 2, 도 3, 도 4, 도 5 및 표 1 참조)한 것으로 나타났다. 참고로, 발효효소 없이 효모만을 접종하여 발효를 시도한 경우(특허문헌 4)에, 문헌에서의 설명과 달리 발효반응이 진행되지 않아서, 컴파운드 K 등의 저분자 진세노사이드는 거의 검출되지 않았다.

또한, 효모 없이 단일 효소를 투입하여 발효한 발효인삼 및 발효홍삼(도 3)과 본 발명에 따라 효소 및 효모를 동시 투입하여 발효한 발효홍삼(도 4)과의 비교에서 보면, 본 발명에 따른 발효홍삼(도 4)에는 특정 진세노사이드 중 특히 F2 및 Rd의 함량이 상대적으로 적은 반면, Compound-K 및 프로토파낙사디올의 함량은 월등히 높은 것으로 나타나서, 발효에 있어서 최종산물로의 전환이 용이하다는 것을 나타낸다 할 수 있겠다. 이는 홍삼이나 인삼에 함유되어 있는 분자량이 큰 사포닌 화합물 (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re, Rf)이 효소와 효모의 작용에 의해 당 가수분해되어, 분자량이 작은 Rd나 진세노사이드 F2로 전환된 뒤, 침전되지 아니하고 바로 다음 단계의 발효가 실행되어, 최종산물인 Compound-K 및 프로토파낙사디올로 전환되었음을 보여 주는 것(도 6 참조)이다.

이상, 특정한 실시예를 따라서 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 이 구체적인 실시예에 한정되는 것이 아니고, 이하의 청구범위에 기재되는 사항과 동일성을 가지는 변형, 변경, 개량은 모두 본 발명에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명은, 저분자 진세노사이드의 제조, 내지는 이를 포함하는 발효삼의 제조에 이용될 수 있다.

A : 홍삼농축액
B : 효소 첨가발효 홍삼농축액
C : 효소 및 효모첨가 발효 홍삼농축액

Claims (8)

1. 고분자 진세노사이드의 분자구조로부터 당을 분리시켜서 저분자화시키는 발효효소 또는 상기 발효효소를 내는 발효균주를 투입하여 발효반응시킴으로써 저분자 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서,
   상기 발효반응에 의하여 분리된 당을 이용하여 알코올을 생성하는 알코올발효균주를 투입하고,
   상기 저분자화 과정에서 생기는 중간산물 중 저용해도의 물질을 상기 알코올에 용해시켜서, 침전을 억제함
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 발효효소는, 베타 글루코시다아제, 락타아제, 및 알파 갈락토시다아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상임
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 알코올발효균주는, 자낭균강(子囊菌綱; Ascomycetes)의 효모임
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 효모는, Saccharomycoideae과의 Saccharomyces Cerevisiae 효모, Saccharomyces Carlsbergensis 효모, Sachizoccharomycoideae과의 Sachizoccharomyces Octosporus 효모, 및 Sachizoccharomyces Pombe 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상임
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 발효반응의 최종산물은, 20S-프로토파낙스디올 3,20-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxdiol 3,20-O-β-D-glucopyraniside; F2), 20S-프로토파낙스트리올 20-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxtriol 20-O-β-D-glucopyraniside; F1), 20S-프로토파낙스트리올 3-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxtriol 3-O-β-D-glucopyraniside; Rh1), 20S-프로토파낙스디올 3-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxtriol 3-O-β-D-glucopyraniside; Rh2), 20S-프로토파낙스디올 20-O-β-D글루코피라노시드 (20S-protopanaxdiol 20-O-β-D-glucopyraniside; 컴파운드 K), 20S-프로토파낙스디올 (20S-protopanaxdiol ; PPD), 20S-프로토파낙스디올 (20S-protopanaxtriol ; PPT) 중의 적어도 하나를 포함하는 것
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 발효반응의 종료 후에, 상기 알코올발효균주에 의하여 생성된 알코올을 제거하고,
   그 잔존물에 유기산에 의한 처리를 더욱 시행하여, 상기 유기산에 의하여 결정되는 종류의 저분자 진세노사이드를 선택적으로 생산하는 것
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 유기산에 의하여 결정되는 종류의 저분자 진세노사이드는, ginsenoside-Rh1, ginsenoside-Rh2, PPT, 및 PPD 중의 적어도 하나를 포함하는 것
   을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드의 제조방법.
8. 인삼, 홍삼, 장뇌삼 또는 산삼이나 그 추출물, 분말에 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 방법을 적용하여, 저분자 진세노사이드가 함유된 발효삼을 제조하는 방법.

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