CN108350475B - 使用aobgl1同源体的甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明在于提供一种甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的生产方法，其包括使糖苷酶AOBGL1及/或AOBGL3或其突变体与具有至少1个没有支链的β1,2‑糖苷键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述β1,2‑糖苷键的工序。

Description

使用AOBGL1同源体的甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法

技术领域

本发明涉及甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法。

背景技术

在菊科甜菊(Stevia rebaudiana)的叶中包含二萜的一种的被称作甜菊醇(Steviol)的次级代谢产物，在甜菊醇上附加了糖的甜菊醇糖苷中呈现砂糖的约300倍的甜味，它们作为低热量的甜味剂在食品产业中被利用。肥胖作为深刻的社会问题在国际上日益严峻，从增进健康及削减医疗费的观点出发低热量甜味剂的需求也日益增大。目前，人工合成的氨基酸衍生物阿斯巴甜(Aspartame)、乙酰磺胺酸钾(Acesulfame Potassium)作为人工甜味剂被利用，而像甜菊醇糖苷这样天然存在的低热量甜味剂更令人放心，从而可期待能够更容易得到消费者理解(Public Acceptance)。

甜菊醇糖苷中的甜菊苷为在甜菊醇上附加了3个葡萄糖的化合物，一般在甜菊的叶中包含最多。甜菊苷具有蔗糖的大约300倍的甜味度但呈现些许苦味。甜菊醇糖苷的瑞鲍迪甙A为在甜菊醇上附加了4个葡萄糖的化合物，具有蔗糖的大约400倍的甜味度。甜菊苷与瑞鲍迪甙A为甜菊甜味的核心物质。另外，还已知有在甜菊醇上附加了5个葡萄糖的瑞鲍迪甙D、附加了6个葡萄糖的瑞鲍迪甙M等糖苷。另外，已知甜茶中包含在甜菊醇的13位与19位分别各附加了1个葡萄糖的甜茶苷，其为甜茶主要的甜味成分。除此以外，已知存在认为是反应中间体的糖苷或根据糖的种类而不同的类似物(图1)。

另一方面，关于甜菊醇已知有认知功能的改善效果等。

在甜菊醇糖苷中，只要能够利用仅作用于特定的糖苷键的酶，则可生产特定的糖苷或除去不需要的糖苷，从而甜菊提取物味质的改善、特定的甜菊醇糖苷的纯化变得容易等的优点明显。

关于水解甜菊醇糖苷的酶活性，在几个生物种类中有报道。其中，关于曲霉属丝状菌生成甜菊醇糖苷水解酶，报道了在生酱油中具有将甜菊苷水解成甜茶苷的活性(非专利文献1)、在Pectinase酶制剂或Hesperidinase酶制剂、Taka diastase酶制剂中具有将甜菊苷水解成甜菊醇的活性(非专利文献2-4)。另外，报道了通过组合使用来自曲霉属丝状菌的果胶酶制剂与来自蜗牛(Helix pomatia)的酶制剂从而由甜菊苷制造甜菊醇的方法(专利文献1)。记载了在来自Aspergill us aculeatus的酶制剂Viscozyme L(novozyme)中，具有水解成为甜菊苷→甜茶苷→甜菊醇单糖基酯的活性(非专利文献5)。另外，记载了在Aspergillus ac uleatus的固体培养提取物中具有将甜菊苷转变为甜菊醇的活性(非专利文献6)。

如上所述，虽然提示了包含曲菌的曲霉属丝状菌存在具有甜菊醇糖苷水解活性的酶基因，但是并没有关于承担酶活性的基因或酶的报道。

另外，存在曲菌的AO090009000356基因所编码的糖苷水解酶(GH)3家族的β-糖苷酶水解具有β-糖苷键的二糖类的报道(非专利文献7)。具体而言，按照具有β-1,3键的昆布二糖、具有β-1,6键的β-龙胆二糖、具有β-1,4键的纤维二糖、具有β-1,2键的槐糖的顺序，水解的特异性高。然而，并没有报道是否具有水解以甜菊醇糖苷为代表的萜烯糖苷的活性。

在除此以外的生物中也报道了具有水解甜菊醇糖苷的活性。例如，公开了甲米菌属细菌具有分解甜茶苷的19位葡萄糖基酯键但无法分解13位糖苷键的酶(专利文献2)。另外，报道了来自Flavobacterium johnsoniae的β-糖苷酶具有分解甜菊醇糖苷的活性(水解13位β-糖苷键与19位葡萄糖基酯键的活性)。然而，虽然发现了它们中的任一个均具有水解甜菊醇糖苷的活性，但并没有鉴定出承担其活性的基因。

进而，在曲菌中认为存在很多编码具有β-糖苷酶样活性的GH3家族酶、G H5家族酶的基因，即使可检测酶活性，但鉴定哪个基因承担其活性并不容易。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2013-516963号公报

专利文献2：日本特开平10-276775号公报

专利文献3：日本特开平10-276775号公报

非专利文献

非专利文献1：日本食品工业学会志第37卷第5号369-374(1990)

非专利文献2：Phytochemistry,6,1107(1967)

非专利文献3：药志,95,1507(1975)

非专利文献4：日化志,1981,726(1981)

非专利文献5：J.Agric.Food Chem.,60,6210-6216(2012)

非专利文献6：Wei Sheng Wu Xue Bao,54(1),62-68(2014)

非专利文献7：Biochim Biophys Acta.,1764 972-978(2006)

发明内容

在上述这样的情况下，寻求甜菊醇糖苷及甜菊醇的新生产方法。

本发明者为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现AOBGL1基因所编码的来自曲菌的糖苷水解酶同源体蛋白质具有水解甜菊醇糖苷的活性。即发现了该蛋白质具有特异性剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键的活性，从而完成了本发明。进而，通过合并表达来自曲菌的AOBGL3基因所编码的其他糖苷酶同源体蛋白质，可生成甜菊醇糖苷及/或甜菊醇，从而完成了本发明。

即，本发明如下所示。

[1]一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括使选自以下(a)～(c)的蛋白质与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述没有支链的β1,2-糖苷键的工序，

(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(c)具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质。

[2]根据所述[1]所述的方法，其特征在于，所述选自(a)～(c)的蛋白质进一步包含分泌信号肽。

[3]根据所述[1]所述的方法，其特征在于，所述分泌信号肽为由序列号28、30、32、34及36中任一种记载的氨基酸序列构成的肽。

[4]根据所述[3]所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙B、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷。

[5]根据所述[4]所述的方法，其特征在于，所述不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自甜茶苷、瑞鲍迪甙A及甜菊醇单糖苷。

[6]一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括在生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的宿主中将导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸的非人转化体进行培养的工序，

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其编码由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(d)多核苷酸，其编码具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(e)多核苷酸，其与如下多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质，该多核苷酸由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成。

[7]根据所述[6]所述的方法，其特征在于，所述选自(a)～(e)的多核苷酸进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸。

[8]根据所述[7]所述的方法，其特征在于，所述由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸为由序列号27、29、31、33及35中任一种记载的碱基序列构成的多核苷酸。

[9]根据所述[6]～[8]中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸插入在表达载体中。

[10]根据所述[6]～[9]中任一项所述的方法，其特征在于，所述转化体为转化曲菌、转化酵母或转化植物。

[11]一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括在宿主细胞中使来自导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸的非人转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷接触，从而剪切所述β1,2-糖苷键的工序，

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其编码由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(d)多核苷酸，其编码具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(e)多核苷酸，其与如下多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质，该多核苷酸由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成。

[12]根据所述[11]所述的方法，其特征在于，所述选自(a)～(e)的多核苷酸进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸。

[13]根据所述[12]所述的方法，其特征在于，所述由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸为由序列号27、29、31、33及35中任一种记载的碱基序列构成的多核苷酸。

[14]根据所述[11]～[13]中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸插入在表达载体中。

[15]根据所述[11]～[14]中任一项所述的方法，其特征在于，所述转化细胞为转化曲菌、转化细菌或转化酵母。

[16]根据所述[11]～[15]中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷。

[17]根据所述[16]所述的方法，其特征在于，所述不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自甜茶苷、瑞鲍迪甙A、甜菊苷及甜菊醇单糖苷。

[18]一种制造瑞鲍迪甙B及甜菊醇中至少一个的方法，其特征在于，包括使选自以下(a)～(c)的蛋白质、选自(d)～(f)的蛋白质与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应的工序，

(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(c)具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(d)由序列号7或8的氨基酸序列构成的蛋白质；

(e)由序列号7或8的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；

(f)具有相对于序列号7或8的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质。

[19]根据所述[18]所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷为选自瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D、甜菊苷、甜茶苷、甜菊醇单糖苷及甜菊醇单葡萄糖基酯中的1个以上的甜菊醇糖苷。

根据本发明的方法可提供甜菊醇及甜菊醇糖苷的新生产方法。根据本发明的方法可制造甜菊醇。另外，可高效提取及纯化在甜菊醇的13位及/或19位附加了支链三糖(β1,2、β1,3)的甜菊醇糖苷。

附图说明

图1为各种甜菊醇糖苷的结构及在甜菊中的生物合成路径。

图2为表示分泌信号的氨基酸序列及碱基序列的图：(A)MF(ALPHA)1(YPL187W)；(B)PHO5(YBR093C)；(C)SUC2(YIL162W)。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，但本发明的主旨并不仅限定于该实施方式。只要不脱离本发明的要旨，则可通过各种各样的方式实施。

且，在本说明书中引用的全部文献及公开公报、专利公报等的专利文献作为参考也编入本说明书中。另外，本说明书包含2015年10月30日申请的成为本申请优先权要求的基础的日本专利申请(日本特申请2015-214255号公报)的说明书及附图记载的内容。

“AOBGL1”为来自曲菌的β-糖苷酶，其cDNA序列、基因组DNA序列、氨基酸序列及成熟蛋白质的氨基酸序列分别如序列号1、序列号2、序列号3及序列号4所示。

“AOBGL3”为来自曲菌的β-糖苷酶，其cDNA序列、基因组DNA序列、氨基酸序列及成熟蛋白质的氨基酸序列分别如序列号5、序列号6、序列号7及序列号8所示。

1.甜菊醇糖苷的生产方法

本发明在于提供一种甜菊醇糖苷的生产方法，包括使选自以下(a)～(c)的蛋白质(以下称为“本发明蛋白质”)与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应从而剪切所述没有支链的β1,2-糖苷键的工序。

(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(c)具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质。

上述(b)或(c)记载的蛋白质的代表为由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的突变体，例如还包括使用“Sambrook&Russell,Molecular Cloning：A LaboratoryManual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、“Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons 1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、“Gene,34,315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等记载的部位特异性突变导入法可人为取得的蛋白质。

作为“由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质”，可列举在序列号3或4的氨基酸序列中，例如由1～77个、1～75个、1～70个、1～65个、1～60个、1～55个、1～50个、1～49个、1～48个、1～47个、1～46个、1～45个、1～44个、1～43个、1～42个、1～41个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个(1～数个)、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或附加的数量一般越小越优选。

另外，作为这样的蛋白质，可列举具有与序列号3或4的氨基酸序列有90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质。上述序列同一性的数值一般越大越优选。

在此，“剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2糖苷键的活性”是指在甜菊醇糖苷(在作为糖苷配基的甜菊醇上结合了葡萄糖的糖苷)中剪切在甜菊醇糖苷中的2个葡萄糖残基间所形成的没有支链的β1,2糖苷键的活性。在此，“没有支链的β1,2糖苷键”是指形成β1,2糖苷键的葡萄糖残基进一步不具有像β1,3糖苷键这样的支链结构的β1,2糖苷键(在下述表1中为“Glc-β1,2-Glu”)。相反地，形成β1,2糖苷键的葡萄糖残基进一步具有β1,3糖苷键这样的支链结构时，该β1,2糖苷键可以说是具有支链的β1,2糖苷键(下述表1中为“Glc-β1,2-Glu(β1,3-Glu)”)。

剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键的活性可如下来确认：使本发明的蛋白质与例如甜菊苷等具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，从而将得到的反应产物纯化并将纯化的反应产物用液相色谱(Liquid Chromatography：LC)等公知的方法进行分析。

另外，水解β-糖苷键的活性可通过将用于表达本发明蛋白质的基因重组的转化体用包含X-β-Glc的培养基进行培养，并确认菌体及其周边是否被染成蓝色来检测。由于在该培养基中X-β-Glc被水解时菌体及其周边被染成蓝色，故而呈现蓝色时可以说具有水解β-糖苷键的活性。

或者，通过将对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷作为基质使用，并将通过水解所生成的对硝基酚量以吸光度(A405)进行测定，从而可测定水解β-糖苷键的活性。

“在序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加”意味着在同一序列中的任意且1～77个氨基酸序列中的位置上，1～77个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加，缺失、取代、插入及附加中还可2种以上同时发生。

以下，示出可相互取代的氨基酸残基的例子。同一组所包含的氨基酸残基可相互取代。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸；

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；

F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；

G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的几个方式的蛋白质的分泌信号肽被剪切，从而不包含分泌信号肽。本发明的其他几个方式的蛋白质的分泌信号肽没有被剪切而残留，因此还可进一步包含分泌信号肽。包含分泌信号肽时，优选分泌信号肽包含于本发明蛋白质的N末端。分泌信号肽意味着承担着将结合于该分泌信号肽的蛋白质分泌到细胞外的功能的肽区域。这样的分泌信号肽的氨基酸序列及编码它的多核苷酸序列在该技术领域中为周知且有报道。

本发明的蛋白质可通过使编码它的多核苷酸(参考后述的“本发明的多核苷酸”)在适当的宿主细胞内表达等来得到，还可通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。另外，还可利用AAPPTec LLC制、Perkin Elmer Inc.制、ProteinTechnologies Inc.制、PerSeptive Biosystems制、Applied Biosystems制、SHIMADZUCORPORATION制等的肽合成机来化学合成。

在本发明中，“甜菊醇糖苷”是指在作为糖苷配基的甜菊醇上结合了葡萄糖的糖苷。甜菊醇及甜菊醇糖苷的例子如下述通式(I)所示。

表1

表1

化合物名	R<sub>1</sub>	R<sub>2</sub>
			瑞鲍迪甙D	Glc-β1，2-Glu(β1，3-Glu)	Glc-β1，2-Glu
瑞鲍迪甙E	Glc-β1，2-Glu	Glc-β1，2-Glu
			瑞鲍迪甙A	Glc-β1，2-Glu(β1，3-Glu)	Glc-
甜菊苷	Glc-β1，2-Glu	Glc-
			甜茶苷	Glc-	Glc-
甜菊醇单葡萄糖基酯	H	Glc-
			瑞鲍迪甙B	Glc-β1，2-Glu(β1，3-G1u)	H
甜菊醇双糖苷	Glc-β1，2-Glu	H
			甜菊醇单糖苷	Glc-	H
甜菊醇	H	H

且，在上述中“Glc”表示葡萄糖，“Glc-β1，2-Glu”表示包含β1，2-糖苷键。“Glc-β1，2-Glu(β1，3-Glu)”表示包含β1，2-糖苷键与β1，3-葡萄糖苷键。

在此，“具有至少1个没有支链的β1，2-糖苷键的甜菊醇糖苷”意味着具有上述通式(I)的R1及R2中的至少一个为没有支链的结构的甜菊醇糖苷。例如，为选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷的甜菊醇糖苷。

通过本发明涉及的甜菊醇糖苷的生产方法，没有支链的β1，2-糖苷键被剪切，从而可得到其他种类的甜菊醇糖苷。

通过本方法所得到的甜菊醇糖苷(以下称为“本发明的甜菊醇糖苷”)按照起始物质的“具有至少1个没有支链的β1，2-糖苷键的甜菊醇糖苷”进行变化。以下示出其例子。

表2

表2

起始物质	本发明的甜菊醇糖苷
		瑞鲍迪甙D	瑞鲍迪甙A
瑞鲍迪甙E	甜菊苷、甜茶苷
		甜菊苷	甜茶苷
甜菊醇双糖苷	甜菊醇单糖苷

在本发明的甜菊醇糖苷的生产方法中，成为起始物质的具有至少1个没有支链的β1，2-糖苷键的甜菊醇糖苷可通过如下公知的方法提取、纯化来获得：由甜菊或甜茶(Rubussuavissimus)通过适当的溶剂(水等的水性溶剂或醇、醚及丙酮等的有机溶剂)进行提取；乙酸乙酯等有机溶剂：水的梯度提取；高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography：HPLC)、气相色谱、飞行时间质谱(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)、超高效液相色谱(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等。或者，成为起始物质的具有至少1个没有支链的β1，2-糖苷键的甜菊醇糖苷还可为市售的物质。

在本发明的几个方式中，选自甜菊苷、瑞鲍迪甙D及甜菊醇双糖苷的甜菊醇糖苷的没有支链的β1，2-糖苷键被剪切，从而可得到选自甜茶苷、瑞鲍迪甙A及甜菊醇单糖苷的甜菊醇糖苷。另外在其他方式中，瑞鲍迪甙E的没有支链的β1，2-糖苷键被剪切，从而可得到甜茶苷。

本发明所涉及的甜菊醇糖苷的生产方法包括如下工序：使本发明的蛋白质与具有至少1个没有支链的β1，2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述没有支链的β1，2-糖苷键。本发明的方法还可进一步包括将在所述工序中生成的甜菊醇糖苷纯化的工序。

在前述工序中生成的甜菊醇糖苷可通过如下公知的方法来纯化：用适当的溶剂(水等的水性溶剂或醇、醚、丙酮等的有机溶剂)进行提取；乙酸乙酯等有机溶剂：水的梯度提取；高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)、气相色谱、飞行时间质谱(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)、超高效液相色谱(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等。

另外，通过将本发明的蛋白质与具有其他活性的蛋白质组合可制造其他的甜菊醇糖苷。

因此，在其他的实施方式中，还可提供可制造瑞鲍迪甙B及甜菊醇中的至少1个的方法，包括使本发明的蛋白质与选自以下(d)～(f)的蛋白质(以下称为“第2活性蛋白质”)与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应的工序。

(d)由序列号7或8的氨基酸序列构成的蛋白质；

(e)由序列号7或8的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质；

(f)具有相对于序列号7或8的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键活性的蛋白质。

在该方法中，具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷还可为选自瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D、甜菊苷、甜茶苷、甜菊醇单糖苷及甜菊醇单葡萄糖基酯中的1个以上的甜菊醇糖苷。

在此，剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的活性意味着在作为在糖苷配基的甜菊醇上结合了葡萄糖的糖苷即甜菊醇糖苷中，剪切(水解)甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的活性。在某个实施方式中，所剪切的键为13位的单葡萄糖苷键，但并不限定于此。在其他的实施方式中，所剪切的键为19位的单葡萄糖基酯键，但并不限定于此。

剪切甜菊醇糖苷的单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的活性可通过使第2活性蛋白质与例如具有单葡萄糖苷键或单葡萄糖基酯键或其两者的结合的甜菊醇糖苷(甜茶苷)反应，将所得到的反应产物纯化，并将纯化的反应产物用液相色谱(LiquidChromatography：LC)等公知的方法进行分析来确认。

“在序列号7或8的氨基酸序列中1～77个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加”意味着在同一序列中的任意且1～77个氨基酸序列中的位置上，1～77个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加，缺失、取代、插入及附加中还可2种以上同时发生。

可相互取代的氨基酸残基的例子如上所述。

第2活性蛋白质可以包含分泌信号肽也可不包含分泌信号肽。包含分泌信号肽时，优选分泌信号肽包含于第2活性蛋白质的N末端。分泌信号肽意味着承担着将结合于该分泌信号肽的蛋白质分泌到细胞外的功能的肽区域。这样的分泌信号肽的氨基酸序列及编码它的多核苷酸序列在该技术领域中为周知且有报道。

第2活性蛋白质可通过使编码它的多核苷酸(例如由序列号5或6的碱基序列构成的多核苷酸)在适当的宿主细胞内表达等来得到，还可通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。另外，还可利用AAPPTec LLC制、Perkin Elmer Inc.制、Protein Technologies Inc.制、PerSeptive Biosystems制、Applied Biosystems制、SHIMADZU CORPORATION制等的肽合成机来化学合成。

关于“甜菊醇糖苷”如上所述。作为具有单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷的例子，例如可列举瑞鲍迪甙A、甜菊苷、甜茶苷、甜菊醇单糖苷及甜菊醇单葡萄糖基酯。

通过第2活性蛋白质来剪切单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键，所得到的产物按照起始物质的“具有单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷”如下进行变化。以下示出其例子。

表3

表3

基于上述第2活性蛋白质的活性，在包括使本发明的蛋白质、第2活性蛋白质与选自瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D、甜菊苷、甜茶苷、甜菊醇单糖苷及甜菊醇单葡萄糖基酯中的1个以上的甜菊醇糖苷反应的工序，从而制造瑞鲍迪甙B及甜菊醇中的至少1个的方法中，可如下由瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D及甜菊苷得到作为产物的瑞鲍迪甙B及甜菊醇。

表4

表4

2.使用非人转化体的本发明的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的生产方法

本发明的蛋白质为来自曲菌的分泌型的酶或其突变体，在细胞外环境中可期待具有高活性。此时，通过将编码本发明蛋白质的多核苷酸(参考后述的“本发明的多核苷酸”)导入来自细菌、真菌类、植物、昆虫、除人以外的哺乳动物等的宿主细胞使本发明蛋白质在细胞外表达，并使本发明蛋白质与具有β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，从而可生成本发明的甜菊醇糖苷。或者，根据宿主的不同使本发明蛋白质在宿主细胞内表达，还可生成本发明的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇。

因此，本发明提供一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括在生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的宿主中将导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸(以下称为“本发明的多核苷酸”)的非人转化体(以下称为“本发明的转化体”)进行培养的工序，

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其编码由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(d)多核苷酸，其编码具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(e)多核苷酸，其与如下多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质，该多核苷酸由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成。

在本说明书中，多核苷酸意味着DNA或RNA。

作为编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，例如可列举由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸。作为编码由序列号8的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸，例如可列举由序列号5的碱基序列构成的多核苷酸。

作为“由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质”，可列举前述蛋白质。

作为“具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质”，可列举前述蛋白质。

在本说明书中，“在高严谨条件下杂交的多核苷酸”是指例如可通过将由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸或由与编码序列号3或4的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等所得到的多核苷酸。作为杂交的方法，例如可利用“Sambrook&Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2012”、”Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons 1987-1997”等记载的方法。

在本说明书中，“高严谨条件”例如是指如下条件：5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃；或0.2×SSC、0.1％SDS、60℃；或0.2×SSC、0.1％SDS、62℃；或0.2×SSC、0.1％SDS、65℃，但并不限定于此。在这样的条件下，可期待温度越高越能够高效得到具有高序列同一性的DNA。但是，作为影响杂交严谨性的要素，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，通过适当选择这些要素则可实现同样的严谨性。

且，杂交使用市售的试剂盒时，例如可使用Alkphos Direct Labelling andDetection System(GE Healthcare)。此时，按照试剂盒所附的操作说明书，与标记的探针进行一晩孵育后，将膜在55～60℃的条件下用包含0.1％(w/v)SDS的1次清洗缓冲液清洗后，可检测杂交的DNA。或者，基于与序列号1的碱基序列互补的碱基序列或与编码序列号3或4的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分来制作探针时，使用市售的试剂(例如，PCR标记混合物(Roche Diagnostics Corporation)等)将该探针进行地高辛(DIG)标记时，可使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics Corporation)来检测杂交。

作为上述以外的可杂交的多核苷酸，通过BLAST的同源性检索软件使用默认值进行计算时，可列举与序列号1的碱基序列的DNA或编码序列号3或4的氨基酸序列的DNA具有60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上的序列同一性的DNA。

且，氨基酸序列、碱基序列的序列同一性可使用根据Karlin及Altschul的公式BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)来确定。使用BLAST时，使用各程序的默认值。

本发明的多核苷酸还可进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸。优选由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸包含于本发明多核苷酸的5’末端。分泌信号肽如上所述。这样的分泌信号肽可根据导入本发明多核苷酸的宿主来适当选择。例如宿主为酵母时，可列举来自酵母菌的分泌信号肽，例如MF(ALPHA)1信号肽、PHO5信号肽及SUC2信号肽。作为编码MF(ALPHA)1信号肽、PHO5信号肽及SUC2信号肽的多核苷酸，例如分别可列举由序列号31、序列号33及序列号35的碱基序列构成的多核苷酸。MF(ALPHA)1信号肽、PHO5信号肽及SUC2信号肽的氨基酸序列分别为序列号32、序列号34及序列号36的氨基酸序列。另外，宿主为曲菌时，可列举来自曲菌的信号肽，例如由序列号28或序列号30的氨基酸序列构成的肽。编码由序列号28或序列号30的氨基酸序列构成的肽的多核苷酸例如分别为由序列号27或序列号29的碱基序列构成的多核苷酸。

上述本发明的多核苷酸可通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法取得。

本发明的多核苷酸优选以插入于适当的表达载体的状态导入到宿主中。

适当的表达载体通常包含以下物质而构成：

(i)在宿主细胞内可转录的启动子；

(ii)结合于该启动子的本发明的多核苷酸；及

(iii)涉及RNA分子的转录终结及聚腺苷酸化，且包含在宿主细胞内发挥功能的信号作为构成要素的表达盒。

作为表达载体的制作方法，可列举使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，但没有特别限定。

载体的具体种类没有特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，选择可用于确实表达本发明多核苷酸的适当的启动子序列，并将其与本发明多核苷酸组入各种质粒等的载体作为表达载体来使用即可。

本发明的表达载体依据应导入的宿主种类而含有表达控制区域(例如启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，可使用常用的启动子(例如trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，作为酵母用启动子，例如可列举3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等，作为丝状菌用启动子，例如可列举淀粉酶、trpC等。另外，作为用于在植物细胞内使目的基因表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、将所述花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子的增强子序列附加在来自农杆菌的甘露碱合成酶启动子序列的5’侧的mac-1启动子等。作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如SV40初始启动子、SV40晚期启动子等)。作为因外界刺激而诱导性活化的启动子的例子，可列举mouse mammary tumor virus(MMTV)启动子、四环素应答性启动子、金属硫蛋白启动子及热休克蛋白启动子等。

表达载体优选包含至少1个选择标记。作为这样的标记，可利用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(潮霉素、博来霉素(Zeocin))、遗传霉素抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m,PDR4)(分别参考猪腰淳嗣等,生物化学,vol.64,p.660,1992；Hussain etal.,Gene,vol.101,p.149,1991)等。

本发明转化体的制作方法(生产方法)没有特别限定，例如可列举将包含本发明多核苷酸的表达载体导入宿主进行转化的方法。在此，所使用的宿主只要可生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷，则没有特别限定，不仅是甜菊这样的可生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的植物，在本来无法生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的细胞或生物中导入对于生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷所必需的基因的细胞或生物也可作为宿主使用。作为“对于生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷所必需的基因”，例如可列举WO2011/093509号公报等记载的具有甜菊醇、甜菊醇糖苷合成活性的基因。作为成为转化对象的细胞或生物，可适合地使用以往公知的各种细胞或生物。作为成为转化对象的细胞，例如可列举大肠杆菌(Escherichia coli)等的细菌、酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe)、丝状菌(曲菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae)、植物细胞、除人以外的动物细胞等。用于上述宿主细胞的适当的培养基及条件在本领域中周知。另外，成为转化对象的生物也没有特别限定，可列举在上述宿主细胞中例示的各种微生物或植物或除人以外的动物。转化体优选酵母或植物。

作为宿主细胞的转化方法，可利用通常所使用的公知的方法。例如，可通过电穿孔法(Mackenxie,D.A.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)、粒子轰击法(日本特开2005-287403号公报“脂质生产菌的育种方法”记载的方法)、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)、醋酸锂法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)、Methods in yeast genetics,2000Edition：A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual等记载的方法来实施，但并不限定于此。另外，向植物或者来自植物的组织或细胞导入基因时，例如可适当选择农杆菌法(Plant Molecular BiologyManual,Gelvin,S.B.et al.,Academic Press Publishers)、粒子枪法、PEG法、电穿孔法等来使用。

另外，关于通常的分子生物学的方法”，可参考Sambrook&Russell,MolecularCloning：A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Cold Spring Harbor,NY)”等。

转化体为酵母或曲菌时，为了使由该多核苷酸编码的多肽表达，通过将包含本发明多核苷酸的重组载体导入到酵母或曲菌中来实现。由本发明多核苷酸转化的酵母或曲菌与野生型相比能够大量表达本发明的蛋白质。因此，表达的本发明的蛋白质与在酵母或曲菌中生成的具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，没有支链的β1,2-糖苷键被剪切，不具有没有支链的β1,2-糖苷键的本发明的甜菊醇糖苷在酵母或曲菌的细胞内或培养液中生成，优选在培养液中生成。

转化体为植物时，为了使由该多核苷酸编码的蛋白质表达，可通过将包含本发明多核苷酸的重组载体导入到植物中来实现。在本发明中，成为转化对象的植物意味着植物体全体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等)或植物培养细胞或者各种方式的植物细胞(例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等中的任一种。作为用于转化的植物，只要是可生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的植物或在本来无法生成具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的植物中导入必要的基因从而成为可生成具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的植物，则没有特别限定，可为属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物中的任一种。本发明的多核苷酸是否导入植物的确认可通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。只要一旦取得本发明的多核苷酸组入到基因组内的转化植物体，则通过该植物体的有性繁殖或无性繁殖可得到后代。另外，可从该植物体或其后代或者它们的克隆体得到例如种子、果实、切穂、块茎、块根、树桩、愈伤组织、原生质体等，以此为基础可将该植物体量产。由本发明多核苷酸转化的植物(以下称为“本发明的植物”)与其野生型相比包含大量本发明的蛋白质。因此，本发明的蛋白质与在本发明的植物中生成的具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，没有支链的β1,2-糖苷键被剪切，不具有β1,2-糖苷键的本发明的甜菊醇糖苷在植物中生成。

本发明的几个方式的转化体或其培养液与其野生型相比，本发明的甜菊醇糖苷的含量高，在其提取物或培养液中能够以高浓度包含本发明的甜菊醇糖苷。本发明转化体的提取物可通过将转化体用玻璃珠、均质器或超声仪等破碎，将该破碎物离心处理并回收其上清来得到。本发明的甜菊醇糖苷在培养液中蓄积时，培养结束后通过通常的方法(例如离心分离、过滤等)将转化体与培养上清分离，可得到包含本发明的甜菊醇糖苷的培养上清。

这样所得到的提取液或者培养上清还可进一步供于纯化工序。本发明的甜菊醇糖苷的纯化还可通过通常的分离及纯化方法进行。具体的方法与前述相同。

3.使用来自非人转化细胞的酶制剂的本发明的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的生产方法

将本发明的多核苷酸导入来自细菌、真菌类、植物、昆虫、除人以外的哺乳动物等的宿主细胞使本发明的蛋白质表达，使用来自表达本发明蛋白质的转化细胞的酶制剂，即通过使来自表达本发明蛋白质的转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷接触，从而可生成本发明的甜菊醇糖苷。“来自转化细胞的酶制剂”只要使用转化细胞制备且包含本发明的蛋白质，则没有限定，例如转化细胞自身、转化细胞的粉碎物自身、转化细胞的培养上清自身及它们的纯化物。因此，本发明在于提供一种甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括在宿主细胞中使来自导入有选自以下(a)～(e)的多核苷酸的非人转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷接触，从而剪切所述没有支链的β1,2-糖苷键的工序，

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其编码由序列号3或4的氨基酸序列中1～77个氨基酸发生缺失、取代、插入、及/或附加的氨基酸序列构成且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(d)多核苷酸，其编码具有相对于序列号3或4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列且具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质；

(e)多核苷酸，其与如下多核苷酸在高严谨条件下杂交且编码具有剪切甜菊醇糖苷所具有的没有支链的β1,2-糖苷键活性的蛋白质，该多核苷酸由与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成。

选自上述(a)～(e)的多核苷酸为本发明的多核苷酸，与前述相同。

本发明的多核苷酸还可进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸。优选由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸包含于本发明多核苷酸的5’末端。分泌信号肽及由编码它的碱基序列构成的多核苷酸与前述相同。

本发明的多核苷酸优选以插入到适当的表达载体的状态导入到宿主细胞中。适当的表达载体与前述相同。

本发明的转化细胞的制作方法没有特别限定，例如可列举将包含本发明的多核苷酸的表达载体导入宿主细胞来转化的方法。成为转化对象的细胞与前述相同。

另外，宿主细胞的转化方法与前述相同。

为了使由该多核苷酸编码的多肽表达，本发明的转化细胞例如可通过将包含本发明多核苷酸的重组载体导入到的宿主细胞中来实现。由本发明多核苷酸转化的宿主细胞与野生型相比能够大量表达本发明的蛋白质。因此，使用来自表达本发明蛋白质的转化细胞的酶制剂，即通过使来自表达本发明蛋白质的转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷接触，可生成本发明的甜菊醇糖苷及/或甜菊醇。

“接触”意味着使来自本发明转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷在同一反应系统或培养系统中存在，例如包括如下方式：在包含来自本发明转化细胞的酶制剂的容器中添加具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷；将来自本发明转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷混合；将来自本发明转化细胞的酶制剂添加到包含具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的容器中。

“甜菊醇糖苷”及“具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷”与前述相同。

这样所得到的本发明的甜菊醇糖苷可根据常规方法用于例如食品、饮料、甜味剂、香料、医药品、工业原料(化妆料、肥皂等的原料)的制造等用途。

作为食品的例子，可列举营养辅助食品、健康食品、功能性食品、婴儿用食品、老人用食品等。在本说明书中，食品为固体、流体及液体以及它们的混合物，为可摄食的物质的总称。

且，在本说明书中引用的全部文献及公开公报、专利公报等专利文献作为参考编入本说明书中。

实施例

以下，使用实施例来更具体地说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例的限定。

1.甜菊醇水解酶基因的克隆

1-(1)基因

克隆AO090009000356及AO090701000274并使其在酵母中表达从而确认活性。

1-(2)曲菌的cDNA的克隆

将曲菌Aspergillus oryzae var.Brunneus(IFO30102)接种于GY培养板(2％葡萄糖、0.5％酵母提取物、2％琼脂)，并于25℃培养3天。将繁殖的菌体从GY培养板回收，并用RNeasy(QIAGEN)提取总RNA。通过SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(Life Technologies)合成cDNA。

以AO090009000356及AO090701000274的DNA序列为基础设计以下引物。AO090009000356(以下标注为AOBGL1)

AOBGL1-1：5’-AGATCTATGAAGCTTGGTTGGATCGAGGT-3’(序列号9)

AOBGL1-2：5’-GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA-3’(序列号10)

AO090701000274(以下标注为AOBGL3)

AOBGL3-1：5’-GCGGCCGCatggtttccggtgtctttacgaagg-3’(序列号11)

AOBGL3-2：5’-GGATCCtcactgcacatagaaagtagcattgcc-3’(序列号12)

将如上合成的cDNA作为模板，使用ExTaq(Takara Bio)将通过PCR扩增的约2.6kbp或2.3kbp的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(Life Technologies)进行克隆。在此，将所得到的质粒分别作为pCR-AOBGL1或pCR-AOBGL3。

2.在酵母中的表达

2-(1)酵母表达用载体的构建与转化株的取得

使用DNA Ligation Kit Ver.1(Takara Bio)连接将酵母用表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995)用限制酶BamHI与SalI消化所得到的DNA片段与将pCR-AOBGL1用限制酶BglII与SalI消化所得到的约2.6kbp的DNA片段，并将所得到的质粒作为pYE-AOBGL1。另外，同样地连接将pYE22mN用限制酶NotI与BamHI消化所得到的DNA片段与将pCR-AOBGL3用限制酶NotI与BamHI消化所得到的约2.3kbp的DNA片段，并将所得到的质粒作为pYE-AOBGL3。

作为转化的亲株，使用S.cerevisiae的EH13-15株(trp1,MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989)。

分别使用质粒pYE22m(对照)、pYE-AOBGL1(AOBGL1表达用)、pYE-AOBGL3(AOBGL3表达用)通过醋酸锂法将EH13-15株转化。筛选在SC-Trp(每1L包含Yeast nitrogen base w/oamino acids(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g及氨基酸粉(将腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g混合的物质)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上繁殖的转化株。

将筛选的菌株涂布于包含0.004％X-β-Glc的SC-Trp琼脂培养基上，于30℃培养3天，通过pYE-AOBGL1、pYE-AOBGL3的任一质粒转化的菌株以及通过作为对照的pYE22m转化的菌株均没有呈现蓝色，从而无法确认到X-β-Glc分解活性。

另一方面，将筛选的菌株在添加了1/10量的1M磷酸钾缓冲液的SC-Trp液体培养基10mL中接种1接种环，于30℃以125rpm振荡培养2天。将所得到的培养物通过离心分离分成培养上清与菌体。菌体悬浮于50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.1％CHAPS溶液，用玻璃珠将菌体破碎，并将离心分离所得到的上清作为菌体破碎液。研究所得到的培养上清或菌体破碎液的pNP-β-Glc活性。

其结果，包括对照在内任一转化株的培养上清及菌体破碎液的两者均具有pNP-β-Glc分解活性，在两者之间活性并没有大的差别。

由此提示即使将质粒pYE-AOBGL1、pYE-AOBGL3导入酵母EH13-15株，也无法使具有β-糖苷酶活性的活性型蛋白质表达。另外，还可知需要使酵母内源性的承担β-糖苷酶活性的基因预先缺失。

2-(2)Δexg1Δexg2酵母宿主株的制作

作为转化的宿主株，使用认为承担酵母菌体外β-糖苷酶活性的大半的EXG1(YLR300w)基因与作为其同源体的EXG2(YDR261c)基因缺失的菌株，并如下制作。

将Δexg1株(MATalpha his3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0,克隆体ID15210、OpenBio Systems)与Δexg2株(MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0,克隆体ID3620、OpenBio Systems)分别涂布于YPD琼脂培养基，并于30℃培养2天。将各个菌体用接种环取下，在SC-Met,Lys(每1L包含Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g及氨基酸粉(将腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g、尿嘧啶0.6g混合的物质)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)上混合，并于30℃培养2天。认为繁殖的菌株为2个菌株杂交的异双倍体。将所得到的菌株涂布于YPD琼脂培养基，并于30℃培养2天后，将菌体用接种环取下并涂布于0.5％醋酸钾琼脂培养基(2％琼脂)，于室温培养5天来形成胞子。进行四分子分离并分离一倍体株。将所得到的菌株的基因型通过PCR确认，并筛选Δexg1Δexg2-1株(his3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0)。

以酵母S288C株的基因组DNA作为模板，通过以下的引物TRP1-F与引物TRP1-R使用KOD-Plus(东洋纺)进行PCR。将所扩增的约2.7kbp的DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCRcloning Kit(Life Technologies)进行克隆，从而得到质粒pCR-TRP1。

TRP1-F：TACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCG(序列号13)

TRP1-R：TCTACAACCGCTAAATGTTTTTGTTCG(序列号14)

将pPRGINFRT3-103(日本特开2001-120276号公报)用限制酶EcoRI与HindIII消化所得到的2.7kbp的DNA片段通过Blunting Kit(Takara Bio)使末端平滑化后，使用Ligation High(东洋纺)将其与用限制酶HpaI与StuI消化质粒pCR-TRP1所得到的DNA片段连接，从而得到质粒pCR-Δtrp1：URA3-FRT。以其作为模板，通过引物TRP1-F与引物TRP1-R使用KOD-Plus(东洋纺)进行PCR，使用所得到的4.4kbp的DNA片段将Δexg1Δexg2-1株通过醋酸锂法进行转化，筛选在SC-Ura(每1L包含Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g及氨基酸粉(将腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2gを混合的物质)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂))上繁殖的菌株作为转化株。将转化株用YPGal培养基(酵母提取物2％、多聚蛋白胨1％、半乳糖2％)培养后，涂布于SC+5-FOA(每1L包含Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g及氨基酸粉(将腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g、尿嘧啶0.6g混合的物质)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂))，繁殖的菌株为Δexg1Δexg2-2株，并作为以下转化的宿主。

2-(3)分泌信号序列的取代与在酵母中的表达

推定AOBGL1p的N末端的19个氨基酸(序列号28)及AOBGL3的N末端的22个氨基酸(序列号30)为分泌信号序列。

因此，为了使AOBGL1、AOBGL3在酵母中分泌表达，使推定分泌信号序列在酵母的分泌蛋白质的分泌信号序列中取代。首先，合成以下的寡聚DNA，使其退火后插入到载体pYE22m的EcoRI位点，并制作pYE-PacNhe。

PacI-NheI-F：5’-AATTAATTAAGAGCTAGCG-3’(序列号15)

PacI-NheI-R：5’-TTAATTCTCGATCGCTTAA-3’(序列号16)

以质粒pCR-AOBGL1或pCR-ASBGL1为模板，通过以下的引物Bgl2-AOBGL1-F与引物AOBGL1-2使用KOD-Plus(东洋纺)进行PCR。将通过PCR扩增的DNA片段用限制酶BglII与SalI消化所得到的约2.5kbp的DNA片段插入载体pYE-PacNhe的限制酶BamHI与SalI位点，从而构建质粒pYE-PN-AOBGL1。

Bgl2-AOBGL1-F：5’-TAAGATCTAAGGATGATCTCGCGTACTCCCC-3’(序列号17)

AOBGL1-2：5’-GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA-3’(序列号18)

以质粒pCR-ASBGL3为模板，通过以下的引物Bam-ASBGL3-F与引物Sal-ASBGL3-R使用KOD-Plus(东洋纺)进行PCR。将通过PCR扩增的DNA片段用限制酶BamHI与SalI消化所得到的约2.3kbp的DNA片段插入载体pYE-PacNhe的限制酶BamHI与SalI位点，从而构建质粒pYE-PN-AOBGL3。Bam-AOBGL3-F：5’-AAGGATCCCAAGATGAGAAGCCTCGCTACAAGG-3’(序列号19)

Sal-AOBGL3-R：5’-GGGTCGACTCACTGCACATAGAAAGTAGCATTGCC-3’(序列号20)

为了构建用于使AOBGL1或AOBGL3的推定分泌信号序列在酵母的分泌蛋白质的分泌信号序列MF(ALPHA)1(YPL187W)(图2A记载的氨基酸序列的1～19号的序列(序列号32))、PHO5(YBR093C)(图2B记载的氨基酸序列的1～17号的序列(序列号34))、SUC2(YIL162W)(图2C记载的氨基酸序列的1～19号的序列(序列号36))上取代的蛋白质表达的质粒，设计以下引物。ScPHO5-F：

5’-TAAATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAG-3’(序列号21)

ScPHO5-R：

5’-CTAGCTGCATTGGCCAAAGAAGCGGCTAAAATTGAATAAACAACAGATTTAAACATTTAAT-3’(序列号22)

ScSUC2-F：

5’-TAAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCAG-3’(序列号23)

ScSUC2-R：

5’-TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG-3’(序列号24)

ScMF1-F：

5’-TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG-3’(序列号25)

ScMF1-R：

5’-CTAGCAGCTAATGCGGAGGATGCTGCGAATAAAACTGCAGTAAAAATTGAAGGAAATCTCATTTAAT-3’(序列号26)

将用ScPHO5-F与ScPHO5-R的组合、ScSUC2-F与ScSUC2-R的组合及ScMF1-F与ScMF1-R的组合退火后的物质分别与将质粒pYE-PN-AOBGL1或pYE-PN-ASBGL1用限制酶PacI与NheI消化后的物质连接，从而得到以下的质粒。pYE-PHO5s-AOBGL1(PHO5s-AOBGL1表达用)

pYE-SUC2s-AOBGL1(SUC2s-AOBGL1表达用)

pYE-MF1s-AOBGL1(MF1s-AOBGL1表达用)

pYE-PHO5s-AOBGL3(PHO5s-AOBGL3表达用)

pYE-SUC2s-AOBGL3(SUC2s-AOBGL3表达用)

pYE-MF1s-AOBGL3(MF1s-AOBGL3表达用)

将Δexg1Δexg2-2株用上述质粒通过醋酸锂法转化，并筛选在SC-Trp琼脂培养基上繁殖的菌株作为转化株。

将所得到的转化株涂布于包含0.004％X-β-Glc的SD-Trp琼脂培养基上，于30℃培养3天时，通过pYE-PHO5s-AOBGL1、pYE-SUC2s-AOBGL1、pYE-MF1s-AOBGL1、pYE-PHO5s-ASBGL1、pYE-SUC2s-ASBGL1、pYE-MF1s-ASBGL1转化的菌株的菌体及其周边被染成蓝色，从而提示具有水解X-β-Glc的活性。

另一方面，由用于使AOBGL3表达的质粒转化的菌株的菌体及其周边没有被染成蓝色，从而无法确认到水解X-β-Glc的活性。

另外，即使在导入对照载体的菌株中，菌体及其周边与而没有被染成蓝色，从而没有水解X-β-Glc的活性。

将所得到的转化株在将SD-Trp液体培养基10mL与1M磷酸钾缓冲液1mL混合的液体培养基中接种1接种环，并于30℃振荡培养2天。将培养物通过离心分离从而分离为菌体与培养上清。

将培养上清50μL、0.2M柠檬酸钠缓冲液50μL、20mMpNP-βGlc水溶液50μL、水50μL混合，于37℃反应1小时，研究β-糖苷酶活性引起的405nm处的吸光度的增加。

使AOBGL1表达时，如表5所示可确认β-糖苷酶活性。认为AOBGL1在MF1信号序列替换上时表达地最好。

表5

表5培养液的β-糖苷酶活性

(405nm处吸光度的增加，反应1小时)

然而，使AOBGL3表达时，在同样的条件下无法确认β-糖苷酶活性。

2-(4)重组酶相对于甜菊醇糖苷的活性

可确认AOBGL1具有将甜菊苷转变为甜茶苷的活性。

3.AOBGL3在曲菌中的表达

3-(1)曲菌表达用载体的构建

连接将曲菌用载体pUNA(酒类综合研究所)用限制酶SmaI消化所得到的DNA片段与将质粒pCR-AOBGL3用限制酶NotI、BamHI消化且将末端通过Blunting Kit(Takara Bio)平滑化所得到的约2.3kbp的DNA片段，从而得到质粒pUNA-AOBGL3。

3-(2)曲菌的转化

曲菌的转化如下实施。

作为宿主，使用Aspergillus oryzae niaD300株(酒类综合研究所)。将宿主株接种于PDA培养板，并于30℃培养大约1周。为了得到分生体悬浮液，加入0.1％tween80,0.8％NaCl使分生体悬浮。通过神奇滤布(Miracloth)过滤后通过离心分离回收分生体，进一步用0.1％tween80,0.8％NaCl清洗，并悬浮于灭菌水。

将分生体涂布于CD培养板，并通过粒子轰击法进行DNA的导入。使用PDS-1000/He(Bio-Rad)，粒子：钨M-10，爆破片：1100psi，距离：3cm。作为转化株，通过CD培养板(每1L包含NaNO₃ 6g、KCl 0.52g、KH₂PO₄ 1.52g、葡萄糖10g、1M MgSO₄ 2ml、Trace elementsolution(每1L包含FeSO₄·7H₂O 1g、ZnSO₄·7H₂O 8.8g、CuSO₄·5H₂O 0.4g、NaB₄O₇·10H₂O0.1g、(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 0.05g)1ml、琼脂20g(pH6.5))筛选繁殖的菌株。

3-(3)分生体液的制备

将BGL3-1株或C-1株接种于CD培养板，并于30℃培养7天从而形成分生体。为了得到分生体悬浮液，加入0.1％tween80,0.8％NaCl将分生体悬浮。用神奇滤布过滤后通过离心分离回收分生体，进一步用0.1％tween80,0.8％NaCl清洗并悬浮于灭菌水，从而作为分生体悬浮液。

3-(4)通过液体培养的AOBGL3的生产

将BGL3-1株或C-1株的分生体接种于酶生产用液体培养基(每1L包含麦芽糖100g、胰化蛋白胨1g、酵母提取物5g、NaNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O0.01g)，并于30℃进行2天振荡培养。通过神奇滤布进行过滤来除去菌体，接着通过膜过滤系统(IWAKI)进行过滤并收集上清。进而，用Amicon Ultra-15 50k(Merck)通过超滤进行浓缩，用包含0.1％CHAPS的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行缓冲液更换，从而得到祖酶液。

3-(5)活性确认(液体培养)

研究相对于各种基质的活性。

pNP-β-Glc：BGL3-1株、C-1株均呈黄色，两者均具有水解pNP-β-Glc的活性。

X-β-Glc：BGL3-1株呈蓝色，具有水解X-β-Glc的活性。另一方面，由于C-1株并不成为蓝色，故而认为没有水解X-β-Glc的活性。认为相对于X-β-Glc的活性由AOBGL3基因产物引起。

3-(6)甜菊醇糖苷的水解活性

来自BGL3-1株或C-1株的酶液(液体培养、培养板培养)相对于各种甜菊醇糖苷(甜茶苷)的水解活性如下研究。

反应条件

使基质50μg/ml、酶液20μl、50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)的总量为100μl，并使其于50℃反应。将反应液用乙腈清洗后，供于用水平衡化的Sep-PakC18(Waters)，接着用20％乙腈清洗后用50％乙腈洗脱。将洗脱液用真空离心蒸发浓缩器干固后，用100μL的80％乙腈再溶解从而供于HPLC。

HPLC条件如下所示。

色谱柱：COSMO SEAL 5C₁₈-AR-II 4.6mmI.D.x250mm(Nacalai Tesque)流动相：A；乙腈，B；B conc.70％→30％40分linear gradient

流速：1ml/分钟

温度：40℃

检测：UV 210nm

即，通过使AOBGL3表达，可水解甜茶苷的13位的糖苷键与19位的葡萄糖基酯键的酶活性表达。但是，与甜茶苷反应时，由于除甜菊醇以外检测到了中间体甜菊醇单葡萄糖基酯，故而AOBGL3蛋白质将甜茶苷的13位的糖苷键与19位的葡萄糖基酯键的两者水解，为更加选择性水解13位糖苷键的酶。

序列表

<110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED

<120> 使用AOBGL1同源体的甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法

<130> G1395WO

<150> JP 2015-214255

<151> 2015-10-30

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2586

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 1

atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgccaag 60

gatgatctcg cgtactcccc tcctttctac ccttccccat gggcagatgg tcagggtgaa 120

tgggcggaag tatacaaacg cgctgtagac atagtttccc agatgacgtt gacagagaaa 180

gtcaacttaa cgactggaac aggatggcaa ctagagaggt gtgttggaca aactggcagt 240

gttcccagac tcaacatccc cagcttgtgt ttgcaggata gtcctcttgg tattcgtttc 300

tcggactaca attcagcttt ccctgcgggt gttaatgtcg ctgccacctg ggacaagacg 360

ctcgcctacc ttcgtggtca ggcaatgggt gaggagttca gtgataaggg tattgacgtt 420

cagctgggtc ctgctgctgg ccctctcggt gctcatccgg atggcggtag aaactgggaa 480

ggtttctcac cagatccagc cctcaccggt gtactttttg cggagacgat taagggtatt 540

caagatgctg gtgtcattgc gacagctaag cattatatca tgaacgaaca agagcatttc 600

cgccaacaac ccgaggctgc gggttacgga ttcaacgtaa gcgacagttt gagttccaac 660

gttgatgaca agactatgca tgaattgtac ctctggccct tcgcggatgc agtacgcgct 720

ggagtcggtg ctgtcatgtg ctcttacaac caaatcaaca acagctacgg ttgcgagaat 780

agcgaaactc tgaacaagct tttgaaggcg gagcttggtt tccaaggctt cgtcatgagt 840

gattggaccg ctcatcacag cggcgtaggc gctgctttag caggtctgga tatgtcgatg 900

cccggtgatg ttaccttcga tagtggtacg tctttctggg gtgcaaactt gacggtcggt 960

gtccttaacg gtacaatccc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg tatcatggcc 1020

gcttattaca aggttggccg cgacaccaaa tacacccctc ccaacttcag ctcgtggacc 1080

agggacgaat atggtttcgc gcataaccat gtttcggaag gtgcttacga gagggtcaac 1140

gaattcgtgg acgtgcaacg cgatcatgcc gacctaatcc gtcgcatcgg cgcgcagagc 1200

actgttctgc tgaagaacaa gggtgccttg cccttgagcc gcaaggaaaa gctggtcgcc 1260

cttctgggag aggatgcggg ttccaactcg tggggcgcta acggctgtga tgaccgtggt 1320

tgcgataacg gtacccttgc catggcctgg ggtagcggta ctgcgaattt cccatacctc 1380

gtgacaccag agcaggcgat tcagaacgaa gttcttcagg gccgtggtaa tgtcttcgcc 1440

gtgaccgaca gttgggcgct cgacaagatc gctgcggctg cccgccaggc cagcgtatct 1500

ctcgtgttcg tcaactccga ctcaggagaa ggctatctta gtgtggatgg aaatgagggc 1560

gatcgtaaca acatcactct gtggaagaac ggcgacaatg tggtcaagac cgcagcgaat 1620

aactgtaaca acaccgttgt catcatccac tccgtcggac cagttttgat cgatgaatgg 1680

tatgaccacc ccaatgtcac tggtattctc tgggctggtc tgccaggcca ggagtctggt 1740

aactccattg ccgatgtgct gtacggtcgt gtcaaccctg gcgccaagtc tcctttcact 1800

tggggcaaga cccgggagtc gtatggttct cccttggtca aggatgccaa caatggcaac 1860

ggagcgcccc agtctgattt cacccagggt gttttcatcg attaccgcca tttcgataag 1920

ttcaatgaga cccctatcta cgagtttggc tacggcttga gctacaccac cttcgagctc 1980

tccgacctcc atgttcagcc cctgaacgcg tcccgataca ctcccaccag tggcatgact 2040

gaagctgcaa agaactttgg tgaaattggc gatgcgtcgg agtacgtgta tccggagggg 2100

ctggaaagga tccatgagtt tatctatccc tggatcaact ctaccgacct gaaggcatcg 2160

tctgacgatt ctaactacgg ctgggaagac tccaagtata ttcccgaagg cgccacggat 2220

gggtctgccc agccccgttt gcccgctagt ggtggtgccg gaggaaaccc cggtctgtac 2280

gaggatcttt tccgcgtctc tgtgaaggtc aagaacacgg gcaatgtcgc cggtgatgaa 2340

gttcctcagc tgtacgtttc cctaggcggc ccgaatgagc ccaaggtggt actgcgcaag 2400

tttgagcgta ttcacttggc cccttcgcag gaggccgtgt ggacaacgac ccttacccgt 2460

cgtgaccttg caaactggga cgtttcggct caggactgga ccgtcactcc ttaccccaag 2520

acgatctacg ttggaaactc ctcacggaaa ctgccgctcc aggcctcgct gcctaaggcc 2580

cagtaa 2586

<210> 2

<211> 2891

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 2

atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgccaag 60

gtatgcttca gcatctcata cggtgctatt cgactcaatt gaatcagctt tttaacaatt 120

tttactctga ataggatgat ctcgcgtact cccctccttt ctacccttcc ccatgggcag 180

atggtcaggg tgaatgggcg gaagtataca aacgcgctgt agacatagtt tcccagatga 240

cgttgacaga gaaagtcaac ttaacgactg gaacagggta agcttgcgta tgccttagcg 300

tgtctgaagc tcgattagct aaagtacttc agatggcaac tagagaggtg tgttggacaa 360

actggcagtg ttcccaggta agtagatttt cacatgactt tatactctta cggaaggctg 420

attgttgtga atatagactc aacatcccca gcttgtgttt gcaggatagt cctcttggta 480

ttcgtttctg tacgtgtggc ttttatttcc ctttccttcc taacatgttg ctaacagtag 540

acgcgcagcg gactacaatt cagctttccc tgcgggtgtt aatgtcgctg ccacctggga 600

caagacgctc gcctaccttc gtggtcaggc aatgggtgag gagttcagtg ataagggtat 660

tgacgttcag ctgggtcctg ctgctggccc tctcggtgct catccggatg gcggtagaaa 720

ctgggaaggt ttctcaccag atccagccct caccggtgta ctttttgcgg agacgattaa 780

gggtattcaa gatgctggtg tcattgcgac agctaagcat tatatcatga acgaacaaga 840

gcatttccgc caacaacccg aggctgcggg ttacggattc aacgtaagcg acagtttgag 900

ttccaacgtt gatgacaaga ctatgcatga attgtacctc tggcccttcg cggatgcagt 960

acgcgctgga gtcggtgctg tcatgtgctc ttacaaccaa atcaacaaca gctacggttg 1020

cgagaatagc gaaactctga acaagctttt gaaggcggag cttggtttcc aaggcttcgt 1080

catgagtgat tggaccgctc atcacagcgg cgtaggcgct gctttagcag gtctggatat 1140

gtcgatgccc ggtgatgtta ccttcgatag tggtacgtct ttctggggtg caaacttgac 1200

ggtcggtgtc cttaacggta caatccccca atggcgtgtt gatgacatgg ctgtccgtat 1260

catggccgct tattacaagg ttggccgcga caccaaatac acccctccca acttcagctc 1320

gtggaccagg gacgaatatg gtttcgcgca taaccatgtt tcggaaggtg cttacgagag 1380

ggtcaacgaa ttcgtggacg tgcaacgcga tcatgccgac ctaatccgtc gcatcggcgc 1440

gcagagcact gttctgctga agaacaaggg tgccttgccc ttgagccgca aggaaaagct 1500

ggtcgccctt ctgggagagg atgcgggttc caactcgtgg ggcgctaacg gctgtgatga 1560

ccgtggttgc gataacggta cccttgccat ggcctggggt agcggtactg cgaatttccc 1620

atacctcgtg acaccagagc aggcgattca gaacgaagtt cttcagggcc gtggtaatgt 1680

cttcgccgtg accgacagtt gggcgctcga caagatcgct gcggctgccc gccaggccag 1740

cgtatctctc gtgttcgtca actccgactc aggagaaggc tatcttagtg tggatggaaa 1800

tgagggcgat cgtaacaaca tcactctgtg gaagaacggc gacaatgtgg tcaagaccgc 1860

agcgaataac tgtaacaaca ccgttgtcat catccactcc gtcggaccag ttttgatcga 1920

tgaatggtat gaccacccca atgtcactgg tattctctgg gctggtctgc caggccagga 1980

gtctggtaac tccattgccg atgtgctgta cggtcgtgtc aaccctggcg ccaagtctcc 2040

tttcacttgg ggcaagaccc gggagtcgta tggttctccc ttggtcaagg atgccaacaa 2100

tggcaacgga gcgccccagt ctgatttcac ccagggtgtt ttcatcgatt accgccattt 2160

cgataagttc aatgagaccc ctatctacga gtttggctac ggcttgagct acaccacctt 2220

cgagctctcc gacctccatg ttcagcccct gaacgcgtcc cgatacactc ccaccagtgg 2280

catgactgaa gctgcaaaga actttggtga aattggcgat gcgtcggagt acgtgtatcc 2340

ggaggggctg gaaaggatcc atgagtttat ctatccctgg atcaactcta ccgacctgaa 2400

ggcatcgtct gacgattcta actacggctg ggaagactcc aagtatattc ccgaaggcgc 2460

cacggatggg tctgcccagc cccgtttgcc cgctagtggt ggtgccggag gaaaccccgg 2520

tctgtacgag gatcttttcc gcgtctctgt gaaggtcaag aacacgggca atgtcgccgg 2580

tgatgaagtt cctcagctgg taagttgacc tgattgggtg atgtgtaata atttcaatgc 2640

taactttttc tgtgtagtac gtttccctag gcggcccgaa tgagcccaag gtggtactgc 2700

gcaagtttga gcgtattcac ttggcccctt cgcaggaggc cgtgtggaca acgaccctta 2760

cccgtcgtga ccttgcaaac tgggacgttt cggctcagga ctggaccgtc actccttacc 2820

ccaagacgat ctacgttgga aactcctcac ggaaactgcc gctccaggcc tcgctgccta 2880

aggcccagta a 2891

<210> 3

<211> 861

<212> PRT

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 3

Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Val Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser

20 25 30

Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala

35 40 45

Val Asp Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Thr Glu Lys Val Asn Leu Thr

50 55 60

Thr Gly Thr Gly Trp Gln Leu Glu Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser

65 70 75 80

Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu

85 90 95

Gly Ile Arg Phe Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn

100 105 110

Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala

115 120 125

Met Gly Glu Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu

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Gly Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr

165 170 175

Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr

180 185 190

Ile Met Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly

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Tyr Gly Phe Asn Val Ser Asp Ser Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys

210 215 220

Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala

225 230 235 240

Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr

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Gly Cys Glu Asn Ser Glu Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu

260 265 270

Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Thr Ala His His Ser Gly

275 280 285

Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val

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Thr Phe Asp Ser Gly Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly

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Val Leu Asn Gly Thr Ile Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val

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Arg Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Thr Lys Tyr Thr

340 345 350

Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Ala His

355 360 365

Asn His Val Ser Glu Gly Ala Tyr Glu Arg Val Asn Glu Phe Val Asp

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Val Gln Arg Asp His Ala Asp Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Gln Ser

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Lys Leu Val Ala Leu Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Ser Trp Gly

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Ala Asn Gly Cys Asp Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met

435 440 445

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Gln Ala Ile Gln Asn Glu Val Leu Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala

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Val Thr Asp Ser Trp Ala Leu Asp Lys Ile Ala Ala Ala Ala Arg Gln

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Ala Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ser Gly Glu Gly Tyr

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Leu Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn Asn Ile Thr Leu Trp

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Lys Asn Gly Asp Asn Val Val Lys Thr Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn

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Thr Val Val Ile Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp

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565 570 575

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Ser Asp Phe Thr Gln Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys

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<212> PRT

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

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Phe Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val Ala Ala

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130 135 140

Pro Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Met Asn

165 170 175

Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Phe

180 185 190

Asn Val Ser Asp Ser Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr Met His

195 200 205

Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly

210 215 220

Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln

245 250 255

Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Thr Ala His His Ser Gly Val Gly Ala

260 265 270

Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Thr Phe Asp

275 280 285

Ser Gly Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly Val Leu Asn

290 295 300

Gly Thr Ile Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met

305 310 315 320

Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Thr Lys Tyr Thr Pro Pro Asn

325 330 335

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385 390 395 400

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435 440 445

Gln Asn Glu Val Leu Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala Val Thr Asp

450 455 460

Ser Trp Ala Leu Asp Lys Ile Ala Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ser Val

465 470 475 480

Ser Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Leu Ser Val

485 490 495

Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn Asn Ile Thr Leu Trp Lys Asn Gly

500 505 510

Asp Asn Val Val Lys Thr Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn Thr Val Val

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Gly Asn Ser Ile Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Ala

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580 585 590

Leu Val Lys Asp Ala Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Ser Asp Phe

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<210> 5

<211> 2340

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 5

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cttggtcaag atgagaagcc tcgctacaag gaccccagtg ttccagtgga ggagcgcgtc 120

actgatctgc tgggtcgtat gacgctcgag gagaagatgt ctcaattgat tcagggcgac 180

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attgttcaga cagaatctct tcacggattc ctcatcggta atgcaacgat ctataactct 420

cccatcgggt tcgcatgctc gttcaacccg gagcttatcg agaaaatggc acgcctcatc 480

ggtcaggagg cctcagccct tggggttaac cacgtaatgg gaccagtggt tgatctcgcc 540

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<210> 6

<211> 2959

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 6

atggtttccg gtgtctttac gaagggggtt ctgctcctgg gcctcttgtc gggtctggct 60

cttggtcaag atgagaagcc tcgctacaag gaccccagtg ttccagtgga ggagcgcgtc 120

actgatctgc tgggtcgtat gacgctcgag gagaagatgt ctcaattgat tcagggtgcg 180

attggaattg tctcgttttt accaacagga ggtactgatt gatcatcgca ggcgacatca 240

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<211> 779

<212> PRT

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 7

Met Val Ser Gly Val Phe Thr Lys Gly Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Leu Gly Gln Asp Glu Lys Pro Arg Tyr Lys Asp Pro

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Ser Val Pro Val Glu Glu Arg Val Thr Asp Leu Leu Gly Arg Met Thr

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Leu Glu Glu Lys Met Ser Gln Leu Ile Gln Gly Asp Ile Thr Asn Trp

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Met Asn Glu Thr Thr Gly Glu Phe Asn Leu Thr Gly Leu Glu Trp Ser

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Thr Lys Met Arg Gly Gly Met Phe Tyr Val Gly Tyr Pro Val Pro Trp

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Asp Tyr Ile Ala Asp Asn Val Lys Lys Ala Gln Asp Tyr Ile Leu Gln

100 105 110

Asn Thr Thr Leu Gly Ile Pro Ala Ile Val Gln Thr Glu Ser Leu His

115 120 125

Gly Phe Leu Ile Gly Asn Ala Thr Ile Tyr Asn Ser Pro Ile Gly Phe

130 135 140

Ala Cys Ser Phe Asn Pro Glu Leu Ile Glu Lys Met Ala Arg Leu Ile

145 150 155 160

Gly Gln Glu Ala Ser Ala Leu Gly Val Asn His Val Met Gly Pro Val

165 170 175

Val Asp Leu Ala Arg Glu Leu Arg Phe Gly Arg Val Glu Glu Thr Tyr

180 185 190

Gly Glu Asp Pro Phe Leu Ala Gly Glu Ile Gly Tyr His Tyr Thr Lys

195 200 205

Gly Ile Gln Ser His Asn Ile Ser Ala Asn Val Lys His Phe Val Gly

210 215 220

Phe Ser Gln Pro Glu Gln Gly Leu Asn Thr Ala Pro Val His Gly Gly

225 230 235 240

Glu Arg Tyr Leu Arg Thr Thr Trp Leu Pro Ser Phe Lys Arg Ala Ile

245 250 255

Met Asp Ala Gly Ala Trp Ser Ile Met Ser Ala Tyr His Ser Tyr Asp

260 265 270

Gly Ile Pro Ala Val Ala Asp Tyr His Thr Leu Thr Glu Ile Leu Arg

275 280 285

Glu Glu Trp Gly Tyr Lys Tyr Trp Val Thr Ser Asp Ala Gly Ala Ser

290 295 300

Asp Arg Val Cys Thr Ala Phe Lys Leu Cys Arg Ala Asp Pro Ile Asp

305 310 315 320

Lys Glu Ala Val Thr Leu Ala Ile Leu Pro Ala Gly Asn Asp Val Glu

325 330 335

Met Gly Gly Gly Ser Tyr Asn Phe Glu Thr Ile Ile Asp Leu Val Asn

340 345 350

Ala Gly Lys Leu Asp Ile Glu Ile Val Asn Thr Ala Val Ser Arg Val

355 360 365

Leu Arg Ala Lys Phe Glu Met Gly Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Asn Ala

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Asp Leu Ala Arg Glu Leu Asp Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Glu Asn

405 410 415

His Asp Asn Ala Leu Pro Leu Lys Lys Ser Gly Ser Ile Ala Val Ile

420 425 430

Gly Pro Met Ala His Gly Phe Met Asn Tyr Gly Asp Tyr Val Val Tyr

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Ser Asn Asp Gln Ser Gly Phe Ala Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Lys

485 490 495

Ser Asp Val Ala Val Val Val Val Gly Thr Trp Ser Arg Asp Gln Lys

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515 520 525

Asn Ser Leu Ser Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Leu Ile Lys Ala Ile

530 535 540

Ile Asp Thr Gly Val Pro Thr Val Val Val Leu Ser Ser Gly Lys Pro

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Ile Thr Glu Pro Trp Leu Ser Asn Asn Thr Ala Ala Leu Val Gln Gln

565 570 575

Phe Tyr Pro Ser Glu Gln Gly Gly Asn Ala Leu Ala Asp Val Leu Phe

580 585 590

Gly Asp Tyr Asn Pro Ser Gly Lys Leu Ser Val Ser Phe Pro His Ser

595 600 605

Val Gly Asp Leu Pro Ile Tyr Tyr Asp Tyr Leu Asn Ser Ala Arg Glu

610 615 620

Ile Gly Asp Ala Gly Tyr Ile Tyr Ser Asn Gly Thr Leu Glu Phe Gly

625 630 635 640

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645 650 655

Gly Lys Ser Tyr Ser Ser Phe Glu Tyr Gly Ala Val Lys Leu Asp Lys

660 665 670

Thr Asn Val Thr Glu Ala Asp Thr Val Thr Val Ser Val Asp Val Lys

675 680 685

Asn Thr Asp Ala Thr Arg Glu Gly Thr Glu Val Val Gln Val Tyr Val

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Val Asp Glu Val Ala Ser Val Val Val Pro Asn Arg Leu Leu Lys Gly

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Phe Lys Lys Val Val Ile Pro Ala Gly Gln Thr Lys Thr Val Glu Ile

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<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 8

Gln Asp Glu Lys Pro Arg Tyr Lys Asp Pro Ser Val Pro Val Glu Glu

1 5 10 15

Arg Val Thr Asp Leu Leu Gly Arg Met Thr Leu Glu Glu Lys Met Ser

20 25 30

Gln Leu Ile Gln Gly Asp Ile Thr Asn Trp Met Asn Glu Thr Thr Gly

35 40 45

Glu Phe Asn Leu Thr Gly Leu Glu Trp Ser Thr Lys Met Arg Gly Gly

50 55 60

Met Phe Tyr Val Gly Tyr Pro Val Pro Trp Asp Tyr Ile Ala Asp Asn

65 70 75 80

Val Lys Lys Ala Gln Asp Tyr Ile Leu Gln Asn Thr Thr Leu Gly Ile

85 90 95

Pro Ala Ile Val Gln Thr Glu Ser Leu His Gly Phe Leu Ile Gly Asn

100 105 110

Ala Thr Ile Tyr Asn Ser Pro Ile Gly Phe Ala Cys Ser Phe Asn Pro

115 120 125

Glu Leu Ile Glu Lys Met Ala Arg Leu Ile Gly Gln Glu Ala Ser Ala

130 135 140

Leu Gly Val Asn His Val Met Gly Pro Val Val Asp Leu Ala Arg Glu

145 150 155 160

Leu Arg Phe Gly Arg Val Glu Glu Thr Tyr Gly Glu Asp Pro Phe Leu

165 170 175

Ala Gly Glu Ile Gly Tyr His Tyr Thr Lys Gly Ile Gln Ser His Asn

180 185 190

Ile Ser Ala Asn Val Lys His Phe Val Gly Phe Ser Gln Pro Glu Gln

195 200 205

Gly Leu Asn Thr Ala Pro Val His Gly Gly Glu Arg Tyr Leu Arg Thr

210 215 220

Thr Trp Leu Pro Ser Phe Lys Arg Ala Ile Met Asp Ala Gly Ala Trp

225 230 235 240

Ser Ile Met Ser Ala Tyr His Ser Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Val Ala

245 250 255

Asp Tyr His Thr Leu Thr Glu Ile Leu Arg Glu Glu Trp Gly Tyr Lys

260 265 270

Tyr Trp Val Thr Ser Asp Ala Gly Ala Ser Asp Arg Val Cys Thr Ala

275 280 285

Phe Lys Leu Cys Arg Ala Asp Pro Ile Asp Lys Glu Ala Val Thr Leu

290 295 300

Ala Ile Leu Pro Ala Gly Asn Asp Val Glu Met Gly Gly Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Asn Phe Glu Thr Ile Ile Asp Leu Val Asn Ala Gly Lys Leu Asp Ile

325 330 335

Glu Ile Val Asn Thr Ala Val Ser Arg Val Leu Arg Ala Lys Phe Glu

340 345 350

Met Gly Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Asn Ala Ala Pro Ala Ser Glu Trp

355 360 365

Asn Lys Leu Ile His Thr Gln Glu Ala Val Asp Leu Ala Arg Glu Leu

370 375 380

Asp Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Glu Asn His Asp Asn Ala Leu Pro

385 390 395 400

Leu Lys Lys Ser Gly Ser Ile Ala Val Ile Gly Pro Met Ala His Gly

405 410 415

Phe Met Asn Tyr Gly Asp Tyr Val Val Tyr Glu Ser Gln Tyr Arg Gly

420 425 430

Val Thr Pro Leu Asp Gly Ile Lys Ala Ala Val Gly Asp Lys Ala Thr

435 440 445

Ile Asn Tyr Ala Gln Gly Cys Glu Arg Trp Ser Asn Asp Gln Ser Gly

450 455 460

Phe Ala Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Lys Ser Asp Val Ala Val Val

465 470 475 480

Val Val Gly Thr Trp Ser Arg Asp Gln Lys Glu Leu Trp Ala Gly Leu

485 490 495

Asn Ala Thr Thr Gly Glu His Val Asp Val Asn Ser Leu Ser Leu Val

500 505 510

Gly Ala Gln Ala Pro Leu Ile Lys Ala Ile Ile Asp Thr Gly Val Pro

515 520 525

Thr Val Val Val Leu Ser Ser Gly Lys Pro Ile Thr Glu Pro Trp Leu

530 535 540

Ser Asn Asn Thr Ala Ala Leu Val Gln Gln Phe Tyr Pro Ser Glu Gln

545 550 555 560

Gly Gly Asn Ala Leu Ala Asp Val Leu Phe Gly Asp Tyr Asn Pro Ser

565 570 575

Gly Lys Leu Ser Val Ser Phe Pro His Ser Val Gly Asp Leu Pro Ile

580 585 590

Tyr Tyr Asp Tyr Leu Asn Ser Ala Arg Glu Ile Gly Asp Ala Gly Tyr

595 600 605

Ile Tyr Ser Asn Gly Thr Leu Glu Phe Gly His Gln Tyr Ala Leu Gly

610 615 620

Asn Pro Lys Ala Trp Tyr Pro Phe Gly Tyr Gly Lys Ser Tyr Ser Ser

625 630 635 640

Phe Glu Tyr Gly Ala Val Lys Leu Asp Lys Thr Asn Val Thr Glu Ala

645 650 655

Asp Thr Val Thr Val Ser Val Asp Val Lys Asn Thr Asp Ala Thr Arg

660 665 670

Glu Gly Thr Glu Val Val Gln Val Tyr Val Val Asp Glu Val Ala Ser

675 680 685

Val Val Val Pro Asn Arg Leu Leu Lys Gly Phe Lys Lys Val Val Ile

690 695 700

Pro Ala Gly Gln Thr Lys Thr Val Glu Ile Pro Leu Lys Val Gln Asp

705 710 715 720

Leu Gly Leu Trp Asn Val Arg Met Lys Tyr Val Val Glu Pro Gly Ala

725 730 735

Phe Gly Val Leu Val Gly Ser Ser Ser Glu Asp Ile Arg Gly Asn Ala

740 745 750

Thr Phe Tyr Val Gln

755

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 9

agatctatga agcttggttg gatcgaggt 29

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 10

gtcgacttac tgggccttag gcagcga 27

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 11

gcggccgcat ggtttccggt gtctttacga agg 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 12

ggatcctcac tgcacataga aagtagcatt gcc 33

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 13

tactattagc tgaattgcca ctgctatcg 29

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 14

tctacaaccg ctaaatgttt ttgttcg 27

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 15

aattaattaa gagctagcg 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 16

ttaattctcg atcgcttaa 19

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 17

taagatctaa ggatgatctc gcgtactccc c 31

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 18

gtcgacttac tgggccttag gcagcga 27

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 19

aaggatccca agatgagaag cctcgctaca agg 33

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 20

gggtcgactc actgcacata gaaagtagca ttgcc 35

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 21

taaatgttta aatctgttgt ttattcaatt ttagccgctt ctttggccaa tgcag 55

<210> 22

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 22

ctagctgcat tggccaaaga agcggctaaa attgaataaa caacagattt aaacatttaa 60

t 61

<210> 23

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 23

taaatgcttt tgcaagcttt ccttttcctt ttggctggtt ttgcagccaa aatatctgca 60

g 61

<210> 24

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 24

taaatgagat ttccttcaat ttttactgca gttttattcg cagcatcctc cgcattagct 60

g 61

<210> 25

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 25

taaatgagat ttccttcaat ttttactgca gttttattcg cagcatcctc cgcattagct 60

g 61

<210> 26

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial（人造的）

<220>

<223> 合成DNA

<400> 26

ctagcagcta atgcggagga tgctgcgaat aaaactgcag taaaaattga aggaaatctc 60

atttaat 67

<210> 27

<211> 57

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(57)

<400> 27

atg aag ctt ggt tgg atc gag gtg gcc gca ttg gcg gct gcc tca gta 48

gtc agt gcc 57

<210> 28

<211> 19

<212> PRT

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 28

Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Val Ser Ala

<210> 29

<211> 66

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(66)

<400> 29

atg gtt tcc ggt gtc ttt acg aag ggg gtt ctg ctc ctg ggc ctc ttg 48

tcg ggt ctg gct ctt ggt 66

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae var. Brunneus）

<400> 30

Met Val Ser Gly Val Phe Thr Lys Gly Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Leu Gly

20

<210> 31

<211> 57

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(57)

<400> 31

atg aga ttt cct tca att ttt act gca gtt tta ttc gca gca tcc tcc 48

gca tta gct 57

<210> 32

<211> 19

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 32

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala

<210> 33

<211> 51

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(51)

<400> 33

atg ttt aaa tct gtt gtt tat tca att tta gcc gct tct ttg gcc aat 48

gca 51

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 34

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn

1 5 10 15

Ala

<210> 35

<211> 57

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(57)

<400> 35

atg ctt ttg caa gct ttc ctt ttc ctt ttg gct ggt ttt gca gcc aaa 48

ata tct gca 57

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 36

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

1 5 10 15

Ile Ser Ala

Claims (22)

1.一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括使以下的蛋白质(a)与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述没有支链的β1,2-糖苷键的工序，

(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质进一步包含分泌信号肽。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分泌信号肽为由序列号28、30、32、34及36中任一种记载的氨基酸序列构成的肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自甜茶苷、瑞鲍迪甙A及甜菊醇单糖苷。

6.一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括在生成具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的宿主中将导入有选自以下(a)～(b)的多核苷酸的非人转化体进行培养的工序，

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；以及

(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸为由序列号27、29、31、33及35中任一种记载的碱基序列构成的多核苷酸。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸插入在表达载体中。

10.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述转化体为转化曲菌、转化酵母或转化植物。

11.一种不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷的生产方法，其特征在于，包括在宿主细胞中使来自导入有选自以下(a)～(b)的多核苷酸的非人转化细胞的酶制剂与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷接触，从而剪切所述β1,2-糖苷键的工序，

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；以及

(b)编码由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多核苷酸进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述由编码分泌信号肽的碱基序列构成的多核苷酸为由序列号27、29、31、33及35中任一种记载的碱基序列构成的多核苷酸。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸插入在表达载体中。

15.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述转化细胞为转化曲菌、转化细菌或转化酵母。

16.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述不具有没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自甜茶苷、瑞鲍迪甙A及甜菊醇单糖苷。

18.一种制造瑞鲍迪甙B及甜菊醇中至少一个的方法，其特征在于，包括使以下的蛋白质(a)、以下的蛋白质(d)与具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷反应的工序，

(a)由序列号3或4的氨基酸序列构成的蛋白质；以及

(d)由序列号7或8的氨基酸序列构成的蛋白质，

所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷为选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷中的1个以上的甜菊醇糖苷。

19.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转化体为转化曲菌、转化酵母或转化植物。

20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述转化细胞为转化曲菌、转化细菌或转化酵母。

21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷。

22.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有至少1个没有支链的β1,2-糖苷键的甜菊醇糖苷选自瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙E、甜菊苷及甜菊醇双糖苷。

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