KR101855280B1 - 베타-글라이코시다아제에 고활성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소의 첨가에 의한 고수율 진세노사이드 컴파운드 k의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용하여 고수율의 진세노사이드 컴파운드 K를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 혼합 효소를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다. 특히, 본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 사용하면, 70℃ 이상의 고온에서도 반응을 수행할 수 있어 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시킬 수 있고, 동시에 주요 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 C-K로 전환함에 있어서 다른 부산물을 생산하지 않아 빠르고 특이적인 C-K 전환 반응이 가능하여 생산 수율을 증가시켜 고수율의 C-K를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 C-K 생산 방법은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

베타-글라이코시다아제에 고활성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소의 첨가에 의한 고수율 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법 {Preparation method of ginsenoside compound K with a high yield using β-glycosidase supplemented with a high activity α-L-arabinofuranosidase}

본 발명은 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제 효소를 이용하여 고수율의 진세노사이드 컴파운드 K를 생산하는 방법에 관한 것이다.

β-글리코시다아제는 올리고당이나 배당체의 글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하여 글루코오스를 생성하는 효소를 의미한다. 진세노사이드는 기본 구조에 글루코오스와 기타 당들의 결합으로 이루어져 있는데 고온성 β-글리코시다아제는 인삼뿌리 추출물에서 글루코오스 및 아라비노스 부분을 가수분해 함으로 목적하는 진세노사이드를 생산 하는데 사용될 수 있다. 또한 이 β-글리코시다아제는 미생물에서부터 고등 동식물에 이르기까지 넓은 범위에서 발견되는 효소이기도 하다.

진세노사이드 컴파운드 K(ginsenoside compound K, C-K)는 하기 [화학식 1]로 표기 되는 화합물이다. 인삼에 풍부하게 포함된 성분으로서 잘 알려진 진세노사이드 화합물 중에서, C-K는 극미량 포함되어있는 희귀한 성분이기 때문에, 인삼에 대량 포함된 주요 진세노사이드인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd로부터 글루코오스(glucose) 및 아라비노스(arabinose)를 선택적으로 가수분해하여 생전환된 C-K를 생산할 수 있다.

C-K의 효과로는 면역증각작용, 종양 혈관 신생 작용 억제작용, 암세포 침윤 억제작용, 암세포 증식 억제작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 피부 내에서 단백질과 점성 용액이나 겔을 형성하여 조직구조의 유지 및 윤활작용 등을 하는 히알루론산(hyaluronic acid)의 생성에 큰 영향을 주어 주름 개선 효과가 있는 것으로 알려져 화장품 산업에 크게 이용되고 있다. 이에 따라, C-K를 건강식품, 화장품 산업 분야에 있어 안정적이고 효율적으로 생산할 수 있는 공정이 보다 요구되고 있다.

[화학식 1]

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기존 C-K는 10 내지 50 ℃ 범위의 중온성 효소를 이용하여 생산되고 있지만, 이 효소는 낮은 반응 온도에서 작용하기 때문에 미생물에 오염되기 쉽고 생산 수율도 떨어지는 문제점이 있다. 따라서, 산업적으로 유용하며 고수율의 C-K를 생산할 수 있는 고온성 효소를 개발하는 것이 절실히 필요하다. 고온성 효소를 사용하여 C-K를 합성하는 것과 관련하여, 고온성 베타-글리코시다제 효소를 이용하여 C-K 및 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol)의 생산 방법에 관하여 보고된 바 있다(특허문헌 002 내지 특허문헌 006). 그러나 최근 C-K 생산에 관련하여 비교적 수율이 높다고 보고된 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래 β-글리코시다아제(β-glycosidase)의 경우에도, 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd 및 컴파운드 엠시(Mc)로 전환하는 반응이 동시에 나타나, Mc의 축적으로 인해 C-K로의 100% 전환이 되지 않는다는 제한점이 있다.

수율에 한계가 있는 것은 베타-글리코시다아제가 진세노사이드의 아라비노퓨라노스 잔기를 잘 분해시키지 못하여 발생한 결과이다. 이에, 최근에 β-글리코시다아제(β-glycosidase)와 α-L-아라비노퓨라노시다아제(α-L-arabinofuranosidase) 두 가지 효소를 혼합하여 프로토파낙사디올형태의 진세노사이드에 대한 C-K의 몰 수율을 100% 근처까지 올린 보고가 있다 (비특허문헌 0002). 그러나, 상기 보고에서 사용한 α-L-아라비노퓨라노시다아제 효소는 재조합 대장균에서 잘 발현되지 않고 활성이 낮아 아라비노퓨라노스 잔기를 함유된 진세노사이드 Rc로부터 컴파운드 케이로의 전환 과정에서 효소 준비에 어려움이 많아 산업화에 한계가 있다.

따라서, 본 발명자들은 β-글리코시다아제와 α-L-아라비노퓨라노시다아제 두 가지 효소를 혼합하여 보다 고수율의 C-K 생산 방법을 제공하기 위해 노력을 계속한 결과, 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 유전자 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제 유전자를 형질전환 미생물에서 과발현하고, 이들 효소를 동시에 홍삼 추출물 및 미삼 추출물과 반응시켜 이로부터 C-K를 생합성한 결과, 높은 반응온도에서 빠른 속도로 C-K를 합성할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2016-0031245 A (2016.03.22) KR 10-1079293 B2 (2011.10.27) KR 10-1210453 B2 (2012.12.04) KR 10-1156204 B2 (2012.06.07) KR 10-1210454 B2 (2012.12.04)

Kyeong-Hwan Noh et al. (2009) Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 73(2), 316-321. Kyung-Chul Shin et al. PLoS One 10(12), e0145876, 2015). Kim SK, Kwak YS, Kim SW, Hwang YS, Ko ys, Yoo CM : Improved method for the preparation of crude ginseng saponin. J. Ginseng Res 1988;22;155-160

이에, 본 발명자들은 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 사용하였을 때 진세노사이드 화합물을 진세노사이드 컴파운드 K로 전환할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고온성 미생물 유래의 고온성 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용하여 고수율의 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 i) 내지 iv)의 단계를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법을 제공한다:

i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 β-글리코시다제 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 α-L-아라비노퓨라노시다제를 혼합하여 효소액을 준비하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 준비한 효소액을 삼(ginseng) 추출물 또는 반응 배지에 첨가하여 반응액을 제조하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 제조한 반응액을 반응시키는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K를 분리하는 단계.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 단계 i)의 β-글리코시다아제는 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 단백질인 것일 수 있고, 상기 단계 i)의 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 단백질인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 혼합은 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 40:1 내지 1250:1(w/v:w/v)의 비율로 혼합하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 단계 ii)의 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼을 용매 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 단계 ii)의 반응 배지는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 단계 ii)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것일 수 있고, 70 내지 90℃에서 수행하는 것일 수 있으며, 1 내지 40 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 초고온성 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다. 특히, 본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 사용하면, 70℃ 이상의 고온에서도 반응을 수행할 수 있어 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시킬 수 있고, 동시에 주요 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 C-K로 전환함에 있어서 다른 부산물을 생산하지 않아 빠르고 특이적인 C-K 전환 반응이 가능하여 생산 수율을 증가시켜 고수율의 C-K를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 C-K 생산 방법은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제 또는 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 각각 발현한 형질전환 대장균에서 발현된 단백질의 발현 수준 및 상대 활성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 홍삼 추출물을 기질로 하였을 때 2 mg/ml β-글리코시다아제에 의한 진세노사이드 C-K의 생산량을 나타낸다.
도 3은 β-글리코시다아제의 농도를 2 ㎎/㎖로 고정하였을 때, 혼합하는 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 농도 변화에 따라 주요 진세노사이드로부터 C-K로 생전환된 생산량 변화를 나타낸다.
도 4는 홍삼 추출물을 기질로 하였을 때 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 혼합에 따른 C-K의 생산량을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 인삼 내 사포닌 성분 중 극미량 포함되어있는 희귀 진세노사이드인 컴파운드 K는 의약산업, 식품산업 및 화장품 산업 등에서 다양하게 사용할 수 있으나 희귀 성분이므로, 고수율로 전환 생산하는 공정의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용하였을 때, 인삼 추출물 내의 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 i) 내지 iv)의 단계를 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법을 제공한다:

i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 β-글리코시다제 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 α-L-아라비노퓨라노시다제를 혼합하여 효소액을 준비하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 준비한 효소액을 삼(ginseng) 추출물 또는 반응 배지에 첨가하여 반응액을 제조하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 제조한 반응액을 반응시키는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 반응 산물루보터 진세노사이드 컴파운드 K를 분리하는 단계.

본 발명의 단계 i)의 β-글리코시다아제는 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 단백질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 β-글리코시다아제는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.

본 발명의 단계 i)의 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 단백질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.

본 발명의 β-글리코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 β-글리코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+), pET-24a(+) 또는 pET-21a 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환된 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단계 i)의 혼합은 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 40:1 내지 1250:1(w/v:w/v:)의 비율로 혼합하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 구체적으로 50:1 내지 1000:1(w/v:w/v:)의 비율로 혼합하는 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 60:1 내지 100:1(w/v:w/v:)의 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다. 그러나, 본 발명에서 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 C-K 합성을 위한 조합으로 사용한다는 점에서, 배지 내 C-K 합성이 효과적으로 나타날 수 있는 비율이라면 어떠한 비율로 혼합하여도 무방하다. 다만, β-글리코시다아제 및/또는 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 첨가 농도가 증가하면 효소 생산 단가가 증가하여, 전체적인 C-K 생산 공정의 단가가 상승하게 되므로, β-글리코시다아제 및/또는 α-L-아라비노퓨라노시다아제가 최대한 적게 포함되는 선에서 최선의 C-K 합성 효과를 얻을 수 있는 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 단계 ii의 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼을 용매 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 용매 추출은 물, C1내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것일 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 단계 ii)의 반응 배지는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 단계 iii)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 pH 4.5 내지 6.5에서 수행하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 pH 5.5에서 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제가 효율적으로 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)를 생산할 수 있는 활성이 유지되는 pH 범위라면 어떤 조건에서 수행하여도 무방하다.

본 발명의 단계 iii)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 70 내지 80℃에서 수행하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 75 내지 80℃에서 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제가 효율적으로 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)를 생산할 수 있는 활성이 유지되는 온도 범위라면 어떤 조건에서 수행하여도 무방하다.

본 발명의 단계 iii)의 반응은 1 내지 40 시간 동안 수행하는 것이 바람직하고, 구체적으로 10 내지 20 시간 동안 수행하는 것이 더욱 바람직하며, 보다 구체적으로 10 내지 15 시간 동안 수행하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 반응액 내에 포함된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd가 전부 C-K로 전환될 수 있는 시간 범위에서 자유롭게 조절할 수 있다. 다만, 본 발명의 효소 반응 공정의 시간을 단축하였을 때 생산성이 높아지고 단가가 저렴해 효과적이라는 측면에서, 짧은 반응 시간 동안 최대 전환수율을 나타낼 수 있는 조건의 범위를 선택하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 C-K 합성 반응에 이용하기 위해, β-글리코시다아제 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제조하여 형질전환한 대장균으로부터, β-글리코시다아제를 과발현하였다. 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 발현 수준은, 동일한 조건으로 과발현한 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제에 비해 상대적 활성이 약 33배 증가한 수준을 나타내므로, 본 발명의 C-K 생산 반응에 효과적일 것으로 확인하였다(도 1).

또한, 본 발명자들은 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제만을 단독으로 사용하여 C-K 합성 반응을 수행한 결과, 진세노사이드 Rc 및 컴파운드 Mc가 반응액 내에 잔존하여 C-K의 생산 수율이 증가하지 못하고 제한되는 것을 확인하였다(도 2).

또한, 본 발명자들은 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 혼합하여 C-K 합성 반응을 진행하였을 때, 80:1(w/v:w/v) 이상의 비율로 효소를 혼합하였을 때 C-K의 합성이 99.9% 이상 나타날 수 있음을 확인하였다(도 3 및 도 4). 특히, 본 발명의 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 사용하면, 적은 효소량을 이용하여 빠른 생물전환을 촉매할 수 있어 고수율의 C-K를 생산할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제 효소를 이용하였을 때, 주요 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)로 전환할 수 있다. 특히, 본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 효소를 사용하면, 적은 효소량을 사용하여 고수율의 C-K를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 C-K 생산 방법은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

고온성 설포로버스 솔파타리쿠스 ( Sulfolobus solfataricus ) 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠 ( Dictyoglomus turgidum ) 유래의 α-L- 아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase)의 발현

<1-1> 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명의 고온성 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 제조하기 위하여, 설포로버스 솔파타리쿠스 및 딕티오클로무스 툴기둠의 유전자로부터 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 암호화하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제를 암호화하는 유전자(Genebank 번호: M34696, 서열번호 1) 및 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제(Genebank 번호: CP001251, 서열번호 2)를 증폭하기 위한 적절한 프라이머를 제작하였다. 그리고, 설포로버스 솔파타리쿠스 및 딕티오클로무스 툴기둠을 각각 배양하여 이로부터 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 각각의 유전체 DNA로부터 적절한 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제를 암호화하는 유전자 및 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 암호화하는 유전자를 증폭하였다. 발현 벡터는 pET-24a(+) 및 pET-21a를 사용하였으며, 제한효소 없이 ligation하여 제작한 발현 벡터를 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 및 pET-21a/α-L-아라비노퓨라노시다아제로 명명하였다. 그런 다음, pET-24a(+)/β-글리코시다아제 및 pET-21a/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 대장균 BL21(DE3) ER2566에 형질전환하고, 상기 형질전환된 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-21a/α-L-아라비노퓨라노시다아제 균주로 명명하였다. 형질전환된 재조합 대장균은 C-K의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에는 20% 글리세린 용액을 첨가하여 -70 ℃에 냉동 보관하였다.

<1-2> 고온성 β-글리코시다아제 및 α-L- 아라비노퓨라노시다아제의 발현 및 제조

효소의 단백질 발현을 위해 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 균주 및 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-21a/α-L-아라비노퓨라노시다아제 균주를 각각 50 ㎖의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지를 포함하는 250 ㎖ 플라스크에 접종하고, 37℃에서 종균배양하였다. 종균배양한 재조합 대장균의 흡광도가 600 nm에서 2.0이 되면 배양액을 500 ㎖의 LB 배지를 포함하는 250 ㎖ 플라스크에 접종하여 배양하고 재조합 대장균의 흡광도가 600 nm에서 0.6에서 0.8에 도달할 때, β-글리코시다아제의 과발현을 유도하기 위하여 최종농도 0.1 mM IPTG를 첨가한 후 그 배양액을 16시간 동안 16℃에서 150 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 또한 상기와 같이 생산된 고온성 베타-글라이코시다아제 와 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소를 정제하기 위하여, 상기 형질전환 된 균주들의 배양액을 4,000×g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리 한 다음 상기 세포 용액을 프렌치 프레서로 15,000 lb/in²에서 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 고온인 75℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 그 결과 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 진세노사이드 컴파운드 케이의 생산에 사용될 수 있는 효소액으로 분리하였다.

<1-3> 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L- 아라비노퓨라노시다아제의 발현 수준 확인

두 가지의 효소를 함께 사용하여 C-K를 생산하는 방법에 있어서, 기존 보고된 연구에서는 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 사용하였으나, 재조합 대장균에서 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 발현 수준이 낮고 활성이 높지 않아 생산 수율의 저해를 가져올 수 있었다(비특허문헌 002, 특허문헌 001). 이에, 본 발명의 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제가 종래 보고된 연구보다 C-K 생산에 적합할 수 있는지를 확인하기 위하여, 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 각각 재조합 대장균에서 발현하고 활성을 비교하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제보다 단백질 발현 수준이 현저히 상승하였으며, 상대적인 활성이 약 33 배 증가하였으므로, 본 발명의 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 사용하는 것이 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 사용하는 것보다 높은 수준의 활성을 통해 C-K 생산성이 증가할 수 있을 것으로 확인하였다(도 1).

고온성 β-글리코시다아제의 효소를 이용한 C-K의 생산

본 발명에서 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 동시에 사용하여 C-K를 생산하는 반응을 수행하기 전에, 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제를 단독으로 사용하였을 때의 C-K 생산 효율을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 배양 기질인 홍삼추출물의 제조는 MeOH/water mixture (4:1 v/v) 1 l 에 100 g 의 건조된 홍삼 가루를 넣고 80 ℃에서 1시간 동안 추출한 후 필터링과 농축을 거쳐 1 ℓ의 2차 증류수에 녹여 실험에 사용하였다(비특허문헌 003). 그런 다음, pH 5.5 환경의 10% 홍삼뿌리 추출물에 β-글리코시다아제를 15 ㎎/㎖ 농도로 가하였다. 그런 다음, 75 ℃에서 12 시간 동안 반응을 유도하여 C-K를 합성하였다. 반응 후, 반응액을 수득하고 HPLC 분석하여 합성된 C-K의 생산량을 구하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제를 단독으로 사용하였을 때 홍삼 추출물 내의 진세노사이드 성분이 C-K로 전환되어 농도가 증가하였으나, 이와 동시에 프로토파낙사다이올계 사포닌 중 진세노사이드 Rc 및 컴파운드 Mc가 반응액 내에 잔존하여 C-K의 생산 수율이 증가하지 못하고 제한되는 것을 확인하였다(도 2).

고온성 β-글리코시다아제와 고온성 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 진세노사이드 컴파운드 K(C-K)의 생산

<3-1> β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 최적 혼합 비율의 확인

본 발명에서 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 동시에 사용하여 C-K를 생산하는 반응을 수행하기 위하여, β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 최적 혼합 비율을 먼저 확인하였다.

구체적으로, 약 7.5 mg/ml의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 홍삼추출물 및 50 mM 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액(pH 6.0)을 혼합하고, 상기 실시예 <1-2>에서 분리 정제한 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 혼합 효소를 처리하여 C-K 생산 반응을 12 시간 동안 수행하였다. 상기 혼합 효소 처리를 위해, β-글리코시다아제는 2 ㎎/㎖로 처리 농도를 고정하였으며, α-L-아라비노퓨라노시다아제는 0.0016 내지 0.05 ㎎/㎖의 처리 농도 범위로 효소를 혼합하였다. 12 시간의 반응 후, 반응액을 수득하고 HPLC 분석하여 컴파운드 Mc의 잔존량을 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 β-글라이코시다아제를 2 mg/ml로 고정하였을 때 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 농도가 증가할수록 반응액 내 컴파운드 Mc의 잔존량이 유의적으로 감소하여, α-L-아라비노퓨라노시다아제를 0.025 mg/ml이상 처리하였을 때 12 시간 반응동안 컴파운드 Mc가 모두 전환될 수 있음을 확인하였다.

<3-2> β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 혼합에 따른 C-K 생산성 확인

고온성 β-글라이코시다아제와 고활성 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 이용한 진세노사이드 C-K의 생산 방법을 개발하기 위해, 최적 혼합 비율로서 확인한 효소농도를 적용하여 2.0 mg/ml β-글리코시다아제 및 0.025 mg/ml α-L-아라비노퓨라노시다아제를 혼합한 효소액을 홍삼 추출물 및 미삼 추출물에 가하여 C-K의 시간별 생산량을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 홍삼 추출물 및 미삼 추출물 내의 진세노사이드는 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제에 의해 C-K로 전환되어 12 시간에 반응액 내 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd 및 컴파운드 Mc의 농도가 감소하고 C-K의 농도가 증가하여, 최종 생산량을 4.0 ㎎/㎖ 이상으로 나타내는 것을 확인하였다(도 4).

종래 보고된 연구들에 의하면, C-K 생산을 위해 β-글리코시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 혼합 효소를 사용하는 방법 중 가장 높은 생산성을 나타내는 것은 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제 및 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 사용하는 조합인 것으로 알려져 있다(특허문헌 0001, 비특허문헌 0002). 보고에 따르면, 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제(2.3 ㎎/㎖) 및 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제(0.39 ㎎/㎖)를 사용하는 경우, 7.5 ㎎/㎖의 프로토파낙사다이올계 사포닌이 함유된 홍삼 추출물에서 12 시간 동안 최종 4.2 ㎎/㎖ C-K 생산량을 나타낼 수 있음이 보고된 바 있다.

이를 본 발명의 설포로버스 솔파타리쿠스 유래의 β-글리코시다아제 및 딕티오클로무스 툴기둠 유래의 α-L-아라비노퓨라노시다아제의 조합과 비교하였을 때, 본 발명의 효소 조합은 기존 보고된 효소 조합에 비해 1.3 배 낮은 농도의 효소를 사용하면서 그 중 C아라비노퓨라노시다아제의 농도는 16 배 낮게 사용하였다. 그러나, 본 발명의 효소 조합을 통해 C-K의 생산성은 약 1.2 배 증가된 수준을 나타내어, 본 발명의 효소 농도당 C-K의 생산성은 기존 보고된 효소조합에 비해 약 1.6 배 증가된 수준의 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Preparation method of ginsenoside compound K with a high yield using b-glycosidase supplemented with a high activity a-L-arabinofuranosidase <130> 1061543 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 489 <212> PRT <213> Sulfolobus solfataricus <400> 1 Met Tyr Ser Phe Pro Asn Ser Phe Arg Phe Gly Trp Ser Gln Ala Gly 1 5 10 15 Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn Thr Asp 20 25 30 Trp Tyr Lys Trp Val His Asp Pro Glu Asn Met Ala Ala Gly Leu Val 35 40 45 Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp Gly Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Phe His Asp Asn Ala Gln Lys Met Gly Leu Lys Ile Ala Arg Leu 65 70 75 80 Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Asn Pro Leu Pro Arg Pro Gln 85 90 95 Asn Phe Asp Glu Ser Lys Gln Asp Val Thr Glu Val Glu Ile Asn Glu 100 105 110 Asn Glu Leu Lys Arg Leu Asp Glu Tyr Ala Asn Lys Asp Ala Leu Asn 115 120 125 His Tyr Arg Glu Ile Phe Lys Asp Leu Lys Ser Arg Gly Leu Tyr Phe 130 135 140 Ile Leu Asn Met Tyr His Trp Pro Leu Pro Leu Trp Leu His Asp Pro 145 150 155 160 Ile Arg Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Gly Pro Ser Gly Trp Leu Ser 165 170 175 Thr Arg Thr Val Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Ile Ala Trp 180 185 190 Lys Phe Asp Asp Leu Val Asp Glu Tyr Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn 195 200 205 Val Val Gly Gly Leu Gly Tyr Val Gly Val Lys Ser Gly Phe Pro Pro 210 215 220 Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Leu Ser Arg Arg His Met Tyr Asn Ile Ile 225 230 235 240 Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Gly Ile Lys Ser Val Ser Lys Lys 245 250 255 Pro Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Ser Ser Phe Gln Pro Leu Thr Asp 260 265 270 Lys Asp Met Glu Ala Val Glu Met Ala Glu Asn Asp Asn Arg Trp Trp 275 280 285 Phe Phe Asp Ala Ile Ile Arg Gly Glu Ile Thr Arg Gly Asn Glu Lys 290 295 300 Ile Val Arg Asp Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp Trp Ile Gly Val Asn 305 310 315 320 Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Lys Arg Thr Glu Lys Gly Tyr Val Ser 325 330 335 Leu Gly Gly Tyr Gly His Gly Cys Glu Arg Asn Ser Val Ser Leu Ala 340 345 350 Gly Leu Pro Thr Ser Asp Phe Gly Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu 355 360 365 Tyr Asp Val Leu Thr Lys Tyr Trp Asn Arg Tyr His Leu Tyr Met Tyr 370 375 380 Val Thr Glu Asn Gly Ile Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr 385 390 395 400 Tyr Leu Val Ser His Val Tyr Gln Val His Arg Ala Ile Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu 420 425 430 Trp Ala Ser Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr 435 440 445 Asn Thr Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg Glu 450 455 460 Ile Ala Thr Asn Gly Ala Ile Thr Asp Glu Ile Glu His Leu Asn Ser 465 470 475 480 Val Pro Pro Val Lys Pro Leu Arg His 485 <210> 2 <211> 824 <212> PRT <213> Dictyoglomus turgidum <400> 2 Met Asn Lys Arg Leu Leu Ile Ile Phe Phe Ile Ile Phe Leu Val Met 1 5 10 15 Pro Phe Ile Leu Glu Gly Asn Asp Glu Thr Thr Asp Val Leu Glu Ile 20 25 30 Asp Leu Ser Lys Lys Gly Ile Glu Ile Ser Pro Asn Leu Tyr Gly Ile 35 40 45 Phe Phe Glu Asp Ile Asn Tyr Ala Gly Asp Gly Gly Leu Tyr Ala Glu 50 55 60 Leu Ile Gln Asn Arg Ser Phe Glu Phe Pro Asp Pro Met Tyr Ser Trp 65 70 75 80 Ser Ile Asn Val Met Gly Lys Asp Lys Ala Gly Tyr Val Ile Glu Lys 85 90 95 Lys Asp Pro Val Ser Thr Lys Asn Pro Asn Tyr Leu Arg Ile Val Ile 100 105 110 Ser Ser Leu Asp Lys Gly Val Leu Leu Ser Asn Gln Gly Tyr Gln Gly 115 120 125 Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Tyr Tyr Ile Val Thr Leu Tyr Ala Arg 130 135 140 Ser Pro Asp Gly Ser Ile Lys Asn Ile Asn Phe Glu Val Ser Asn Arg 145 150 155 160 Lys Gly Asn Val Ala Phe Lys Asp Phe Ile Ser Asp Ile Asp Arg Lys 165 170 175 Trp Lys Lys Phe Glu Lys Val Ile Met Cys Asn Gln Asp Ile Asp Asp 180 185 190 Gly Arg Phe Val Ile Leu Ile Lys Glu Lys Gly Thr Val Asp Leu Asp 195 200 205 Phe Ile Ser Leu Phe Pro Gln Asn Thr Trp Lys Glu Arg Lys Asn Gly 210 215 220 Leu Arg Phe Asp Leu Val Lys Trp Leu Tyr Asp Leu Lys Pro Ser Phe 225 230 235 240 Met Arg Phe Pro Gly Gly Cys Leu Val Gln Gly Arg Asn Met Asn Glu 245 250 255 Ala Tyr Arg Trp Lys Phe Thr Ile Gly Asp Pro Leu Glu Arg Pro Thr 260 265 270 Ile Pro Asn Phe Trp Gly Tyr Tyr Gln Ser Leu Gly Leu Gly Phe Tyr 275 280 285 Glu Tyr Phe Leu Leu Cys Glu Asp Leu Gly Ala Glu Pro Ile Pro Val 290 295 300 Ile Asn Cys Gly Met Ser Phe Gln Gly Gly Ser Tyr Thr Asp Met Val 305 310 315 320 Pro Leu Asp Lys Leu Asp Glu Tyr Ile Gln Asp Ala Leu Asp Leu Ile 325 330 335 Glu Phe Ala Asn Gly Ser Val Asp Thr Lys Trp Gly Ser Ile Arg Ala 340 345 350 Lys Leu Gly His Pro Glu Pro Phe Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ile Gly 355 360 365 Asn Glu Gln Trp Gly Pro Glu Tyr Tyr Val Arg Tyr Glu Lys Phe Tyr 370 375 380 Asp Ala Ile Lys Lys Lys Tyr Pro Tyr Ile Lys Val Ile Phe Gly Val 385 390 395 400 Gly Pro Ser Pro Ser Gly Lys Ile Phe Asp Asp Gly Trp Asn Trp Val 405 410 415 Lys Lys Thr Gly Lys Ala Asp Leu Val Asp Glu His Tyr Tyr Met Ser 420 425 430 Pro Glu Trp Phe Leu Asn Asn Val Asp Arg Tyr Ser Thr Tyr Asp Arg 435 440 445 Lys Gly Pro Lys Val Tyr Val Gly Glu Tyr Ala Ala His Gly Val Gly 450 455 460 Arg Arg Asn Asn Leu Glu Ala Ala Leu Ser Glu Ala Ala Tyr Leu Leu 465 470 475 480 Asn Ile Glu Lys Tyr Ser Asp Ile Val Ser Met Ile Ser Tyr Ala Pro 485 490 495 Leu Phe Gly Lys Glu Gly Ala Ser Gln Trp Gln Pro Asn Leu Ile Trp 500 505 510 Phe Asn Asn Arg Ser Ser Tyr Ala Thr Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Lys 515 520 525 Ile Leu Asn Glu Asn Lys Gly Lys Tyr Val Leu Pro Phe Lys Leu Leu 530 535 540 Thr Leu Lys Asp Lys Ala Asp Glu Val Ile Ser Gly Met Ile Gly Leu 545 550 555 560 Gly Ser Trp Gln Thr Ser Val Glu Tyr Lys Asp Leu Arg Val Ile Ser 565 570 575 Asn Ile Thr Gly Glu Val Leu Tyr Lys Asp Asn Phe Ile Asp Thr Leu 580 585 590 Lys Asn Trp Thr Ile Ala Arg Gly Ile Trp Thr Ile Lys Asn Gly Val 595 600 605 Phe Ser Gln Ser Thr Leu Ser Glu Asn Cys Phe Ala Leu Thr Gly Asp 610 615 620 Val Asn Trp Ser Asn Tyr Thr Ile Gln Val Lys Ala Arg Lys Ile Ser 625 630 635 640 Gly Arg Glu Gly Phe Leu Ile Met Phe Gly Val Lys Asn Ser Asp Asn 645 650 655 Phe Tyr Trp Trp Asn Ile Gly Gly Trp Gly Asn Ser Tyr Thr Ala Ile 660 665 670 Glu Lys Ala Val Gly Gly Ile Lys Ser Ile Ile Gly Asn Ser Ala Asn 675 680 685 Val Arg Val Glu Glu Asn Arg Trp Tyr Asp Ile Lys Ile Glu Val Asn 690 695 700 Gly Asn Arg Ile Arg Cys Tyr Leu Asp Gly Val Leu Ile His Asp Val 705 710 715 720 Glu Asp Arg Val Val Arg Gln Asp Ile Tyr Ser Asn Val Thr Glu Asp 725 730 735 Glu Asn Gly Asp Ile Leu Ile Lys Val Val Asn Ile Ser Asn Lys Asn 740 745 750 Lys Arg Phe Ser Ile Val Ile Lys Gly Leu Glu Asn Leu Arg Leu Glu 755 760 765 Glu Glu Ala Arg Val Ile Thr Leu Thr Ser Asp Ser Leu Lys Asp Glu 770 775 780 Asn Ser Phe Ile Ala Pro Asn Lys Ile Ser Pro Gln Tyr Thr Asn Ile 785 790 795 800 Ser Gly Val Asp Lys Asn Phe Val Tyr Val Phe Pro Arg Tyr Ser Leu 805 810 815 Thr Val Leu Arg Leu Lys Lys Arg 820 <210> 3 <211> 2346 <212> DNA <213> Sulfolobus solfataricus <400> 3 aaggagaaac ttggcagttt ataacttgac agtaggttgt ggagtgatga ctggatcaat 60 actaggagga gtagcatata attacgttac acaattttat aacccaatat attcaataga 120 ccttatgctt atcctatcct ctattctaag attctcggta tctcccctat tcttgaccat 180 aaaagatact cgctcaaagc ttaaataata ttaatcataa ataaagtcat gtactcattt 240 ccaaatagct ttaggtttgg ttggtcccag gccggatttc aatcagaaat gggaacacca 300 gggtcagaag atccaaatac tgactggtat aaatgggttc atgatccaga aaacatggca 360 gcgggattag taagtggaga tctaccagaa aatgggccag gctactgggg aaactataag 420 acatttcacg ataatgcaca aaaaatggga ttaaaaatag ctagactaaa tgtggaatgg 480 tctaggatat ttcctaatcc attaccaagg ccacaaaact ttgatgaatc aaaacaagat 540 gtgacagagg ttgagataaa cgaaaacgag ttaaagagac ttgacgagta cgctaataaa 600 gacgcattaa accattacag ggaaatattc aaggatctta aaagtagagg actttacttt 660 atactaaaca tgtatcattg gccattacct ctatggttac acgacccaat aagagtaaga 720 agaggagatt ttactggacc aagtggttgg ctaagtacta gaacagttta cgaattcgct 780 agattctcag cttatatagc ttggaaattc gatgatctag tggatgagta ctcaacaatg 840 aatgaaccta acgttgttgg aggtttagga tacgttggtg ttaagtccgg ttttccccca 900 ggatacctaa gctttgaact ttcccgtagg catatgtata acatcattca agctcacgca 960 agagcgtatg atgggataaa gagtgtttct aaaaaaccag ttggaattat ttacgctaat 1020 agctcattcc agccgttaac ggataaagat atggaagcgg tagagatggc tgaaaatgat 1080 aatagatggt ggttctttga tgctataata 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tcccttatta tctgccttgc aacactaggg 1980 tagaactctg aaatcagata tggtaggtaa gttgtaagtg ataggacgta aactttagag 2040 ttagagtaag tgttctgaaa gactactggg tgcaattcga caccgttata ggcgtaaagg 2100 attggcgtag ctccgtttaa tgaaaatata ggtcctacag ggaaattggc ttgcctcttg 2160 taatatgacc aatagaacgt tttcccatcc ctggttaacg cattgacact aacactatcg 2220 taaatcaagt taccgacacc aagaattttc agtgcagtat cccccaagac ttcaataagc 2280 tttttagctg cacttgctgt aaacattaag ttaactcccc tattaagtaa atccacaata 2340 tctaga 2346 <210> 4 <211> 2475 <212> DNA <213> Dictyoglomus turgidum <400> 4 ttatcttttc tttagtctta acaccgttag tgaataccta ggaaaaacat acacaaaatt 60 tttgtctact ccagatatat ttgtatattg aggagagatt ttgttgggag ctataaatga 120 gttttcatcc ttcaaactat ctgaagttaa agttataact cttgcctctt cttctaacct 180 aagattttcc aaccccttaa tcacaatact aaatcttttg tttttattag agatattaac 240 aactttgata agtatatctc cattttcgtc ttctgtaaca ttactataaa tgtcttgcct 300 cacaacccta tcctccacat cgtgaattaa aaccccgtct aagtaacaac gaattctatt 360 accatttact tcaatcttaa tgtcatacca tctgttttct tctaccctta cattggcaga 420 gtttccgata atgcttttta ttcctcctac cgctttttca atagcggtat aagaattacc 480 ccaccctcct atattccacc aataaaaatt gtctgaattt ttaactccaa acattattaa 540 aaaaccttct ctcccagaaa tttttctcgc cttgacttgt attgtgtaat tactccaatt 600 aacatctcct gttaaagcaa aacaattctc cgagagagta gactgggaaa aaacaccatt 660 ttttatcgtc catatgcccc tcgcaatagt ccaatttttc aaagtatcaa tgaaattatc 720 tttgtagagt acttctcccg taatattact tataactctt aaatccttat attccacaga 780 agtttgccaa gatcctaaac ctatcattcc agatattact tcatcagctt tgtcttttaa 840 ggtgagcaac ttaaaaggca atacgtattt ccctttgttc tcattcaaga tcttaagcac 900 gtaataactg ggagtagcat aggaagatct attattaaac catatcaaat tgggctgcca 960 ctggcttgct ccttccttcc caaataaagg agcataagaa atcatagaaa ctatatctga 1020 atacttctca atatttaata aatatgcagc ttcagaaagg gctgcttcta aattatttct 1080 tctccctacc ccatgagcag catactctcc tacataaacc ttagggcctt tcctatcgta 1140 tgtagaataa cgatctacat tgttcaaaaa ccattctgga gacatatagt aatgttcgtc 1200 tacaagatca gcttttcctg tcttcttcac ccaattccaa ccatcatcga aaatttttcc 1260 actgggagaa ggccctactc caaatataac ttttatataa ggatattttt tctttatagc 1320 gtcataaaat ttctcataac gtacataata ttcaggcccc cattgctcat ttccaatttc 1380 aatatatttc agattaaaag gctccggatg tccaagttta gctcttatag atccccactt 1440 agtatctacc gaaccatttg caaattctat taaatccaat gcatcttgaa tatattcatc 1500 cagtttgtct aaaggaacca tatctgtata gctaccacct tgaaaagaca taccacagtt 1560 aattacagga ataggttcag ctccaagatc ttcacataat agaaaatatt cataaaaacc 1620 cagtccaaga ctttgatagt atccccaaaa attgggtatg gttggtcttt ctaacggatc 1680 accaatggta aacttccacc tataagcttc attcatgttt ctaccttgaa caagacatcc 1740 ccctgggaat ctcataaaag atggcttcaa atcataaagc cattttacca aatcaaacct 1800 taatccattt ttgcgctctt tccaggtgtt ttgaggaaaa agagatataa aatccaaatc 1860 aacagtacct ttttccttaa tcaaaattac aaatcttcca tcatcaatat cttgattaca 1920 cattattact ttctcaaatt ttttccattt tctatctata tcagaaataa aatccttaaa 1980 agcaacattt ccttttctat tagagacttc aaaatttata ttcttaatgc taccatcggg 2040 agaacgagca taaagggtca caatgtaata ttctcctttt tttaaagaaa taccttgata 2100 accttgattt gaaagcaata ctcctttatc taaagaacta ataacaattc gtaaataatt 2160 gggatttttc gtagaaacag gatccttctt ttctataaca taacctgcct tatcttttcc 2220 cataacattt attgaccagc tatacatagg atcaggaaat tcaaaagatc tattttgaat 2280 tagttctgca taaagtccac catctcctgc atagttaata tcttcaaaaa atattccata 2340 caaatttggg cttatctcaa ttcctttctt agatagatct atttctaaaa catcagtagt 2400 ttcatcattc ccttctaaaa taaatggcat cactaagaaa attataaaaa agattatcag 2460 caatctttta ttcat 2475

Claims (9)

1. i) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 β-글리코시다아제 및 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 α-L-아라비노퓨라노시다아제를 40:1 내지 80:1(w/v)로 혼합하여 효소액을 준비하는 단계;
   ii) 상기 단계 i)에서 준비한 효소액을 삼(ginseng) 추출물 또는 반응 배지에 첨가하여 반응액을 제조하는 단계;
   iii) 상기 단계 ii)에서 제조한 반응액을 반응시키는 단계; 및
   ⅳ) 상기 단계 iii)의 반응 산물로부터 진세노사이드 컴파운드 K를 분리하는 단계를 포함하되,
   상기 단계 i)의 β-글리코시다아제는 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래의 단백질이고, 상기 α-L-아라비노퓨라노시다아제는 딕티오클로무스 툴기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 단백질인 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼을 용매 추출한 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 반응 배지는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 반응은 pH 4.5 내지 7.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
   
8. 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.
   
9. 제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 반응은 1 내지 40 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 진세노사이드 컴파운드 K의 생산 방법.

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