JP4927774B2 - Udp−グルクロン酸転移酵素およびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Description
(a)配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列、配列番号:10で表される塩基配列の第1番目〜第1365番目の塩基配列、配列番号:12で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列、及び配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなる群から選択される1つの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列、配列番号:10で表される塩基配列の第1番目〜第1365番目の塩基配列、配列番号:12で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列、及び配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなる群から選択される1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または
(f)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(2) 以下の(g)〜(j)のいずれかである上記(1)に記載のポリヌクレオチド:
(g)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列において10個以下(0〜10個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列に対して、90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(i)配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列、配列番号:10で表される塩基配列の第1番目〜第1365番目の塩基配列、配列番号:12で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列、及び配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなる群から選択される1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または
(j)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(3)配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(4)配列番号:10で表される塩基配列の第1番目〜第1365番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)配列番号:12で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(6)配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(7)配列番号:5のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(8)配列番号:11のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(9)配列番号:13のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(10)配列番号:23のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(11)DNAである、上記(1)〜(10)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
(12)上記(1)〜(11)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(13)上記(1)〜(11)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
(14)上記(1)〜(11)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
(15)上記(13)に記載のベクターが導入された形質転換体。
(16)上記(14)又は(15)に記載の形質転換体を用いる上記(10)のタンパク質の製造方法。
(17)上記(12)に記載のタンパク質を触媒として、UDP−グルクロン酸とフラボノイドからグルクロン酸抱合体を生成する、グルクロン酸抱合体の製造方法。
まず、本発明は、(a) 配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列、配列番号:10で表される塩基配列の第1番目〜第1365番目の塩基配列、配列番号:12で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列、及び配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなる群から選択される1つの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド(具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する);及び(b)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のUDP−グルクロン酸転移酵素をコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列において、例えば、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個(1〜数個)、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列に対して、約80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
UDP−グルクロン酸転移酵素活性は、例えば、UDP−グルクロン酸と糖受容体基質(例えば、フラボン)を評価対象となる酵素の存在下で反応させ、得られる反応物をHPLC等で分析することによって測定することができる(より具体的には、後述の実施例の記載を参照)。
本発明は、さらに別の実施形態において、上記ポリヌクレオチド(a)〜(f)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号:5、11、13及び23からなる群から選択される1つのアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン; B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸; C群:アスパラギン、グルタミン; D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸; E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン; F群:セリン、スレオニン、ホモセリン; G群:フェニルアラニン、チロシン。
スチルベンには、レスベラトロール(Resveratrol)およびその配糖体のピセイド(piceid)等が含まれる。
リグナンには、(+)-ピノレジノール((+)-Pinoresinol)、(+)-ピペリトール((+)-Piperitol)、(+)-セサミノール((+)-Sesaminol)、(+)-セコイソラリシレジノール((+)-Secoisolariciresinol)、(+)-セサミンカテコール1((+)-Sesamim catecol1)(SC1)、(+)-セサミンカテコール2((+)-Sesamim catecol2)(SC2)、(+)-エピセサミンカテコール2((+)-Episesamim catecol2)(EC2)、およびマタイレジノール(matairesinol)等が含まれる。
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、上記(a)〜(f)のいずれかのポリヌクレオチドを含有する。好ましくは、本発明の発現ベクターは、(g)〜(j)のいずれかのポリヌクレオチドを含有する。さらに好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号:10で表される塩基配列の第1番目〜第1365番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号:12で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号:22で表される塩基配列の第1番目〜第1371番目の塩基配列からなる群から選択される1つのポリヌクレオチド、又は、配列番号:5のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、配列番号:11のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、配列番号:13のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び配列番号:23のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される1つのポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有する。
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる本発明のタンパク質の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質を用いてグルクロン酸抱合体を製造する方法を提供する。本発明のタンパク質は、糖受容体基質(例えば、フラボノイド、スチルベン、またはリグナン)にUDP−グルクロン酸からグルクロン酸を転移する反応を触媒するので、本発明のタンパク質を用いることにより、糖受容体基質およびUDP−グルクロン酸を原料として、グルクロン酸抱合体を製造することができる。糖受容体基質は、好ましくは、フラボノイドである。
例えば、1mMの糖受容体基質、2mMのUDP−グルクロン酸、50mMのリン酸カルシウムバッファー(pH7.5)、および20μMの本発明のタンパク質を含む溶液を調製し、30℃で、30分間反応させることにより、グルクロン酸抱合体を製造することができる。この溶液から、グルクロン酸抱合体は、公知の方法により分離・精製することができる。具体的には、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
このようにして得られるグルクロン酸抱合体は、その生体内での機能を調べるための試薬や、抗酸化剤などとして有用である(Gao, Z., Huang, K., Yang, X., and Xu, H. (1999) Biochimica et Biophysica Acta 1472, 643−650.)。
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
本実施例では、シソ科ヤクシマタツナミソウからPCRによりSb7GATホモログ遺伝子(SlUGT)をクローニングし、この遺伝子をプローブとしてフラボノイドの7位グルクロン酸抱合体を蓄積するシソ科シソの葉由来cDNAライブラリーからフラボノイドの7位グルクロン酸転移酵素の単離を試みた。
スクリーニングの結果、シソ由来配糖化酵素(PfUGT)の中にフラボンの7位の水酸基に対してグルクロン酸を転移する活性を有するPfUGT50を同定した。このPfUGT50はバイカレイン、スクテラレイン、アピゲニン、ルテオリンなどのフラボン類だけなく、フラボノールであるケルセチンに対してもグルクロン酸転移活性を有していた。従って、PfUGT50を用いることでフラボンを含む多様なフラボノイドの7位を試験管内(in vitro)においてグルクロン酸化することができるようになる。
さらにスクリーニングプローブとして単離したヤクシマタツナミソウ由来のSlUGTについても多様なフラボノイドに対してグルクロン酸転移活性を示した。また、ゴマノハグサ科キンギョソウについても、PfUGT50およびSlUGTと相同性の高いUGT(UDP− glucuronosyltransferase)を探索し、キンギョソウ由来のUGTであるAmUGTcg10を同定した。大腸菌発現させたAmUGTcg10タンパク質はアピゲニン、ケルセチン、ナリンゲニンに対してグルクロン酸転移活性を示した。したがって構造的に類似した上記のシソPfUGT50、タツナミソウSlUGTおよびキンギョソウAmUGTcg10はフラボノイドの7位グルクロン酸転移活性を有する酵素であることが示された。
(1)プローブの調整
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning(Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001)に記載の方法に従った。
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を使用して、ヤクシマタツナミソウの根から総RNAを抽出した後、SuperScriptTM First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen社)を製造業者が推奨する条件に従って使用して、総RNA 1μgからcDNAを合成した。コガネバナのSb7GATの配列(GenBankアクセションNo.AB042277)を基にプライマー−Fw(配列番号:1)とプライマー−Rv(配列番号:2)を設計し、これを用いてヤクシマタツナミソウcDNAを鋳型にPCRを行った。
配列番号:2:SlUGT−Rv:5’ −TTTTGATCATTAATCCCGAGTGGCGTGAAG−3’ (下線はBclIサイト)
非ラジオアイソトープDIG−核酸検出システム(ロシュ)を製造者の推奨する方法に従って使用して、シソ(品種:赤縮緬紫蘇)の葉由来cDNAライブラリー(Yonekura−Sakakibara, K. et al., Plant Cell Physiol. 41, 495−502. 2000)を、前述のSlUGTプローブを用いてスクリーニングした。
陽性クローンをニ次スクリーニングによってシングルプラーク化し、M13RVおよびM13M4(−20)のプライマー対を用いて、挿入物断片を増幅し、挿入部分のDNA配列を決定した。得られたDNA配列に基づいて得た推定のアミノ酸配列を用いてBlast xによるデータベース検索した結果、SlUGTおよびSb7GATと高い相同性を示すシソUGT(PfUGT50)を得た(配列番号:4、5)。
配列番号:7:SlUGT−nest−Rv: 5’ −AAT CAT CCA AAT CTT TAA GGT
配列番号:9:SlUGT−nest−Fw: 5’ −GAA CAG CGG TCA CAG ATT TCT
(1)Scutellarein 7−glucuronideの精製
青シソの葉(愛知産・豊橋温室連合)、200枚、144.4gを液体窒素中で粉砕し、1.5Lの50%CH3CN、0.1%HCOOHに一晩、浸漬しセライトろ過した。ろ液を減圧濃縮し、濃縮液を600mlのCHP−20Pに負荷し、水、10,20,30,40,50%CH3CN/H2O各300mlx2でステップワイズ溶出を行い、ポリフェノール類の溶出が認められた10%−2から50%−1までの各画分を濃縮、凍結乾燥を行いHPLCで分析した。収量は10%−2(12.1mg)、20%−1(52.5mg)、20%−2(122.4mg)、30%−1(227.5mg)、30%−2(262.8mg)、40%−1(632.4mg)、40%−2(192.0mg)、50%−1(113.2mg)で40%−1はrosmarinic acidが高純度で含まれており、他はすべてフラボンを含む画分であった。30%−2画分を下記の分取HPLCで精製しScutellarein 7−glucuronide、16mgが得られた。
カラム:Develosil C−30−UG5, 20mm x 250mm,
移動相:A−0.1%TFA, B−0.05% TFA/90% CH3CN,
流速:6ml/min.
グラジエント:B20→B60%(100min),B60%iso(20min)
検出:A280nm
上記(1)で得られたScutellarein 7−glucuronideのうち3mgを100μLのDMSOに溶解し、15mlのファルコンチューブに二分した。各チューブに10mLのH2Oと0.2Mの酢酸Na緩衝液(pH5.0)、2.5mLおよびβ−Glucronidase/Arylsulfatase(EC3.2.1.31/EC3.1.6.1、Roche Diagnostics GmbH製)溶液、0.8mlを加え37℃で2時間インキュベートした。反応終了液をSep−Pak−C18(20cc)に負荷し、水、20mlの後、10%EtOH、20mlで塩類、タンパク類を除去し、80%CH3CN+0.05%TFA、40mlで生成したアグリコンを溶出し、濃縮、凍結乾燥した。この画分を下記の分取HPLCで精製し、0.4mgのScutellarein(アグリコン)を得た。
カラム:Develosil C−30−UG5, 20mm x 250mm,
移動相:A−0.1%TFA, B−0.05% TFA/90% CH3CN,
流速:6ml/min.
グラジエント:B15→B70%(60min),B70%iso(10min)
検出:A330nm
(1)発現ベクター構築
上記のお互いに相同性の高い、シソ由来PfUGT50、ヤクシマタツナミソウ由来SlUGT、およびキンギョソウ由来AmUGTcg10の3種の配糖体化酵素の完全長ORFを含むcDNAを、それぞれの遺伝子特異的なプライマーセット(PfUGT50,配列番号:14−15;SlUGT,配列番号:16−17;AmUGTcg10,配列番号:18−19)によって増幅した。鋳型にはそれぞれシソ葉,ヤクシマタツナミソウ根,キンギョソウ花弁から抽出したTotal RNAを用いて合成したcDNAを用いた。
配列番号:15:PfUGT50−rv: 5’ −TTTTGATCATTAATCACGAGTTACGGAATC−3’ (下線はBclIサイト)
配列番号:16:SlUGT−fw: 5’ −AAACATATGGAGGACACGATTGTTATC−3’ (下線はNdeIサイト)
配列番号:17:SlUGT−rv: 5’ −TTCATATGTCAATCCCTCGTGGCCAGAAG−3’ (下線はNdeIサイト)
配列番号:18:AmUGTcg10−fw: 5’ −AAACATATGGAGGACACTATCGTTCTC−3’ (下線はNdeIサイト)
配列番号:19:AmUGTcg10−rv: 5’ − TTGGATCCTTAAGAAACCACCATATCAAC−3’ (下線はBamHIサイト)
上記3−(1)で得られたそれぞれのプラスミドを用い大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を、50 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(10 g/l tryptone,5 g/l yeast extract,1 g/l NaCl)4 mlに、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し,37℃で振盪培養した。菌体濁度(OD600)がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.4 mMのIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)を添加し,22℃で20時間振盪培養した。以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離(7,000×g,15 min)にて集菌し,Buffer S[20 mM リン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4),20 mM imidazol,0.5 M NaCl,14 mMβ−メルカプトエタノール]2 ml/gcellを添加し,懸濁した。続いて超音波破砕(15 sec×8回)を行い,遠心分離(15,000×g,10 min)した。得られた上清に終濃度0.12% (w/v) ポリエチレンイミンを添加して懸濁し,30 min静置した。遠心分離(15,000×g,10 min)を行い,上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap (GE Healthcare)にアプライし,遠心(70×g,30 sec)した。Buffer S 600μlで洗浄後,100,200,500 mM imidazoleを含むBuffer S 各600μlにてカラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をMicrocon YM−30 (Amicon)を用いて20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5),14 mMβ−メルカプトエタノールにバッファー置換した。SDS−PAGE解析の結果,100 mMおよび200 mM imidazole溶出画分に目的のサイズのタンパク質を確認したので,これらの画分を混合し解析に用いた。なお,これらの画分では目的タンパク質単一ではなかった。
標準的な反応条件は以下の通りである。反応液(2 mM UDP−グルクロン酸,100 μM 糖受容体基質,50 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5),酵素溶液)50μlを調製し,酵素溶液を添加することで反応を開始させ,30℃,30分間反応させた。0.5% TFA in CH3CN 50μl を添加することにより反応を停止させ,HPLCにて分析した。HPLC条件は以下の通りである。カラム,Develosil C30−UG−5(4.6×150 mm); 溶離液A,0.1% TFA / H2O;溶離液B,0.08% TFA / 90% CH3CN;溶離条件A(オーロン,カテキン,クマリン,フェニルプロパノイド以外),0 min/5%B→18 min/100%B液→18.1 min/5%B→25 min/5%B;溶離条件B(オーロン,カテキン,クマリン,フェニルプロパノイド),0 min/5%B→20 min/50%B液→20.5 min/5%B→25 min/5%B;流速,1 ml/min;検出波長:280, 350 nm。以下に各キャラクタリゼーションの方法及び結果を示す。
上記の方法に従い,各種糖受容体基質に対する特異性を解析した(図2〜4)。
図2は、PfUGT50の糖受容体基質の基質特異性の解析の結果を示す図である。図2では、Scutellareinに対する活性を100%としたときの各基質に対する相対活性を示した。解析の結果,PfUGT50はScutellareinに対し最大の活性を示し,配糖体以外のフラボンによく反応した(Baicalein(Scutellareinに対する相対活性,73%),Apigenin(44%),Luteolin(41%),Tricetin(87.9%),Diosmetin(62%),Chrysoeriol(18%))。さらにフラボノール(Quercetin(26%),Myricetin(9%),Kaempferol(3%)),フラバノン(Naringenin(3%))およびオーロン(Aureusidin(40%))に対しても活性を示した。しかしながら,フラボンC配糖体(Vitexin,Isovitexin,Orientin),イソフラボン(Genistein,Daidzein,Formononetin),カテキン(Catechin,Epigallocatechin gallate),クマリン(Esculetin)およびフェニルプロパノイド(Coniferyl alcohol)に対しては活性を示さなかった。また,HPLCにおいてScutellarein,Baicalein,Apigenin,Quercetinはその反応生成物がそれぞれの7位グルクロノシル化物の保持時間と一致した。
Apigeninを糖受容体基質として用い,各種UDP活性化糖供与体に対する特異性を解析した。その結果,PfUGT50,SlUGTおよびAmUGTcg10はUDP−グルクロン酸に対してのみ活性を示し,UDP−グルコース,UDP−ガラクトースに対しては活性を示さなかった。
以上の結果からこれらの酵素はフラボンに特異性の高い7位グルクロン酸転移酵素(フラボン 7−O−グルクロノシルトランスフェラーゼ)であると考察した。
温度安定性は以下のようにして解析した。酵素溶液を15〜55℃,1時間処理後,4℃に冷却した。冷却後のサンプルを用い,標準的な反応条件で残存活性を算出した。pH安定性は以下のようにして解析した。酵素溶液に終濃度 167 mM 緩衝液(pH 4, 4.5, 5,Acetate−NaOH;pH 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5,NaH2PO4−NaOH;pH 8, 8.5, 9,Tris−HCl)を添加し,4℃,1時間処理後,終濃度500 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)を添加した。処理後のサンプルを用い,標準的な反応条件で残存活性を算出した。反応温度依存性は反応温度を10〜55℃にした標準的な反応条件で反応を行い解析した。 反応pH依存性はリン酸カリウムバッファー(pH 7.5)の代わりに緩衝液(pH 4, 4.5, 5,Acetate−NaOH;pH 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5,NaH2PO4−NaOH;pH 8, 8.5, 9,Tris−HCl)を用いた標準的な反応条件で反応を行い解析した。以上の解析の結果,PfUGT50はpH 7〜9の範囲において安定で,その触媒活性はpH 7〜8の範囲において最大で,酸性領域ではあまり活性を示さなかった。また,30℃以下において安定で(1時間,pH 7.5),30分間における活性測定では反応至適温度は30℃であった。SlUGTはpH 4.5〜8の範囲において安定で,その触媒活性はpH 7〜8の範囲において最大で,酸性領域ではあまり活性を示さなかった。また,本酵素は40℃以下において安定で(1時間,pH 7.5),30分間における活性測定では反応至適温度は35℃であった。AmUGTcg10はpH 7.5〜9.5の範囲において安定で,その触媒活性はpH 8.5〜9.5の範囲において最大で,酸性領域ではあまり活性を示さなかった。また,本酵素は30℃以下において安定で(1時間,pH 7.5),30分間における活性測定では反応至適温度は45℃であった。これらの性質は既知の植物2次代謝に関わるGTと類似していた。
上記のように、構造的に類似したシソ科シソ由来PfUGT50、シソ科ヤクシマタツナミソウ由来SlUGTおよびゴマノハグサ科キンギョソウ由来AmUGTcg10を同定した。PfUGT50およびAmUGTcg10配糖体化酵素はコガネバナSb7GATと比べ糖受容体基質特異性が広く、フラボン、フラボノール、オーロンなどの多様なフラボノイドの7位グルクロン酸転移活性を有していた。一方、SlUGTはSb7GATと類似した基質特異性を示した。これらの配糖体化酵素を用いることで安価にフラボノイドの7位をグルクロン酸抱合化することができるようになる。
このため、Quercetin 7−glucronideなどの生体内に存在するグルクロン酸抱合体をin vitroで大量に生成し、生理活性の評価を行うことが可能である。
本実施例では、シソ目ゴマ科ゴマ(Sesamum indicum)からタツナミソウSlUGTおよびキンギョソウAmUGTcg12と相同性の高いSiUGT23を同定し、その大腸菌発現タンパク質にスクテラレインおよびルテオリンに対してグルクロン酸転移活性を有していることを確認した。
タツナミソウおよびキンギョソウのフラボノイド7位グルクロン酸転移酵素遺伝子(UGT遺伝子)の配列保存性に着目しこれらの遺伝子と相同性の高い遺伝子を調査した結果、シソ目ゴマ科ゴマにおいても、これらのUGT遺伝子と高い相同性を示すゴマUGT遺伝子、SiUGT23があること見出した。ゴマcDNAライブラリー内から単離されたSiUGT23は完全長配列を有していなかった為、下記配列番号:20および21のプライマーを用いて前記実施例1の2(3)で述べたRACE法によりSiUGT23の完全長配列を決定した(配列番号:22および23)。
5'−GGCCAAACGCGCCGGAGCTGATGTAGA−3'
配列番号:21:SiUGT23-nest-Rv
5'-AGTGGGTATATTCAAGCCTGT-3'
ゴマ由来SiUGT23の完全長ORFを含むcDNAを、遺伝子特異的なプライマーセット(配列番号:24および25)によって増幅した。鋳型にはゴマ種子から抽出したTotal RNAを用いて合成したcDNAを用いた。前記実施例1のシソ、タツナミソウ、およびキンギョソウのUGTと同様に大腸菌発現ベクターに組み込み、同様の方法によって組み換えSiUGT23タンパク質を発現させ、酵素活性を測定した。
配列番号:25:SiUGT23−rv: 5' −GGATCCTAACATCACTCAAACCCGAGTCA−3' (下線はBamHIサイト)
カラム:Develosil C30-UG3, 3mm x 150 mm
移動相:A; H2O, B; CH3CN, C; 2.5%HCOOH, 0.2ml/min.
グラジエント:B20%→B70%(10分)、B70%(5分)、C4%
検出:A280nm
MS条件:Q-TOF-Premier (Micromass、Manchester、UK製)
Vモード、negative、キャピラリー電圧:2.3KV、コーン電圧:45V
これらはゴマ由来SiUGT23、キンギョソウ由来AmUGTcg10、およびシソ由来PfUGT50では認められない特徴的な生成物である。LC-MS分析の結果、保持時間7〜9分の間にはケルセチンに対して二つグルクロン酸が転移したと思われるm/z= 653.1009 [M‐H]-(C27H25O19, calcd. 653.0990, err. 2.9ppm)を示すケルセチンジグルクロナイドが検出された。保持時間9〜11分の間にはケルセチンに対してグルクロン酸が一つ転移したと思われるm/z= 477.06 [M‐H]-のケルセチンモノグルクロナイドが3種類検出された。R.T.=10.12分の成分はシソのGATによる反応生成物を精製し構造解析したものと一致したことから、Quercetin 7-O-glucuronideであることがわかった。またR.T.=10.34分の成分はブドウの葉の主フラボノールを精製し構造解析したものと一致したことから、Quercetin 3-O-glucronideであることがわかった。(Hmamouch, M. et al. (1996) Am J Enol Vitic., 47, 186-192)主反応生成物であるR.T.=11.3分の成分は逆相HPLCで精製しNMRで構造解析した結果、Quercetin 3'-O-glucronideであることが明らかになった。主要な3つのピークはそれぞれケルセチンの7位、3位、3'位のモノグルクロナイドであることが確認された。
カラム:YMC-pack polymer C18, 2mm x 150 mm,6μm
移動相:A; H2O, B; CH3CN, C; 2.5%HCOOH, 0.2ml/min.
グラジエント:B10%→B50%(10分)、B50%(5分)、C4%
検出:A350nm
MS条件:Q-TOF-Premier (Micromass、Manchester、UK製)
Vモード、negative、キャピラリー電圧:3.0KV、コーン電圧:30V
配列番号:2:合成DNA
配列番号:6:合成DNA
配列番号:7:合成DNA
配列番号:8:合成DNA
配列番号:9:合成DNA
配列番号:14:合成DNA
配列番号:15:合成DNA
配列番号:16:合成DNA
配列番号:17:合成DNA
配列番号:18:合成DNA
配列番号:19:合成DNA
配列番号:20:合成DNA
配列番号:21:合成DNA
配列番号:24:合成DNA
配列番号:25:合成DNA
Claims (11)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:5のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:5のアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または
(d)配列番号:5のアミノ酸配列に対して、80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の(e)または(f)である請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(e)配列番号:5のアミノ酸配列において10個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または
(f)配列番号:5のアミノ酸配列に対して、90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号:4で表される塩基配列の第1番目〜第1359番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:5のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
- 請求項7に記載のベクターが導入された形質転換体。
- 請求項8又は9に記載の形質転換体を用いる請求項6のタンパク質の製造方法。
- 請求項6に記載のタンパク質を触媒として、UDP−グルクロン酸とフラボノイドからグルクロン酸抱合体を生成する、グルクロン酸抱合体の製造方法。
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