CN101575631B - 一种半乳糖基转移酶修饰黄酮类糖苷化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种半乳糖基转移酶修饰黄酮类糖苷化合物的方法。黄酮类糖苷化合物是自然界普遍存在的一类次生代谢产物,是药用植物的主要活性成分之一,具有抗菌、抗癌、抗氧化等生理活性。但天然黄酮类糖苷化合物往往具有水溶性差、药效不好等缺点。本方法解决了天然黄酮类糖苷化合物溶解度较低的缺点,以天然黄酮类糖苷活性化合物为先导,通过糖基化反应提高其水溶性,进而改善其生物利用率。其技术要点是将酶促反应应用于黄酮类化合物多糖苷的合成,与化学合成方法相比较,合成效率较高,成本较低。糖基化修饰后,部分药物可以提高药效,降低毒副作用,为黄酮类化合物新药研制提供一个新的途径。
Description
【技术领域】:
本发明属于生物制药技术领域。具体涉及一种利用半乳糖基转移酶修饰黄酮类糖苷化合物的方法,本方法在黄酮类糖苷天然活性先导物的基础上,通过分析其化学结构与生物活性的关系,对黄酮类糖苷化合物进行糖基化修饰,是新药研制的一条有效途径之一。
【背景技术】:
黄酮类化合物又称生物黄酮或植物黄酮,是自然界存在的一大类酚类物质,它们是植物次级代谢的产物,是一组存在于植物的叶、花、果中的天然色素,因多呈黄色而被称为生物类黄酮。
黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的一类物质,两个芳环(A环、B环)之间以一个三碳链相连,具有C6-C3-C6基本构型,将三个环分别标为A、B、C。
黄酮类化合物的基本结构
其中C环部分可以是脂链,也可以与B环部分形成六元或五元的氧杂环。根据C3部分的成环、氧化和取代方式的差异,黄酮类化合物可以分为10多个类别:黄酮(flavones)、二氢黄酮(flavonone)、黄酮醇(flavanol)、二氢黄酮醇(flavanonol)、异黄酮(isoflavones)、二氢异黄酮(isoflavanone)、噢哢或橙酮(aurones)、黄烷酮(flavanone)、花色素(anthocyanins)、查尔酮(chalcones)、色酮或色原酮(chromone)等。天然的生物类黄酮多是其基本结构的衍生物,而且多以糖苷形式存在,由于糖的种类、连接位置、苷元等不同,可形成各种各样的黄酮苷。种类不同的黄酮苷在基团上被进一步修饰后产生了自然界中种类繁多的黄酮类化合物。到2005年底已发现约8000余种黄酮类化合物。
大量研究表明,黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能,还有许多黄酮类化合物被证明有抗HIV病毒活性。黄酮类化合物是很多药用植物的主要活性成分之一。根据不完全统计,在最常用的750种植物药(分布于162科)中,有71科(占44%)的140种(占18.7%)含有黄酮类化合物。如黄杞(Engelhardtia chrysolepis)总黄酮具有一定的活血化瘀、降血脂、降血糖和提高免疫功能的作用。山楂(Crataegus pinnatifida)叶总黄酮可有效防治心血疾病、清除氧自由基、降脂、利尿和增强耐缺氧能力等。此外,黄酮类化合物还具有防止紫外线对植物的伤害、抗炎,以及作为植物抗毒素、植物和微生物之间相互作用的信号分子和参与调节植物对生长素的反应等功能。
近年来随着分离提取技术的发展,发现了大量新黄酮类化合物,开发了数种含有黄酮类物质的产品。在医药方面,根据其在心血管系统、内分泌系统、抗肿瘤方面的药理作用,很多以黄酮类成分为主的制剂已作为成药上市,如以葛根素为主的愈风宁心片、天宝银杏制剂等,还有许多中药中含有黄芪、淫羊藿、银杏叶、黄芩等成分。在食品中它们应用于功能性食品添加剂,如天然甜味剂、天然抗氧化剂、天然色素等;应用于功能食品,如生物类黄酮口香糖、银杏叶袋泡茶等防衰、抗癌、提高免疫力食品。在兽药、农药等领域,现已开发出了一些具有特效功能的含有黄酮类化合物药品和驱虫、杀虫剂等。
直接从天然植物中提取的黄酮类化合物一般以游离态或糖苷形式存在,分子中含有多个酚羟基。黄酮类化合物分子中的苯环为疏水基团,酚羟基为亲水基团,所以黄酮类化合物既有亲水性又有亲油性,但大多数黄酮类化合物在水相和有机相中溶解度都不高。天然存在的黄酮类化合物往往具有水溶性差、药效不好等缺点,限制了其生物活性的发挥。因此,通过结构修饰以提高其在水相或有机相中的溶解性是提高黄酮类化合物药学价值的一个可行途径。
【发明内容】:
本发明目的是解决天然黄酮类糖苷化合物溶解度较低的问题,提供一种半乳糖基转移酶修饰黄酮类糖苷化合物的方法。
本发明以天然黄酮类糖苷活性化合物为先导,通过糖基化反应提高其水溶性,进而改善其生物利用率,对先导药物进行糖基化修饰后,部分药物可以提高药效,降低毒副作用,为黄酮类化合物新药研制提供一个新的途径。
本发明提供的利用半乳糖转移酶糖基化修饰黄酮类糖苷化合物的方法的具体步骤如下:
第一、以酶促反应缓冲液配制反应底物黄酮类糖苷化合物溶液和尿苷二磷酸(UDP)-半乳糖溶液;
第二、将上步的反应底物黄酮类糖苷化合物溶液和UDP-半乳糖溶液加入反应容器中,再加入反应溶液总体积的4%~16.7%体积的半乳糖基转移酶提取液,以酶促反应缓冲液补足体积,使上述黄酮类糖苷化合物和糖基供体UDP-半乳糖的摩尔终浓度比为1∶3~10∶3;
第三、35~38℃恒温水浴反应30~60分钟;
第四、沸水浴5~15分钟,冷却至室温后,10000~12000rpm离心10~15分钟,除去沉淀;
第五、以高效液相分离反应产物,再经旋干获得所述的糖基化修饰的黄酮类糖苷化合物。
第一步所述的酶促反应缓冲液的主要成分为羟乙基呱嗪乙硫磺酸(Hepes)、牛血清白蛋白(BSA)和氯化锰(MnCl2);Hepes的工作浓度为4.7mg/mL,BSA的工作浓度为2mg/mL,MnCl2的工作浓度为0.015mg/mL~0.25mg/mL。酶促反应液的pH优选为6.8~7.4。
第二步所述的反应底物中糖基受体黄酮类糖苷化合物和糖基供体UDP-半乳糖的摩尔终浓度比为1∶3~10∶3。
第二步所述的反应底物中黄酮类糖苷化合物为天然黄酮类糖苷化合物。特别是末端糖基团为葡萄糖的黄酮类糖苷化合物(由于酶催化反应特异性的原因,如末端糖基团为葡萄糖,其催化效率较高),如葛根素、根皮苷、柚皮苷。
第二步所述的半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶。
本发明的优点和积极效果:
本发明将酶促反应应用于黄酮类化合物多糖苷的合成,与化学合成方法相比较,合成效率较高;而且其应用的半乳糖转移酶的获得较为容易,成本较低。
本发明采用的半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶,这种酶在生物中分布较为广泛,其基因序列、氨基酸序列及空间结构已经测定,其催化作用机制较为明确,已转入工程菌中表达,获得较为容易,且催化糖基受体范围比较广泛。
【附图说明】:
图1.葛根素糖基化产物的高效液相色谱(HPLC)谱图;
图2.葛根素糖基化产物的质谱(MS)谱图;
图3.葛根素糖基化产物的核磁共振(NMR)谱图。
图4.葛根素糖基化前后对血管平滑肌舒张作用的比较。
【具体实施方式】:
本发明提供的利用半乳糖转移酶糖基化修饰黄酮类糖苷化合物的方法如下:
1)以酶促反应缓冲液配制反应底物;
酶促反应缓冲液的配制:酶促反应缓冲液的主要成分为羟乙基呱嗪乙硫磺酸(Hepes)、牛血清白蛋白(BSA)和氯化锰(MnCl2);Hepes的工作浓度为4.7mg/mL,BSA的工作浓度为2mg/mL,MnCl2的工作浓度为0.015mg/mL~0.25mg/mL。反应中使用的酶促反应缓冲液的优选的pH为6.8~7.4。
然后以酶促反应缓冲液配制反应底物天然黄酮类糖苷化合物溶液和UDP-半乳糖溶液。
2)将反应底物糖基受体天然黄酮类糖苷化合物溶液和糖基供体UDP-半乳糖溶液加入反应容器中,天然黄酮类糖苷化合物和糖基供体的摩尔终浓度比为1∶3~10∶3。再加入反应溶液总体积4%~16.7%体积的半乳糖基转移酶提取液;以酶促反应缓冲液补足体积至50mL。
3)35~38℃水浴反应30~60分钟。
4)沸水浴5~15分钟,冷却至室温后,10000~12000rpm离心10~15分钟,除去沉淀。
5)以高效液相分离反应产物,再经旋干获得糖基化修饰的黄酮类糖苷化合物。
反应获得的糖基化产物可以用质谱(MS)和核磁共振(NMR)的方法进行结构分析及验证,并以平衡法测定其溶解度。
本方法采用的半乳糖基转移酶为β-1,4-半乳糖基转移酶。这种酶在生物中分布较为广泛,其基因序列、氨基酸序列及空间结构已经测定,其催化作用机制较为明确,已转入工程菌中表达,获得较为容易,且催化糖基受体范围比较广泛。
酶提取液的制备:
构建含有β-1,4-半乳糖基转移酶基因的表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,超声破碎菌体,经Ni柱亲和纯化、超滤浓缩后,获得纯度较高的酶提取液。以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验获得目的蛋白的分子量及纯度,以BIOFORD方法测定酶提取液的浓度。获得的酶提取液,加入酶提取液总体积50%的甘油和摩尔终浓度为0.01m mol/L的DTT,-20℃保存备用,避免反复冻融,以免酶的活性下降。
本方法适用于天然黄酮类糖苷化合物,特别是末端糖基团为葡萄糖的黄酮类糖苷化合物(由于酶催化反应特异性的原因,如末端糖基团为葡萄糖,其催化效率较高)。如葛根素、根皮苷、柚皮苷。
实施例1:糖基化葛根素的合成
按照以上实施方式中的方法配制新鲜的酶促反应缓冲液,称取Hepes 0.952g,BSA 0.4g,MnCl2·4H2O 0.00475g,以蒸馏水充分溶解后,定容至200mL。然后以酶促反应缓冲液分别配制9.12mg/mL的葛根素溶液和4.00mg/mL的UDP-半乳糖溶液。
将葛根素溶液5mL和UDP-半乳糖溶液5mL加入反应容器,其摩尔终浓度比为10∶3;再加入200μL的酶提取液(酶提取液按照以上实施方式中的方法制备);以酶促反应缓冲液补足体积至50mL,轻轻混匀。37℃反应30分钟。反应完成后,将反应容器置于沸水浴5分钟,除去反应液中的蛋白质。冷却到室温后,12000rpm离心10分钟,弃沉淀。
将获得的反应液过滤后,以高效液相的方法进行分离制备。应用的仪器为岛津HPLC,C18反相柱,流动相为甲醇∶水=40%∶60%(V/V),检测波长为260nm,流速为1mL/min(图1)。从HPLC获得的谱图上看,反应后出现了新的吸收峰,说明了酶促反应的发生。
将获得的含有糖基化的葛根素产物的溶液进行旋干,得到目的产物的干粉。取一定量目的产物进行MS和NMR结构分析及验证(图2,图3)。从MS谱图上看,获得产物分子量约为578,与预期目的产物的分子量一致;从NMR谱图上看,获得产物的结构与预期产物的结构是一致的。以上结果证实反应液中生成了半乳糖基化的葛根素。
lgtB:β-1,4-galactosyltranserase
以平衡法测定获得的半乳糖基化的葛根素产物的溶解度,约为葛根素溶解度的12倍。
以主动脉血管平滑肌作为生理模型,将葛根素和糖基化葛根素对血管平滑肌的舒张作用进行比较,发现糖基化的葛根素的舒张作用好于葛根素(图4)。
实施例2:糖基化柚皮苷的合成
按照以上实施方式中的方法配制新鲜的酶促反应缓冲液,称取Hepes 0.952g,BSA 0.4g,MnCl2·4H2O 0.00475g,以蒸馏水充分溶解后,定容至200mL。然后以酶促反应缓冲液分别配制1.45mg/mL的柚皮苷溶液和29.3mg/L的UDP-半乳糖溶液。
将柚皮苷溶液42mL和UDP-半乳糖溶液5mL加入反应容器,其摩尔终浓度比为7∶16;再加入200μL的酶提取液(酶提取液按照以上实施方式中的方法制备);以酶促反应缓冲液补足体积至50mL,轻轻混匀。37℃反应30分钟。反应完成后,将反应容器置于沸水浴10分钟,除去反应液中的蛋白质。冷却到室温后,10000rpm离心10分钟,弃沉淀。
将获得的反应液过滤后,以高效液相的方法进行分离制备。应用的仪器为岛津HPLC,C18反相柱,流动相为甲醇∶水∶醋酸=35%∶61%∶4%(V/V/V),检测波长为283nm,流速为1mL/min。将获得的含有糖基化的葛根素产物的溶液进行旋干,得到目的产物的干粉。取一定量目的产物进行MS和NMR结构分析及验证;另取-定量产物以平衡法测定其溶解度。实验结果表明,获得了预期的反应产物,其溶解度得到了提高(结果未显示)。
lgtB:β-1,4-galactosyltranserase
实施例3:糖基化根皮苷的合成
按照以上实施方式中的方法配制新鲜的酶促反应缓冲液,称取Hepes 0.952g,BSA 0.4g,MnCl2·4H2O 0.00475g,以蒸馏水充分溶解后,定容至200mL。然后以酶促反应缓冲液分别配制4.36mg/mL的根皮苷溶液和29.3mg/L的UDP-半乳糖溶液。
将葛根素溶液42mL和UDP-半乳糖溶液5mL加入反应容器,其摩尔终浓度比为7∶4;再加入200μL的酶提取液(酶提取液按照以上实施方式中的方法制备);以酶促反应缓冲液补足体积至50mL,轻轻混匀。37℃反应30分钟。反应完成后,将反应容器置于沸水浴10分钟,除去反应液中的蛋白质。冷却到室温后,10000rpm离心10分钟,弃沉淀。
将获得的反应液过滤后,以高效液相的方法进行分离制备。应用的仪器为岛津HPLC,C18反相柱,流动相为乙腈∶水=30%∶70%(V/V),检测波长为285nm,流速为1mL/min。将获得的含有糖基化的葛根素产物的溶液进旋行干,得到目的产物的干粉。取一定量目的产物进行MS和NMR结构分析及验证;另取一定量产物以平衡法测定其溶解度。实验结果表明,获得了预期的反应产物,其溶解度得到了提高(结果未显示)。
lgtB:β-1,4-galactosyltranserase
Claims (4)
1.一种利用半乳糖转移酶糖基化修饰黄酮类糖苷化合物的方法,其特征在于该方法的步骤如下:
第一、以酶促反应缓冲液配制反应底物黄酮类糖苷化合物溶液和尿苷二磷酸-半乳糖溶液,所述的酶促反应缓冲液的主要成分为羟乙基呱嗪乙硫磺酸、牛血清白蛋白和氯化锰;羟乙基呱嗪乙硫磺酸的工作浓度为4.7mg/mL,牛血清白蛋白的工作浓度为2mg/mL,氯化锰的工作浓度为0.015mg/mL~0.25mg/mL,所述的黄酮类糖苷化合物是末端糖基团为葡萄糖的黄酮类糖苷化合物;
第二、将上步的反应底物黄酮类糖苷化合物溶液和尿苷二磷酸-半乳糖溶液加入反应容器中,再加入反应溶液总体积的4%~16.7%体积的β-1,4-半乳糖基转移酶提取液,以酶促反应缓冲液补足体积,使上述黄酮类糖苷化合物和糖基供体尿苷二磷酸-半乳糖的摩尔终浓度比为1∶3~10∶3;
第三、35~38℃恒温水浴反应30~60分钟;
第四、沸水浴5~15分钟,冷却至室温后,10000~12000rpm离心10~15分钟,除去沉淀;
第五、以高效液相分离反应产物,再经旋干获得所述的糖基化修饰的黄酮类糖苷化合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于反应中使用的酶促反应缓冲液的pH为6.8~7.4。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于第一步所述的反应底物中黄酮类糖苷化合物为天然黄酮类糖苷化合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于所述的天然黄酮类糖苷化合物是葛根素、根皮苷、柚皮苷。
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