TWI795369B - 芝麻素酚或芝麻素酚配糖體之生產方法 - Google Patents

Abstract

本發明係尋求芝麻素酚配糖體及芝麻素酚之新穎製造方法。

本發明提供一種芝麻素酚配糖體及/或芝麻素酚之製造方法，係包含切斷芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵的步驟。

Description

芝麻素酚或芝麻素酚配糖體之生產方法

本發明係關於芝麻素酚(sesaminol)或芝麻素酚配糖體之生產方法。

芝麻(Sesamum indicum)為芝麻科芝麻屬之一年性植物。芝麻為有約6000年歴史之最古老栽培油糧植物，可於世界各處栽培。已知芝麻自古以來即為貴重食品，係有助於健康之食品。尤其，芝麻之種子、得自芝麻種子之油、芝麻種子之萃取物被廣泛利用。芝麻種子所含之成分中，約50%為脂質，其主要成分係以油酸及亞油酸為主體之甘油三酯。此外，就芝麻種子中之特徴性成分而言，包含芝麻木酚素。

木酚素(lignan)為植物之二次代謝物，為2分子之具有C₆C₃骨架之苯丙素類(phenylpropanoids)化合物，主要經由該等之8-8'位聚合(8,8'-鍵)而成的化合物。木酚素被認為有助於植物中之活體防禦機構。芝麻中所含之木酚素被稱為芝麻木酚素，有芝麻素(sesamin)、芝麻素酚、芝麻林素(sesamolin)、松脂(pinoresinol)、及芝麻林素 酚(sesamolinol)(非專利文獻1)。為芝麻木酚素之一的芝麻素，具有多樣化之生理活性，從芝麻種子或芝麻種子之榨粕中分離精製的方法已經實用化。

已知芝麻木酚素中之任一種均形成配糖體而存在於植物中。在芝麻木酚素之中，芝麻素酚具有高抗氧化活性。芝麻素酚於芝麻種子中係以芝麻素酚配糖體存在，芝麻素酚配糖體方面，有芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚單葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))、及芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)等。

又，芝麻素酚亦可於芝麻油之精製步驟中，藉由酸觸媒反應而從芝麻林素生成。芝麻素酚具有強力抗氧化活性，且被報導具有對健康有益的生理活性(非專利文獻2)。芝麻素酚之生理活性係藉由除去糖部分之糖苷配基(aglycone)而發揮。

又，芝麻油製造時產生之芝麻榨粕，雖含有芝麻素酚配糖體，然而卻未被有效靈活應用。若將芝麻素酚配糖體水解，可得到為糖苷配基之芝麻素酚，則將能以廉價之芝麻榨粕生產芝麻素酚。就從芝麻素酚配糖體取得芝麻素酚之方法而言，已開發使用真菌麴黴菌 (Aspergillus)屬微生物之方法(專利文獻1)，或使用芽孢桿菌屬及腸球菌屬菌之混合培養物的發酵法(專利文獻2)。然而，此等方法由於為了將芝麻素酚配糖體完全分解，需要長時間等而效率低。此外，就從芝麻素酚配糖體取得芝麻素酚之方法而言，揭示使用從屬於類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬之細菌KB0549株來源之β-葡萄糖苷酶的方法(專利文獻3、非專利文獻3)。此酵素係將芝麻素酚配糖體之β-1,2-及β-1,6-糖苷鍵及芝麻素酚-葡萄糖間β-糖苷鍵切斷。在以STG作為基質之情況，β-1,2-糖苷鍵比β-1,6-糖苷鍵優先水解。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2005-23125

[專利文獻2]日本特開2006-61115

[專利文獻3]日本特開2008-167712

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Biochemical Systematics and Ecology 13, 133-139 (1985)

[非專利文獻2]J. Agric. Food Chem., 64, 4908-4913 (2016)

[非專利文獻3]PLOS ONE, 8, e60538 (2013)

在如上述之狀況下，尋求芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之新穎生產方法。

本發明人等為解決上述課題而重覆專心檢討之結果，發現來自麴菌之糖苷水解酶的AOBGL11p，具有將芝麻素酚三葡萄糖苷水解，生成芝麻素酚及芝麻素酚配糖體的活性，於是完成本發明。

亦即，本發明如以下所示。

(1)一種製造生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體之方法，包含使選自以下之(a)至(c)所構成之群組中的蛋白質，與含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體反應，而使基質芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解的步驟；(a)由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質；(b)由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列構成，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解之活性的蛋白質；(c)含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解之活性的蛋白質。

(2)如上述(1)記載之方法，其中該基質芝麻素酚配糖體為選自芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚單葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))、及芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)所構成之群組中的任一種。

(3)如上述(1)或(2)記載之方法，其中前述基質芝麻素酚配糖體為芝麻素酚三葡萄糖苷(STG)。

(4)如上述(1)或(2)記載之方法，其中前述生成之芝麻素酚或生成之芝麻素酚配糖體為選自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚所構成之群組中的任一種以上。

(5)如上述(1)至(4)中任一項記載之方法，其中前述至少1個糖苷鍵為選自鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基(aglycone)之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之龍膽二糖(gentiobiose)之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖(sophorose)之β-1,2鍵、或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵所構成之群組中的任一種。

(6)一種製造生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體之方法，包含在宿主細胞中，使來自非人類轉形細胞之酵素劑與含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體接觸，而將基質芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解的步驟，其中該非人類轉形細胞係導入有選自以下(a)至(e)所構成之群組中之聚核苷酸：(a)由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸；(b)編碼由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質係由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(d)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(e)編碼具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解之活性的蛋白質的聚核苷酸；該聚核苷酸可與由互補性鹼基序列所構成之聚核苷酸於高嚴苛條件下雜交，其中該互補性鹼基序列係與由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸互補。

(7)如上述(6)記載之方法，其中該聚核苷酸係插入於表現載體者。

(8)如上述(6)或(7)記載之方法，其中該轉形細胞係選自轉形植物、轉形大腸菌、轉形細菌、轉形酵母、轉形絲狀菌所構成之群組。

(9)如上述(6)至(8)中任一項記載之方法，其中該基質芝麻素酚配糖體係選自芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚單葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷， SDG(1,2))、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))、及芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)所構成之群組中的任一種。

(10)如上述(6)至(9)中任一項記載之方法，其中該生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體係選自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚所構成之群組中的任一種。

(11)如上述(6)至(10)中任一項記載之方法，其中該至少1個糖苷鍵係選自鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2’位之龍膽二糖之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖之β-1,2鍵、或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵所構成之群組中的任一種。

(12)一種生產生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體之方法，包含培養非人類轉形體，該非人類轉形體係導入有選自以下之(a)至(e)所構成之群組中之聚核苷酸：(a)由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸；(b)編碼由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質係由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性； (d)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(e)編碼具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解之活性的蛋白質的聚核苷酸；該聚核苷酸可與由互補性鹼基序列所構成之聚核苷酸於高嚴苛條件下雜交，其中該互補性鹼基序列係與由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸互補。

(13)如上述(12)記載之方法，其中該聚核苷酸係插入於表現載體者。

(14)如上述(12)或(13)記載之方法，其中該轉形體係選自轉形植物、轉形大腸菌、轉形細菌、轉形酵母、轉形絲狀菌所構成之群組。

(15)如上述(12)至(14)中任一項記載之方法，其中該至少1個糖苷鍵係選自鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之龍膽二糖之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖之β-1,2鍵、或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵所構成之群組中的任一種。

依照本發明之方法，可提供芝麻素酚及芝麻素酚配糖體之新穎製造方法。

又，藉由選擇反應條件，可製造各種芝麻素酚配糖體。 在本發明之一實施態樣中，藉由選擇酵素濃度等反應條件，可使芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之生成量增加。又，藉由本發明之一實施態樣，可使SDG(1,2)之生成量選擇性地增加。

第1A圖為AOBGL11之cDNA序列及胺基酸序列之圖。

第1B圖為AOBGL11之cDNA序列及胺基酸序列之圖。

第2圖A：以pNP-β-Glc作為基質之AOBGL11p之最佳溫度的圖。B：以pNP-β-Glc作為基質之AOBGL11p之最佳pH的圖。C：以pNP-β-Glc作為基質之AOBGL11p之熱安定性的圖。D：以pNP-β-Glc作為基質之AOBGL11p之pH安定性的圖。

第3A圖為AOBGL11之基因組DNA序列與cDNA序列之比較圖。

第3B圖為AOBGL11之基因組DNA序列與cDNA序列之比較圖。

第4圖為芝麻素酚三葡萄糖苷之水解反應圖。反應時間為1小時。A：10倍稀釋之BGL11-1粗酵素液，B：未稀釋之BGL11-1粗酵素液，C：C-1粗酵素液。

以下詳細說明本發明。以下之實施態樣為 用於說明本發明之例示，然而本發明之旨趣並非僅只限定於此實施態樣。本發明在不超脫其要旨之範圍，能以各種態樣實施。

再者，本說明書中所引用之全部文獻及公開公報、專利公報之其他專利文獻，均作為參考而編入本說明書中。又，本說明書包含2016年9月23日申請的日本專利申請案(特願2016-186066號)之說明書及圖式所記載的內容，該日本專利申請案為本案優先權主張之基礎。

再者，以下將作為基質之芝麻素酚配糖體稱為「基質芝麻素酚配糖體」，亦將作為生成物之芝麻素酚配糖體稱為「生成芝麻素酚配糖體」。又，亦將兩者總稱為「芝麻素酚配糖體」。

「AOBGL11p」為糖苷水解酶家族3(GH3)之β-葡萄糖苷酶，其cDNA序列示於序列編號1，胺基酸序列示於序列編號2，基因組DNA序列示於序列編號3。

1.芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之製造方法

本發明提供一種芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之製造方法，包含使選自包含以下之(a)至(c)所構成之群組中的蛋白質(以下，稱為「本發明之蛋白質」)與芝麻素酚配糖體反應，而將至少1個糖苷鍵水解的步驟；(a)由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質；(b)由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且 具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質；(c)含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質。

上述(b)或(c)所記載之蛋白質，典型而言，為由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的變異體，然而亦包含例如使用“Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”、”Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、”Gene, 34, 315 (1985)”、”Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等所記載之部位特異變異導入法，藉由人為方式取得者。

就「由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質」而言，可列舉在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加例如1至83個、1至80個、1至75個、1至70個、1至65個、1至60個、1至55個、1至50個、1至49個、1至48個、1至47個、1至46個、1至45個、1至44個、1至43個、1至42個、1至41個、1至40個、1至39個、1至38個、1至37個、1至36個、1至35個、1至34個、1至33個、1至32個、1至31個、1至30個、1至29個、1至28個、1至27個、1至26個、1至25個、1至24個、1至23個、1至22個、1至21個、1至20個、1至19個、1至18個、1至17個、1至16個、1至15個、1至14個、1至13個、1至12個、1至11個、1至10個、1至9個(1至數個)、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1至2個、或1個胺基酸殘基之胺基酸序列所構成，且具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質。上述胺基酸殘基之刪除、置換、插入及/或附加之數，一般而言越小越好。

又，就此種蛋白質而言，可列舉具有與序列編號2之胺基酸序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質。上述序列相同性之數值，一般而言，越大越好。

本文中，「芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵」係指芝麻素酚與糖鍵結而成之配糖體，即芝麻素酚配糖體中，為糖苷配基之芝麻素酚與側鏈之間的糖苷鍵、及側鏈內之糖苷鍵。又，「將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素 酚配糖體之糖苷鍵水解的活性」係指一芝麻素酚與糖鍵結而成之配糖體，即芝麻素酚配糖體中，將為糖苷配基之芝麻素酚與側鏈之間的糖苷鍵、及側鏈內之糖苷鍵中之至少1個切斷(水解)的活性。就側鏈內之糖苷鍵之例而言，可列舉鍵結於芝麻素酚2'位之龍膽二糖之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖之β-1,2-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,2-糖苷鍵、及/或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵。某實施態樣中係將全部糖苷鍵水解，從芝麻素酚配糖體產生芝麻素酚。在其他實施態樣中係將鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵優先水解。以此種方式，產生只將一部分糖切斷之生成芝麻素酚配糖體或將全部糖切斷之芝麻素酚。

將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解的活性，可使本發明之蛋白質與選自例如STG、SDG(1,2)、SDG(1,6)、SMG所構成之群組中之至少1個基質芝麻素酚配糖體反應，將所得到之反應生成物(芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體)精製，再將經精製物藉由液相層析(Liquid Chromatography：LC)等周知之手法分析而確認。

在一實施態樣中，本發明提供一種芝麻素酚之製造方法，係包含將芝麻素酚配糖體之全部糖苷鍵切斷的步驟。在其他實施態樣中，本發明提供一種芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之製造方法，係包含將芝麻素酚配糖體之特定鍵，例如，鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之龍膽二糖之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖之β-1,2鍵及/或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵切斷的步驟。再者，在本發明中，將鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖水解的情況，β-1,6-鍵比β-1,2-鍵優先水解。

「在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸殘基」係指在相同序列中之任何1至83個胺基酸序列中之位置，有1至83個胺基酸殘基之刪除、置換、插入及/或附加，於刪除、置換、插入及附加中，可同時發生2種以上。

以下，展示可相互置換之胺基酸殘基之例。包含於相同群組之胺基酸殘基係可相互置換。

A群：白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、鄰甲基絲胺酸、三級丁基甘胺酸、三級丁基丙胺酸、環己基丙胺酸；B群：天冬胺酸、麩胺酸、異天冬胺酸、異麩胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基苯乙酸；C群：天冬醯胺酸、麩醯胺酸；D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸；E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸；F群：絲胺酸、酥胺酸、高絲胺酸；G群：苯丙胺酸、酪胺酸。

本發明之蛋白質可藉由使編碼該蛋白質之聚核苷酸(參照後述的「本發明之聚核苷酸」)於適當之宿主細胞內表現等而得到，然而亦可藉由Fmoc法(茀基甲基氧羰基法)、tBoc法(三級丁基氧羰基法)等之化學合成法製造。又，亦可利用AAPPTec LLC製、Perkin Elmer Inc.製、Protein Technologies Inc.製、PerSeptive Biosystems製、Applied Biosystems製、SHIMADZU CORPORATION製等之肽合成機進行化學合成。

在本發明中，「芝麻素酚配糖體」係指芝麻素酚與糖鍵結而成之配糖體。

芝麻素酚及芝麻素酚配糖體之例係以下述通式(I)表示。再者，將芝麻素酚2'位示於式中。在本發明中，「分枝三糖」係指下述通式(I)中，被附加於R₁部分者，其中構成三糖者。

就芝麻素酚配糖體之例而言，可列舉SMG、SDG(1,2)、SDG(1,6)及STG等，然而不限定於此等。

在本發明之一實施態樣中，本發明之酵素係使用由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質及/或 其變異體所構成之蛋白質。在其他實施態樣中，可利用芝麻素酚配糖體作為基質。其中，芝麻素酚配糖體之例子係如前述。在本發明之一實施態樣中，藉由使用本發明之酵素，並藉著調節添加於反應之酵素量、添加有機溶劑於反應液中、或調節反應溫度而調節反應條件，以芝麻油榨粕所含最多之芝麻素酚配糖體，即STG，作為基質，亦可能生成所謂SDG(1,2)或SDG(1,6)之稀有芝麻素酚配糖體。

在本發明中，以芝麻素酚配糖體作為基質之反應的酵素量、基質/酵素比、溫度、pH、有無溶劑、反應時間等，本領域技術人士可適宜調整，藉由調整此等，可決定在何處將芝麻素酚配糖體所鍵結之糖切斷或控制分解度。

藉由根據本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體的製造方法，可將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解。

在使用本發明之酵素的情況，產生芝麻素酚配糖體及/或芝麻素酚。

又，本發明之酵素可能優先地切斷芝麻素酚配糖體分子中之特定鍵結，藉此，可得到例如SDG(1,2)。在本案中，「優先地切斷芝麻素酚配糖體分子中之特定鍵結」係指選擇性偏好地將芝麻素酚配糖體之特定糖苷鍵水解。例如，以STG作為基質之情況係優先將STG鍵結於芝麻素酚2'位的分枝三糖之β-1,6鍵水解，生成SDG(1,2)。就「芝麻素酚配糖體分子中之特定鍵」而言，可列舉鍵結於芝麻 素酚2'位的分枝三糖之β-1,6鍵等。

在本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之製造方法中，為起始物質之芝麻素酚配糖體，可從芝麻種子或芝麻油榨粕，藉由適當之溶劑(水等水性溶劑或醇、醚及丙酮等有機溶劑)萃取，或藉由乙酸乙酯或其他有機溶劑：水之梯度、高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)、超高性能液相層析(Ultra(High)Performance Liquid Chromatography：UPLC)等周知之方法萃取、精製而取得。或者，為起始物質之芝麻素酚配糖體亦可為市售者。就為本發明之起始物質的芝麻素酚配糖體而言，可列舉STG、SDG(1,2)、SDG(1,6)、SMG等，藉由β-1,2-糖苷鍵或β-1,6糖苷鍵、及/或與為糖苷配基之芝麻素酚間之糖苷鍵的切斷，生成SDG(1,2)、SDG(1,6)、SMG、芝麻素酚等。

根據本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之製造方法，係包含使本發明之蛋白質與芝麻素酚配糖體反應，將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解的步驟。本發明之方法可進一步包含將於前述步驟中生成的本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體精製的步驟。本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體，可藉由適當之溶劑(水等水性溶劑；或醇、醚、丙酮等有機溶劑)萃取，或藉由乙酸乙酯或其他有機溶劑：水之梯度、高效液相層析(HighPerformanceLiquidChromatography：HPLC)、超高性能液相層析(Ultra(High)Performance Liquid Chromatography：UPLC)等周知之方法精製。

根據本發明之芝麻素酚配糖體及/或芝麻素酚之製造方法，可於含有基質之反應液中添加有機溶劑的條件下進行。相對於反應液總量，有機溶劑可在1%至20%之範圍，較佳為5%至15%、6至12%，更佳為8%。有機溶劑可為一般能取得者，較佳可為與水以任意比率混合者，可使用乙腈等。有機溶劑可預先添加於反應液中，又，亦可於反應之中途階段添加。

本說明書中，「聚核苷酸」係指DNA或RNA。

就編碼由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的聚核苷酸而言，可列舉例如由序列編號1之鹼基序列所構成的聚核苷酸。

就「由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質」而言，可列舉前述者。

就「含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解之活性的蛋白質」而言，可列舉前述者。

在本說明書中、「於高嚴苛條件下雜交之聚核苷酸」係指藉由將例如與序列編號1之鹼基序列互補的鹼基序列所構成之聚核苷酸、或與編碼序列編號2之胺基酸序列之鹼基序列互補的鹼基序列所構成之聚核苷酸的全 部或一部分，作為探針，採用菌落雜交法(colony hybridization)、斑塊雜交法(plaque hybridization)或南方雜交法(Southern hybridization)等而得到的聚核苷酸。就雜交之方法而言，可利用在例如“Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”、“Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”等中所記載的方法。

在本說明書中，「高嚴苛條件」係指例如5×SSC、5×登哈特(Denharht)溶液、0.5% SDS、50%甲醯胺、50℃，或0.2×SSC、0.1% SDS、60℃，或0.2×SSC、0.1% SDS、62℃，或0.2×SSC、0.1% SDS、65℃之條件，然而不以此為限。在此等條件中，將溫度升得越高，可期待越能有效率地得到具有高序列相同性之DNA。但是，就影響雜交之嚴苛性的要素而言，考慮溫度、探針濃度、探針之長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數個要素，若為本領域技術人士，藉由適宜選擇此等要素，即可實現同樣之嚴苛性。

再者，在使用市售之套組於雜交的情況，可使用例如Alkphos直接標記及檢測系統(Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare))。此情況，可依照套組所附之規程(protocol)，與標識之探針進行一夜培育後，將膜於55至60℃之條件下，用含0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後，檢測經雜交之DNA。或者，關於以與序列編號1之鹼基序列互補的鹼基序列、或與編碼 序列編號2之胺基酸序列之鹼基序列互補的鹼基序列之全部或一部分製作探針時，在使用市售之試藥(例如，PCR Labeling Mix(Roche Diagnostics公司)等)，將該探針進行地高辛(DIG)標識的情況，可使用DIG核酸檢測套組(Roche Diagnostics公司)檢測雜交。

就上述以外可雜交的聚核苷酸而言，可列舉藉由BLAST之同源性檢索軟體，使用預設之參數計算時，與序列編號1之鹼基序列之DNA或編碼序列編號2之胺基酸序列的DNA具有60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上之序列相同性的DNA。

再者，胺基酸序列或鹼基序列之序列相同性，可使用依照Karlin及Artur之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993)而決定。在使用BLAST之情況係使用各程式之預設 參數。

上述之本發明之聚核苷酸可藉由周知之基因工程手法或周知之合成手法而取得。

本發明之聚核苷酸可進一步包含由編碼分泌信號肽之鹼基序列所構成之聚核苷酸。較佳而言，由編碼分泌信號肽之鹼基序列所構成之聚核苷酸係被包含於本發明的聚核苷酸之5’末端。分泌信號肽及來自編碼該分泌信號肽之鹼基序列的聚核苷酸係與前述相同。

本發明之聚核苷酸較佳為以插入至適當之表現載體的狀態導入宿主中。

適當之表現載體通常以包含以下(i)至(iii)之方式而構成：(i)可於宿主細胞內轉錄之啟動子；(ii)與該啟動子鍵結的本發明之聚核苷酸；及(iii)以在宿主細胞內可發揮功能的信號作為構成要素的表現匣，其中該功能係有關RNA分子之轉錄終結及多聚腺苷酸化(polyadenylation)。

就表現載體之製作方法而言，可列舉使用質體、噬菌體或黏粒等的方法，然而無特別限定。

載體之具體種類無特別限定，可適當選擇能於宿主細胞中表現之載體。亦即，只要依據宿主細胞之種類，選擇確實可使本發明之聚核苷酸表現用的適當啟動子序列，並以將其與本發明之聚核苷酸插入各種質體等而成之載體作為表現載體即可。

本發明之表現載體依存於所欲導入之宿主的種類，含有表現控制區(例如啟動子、終結子及/或複製起點等)。就細菌用表現載體之啟動子而言，可使用慣用之啟動子(例如trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子等)，就酵母用啟動子而言，可列舉如甘油醛3磷酸脫氫酶啟動子、PH05啟動子等，就絲狀菌用啟動子而言，可列舉如澱粉酶、trpC等。又，就用於使目標基因在植物細胞內表現之啟動子之例而言，可列舉花椰菜花葉病毒之35S RNA啟動子、rd29A基因啟動子、rbcS啟動子、將前述花椰菜花葉病毒之35S RNA啟動子之增強子序列附加於來自農桿菌之甘露胺酸(mannopine)合成酵素啟動子序列之5’側的mac-1啟動子等。就動物細胞宿主用啟動子而言，可列舉病毒性啟動子(例如SV40初期啟動子、SV40後期啟動子等)。就藉由外在刺激使誘導性活性化的啟動子之例子而言，可列舉小鼠乳腺癌病毒(MMTV)啟動子、四環素回應性啟動子、金屬硫蛋白啟動子及熱休克蛋白啟動子等。

表現載體以含有至少1個選擇標記為較佳。就此種標記而言，可利用營養要求性標記(ura5、niaD)、藥劑耐性標記(潮黴素、Zeocin)、遺傳黴素(geneticin)耐性基因(G418r)、銅耐性基因(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984)、淺藍菌素(celenin)耐性基因(fas2m，PDR4)(分別得自豬腰淳嗣等，生化學，vol. 64, p. 660, 1992；Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991)等。

本發明之轉形體之製作方法(生產方法)無特別限定，可列舉如：將含本發明之聚核苷酸之表現載體導入宿主進行轉形的方法。就成為轉形對象的細胞或生物而言，可適合使用先前周知之各種細胞或生物。就成為轉形對象的細胞而言，可列舉如大腸菌(Escherichia coli)等細菌、酵母(出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe))、絲狀菌(米麴菌(Aspergillus oryzae)、醬油麴黴(Aspergillus sojae))、植物細胞、人類除外之動物細胞等。用於上述宿主細胞之適當培養基及條件為本技術領域所周知。又，成為轉形對象的生物亦無特別限定，可列舉於上述宿主細胞所例示之各種微生物或植物或人類以外之動物。轉形體較佳為絲狀菌、酵母或植物。就轉形中所用之宿主而言，亦可使用能生成芝麻素酚配糖體之任一種者。不僅可使用如芝麻之原本可生成至少1個芝麻素酚配糖體之植物，亦可使用在原本不會生成芝麻素酚配糖體之細胞或生物中導入至少1個芝麻素酚配糖體之生成所必要的基因者，作為宿主。「芝麻素酚配糖體之生成所必要的基因」可列舉如：日本特開2006-129728等所記載之具有芝麻素酚配糖體合成活性的基因。

就宿主細胞之轉形方法而言，可利用一般所用的周知之方法。例如，可藉由電穿孔法(Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000)、粒子輸送法(日本特開2005-287403「脂質生產菌之育種方法」中記載之方法)、原生質球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)、乙酸鋰法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)、Methods in yeast genetics,2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等所記載之方法)而實施，然而不以此等為限。又，對植物、或來自植物之組織或細胞進行基因導入時，可適宜選擇而使用例如農桿菌法(Plant Molecular Biology Mannual,Gelvin,S.B.et al.,Academic Press Publishers)、粒子槍法、PEG法、電穿孔法等。

使用來自非人類轉形細胞之酵素劑的本發明之芝麻素酚配糖體及/或芝麻素酚之製造方法

使本發明之蛋白質於宿主細胞內表現，藉由將細胞破碎，可得到本發明之蛋白質。使本發明之蛋白質與基質芝麻素酚配糖體作用，亦可生成本發明之芝麻素酚配糖體及/或芝麻素酚。

具體而言，藉由使來自本發明之轉形細胞的酵素劑，與含至少1個糖苷鍵之芝麻素酚配糖體接觸，可生成芝麻素酚。本發明之蛋白質即使於酵母中表現時，亦可呈現於麴菌中表現時相同的活性，此可在實施例中確認。

「來自轉形細胞之酵素劑」只要為使用轉形細胞所調製之含有本發明之蛋白質者即可，無特別限定，例如，為轉形細胞本身、轉形細胞之粉碎物本身、轉形細胞之培養上清液本身、及此等之精製物。因此，本發明提供一種芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之製造方法，包含在宿主細胞 中，使來自非人類轉形細胞的酵素劑與含至少1個糖苷鍵之芝麻素酚配糖體接觸，而將至少1個糖苷鍵水解的步驟，其中該非人類轉形細胞係導入有選自以下(a)至(e)所構成之群組中的聚核苷酸：(a)由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸；(b)編碼由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質係由在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至83個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(d)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(e)編碼具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解之活性的蛋白質的聚核苷酸；該聚核苷酸可與由互補性鹼基序列所構成之聚核苷酸於高嚴苛條件下雜交，其中該互補性鹼基序列係與由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸互補。

選自上述(a)至(e)所構成之群組中的聚核苷酸，即為本發明之聚核苷酸，係與前述相同。

「接觸」係指使本發明之來自轉形細胞之酵素劑與含至少1個糖苷鍵之芝麻素酚配糖體存在於相同 反應系統或培養系統中，例如包含：在含本發明之來自轉形細胞之酵素劑的容器中，添加含至少1個糖苷鍵之芝麻素酚配糖體；將本發明之來自轉形細胞之酵素劑與具有至少1個糖苷鍵之芝麻素酚配糖體混合；將本發明之來自轉形細胞之酵素劑添加於具有含至少1個糖苷鍵之芝麻素酚配糖體的容器中。

在轉形體為酵母或麴菌之情況，本發明之聚核苷酸轉形的酵母或麴菌與野生型相比，表現較多的本發明蛋白質。因此，表現的本發明蛋白質，與酵母或麴菌所生成之芝麻素酚配糖體反應，於酵母或麴菌之細胞內或培養液中生成芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體，較佳為於培養液中生成。

在轉形體為植物之情況，成為本發明中轉形對象的植物，意指整株植物體、植物器官(例如葉、花卉、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、篩管部、柔軟組織、木質部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養細胞、或各種形態之植物細胞(例如懸浮培養細胞)、原生質體、葉之切片、癒合組織等之任一種。就用於轉形之植物而言，可為屬於單子葉植物綱或雙子葉植物綱之植物之任一種。要確認本發明之聚核苷酸是否導入植物中，可依照PCR法、南方雜交法、北方雜交法等而進行。一旦取得將本發明之聚核苷酸插入基因組內之轉形植物體，即可藉由該植物體之有性生殖或無性生殖得到其子孫。又，從該植物體或其子孫、或此等純系得到例如種子、果實、切穗、塊莖、塊根、株體、癒合組織、原生質體等，可基於其等而將該植物體量產。以本發明之聚核苷酸轉形的植物(以下稱為「本發明之植物」)，與其野生型相比，含較多的本發明蛋白質。因此，本發明之蛋白質，與本發明之植物所生成之芝麻素酚配糖體反應，而於植物中生成芝麻素酚。又，在植物體中之環境並非最適合水解反應的情況，芝麻素酚配糖體之糖苷鍵的水解反應受到抑制，生成未切斷糖苷鍵而維持原樣之芝麻素酚配糖體或僅切斷糖苷鍵之一部分的芝麻素酚配糖體。

本發明之幾個態樣之轉形體或其培養液，與其野生型相比，本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體的含量較高，在其萃取物或培養液中，含有高濃度的本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體。本發明之轉形體之萃取物，可藉由使用玻璃珠、均質機或超音儀等將轉形體破碎，將該破碎物離心處理，再回收其上清液而得到。在本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體蓄積於培養液中的情況，藉由於培養終了後，依照通常之方法(例如離心、過濾等)將轉形體與培養上清液分離，可得到含本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體的培養上清液。

此種方式所得到之萃取液或培養上清液，可進一步提供於精製步驟。本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之精製，可依照通常之分離及精製方法而進行。具體之方法與前述相同。

「芝麻素酚配糖體」、「具有至少1個糖苷 鍵之芝麻素酚配糖體」及「將至少1個糖苷鍵水解之活性」係與前述相同。

其他，關於一般分子生物學之手法，可參照”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Methods in Yeast Genetics，A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, NY)”等。

此種方式所得到之本發明之芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體，可依照常法，使用於例如食品、甜味料、香料、醫藥品、工業原料(化妝料、肥皂等之原料)之製造等用途。

就食品之例而言，可列舉特定保健用食品、營養機能食品、機能性顯示食品、營養輔助食品、健康食品、機能性食品、幼兒用食品、老人用食品等。本說明書中，食品為固體、流動體、及液體、及此等之混合物而可攝食者的總稱。

再者，在本說明書中所引用之全部文獻及公開公報、專利公報或其他專利文獻，均編入本說明書中，作為參考。

[實施例]

以下，使用實施例更具體地說明本發明，然而本發明之範圍並不受此等實施例之限定。

[實施例1]

麴菌之β-葡萄糖苷酶基因之探討

藉由麴菌基因組數據(PRJNA28175)，探討β-葡萄糖苷酶同源物，發現為菌體內β-葡萄糖苷酶之同源物的AO090701000244(CDS序列：序列編號1，推測胺基酸序列：序列編號2，ORF序列：序列編號3，基因組DNA序列：序列編號4)。以其作為AOBGL11進行純系化。將AOBGL11之cDNA序列及胺基酸序列示於第1圖。

AOBGL11之基因組DNA之選殖

為了選殖AOBGL11，設計以下之引子。

AOBGL11-F：

5'-ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA-3'(序列編號4)AOBGL11-R：5'-TCACAGACCCAACCAGTAGCGA-3'(序列編號5)

將米麴菌Aspergillus oryzae var.Brunneus(IFO30102)之分生孢子接種至10ml之液體培養基(每1L中含20g之葡萄糖、1g之細菌用胰蛋白腖、5g之酵母萃取物、1g之NaNO₃、0.5g之K₂HPO₄、0.5g之MgSO₄‧7H₂O、0.01g之FeSO₄‧7H₂O)中，於30℃培養1日。藉由過濾收集菌體，在液態氮中磨碎後，使用DNeasy植物迷你套組(DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN))，調製基因組DNA。

以基因組DNA作為模板，使用引子AOBGL11-F及AOBGL11-R，以KOD-plus(東洋紡)進行PCR。將所得到之約2.57kbp之DNA斷片，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)進行純系化，得到質體 pCR-AOBGL11g。

[實施例2]

藉由麴菌之AOBGL11p的生產 麴菌表現用載體之構築

將麴菌用載體pUNA(酒類綜合研究所)以限制酵素SmaI消化所得到之DNA斷片，與將質體pCR-AOBGL11g以限制酵素EcoRI消化，末端藉由Blunting Kit(Takara Bio)平滑化所得到之約2.57kbp的DNA斷片連結，得到11g之質體pUNA-AOBGL。

麴菌之轉形

麴菌之轉形係如以下之方式實施。

使用米麴菌(Aspergillus oryzae)niaD300株(酒類綜合研究所)作為宿主。將宿主株接種至PDA培養盤，於30℃培養約1週。為了得到分生孢子懸浮液，添加0.1% tween80、0.8% NaCl，將分生孢子懸浮。以Miracloth過濾後，藉由離心回收分生孢子，進一步用0.1% tween80，0.8% NaCl洗淨，並懸浮於滅菌水。將分生孢子塗布於CD培養盤(每1L中含6g之NaNO₃、0.52g之KCl、1.52g之KH₂PO₄、10g之葡萄糖、2ml之1M MgSO₄、1ml之微量元素溶液(Trace element solution，每1L中含1g之FeSO₄‧7H₂O、8.8g之ZnSO₄‧7H₂O、0.4g之CuSO₄‧5H₂O、0.1g之NaB₄O₇‧10H₂O、0.05g之(NH₄)₆Mo₇O₂₄‧4H₂O)、20g之瓊脂(pH6.5))，藉由粒子輸送法，進行DNA之導入。使用PDS-1000/He(Bio-Rad)，粒子：鎢M-10、碎裂盤：1100psi、 距離：3cm。轉形株係選取於CD培養盤中生育者。將藉由質體pUNA-AOBGL11g轉形所得到之轉形株當作BGL11-1株，將藉由對照載體pUNA轉形所得到之轉形株當作C-1株。

藉由麴菌之AOBGL11p之表現

將BGL11-1株或C-1株接種至CD培養盤，於30℃培養7日，使形成分生孢子。為了得到分生孢子懸浮液，添加0.1% tween80、0.8% NaCl，將分生孢子懸浮。以Miracloth(註冊商標)過濾後，藉由離心回收分生孢子，進一步用0.1% tween80、0.8% NaCl洗淨，懸浮於滅菌水，形成分生孢子懸浮液，將此分生孢子懸浮液接種於酵素生產用液體培養基(每1L中含100g之麥芽糖、1g之細菌用胰蛋白腖、5g之酵母萃取物、1g之NaNO₃、0.5g之K₂HPO₄、0.5g之MgSO₄‧7H₂O、0.01g之FeSO₄‧7H₂O)，於30℃振動2日進行培養。藉由Miracloth(註冊商標)過濾，收集菌體。將所得到之濕菌體中約0.4g以液態氮凍結，用乳鉢研碎。將研碎菌體懸浮於50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)，充分混合後，進行離心。使用Amicon(註冊商標)Ultra-1550k(Merck)，藉由超過濾(ultrafiltration)將所得到之上清液濃縮，再藉由含0.1% CHAPS之50mM磷酸鈉緩衝液pH7.0(緩衝液A)置換，得到約1ml之粗酵素液。

蛋白質濃度之測定

粗酵素液之蛋白質濃度係使用蛋白質檢定CBB溶液(5倍濃縮)(Nakarai Tesque)來定量。其結果，在BGL11-1 粗酵素液中為6.46mg/ml，在C-1粗酵素液中為4mg/ml。

[實施例3]

pNP-β-Glc分解活性

檢討pNP-β-Glc之分解活性。將10μL之粗酵素液、50μL之0.2M磷酸鈉緩衝液(pH7.0)、50μL之20mM pNP-β-Glc水溶液，加水成為總量200μL，於37℃反應。再者，BGL11-1粗酵素液由於活性高，使用將粗酵素液以含0.1% CHAPS之50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)稀釋100倍者。基於pNP-β-Glc水解而游離之對硝基酚(pNP)，每1分鐘之405nm的吸光度變化(Δ405)，BGL11-1粗酵素液為0.244，C-1粗酵素液為0.000。從以上之結果，亦暗示AOBGL11p具有β-葡萄糖苷酶活性。

以pNP-β-Glc作為基質，調查AOBGL11p的最適溫度、最適pH及熱安定性、pH安定性(第2圖(第2A圖至第2D圖))。再者，BGL11-1粗酵素液係使用以緩衝液A稀釋5000倍者(蛋白質濃度1.3μg/ml)。

最適溫度：反應液中添加20μl之粗酵素液(1.3μg/ml)、100μl之0.2M磷酸鈉緩衝液(pH6.5)、20mM pNP-β-Glc，加水使總量成為400μl，從反應開始後15分鐘、30分鐘、45分鐘取樣100μl，與100μl之0.2M碳酸鈉溶液混合後，測定405nm之吸光度，求取Δ405。以Δ405成為最大之45℃當作1，將於各溫度反應時之Δ405的比率示於第2A圖。藉此，可知45-50℃為反應最適溫度。

最適pH：在反應液中添加20μl之粗酵素液 (1.3μg/ml)、100μl之0.2M緩衝液、20mM pNP-β-Glc，加水使總量成為400μl。緩衝液於pH4.0-6.0時使用乙酸鈉緩衝液，於pH6.0-8.0時使用磷酸鈉緩衝液。以與上述相同之方式進行取樣、測定，將於各pH反應時之Δ405相對於Δ405之最大值的比率示於第2B圖。藉此，可知pH6.0-7.0為反應最適pH。

熱安定性：將5000倍稀釋之粗酵素液(1.3μg/ml)分別於30℃、37℃、45℃、50℃保持10分鐘後，進行冰冷。在反應液中添加5μl之粗酵素液(1.3μg/ml)、100μl之0.2M磷酸鈉緩衝液(pH6.5)、20mM pNP-β-Glc，並加水使總量成為100μl，於37℃反應45分鐘後，添加100μl之0.2M碳酸鈉溶液，測定405nm之吸光度。求取相對於無熱處理之酵素液經45分鐘後於405nm的吸光度，各溫度處理時之比率，並示於第2C圖。可知AOBGL11p以10分鐘處理至37℃時安定，然而以45℃處理至約半分鐘失活，以50℃處理時活性幾乎消失。

pH安定性：將粗酵素液以pH4.5、5.0、5.5、6.0(0.2M乙酸緩衝液)、pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0(0.2M磷酸鈉緩衝液)之各種緩衝液稀釋5000倍，於37℃保持1小時後，冰冷之。在反應液中添加5μl之粗酵素液(1.3μg/ml)、100μl之0.2M磷酸鈉緩衝液(pH6.5)、20mM pNP-β-Glc，並加水使總量成為100μl，於37℃反應45分鐘後，添加100μl之0.2M碳酸鈉溶液，並測定405nm之吸光度。求取保持於各pH時之吸光度相對於保持pH6.5(活 性最高)時之吸光度的比率，並示於第2D圖。可知AOBGL11p於pH6.5附近最安定。

[實施例4]

AOBGL11之cDNA之選殖

將BGL11-1株於酵素生產用培養基10ml中培養，藉由過濾收集菌體。將菌體以液態氮凍結，以乳鉢將菌體磨碎後，用RNeasy(QIAGEN)萃取總RNA。藉由SuperScript雙股cDNA合成套組(SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(生命科技))，合成cDNA。以此作為模板，使用引子AOBGL11-F及AOBGL11-R，以KOD-plus(東洋紡)進行PCR。將所得到之約2.52kbp之DNA斷片，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)，將AOBGL11之cDNA純系化，得到質體pCR-AOBGL11cDNA。確認鹼基序列係如序列編號1，推測胺基酸序列如序列編號2。將AOBGL11之基因組DNA序列與cDNA序列之比較示於第3圖。再者，與從已確認具STG水解活性且屬於類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬之細菌KB0549株而來的β-葡萄糖苷酶之推測胺基酸序列的相同性為30.3%。

[實施例5]

以酵母生產AOBGL11p 酵母用表現載體之構築及酵母之轉形

將質體pCR-AOBGL11cDNA以EcoRI消化所得到之約2.52kbp之DNA斷片，插入酵母表現載體pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)之EcoRI位點，選 出AOBGL11被插入載體pYE22m之從GAPDH啟動子表現之方向者，作為pYE-AOBGL3c。就轉形之親株而言，使用釀酒酵母(S. cerevisiae)之EH13-15株(trp1，MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)。分別使用質體pYE22m(對照)、pYE-AOBGL11(AOBGL11表現用)，依照乙酸鋰法，將EH13-15株轉形。轉形株係選取於SC-Trp(每1L中含有6.7g之含或不含胺基酸之酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO))、20g之葡萄糖、及1.3g之胺基酸粉末(由1.25g之腺嘌呤硫酸鹽、0.6g之精胺酸、3g之天冬胺酸、3g之麩胺酸、0.6g之組胺酸、1.8g之白胺酸、0.9g之離胺酸、0.6g之甲硫胺酸、1.5g之苯基丙胺酸、11.25g之絲胺酸、0.9g之酪胺酸、4.5g之纈胺酸、6g之酥胺酸、0.6g之尿嘧啶混合而成者))瓊脂培養基(2%瓊脂)上繁殖者。

將以質體pYE22m轉形所得到之株當作C-Y株，將以質體pYE-AOBGL11轉形所得到之株當作AOBGL11-Y株。將選取之C-Y株及AOBGL11-Y株，在添加1/10量之1M磷酸鉀緩衝液的SC-Trp液體培養基10mL中接種1白金耳，並於30℃，以125rpm進行2日振動培養。將所得到之培養物藉由離心，分為培養上清液及菌體。將培養上清液使用Amicon(註冊商標)Ultra-15 50k(Merck)，藉由超過濾而濃縮，以含0.1% CHAPS之50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)進行緩衝液置換，得到約1ml之培養上清濃縮液。

將菌體懸浮於50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)、0.1% CHAPS溶液1ml中，藉由玻璃珠將菌體破碎，進行離心，以所得到之上清液作為菌體破碎液。將培養上清濃縮液或菌體破碎液調至20μl，添加1μl之2% X-β-Glc/DMF溶液，並於室溫反應5分鐘時，只有來自AOBGL11-Y株之菌體破碎液呈現藍色，暗示具有X-β-Glc活性。

pNP-β-Glc活性測定

檢討pNP-β-Glc之分解活性。將10μL之粗酵素液、50μL之0.2M磷酸鈉緩衝液(pH7.0)、50μL之20mM pNP-β-Glc水溶液，加水使總量成為200μL，並於37℃反應。再者，由於BGL11-1粗酵素液活性高，使用將粗酵素液以含0.1% CHAPS之50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)稀釋100倍者。基於pNP-β-Glc水解而游離之對硝基酚(pNP)，每1分鐘之405nm的吸光度變化(Δ405)，於AOBGL11-Y粗酵素液為0.068，於C-Y粗酵素液為0.000。

[實施例6]

AOBGL11p之芝麻素酚配糖體水解活性

使用芝麻素酚三葡萄糖苷(STG)作為基質。將50μg/mL之STG、50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)、及20μL之上述BGL11-1粗酵素液或其稀釋液，調至總量100μL，於37℃反應1小時。亦使上述C-1粗酵素液同樣地反應，作為對照。將反應液於100℃處理3分鐘，使反應停止後，以Cosmospin過濾器H(Nakarai Tesque)過濾後，付諸於 HPLC。

HPLC之分析條件如以下所示。

管柱：Cosmosil 5C₁₈-AR-II 4.6mmI.D.x250mm(Nakarai Tesque)

移動相：A：0.1%(v/v)三氟乙酸、2：8(v/v)乙腈：水

B：0.1%(v/v)三氟乙酸、8：2(v/v)乙腈：水

B濃度10%(0分鐘至3分鐘)→100% 24分鐘直線性梯度，100%(24分鐘-35分鐘)

流速：0.7ml/分鐘

溫度：40℃

檢測：UV290nm

將結果示於第4圖。

與經10倍稀釋之BGL11-1粗酵素液反應的情況，基質之STG的一部分水解，亦生成SDG(1,6)及SDG(1,2)及為糖苷配基之芝麻素酚(第4A圖)。

又，在不將BGL11-1粗酵素液稀釋而反應之情況，所添加作為基質的STG幾乎全部水解，生成SDG(1,2)及為糖苷配基之芝麻素酚(第4B圖)。由於在與經10倍稀釋之BGL11-1粗酵素液反應的情況，SDG(1,2)比SDG(1,6)多，而在BGL11-1粗酵素液未稀釋而反應之情況，未檢測出SDG(1,6)而只檢測出SDG(1,2)，此暗示AOBGL11p對STG之分枝糖鏈中的β-1,6鍵作用強於對β-1,2鍵的作用。

從以上之結果，顯示與β-1,2鍵相比，AOBGL11p優先將β-1,6鍵水解，最後水解至成為糖苷配基之芝麻素酚 的形式。又，顯示藉由調整酵素液之濃度，可控制芝麻素酚配糖體之水解的進行。再者，C-1粗酵素液與STG之反應的結果示於第4C圖中，由此結果顯示C-1粗酵素液不進行STG之水解。

[產業上之可利用性]

本發明係提供使用來自麴菌之葡萄糖苷水解酶，即AOBGL11p，而將芝麻素酚三葡萄糖苷水解，生產芝麻素酚及/或芝麻素酚配糖體之方法。

<110> 三得利控股股份有限公司(Suntory Holdings Limited)

<120> 芝麻素酚或芝麻素酚配糖體之生產方法

<130> G1644WO

<140> TW106132623

<141> 2017-09-22

<150> JP 2016-186066

<151> 2016-09-23

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2520

<212> DNA

<213> 米麴菌(Aspergillus oryzae)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2517)

<400> 1

<210> 2

<211> 839

<212> PRT

<213> 米麴菌

<400> 2

<210> 3

<211> 2571

<212> DNA

<213> 米麴菌

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AOBGL11-F

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AOBGL11-R

<400> 5

Claims (15)

1. 一種製造生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體之方法，包含使選自以下(a)及(c)所構成之組群中的蛋白質，與含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體反應，而使基質芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解的步驟；(a)由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質；(c)含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解之活性的蛋白質。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基質芝麻素酚配糖體為選自芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚單葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))、及芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)所構成之群組中的任一種。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該基質芝麻素酚配糖體為STG。
4. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該生成 芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體為選自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚所構成之群組中的任一種以上。
5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該至少1個糖苷鍵為選自鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基(aglycone)之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'之龍膽二糖(gentiobiose)之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'之槐糖(sophoroze)之β-1,2鍵、或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵所構成之群組中的任一種。
6. 一種製造生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體之方法，包含在宿主細胞，使來自非人類轉形細胞的酵素劑，與含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體接觸，將基質芝麻素酚配糖體之至少1個糖苷鍵水解的步驟，其中該非人類轉形細胞係導入有選自以下(a)、(b)、(d)及(e)所構成之群組中之聚核苷酸：(a)由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸；(b)編碼由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的聚核苷酸；(d)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(e)編碼具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解之活性的蛋白質的聚核苷酸；該聚核 苷酸可與由互補性鹼基序列所構成之聚核苷酸於高嚴苛條件下雜交，其中該互補性鹼基序列係與由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸互補。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該聚核苷酸係插入於表現載體者。
8. 如申請專利範圍第6或7項所述之方法，其中該轉形細胞係選自轉形植物、轉形大腸菌、轉形細菌、轉形酵母、轉形絲狀菌所構成之群組。
9. 如申請專利範圍第6或7項所述之方法，其中該基質芝麻素酚配糖體為選自芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚單葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))、及芝麻素酚2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)所構成之群組中的任一種。
10. 如申請專利範圍第6或7項所述之方法，其中該生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體為選自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚所構成之群組中的任一種以上。
11. 如申請專利範圍第6或7項所述之方法，其中該至少1個糖苷鍵為選自鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之龍膽二糖 之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖之β-1,2鍵、或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵所構成之群組中的任一種。
12. 一種生產生成芝麻素酚或生成芝麻素酚配糖體之方法，其包含培養非人類轉形體，該非人類轉形體係導入有選自以下之(a)、(b)、(d)及(e)所構成之群組中之聚核苷酸：(a)由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸；(b)編碼由序列編號2之胺基酸序列所構成之蛋白質的聚核苷酸；(d)編碼下述蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質含有對比於序列編號2之胺基酸序列，具有90%以上之序列相同性的胺基酸序列，且具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體的糖苷鍵水解的活性；(e)編碼具有將含至少1個糖苷鍵之基質芝麻素酚配糖體之糖苷鍵水解之活性的蛋白質的聚核苷酸；該聚核苷酸可與由互補性鹼基序列所構成之聚核苷酸於高嚴苛條件下雜交，其中該互補性鹼基序列係與由序列編號1之鹼基序列所構成之聚核苷酸互補。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該聚核苷酸係插入於表現載體者。
14. 如申請專利範圍第12或13項所述之方法，其中該轉形體係選自轉形植物、轉形大腸菌、轉形細菌、轉形酵母、轉形絲狀菌所構成之群組。
15. 如申請專利範圍第12或13項所述之方法，其中該至少1個糖苷鍵為選自鍵結於芝麻素酚2'位之葡萄糖與糖苷配基之間的糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之龍膽二糖之β-1,6-糖苷鍵、鍵結於芝麻素酚2'位之槐糖之β-1,2鍵、或鍵結於芝麻素酚2'位之分枝三糖之β-1,6-糖苷鍵或β-1,2鍵所構成之群組中的任一種。

Images