CN105188419B - 制备圆叶葡萄果渣提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有抗氧化性质的圆叶葡萄提取物。所述提取物是源自青铜色和紫色圆叶葡萄的提取物的混合物，所述青铜色和紫色圆叶葡萄出乎意料地提高了鞣花酸在所述混合物中的溶解度。在某些实例中通过对所述葡萄的果渣进行水提取，得到溶剂提取物，其中已经从所述葡萄将所述果汁基本除去。另外，通过将花色素苷的其他源添加到所述提取物，例如通过将未从其除去大量果汁的整个紫色圆叶葡萄的提取物包括在所述组合物中，也能够实现鞣花酸溶解度的惊奇提高。花色素苷的其他另外源包括蓝莓、黑莓和树莓；所述花色素苷的其他源可得自果实加工废物流以提高所述生产工艺的效率。

Description

制备圆叶葡萄果渣提取物的方法

相关申请

本发明还主张2013年3月14日提交的美国申请13/828,707号的优先权，通过参考将其并入。

技术领域

本发明涉及制备抗氧化剂组合物的方法，所述抗氧化剂组合物包含圆叶葡萄提取物，尤其是得自青铜色和紫色圆叶葡萄的提取物。

发明背景

活性氧物种(ROS)是需氧代谢的必然副产物并由此在人体和其他生物体内连续产生。人体还暴露在源自外源/环境源如污染、太阳光和饮食的ROS下。尽管存在不同化学形式的ROS，但其都对细胞成分和大分子的结构和功能产生有害作用。将ROS产生/暴露的强度称作氧化应激。

认为氧化应激与慢性发炎疾病如糖尿病、癌症、动脉粥样硬化和其他心血管疾病的发病机制相关，并与变性神经疾病如阿尔茨海默(Alzheimer)病和帕金森(Parkinson)病相关。而且，多方面的证据支持如下观点，氧化应激是在正常老化下的中心机制。因此，需要开发组合物和方法以抑制氧化应激。

已经报道，适度使用葡萄酒可以降低喝葡萄酒人群的心血管疾病的发病率并因此降低其死亡率。还报道，适度摄入葡萄酒对痴呆具有神经保护效果。葡萄包含几种生物活性多酚化合物，包括黄酮类化合物(例如黄烷-3-醇及其称作原花色素的低聚物；黄酮醇、花色素苷和黄烷酮)和非黄酮类化合物(例如酚酸、单宁酸和芪衍生物，例如白藜芦醇)。认为非黄酮类化合物白藜芦醇介导葡萄产物对人体心血管系统带了许多有益的效果。认为黄酮类化合物的保护和消炎效果是因为，清除自由基，对细胞信号传导通路和基因表达的各种效果，以及选择性干扰多种因素，所述多种因素影响快速和反常增生的哺乳动物细胞的细胞分裂循环。

发明概述

本文中公开了生产圆叶葡萄果渣溶剂提取物组合物的方法和组合物，所述组合物包含青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物的组合。出乎意料地发现，源自不同颜色葡萄的提取物的组合有利地提高鞣花酸在组合物中的溶解度。还发现，通过将花色素苷包括在所述组合物和/或提取方法中能够进一步提高鞣花酸的溶解度，所述花色素苷不是得自仅果渣(pomace-only)的提取物。所述花色素苷能够得自例如整个紫色圆叶葡萄(whole purple muscadine grape)或另一种有色果实如蓝莓、黑莓或树莓、或果实加工废物流。在其他实例中，花色素苷得自这种有色果实的果汁或果皮或所述两者。在一个特别公开的实施方案中，将青铜色圆叶葡萄仅果渣和整个紫色圆叶葡萄(果渣加果汁)例如利用水单独或一起进行溶剂提取，使得合并的提取物包含源自整个紫色圆叶葡萄的花色素苷。在某些实施方案中，则可以将合并的提取物与紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物合并以生产具有出乎意料地提高的鞣花酸溶解度的组合物。

因此，在所述方法的一个实施方案中，紫色圆叶葡萄果渣包括包含在整个紫色圆叶葡萄中的果渣，且紫色圆叶葡萄果渣提取物至少部分包含得自整个紫色圆叶葡萄的提取物。因此，紫色圆叶葡萄果渣提取物能够包括得自如下物质的提取物的混合物：(a)整个紫色圆叶葡萄；和(b)得自从其已经提前提取了果汁的紫色圆叶葡萄的仅果渣部分的提取物。或者，圆叶葡萄提取物仅得自青铜色和紫色圆叶葡萄的仅果渣，其中仅果渣基本由果渣构成而不含果汁。在任一情况中，能够将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物(例如紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物)合并以生产其中青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物以0.1～10的比例(重量对重量)存在的圆叶葡萄果渣提取物且所述圆叶葡萄果渣提取物具有至少2％如约4％以上的多酚含量。在更特别的实例中，青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物以0.3～3范围内的比例存在。在这些比例中，“果渣提取物”包括来自仅果渣和/或整个葡萄的果渣组分的提取物。

所述青铜色和紫色提取物能够同时或先后生产。在同时提取的一个实例中，将青铜色圆叶葡萄仅果渣(不是整个葡萄)和整个紫色圆叶葡萄合并并同时溶剂提取以提供混合的来自(a)青铜色仅果渣和(b)整个紫色葡萄的提取物(其包括在整个紫色葡萄内所包含的果汁的提取物和整个紫色葡萄的仅果渣部分的提取物)的提取物。或者，将青铜色和紫色圆叶葡萄仅果渣(不含任何的青铜色或紫色的整个葡萄)合并并同时提取。在另一个实例中，将青铜色仅果渣、紫色仅果渣和整个紫色葡萄合并并将所有三者同时提取。在先后提取的实例中，将源自整个葡萄之外的紫色圆叶葡萄果渣(例如仅果渣)和源自整个葡萄之外的青铜色圆叶葡萄果渣(例如仅果渣)分别提取，然后将那些提取物合并。在先后提取的另外实例中，然后接着将合并的紫色/青铜色提取物与源自紫色圆叶葡萄果渣(不是整个葡萄)的提取物或源自整个紫色圆叶葡萄的提取物、或源自整个紫色葡萄的提取物与源自青铜色果渣(不是整个葡萄)的提取物的组合合并。

在某些特别公开的实施方案中，制备青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物，然后将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物合并以生产具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄果渣提取物。例如，将青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣用水进行提取以生产青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物，然后将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物合并以生产具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄果渣提取物。

制备青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物能够还包括(a)在将其合并之前单独或(b)在将其合并之后一起对青铜色圆叶葡萄提取物和紫色圆叶葡萄提取物进行过滤以生产具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄提取物。青铜色和紫色果渣提取物还可单独或以组合的方式进行发酵以有助于除去提取的糖。这种发酵可以发生在对圆叶葡萄果渣提取物进行过滤之前或之后。

对青铜色和紫色圆叶葡萄提取物进一步进行浓缩，使得各种提取物在液体中包含20％～50％的固体，例如在液体中包含约40％的固体。在某些实例中，在对圆叶葡萄果渣提取物进行过滤之后，对圆叶葡萄果渣提取物进行浓缩。

将赋形剂或其他成分添加到提取之后的提取物以例如制备抗氧化剂组合物。其他成分可以包括白藜芦醇或花色素苷。在一个特定的实例中，在通过对整个紫色圆叶葡萄进行提取以同时提取葡萄的果渣和存在于葡萄汁中的花色素苷的提取期间，添加花色素苷。

还公开了通过上述或其他方法制备的组合物。在特定实例中，在组合物中青铜色圆叶葡萄果渣提取物对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比以0.1～10范围内的比例(重量对重量)存在且圆叶葡萄果渣提取物具有至少2％的多酚含量。能够将这些组合物给药到需要其的对象以通过防止或抑制与细胞老化相关的一个或多个过程如自由基的形成或活性来抑制细胞老化。在某些实施方案中，紫色圆叶葡萄果渣提取物包括：(a)整个紫色圆叶葡萄的提取物；(b)源自整个葡萄之外的紫色圆叶葡萄果渣提取物；或(c)(a)和(b)的混合物。所述组合物可以包括在非饮料食品、饮料、膳食增补物、美容组合物或抗老化增补物中。通过将足以降低或抑制氧化应激的组合物剂量给药到需要其的对象，所述组合物还可以用于抑制氧化应激的方法中。在某些实施方案中，在进餐消耗之前或之后10～30分钟给药所述剂量。

所述圆叶葡萄组合物能够在抗氧化剂组合物中包括源自圆叶葡萄果渣或圆叶葡萄之外的源的白藜芦醇或花色素苷。例如，所述组合物能够在抗氧化剂组合物中包含源自日本虎杖提取物的白藜芦醇或源自圆叶葡萄果渣之外的源如整个紫色圆叶葡萄中的果汁的花色素苷、或源自提取工艺期间添加的另一种有色果实如红醋栗、蓝莓、黑莓或树莓的花色素苷。在一个实施方案中，花色素苷能够源自果实加工废物流。例如，废物流花色素苷能够源自有色果实的在其已经加工成果泥、果冻、果酱和果汁浓缩物之后的果皮。废物流在提取工艺期间添加且不是随后在完成提取工艺之后添加到组合物。然而，最终产物抗氧化剂组合物能够还具有添加到其的其他花色素苷(例如源自接骨木提取物)。在某些实施方案中，从起始材料(例如圆叶葡萄果渣和添加的花色素苷源)的混合物制备提取物，所述混合物包含0.5:1～5:1(重量:重量)范围内如1:1(重量:重量)或1.3:1(重量:重量)的花色素苷对鞣花酸的起始材料之比。例如，与其他果实材料如红醋栗、蓝莓、黑莓或树莓合并的圆叶葡萄果渣材料应具有至少0.5:1如大至5:1的花色素苷对鞣花酸之比。在其他实例中，所述比例为至少1:1、2:1或3:1和/或不超过5:1或4:1。在其他实例中，在合并的起始材料中花色素苷对鞣花酸的重量比为超过0.5:1、1:1、10:1或20:1。在其他实例中，在合并的起始材料中花色素苷对鞣花酸的重量比为不超过30:1、40:1或50:1。在其他实例中，从提取物的混合物(例如圆叶葡萄果渣提取物加上添加的花色素苷，所述花色素苷源自有色果实如接骨木果的提取物)制备提取物，其中在合并的提取物材料中花色素苷对鞣花酸的重量比为超过0.5:1、1:1、10:1或20:1，例如其可为24:1。在其他实例中，在合并的起始材料中花色素苷对鞣花酸的重量比为不超过30:1、40:1或50:1。

在某些实例中，圆叶葡萄果渣提取物以如下比例包含整个紫色圆叶葡萄和青铜色圆叶葡萄果渣或通过以如下比例同时提取整个紫色圆叶葡萄和青铜色圆叶葡萄果渣来制备：1:5～1:12(重量:重量)，如1:7(重量:重量)或1:9(重量:重量)或1:10(重量:重量)的整个紫色圆叶葡萄对青铜色圆叶葡萄果渣之比。在另一个实例中，圆叶葡萄果渣提取物以如下比例包含(a)整个紫色圆叶葡萄和(b)青铜色和紫色圆叶葡萄果渣的混合物或通过以如下比例提取(a)和(b)来制备：(a)对(b)之比为1:7～1:16(重量:重量)，如1:9(重量:重量)或1:12(重量:重量)。或者，圆叶葡萄果渣提取物由整个紫色圆叶葡萄、紫色圆叶葡萄果渣和青铜色圆叶葡萄果渣制备，其中在它们中的花色素苷对鞣花酸之比为至少0.5:1，例如0.5:1～5:1(重量:重量)如1:1(重量:重量)或1.3:1(重量:重量)。

根据参考附图的如下详细说明将使得本发明的上述和其他目的、特征和优势变得更明显。尽管在如下页面中对本发明的具体实例进行了讨论，但具体组分、成分或量的描述不意味着本发明的任何这种方面是必须的。

详细说明

I.缩写和术语

(a)缩写

FRAP： 等离子体的三价铁还原能力

mg： 毫克

μg： 微克

ml： 毫升

ORAC： 氧自由基吸收能力

ROS： 活性氧物种

TE： Trolox当量

TEAC： Trolox当量抗氧化能力

wt： 重量

(b)术语

术语和方法的如下说明是用于更好地说明本发明并用于指导本领域技术人员实践本发明。术语“或者”是指所述可选要素的单个要素或两个以上要素的组合，除非上下文明确表明不是。如本文中所使用的，“包含”是指“包括”。由此，“包含A或B”是指“包括A、B、或A和B”，而不排除其他要素。

除非另有解释，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员所普通理解的相同的含义。尽管本发明的实践或试验中使用与本文中所述的类似或等价的方法和材料，但下面描述了合适的方法和材料。除非另有规定，否则所有百分比和比例都是用重量来计算的。

给药：通过任意有效路线向对象提供或给予药剂。给药的示例性路线包括但不限于口服、注射(例如皮下注射、肌肉注射、皮内注射、腹膜内注射、静脉内注射和瘤内注射)、舌下、经表皮、鼻内、局部和吸入路线。

花色素苷：在许多植物中发现的水溶性空泡色素会因pH而呈现红色、紫色或蓝色。花色素苷属于称作黄酮类化合物的母体类分子，所述黄酮类化合物是通过苯基丙酸类路径合成的。花色素苷具有如下所示的普通化学结构：

“源自圆叶葡萄之外的源的花色素苷”是指得自除圆叶葡萄之外的源的花色素苷。这种非圆叶葡萄源的实例包括接骨木、红醋栗果实、蓝莓、黑树莓、红树莓、越桔、葡萄或紫色胡萝卜。

抗氧化剂活性：通过例如清除和中和氧化自由基而降低氧化应激的活性。使用本文中公开的方法以及本领域内已知的方法能够测量抗氧化剂活性，包括氧自由基吸收能力(ORAC)测定法、等离子体的铁还原能力(FRAP)测定法和Trolox当量抗氧化剂能力(TEAC)测定法。例如，组合物具有抗氧化剂活性且如果其具有每mg多酚至少24μmol Trolox当量(μmol TE/mg多酚)的总ORAC，则能够用作抗氧化剂。

抗氧化剂组合物：一种具有抗氧化剂活性的组合物。

抗氧化性有效量：在给药一定量组合物的对象中足以诱发抗氧化剂效果的量。在某些实例中，通过将ORAC_亲脂提高至比根据组合物单独的组分的ORAC_亲脂值的加和所预测的更大程度，所述组合物诱发ORAC_亲脂抗氧化剂活性选择性协同升高。

黑莓：来自产生可食用黑莓果实的Rosaceas科中的Rubus属的多年生植物。

红醋栗：在产生开胃的红醋栗浆果的Grossulariaceae科中的木质灌木。

蓝莓：来自Vaccinium属内Cyanococcus部分的具有靛色浆果的常年生开花植物。这些植物的蓝莓果实是微红到紫色并在成熟时最终呈黑紫色的浆果。

接骨木(Sambucus nigra)：属于在欧洲和北美洲发现的Adoxaceae科的具有几个区域性品种或亚种的植物。花是平的伞房花序。浆果是黑色到绿灰蓝并包含花色素苷和其他多酚(例如原花色素和黄酮醇如栎精)，其中花色素苷和其他多酚的量和类型取决于品种。

“接骨木提取物”是一种通过根据本领域技术人员已知的任意提取方法对接骨木进行提取而得到的材料，条件是其具有期望的活性(例如颜色稳定活性、抗氧化剂活性或其组合)。例如，接骨木提取物能够包括：通过对接骨木的果实进行压缩而得到的果汁；或通过根据已知的提取方法如溶剂(例如水)提取法对接骨木的整个果实或果实的皮肤或籽的合适部分进行提取而得到的提取物。此外，接骨木果实的压碎产物或干燥的接骨木果浓缩物能够被用作“接骨木提取物”。接骨木果(或其提取物)能够用作添加到圆叶葡萄提取物以提高鞣花酸在圆叶葡萄提取物中的溶解度的其他花色素苷源。

赋形剂：用作组合物的活性成分的载体的惰性物质。赋形剂能够包括在具有非常高效活性成分的制剂中大量使用、允许方便并精确的给药、稳定活性成分并使得递送系统在视觉上和/或器官感觉上可接受的物质。药物赋形剂的实例包括：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、氧化硅凝胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、等。在特定实例中，公开的抗老化增补物包括以下赋形剂：甘油、山梨糖醇、胶体二氧化硅和天然香料添加剂。

提取：用于将物质与基体分离。提取物也是通过例如使用压力或溶剂如乙醇和/或水对原料的一部分进行提取而得到物质。提取物可以是液体或粉末形式。本文中公开的提取物的特定实例是液体形式。“溶剂提取物”是指通过将目标暴露在将包含在产物中的期望物质溶解的液体溶剂下而得到的提取物。“水提取物”是指通过水提取产物而得到的提取物。溶剂提取是根据目标物质在溶剂中的溶解度而从产物除去目标物质。本文中公开的特定提取物是溶剂提取物，例如水提取物。

抑制(包括防止)细胞老化：抑制(例如防止)与细胞老化相关的一个或多个过程，例如在摄入所述组合物的对象中抑制自由基的形成或活性。防止细胞老化是指改善细胞老化的信号或症状的干预。防止包括用于延缓与细胞老化相关的一个或多个过程发作的预防。防止或抑制细胞老化不要求细胞老化完全消失。在特定实例中，公开的组合物降低或延缓与细胞老化相关的过程至少10％、至少20％、至少50％或甚至至少90％。使用本文中公开的方法以及本领域内已知的方法能够测量这种降低。

日本虎杖(Fallopia japonica，Polygonum cuspidatum)：原产于东亚的日本、中国和韩国的大型草本多年生植物。其为白藜芦醇及其葡糖苷白藜芦醇苷的浓缩源(高达原始重量的0.05～0.2％)。

圆叶葡萄(Vitus rotundifolia)：原产于美国东南部，并在从特拉华州到墨西哥湾且西到密苏里州、堪萨斯州、俄克拉荷马州和德克萨斯州发现的野生葡萄。圆叶葡萄非常适应美国东南部温暖、潮湿的条件。果实是小、松散的3～40个葡萄的簇，与欧洲和美洲葡萄的大、紧密成串的特性很不一样。圆的、1～1-1/2英寸的果实具有厚、硬的果皮并包含高达5个硬、椭圆形种子。在颜色方面，果实从绿青铜色到青铜色、桃红色、紫色，直到几乎黑色。

有许多不同品种的圆叶葡萄，包括雌性(有雌蕊的)品种如黑美人(BlackBeauty)、Black Fry、Darlene、Fry、Higgins、Jumbo、斯卡珀农(Scuppernong)、Sugargate、Summit、Supreme和Sweet Jenny，以及自体受精的品种如Carlos、Cowart、Dixieland、DixieRed、Fry Seedless、Magnolia、Nesbitt、Noble、Redgate、Regale和Sterling。

例如，本领域技术人员能够辨别的圆叶葡萄的青铜色品种包括Carlos、Chowan、Doreen、Higgins、Magnolia、Nevermiss、Pamlico、Roanoke、斯卡珀农、Sterling和Summit栽培品种。于是，紫色品种是更黑果皮的青铜色品种并包括Albermarle、Bountiful、Cowart、GA-1、Hunt、NC-1、Noble、Regale、Tarheel和Jumbo。一部分紫色品种也被称作是黑色的。

整个圆叶葡萄的植物化学成分与酿酒葡萄(Vitis vinifera)不同。圆叶葡萄具有较高的总的酚含量，其特征在于高的鞣花酸、没食子酸和黄酮苷浓度。圆叶葡萄中鞣花酸的存在是独特的且以游离的鞣花酸、鞣花酸糖苷、甲氧基化衍生物和鞣花单宁的形式被发现。另一个独特的特征是在圆叶葡萄中观察到的花色素苷化学。作为非酰化形式的花翠素、花青素、牵牛花色素(petunidin)、芍药花青素和二甲花翠素的3,5-二葡糖苷(与3-葡糖苷相对)存在的，这些化合物以及来自存在于葡萄内的其他花色素苷的天然颜色影响赋予得自紫色品种的果汁和果渣以暗紫色。紫色果渣提取物包含花色素苷，而青铜色果渣提取物不含。

在紫色圆叶葡萄中发现的红色和紫色颜色的花色素苷是具有抗氧化剂性质的多酚化合物。紫色和青铜色圆叶葡萄包含几种其他的多酚的黄酮类化合物类别，其中黄烷-3醇及其低聚物是在整个圆叶葡萄中存在的最丰富的类别以及黄酮醇是第二最丰富的黄酮类化合物。关于圆叶葡萄果皮部分，报道的主要酚类物质(以降序排列)是鞣花酸、杨梅酮、栎精和山柰酚，而关于种子报道的是表儿茶素、儿茶素和没食子酸(Pastrana-Bonilla等，J.Agric.Food Chem.51:5497-5503,2003)。

圆叶葡萄包含果渣和果汁。“整个葡萄之外的”包括从其提取了至少一部分果汁的圆叶葡萄，且在某些实例中包括小于95％或90％的葡萄中的原始果汁。

药物可接受的媒介物：用于本发明中的药物可接受的媒介物(载体)是常规的。雷明顿药学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),E.W.Martin著,Mack PublishingCo.,Easton,PA,第19版(1995)，描述了适用于药物递送一种或多种组合物如一种或多种圆叶葡萄组合物和其他药剂的组合物和制剂。

通常，媒介物的本质取决于所采用的特定给药模式。例如，肠外制剂通常包括可注射流体，包括药物和生理上可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等以作为媒介物。关于固体组合物(例如粉末、丸、片或胶囊形式)，常规无毒固体媒介物包括例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性媒介物，药物组合物能够包含少量无毒助剂如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或山梨醇单月桂酸酯。

多酚(也称作多羟基酚、酚类物质和多酚类)：特征是存在多个酚结构单元的一类有机化合物。其大部分衍生自植物，并能够通常分为黄酮类化合物、酚酸和芪，尽管存在多个亚类的黄酮类化合物和酚酸。在植物中发现的多酚通常是不同多酚类的复杂混合物，而且可以与糖基(多酚糖苷)共轭，或可以以糖苷配基的形式存在(无糖基附着)。“源自圆叶葡萄之外的源的多酚”是指存在于或得自圆叶葡萄之外的产物的多酚并包括多类多酚如黄酮类化合物、单宁酸和酚酸。这种非圆叶葡萄源的实例包括接骨木、红醋栗、蓝莓、黑树莓、红树莓、黑莓、越桔、云莓、花楸果、醋栗、石榴、葡萄或紫色胡萝卜。

果渣：在果汁提取之后剩余的果皮、种子和果肉。在一个实例中，果渣提取物是青铜色圆叶葡萄果渣提取物、紫色圆叶葡萄果渣提取物或其组合。许多不同品种的圆叶葡萄果渣可作为起始材料，其包括：雌性(有雌蕊的)品种如黑美人、Black Fry、Darlene、Fry、Higgins、Jumbo、斯卡珀农、Sugargate、Summit、Supreme和Sweet Jenny；以及自体受精的品种如Carlos、Cowart、Dixieland、Dixie Red、Fry Seedless、Magnolia、Nesbitt、Noble、Redgate、Regale和Sterling。圆叶葡萄果渣包含具有抗氧化剂性质的酚类化合物，包括没食子酸和鞣花酸。

果渣能够存在于整个葡萄中，其中整个葡萄包含至少90或95％的葡萄汁，或一旦对葡萄进行压缩以除去果汁，则果渣能够被基本分离并基本仅由果渣构成。

仅果渣：例如通过对葡萄进行压缩而已经从其除去了果汁的葡萄果渣部分。如本文中所使用的，“仅果渣”是指包含作为其重量百分比不超过1％的果汁的果渣。在某些实施方案中，仅果渣包含作为其重量百分比不超过0.5％的果汁。

提纯的：术语提纯的不要求绝对纯净；相反，其倾向于是一个相对术语。由此例如，提纯的物质是其中所述物质比所述物质在其自然环境中如在果实(例如葡萄)中更富集的物质。在一个实施方案中，对配制品进行提纯，使得物质代表配制品总含量的至少约5％(例如但不限于至少10％、20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％)。在实例中，公开的具有抗氧化剂活性的组合物包括最小纯度为总白藜芦醇配制品的至少50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％(按重量计)的反式-白藜芦醇。在一个实例中，“提纯的果渣”是葡萄中的在从其已经除去了部分或基本全部果汁的果渣。

紫色胡萝卜(Daucus carota)：包含花色素苷色素的胡萝卜栽培品种。通过根据本领域内已知的任意提取方法如压制或溶剂提取对紫色胡萝卜进行提取能够得到“紫色胡萝卜提取物”，只要所述提取物具有期望的活性(例如颜色稳定活性、抗氧化剂活性或其组合)即可。在实例中，紫色胡萝卜提取物具有稳定圆叶葡萄颜色色素的性质并因此能够随后用作稳定颜色的添加剂。

树莓：在Rubus属中的植物物种，例如产生可食用树莓果实的覆盆子(Rubusidaeus)(红树莓)或喜阴悬钩子(Rubus occidentalis)(黑树莓)。

白藜芦醇：一种植物抗毒素，其为芪类化合物、芪的衍生物，并在酶芪合酶的帮助下在植物中产生。白藜芦醇存在两种结构异构体：顺式-和反式-白藜芦醇。当受热或暴露在紫外射线下时，反式-白藜芦醇能够经历异构化而成为顺式-形式。

发现各种不同痕量的白藜芦醇，当在葡萄、树莓、桑葚、李子、花生、越桔属(Vaccinium)物种的浆果，包括蓝莓、越桔和蔓越橘以及某些松树如苏格兰松和东方白松中测量时，其平均值小于(鲜重)的0.0001％；最富集的白藜芦醇糖苷配基的天然来源(高达鲜重的0.05％)是大虎杖和日本虎杖的根和茎。在葡萄中，任何存在的白藜芦醇主要发现在果皮和种子中。在葡萄果皮中发现的白藜芦醇的量随葡萄栽培品种、其地理起源和在真菌感染下的暴露而变化。然而，如上所述，其典型地仅以痕量存在。

如本文中所使用的，术语白藜芦醇能够包括提取自植物如葡萄的天然反式-白藜芦醇、或合成的反式-白藜芦醇。如本文中所使用的，术语白藜芦醇能够包括反式-白藜芦醇的改性制剂如微胶囊化的或水分散形式。

“源自圆叶葡萄之外的源的白藜芦醇”是指存在于或得自圆叶葡萄(或圆叶葡萄的任意亚部分如其种子)之外的产物的白藜芦醇。白藜芦醇基本不得自溶剂提取的(例如水提取的)圆叶葡萄果渣，且在某些公开的实例中，圆叶葡萄果渣溶剂提取物基本不含白藜芦醇，直至将来自另一种源的白藜芦醇添加到提取物。

对象：活的多细胞脊椎生物，一种包括人和兽医对象如陪伴动物两者的类别，所述陪伴动物包括猫、狗或马。“需要提高线粒体生物合成和/或抗氧化剂活性的对象”是可能从这种提高获益的对象，例如期望降低年龄迹象、弥补由氧化造成的组织损伤和/或改善心血管、神经系统的、肿瘤相关的、皮肤外观或与氧化应激相关的其他状况的对象。

治疗有效量：组合物单独或与其他药剂(例如其他抗氧化剂)一起诱发期望响应(例如防止或抑制细胞老化)的量。本文中公开的配制品能够以治疗有效量给药。

废物流：源自特定生产工艺的被丢弃或者要不就是在生产期望的最终产品中被认为无价值的材料。例如，在将许多果实加工成果泥、果冻、果酱和果汁浓缩物中，果实的果皮被除去且不用于由所述工艺生产的产品中。在此情况中，认为果皮是生产过程中的废物流的一部分。

整个葡萄：如其在自然界中被发现的或通过例如装运过程而被轻微压缩的葡萄。“整个葡萄”包含果渣和至少90％(例如95％)的原始果汁含量。

II.几个实施方案的描述

作为能够用于减少氧化应激的营养药剂的潜在源，已经对植物药剂进行了广泛研究。在众多已经是细致研究的对象的食品中，红色葡萄是其中之一。红色葡萄的抗氧化剂效果广泛归因于多酚化合物如白藜芦醇和原花青素，后者大量呈现在葡萄中。

在过去使用一部分圆叶葡萄果渣提取物的问题是，鞣花酸在提取物中的溶解度低到不如人意，尤其是在青铜色提取物中。如WO 2010/014870和WO 2010/014873中所示，本发明人开发了一种通过将青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物合并而促进鞣花酸在圆叶葡萄果渣提取物中的溶解度的方法。发现将青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物合并惊奇地提高了鞣花酸在合并的提取物中的溶解度。即使在未浓缩和浓缩两种形式中紫色对青铜色提取物之比低(例如0.1至10或0.3至3范围内的比例)，仍惊奇地提高了鞣花酸的溶解度。发现包含与补充的白藜芦醇(源自圆叶葡萄之外的源)组合的、提高的水平的鞣花酸的组合物具有惊奇的协同亲脂性抗氧化剂活性，特别是如通过ORAC测量的。在亲脂性ORAC(ORAC_亲脂)中协同的抗氧化剂活性表明，抗氧化剂活性在亲脂性环境中特别有效，例如在低密度脂蛋白(LDL)中所发现的。在特定实例中，白藜芦醇的外源源为日本虎杖提取物。

还已经确定，通过将白藜芦醇与圆叶葡萄果渣提取物和其他多酚源的混合物合并，能够实现另外的协同效果，所述其他多酚源为例如花色素苷源如接骨木果。参见2013年3月4日提交的美国申请13/784,566号。

A.鞣花酸在合并的青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物中提高的溶解度

确定鞣花酸(其是圆叶葡萄特有的)在圆叶葡萄果渣提取物中的最大溶解度，使得在增强鞣花酸溶解度的条件下制备提取物(并由此获取果渣的多酚分布情况)，从而使得制备的提取物具有更高的抗氧化剂活性。如同WO 2010/014870和WO 2010/014873(通过参考将其并入本文中)中所公开的，具有改善的鞣花酸溶解度的圆叶葡萄提取物能够在非饮料食品、饮料、膳食增补物或局部软膏中单独地或与其他化合物组合给药。公开了制备合并提取物的各种方法，例如将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物合并以生产圆叶葡萄果渣提取物，其中青铜色圆叶葡萄果渣提取物对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比为0.1～10(重量对重量)如0.3～3(重量对重量)。通过单独提取青铜色和紫色圆叶葡萄并随后合并所述提取物，或通过同时提取以期望比例合并的青铜色和紫色圆叶葡萄，可以提取合并的提取物。

在WO 2010/014870和WO 2010/014873中，发明人单独并以组合的方式(以混合物或膳食增补物的方式)确定了标准化成98％反式-白藜芦醇的所公开圆叶葡萄果渣提取物和日本虎杖提取物的抗氧化能力，按ORAC测定法进行测量。对试样的亲水性抗氧化能力和亲脂性抗氧化能力两者都进行了测量。这些研究表明，圆叶葡萄果渣提取物和日本虎杖根提取物的混合物标准化成98％反式-白藜芦醇，具有强的协同亲脂性抗氧化剂效果。在亲脂性条件下展示的选择性协同效应是出乎意料地。用于组合物中的圆叶葡萄提取物能够为天然提取物并且在保持协同亲脂性抗氧化剂活性的同时能够因物种和提取工艺而变化。在特定实例中，具体公开比例的圆叶葡萄多酚和白藜芦醇存在于组合物中。

当与由包含在组合物中的单独提取物所贡献的亲脂性抗氧化能力之和相比时，以与圆叶葡萄果渣提取物组合的方式包含标准化成98％反式-白藜芦醇的日本虎杖提取物的组合物具有改善的亲脂性抗氧化能力。认为发生在亲脂性环境中的氧化过程引发了许多疾病状态的发病机制，例如在动脉粥样硬化中的低密度脂蛋白(LDL)氧化和在II型糖尿病中肥胖引起的胰岛素抗性。而且，膳食类脂质在胃肠道内的氧化导致吸收细胞毒性和基因毒性的脂质过氧化反应产物如丙二醛(MDA)。已经发现，通过抑制脂质过氧化反应和由脂质过氧化反应产生的产物如交联剂，亲脂性抗氧化剂在降低各种皮肤损害中是有效的。由于氧化应激是在正常老化下的中心机制，所以公开的抗氧化剂组合物对于抑制自由基产物或活性是有用的，由此减缓了与细胞老化相关的过程。

申请人的WO 2010/014870和WO 2010/014873公开了具有改善的抗氧化剂活性的圆叶葡萄果渣提取物组合物。作为非饮料食品、饮料、液体或固体膳食增补物或局部软膏的组分而公开了圆叶葡萄果渣提取物组合物。生产所公开组合物的方法包括将具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物与源自圆叶葡萄之外的源的具有至少5％最小纯度的反式-白藜芦醇合并，其中圆叶葡萄多酚对反式-白藜芦醇之比为0.1/1～10/1(重量对重量)。生产所公开组合物的方法包括将具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物与源自圆叶葡萄之外的源的具有至少5％最小纯度的反式-白藜芦醇合并，其中圆叶葡萄果渣提取物对反式-白藜芦醇之比为0.2/1～50/1(重量对重量)如5/1～50/1(重量对重量)，包括20/1～50/1(重量对重量)如18～1(重量对重量)，由此生产具有抗氧化剂活性的圆叶葡萄果渣提取物和反式-白藜芦醇混合物。在某些实施方案中，青铜色对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比为0.1～10如0.3～3，如下面更详细描述的。

B.圆叶葡萄果渣提取物

在WO 2010/014870和WO 2010/014873中公开的圆叶葡萄果渣提取物衍生自青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣。在某些实施方案中，在圆叶葡萄果渣提取物中青铜色圆叶葡萄果渣提取物对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比为0.1～10(重量对重量)如0.3～3(重量对重量)。例如青铜色圆叶葡萄果渣提取物对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比为约2.75～约1(重量对重量)、2.5～约1(重量对重量)、约2.25～约1(重量对重量)、约2～约1(重量对重量)、约1.5～约1(重量对重量)或约1～约1(重量对重量)。在其他实例中，所述比例为约10～约1、约7.5～约1或约5～约1。如本文中所使用的，术语“约”定义为±0.5。在特定实例中，青铜色圆叶葡萄果渣提取物对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比为约2.25～约1(重量对重量)。

在特定实施方案中，圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物具有至少2％的多酚含量。例如，所述多酚含量为至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少12％或至少14％。在特定实例中，圆叶葡萄(Vitisrotundifolia)果渣提取物具有约4％的多酚含量。

在某些实施方案中，所公开圆叶葡萄果渣提取物包括在液体中的20％～50％的固体如至少25％、至少30％、至少35％、至少37％、至少40％、至少42％、至少44％、至少46％或至少48％。在特定实例中，提取物在液体中包括约40％的固体。

在存在于整个葡萄中时或从提纯的基本不含葡萄汁的果渣，能够对圆叶葡萄果渣进行提取。在特定实例中，提纯的果渣是在已经将葡萄中的果汁除去至少50％之后剩余的果皮、种子和果肉。在其他实例中，提纯的果渣是在已经将至少60％、70％、80％或90％的果汁除去之后剩余的果皮、种子和果肉，从而果渣基本仅由果皮、种子和果肉构成。

由包含在整个葡萄中的葡萄果渣制备的提取物具有包含源自葡萄果渣和葡萄果汁两者的提取组分的优势。紫色圆叶葡萄在其果汁中包含花色素苷，使得紫色葡萄的溶剂提取提供一种包含附加量的花色素苷的提取物，所述附加量的花色素苷有助于紫色圆叶葡萄提取物将鞣花酸溶解在合并的青铜色和紫色圆叶葡萄提取物中的能力。

C.制备圆叶葡萄果渣提取物的方法

WO 2010/014870和WO 2010/014873还公开了制备圆叶葡萄果渣提取物的方法，其中青铜色圆叶葡萄果渣提取物对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比为0.1～10(重量对重量)如0.3～3(重量对重量)。尽管通过任意提取方法如在压力下的压制或利用溶剂的提取，能够得到提取物，但特定实例是例如利用醇、水(例如热水)或醇和水的组合进行溶剂提取的。在一个公开的实施方案中，通过同时对以得到期望的青铜色和紫色提取物之比的比例存在的青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣进行提取，制备了圆叶葡萄果渣提取物。在其他实例中，分别制备了青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物。例如，利用水、优选热水分别对青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣进行提取。

提取物还能够被发酵以除去提取的糖。在一个实例中，在提取青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣之后但在将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物合并以生产所公开的圆叶葡萄果渣提取物之前，实施发酵。在其他实例中，在将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物以期望的提取后比率(例如在约2.25～1的青铜色对紫色之比下)进行合并之后，实施发酵。

通过本领域内技术人员已知的任意方法，包括本文中所述的方法，可以实施发酵。例如能够将酵母和酵母养分添加到果渣并继续发酵，直至残留的糖内容物转化成乙醇。在一个实例中，每100加仑1×(未浓缩的)提取物能够添加两磅酵母；发酵典型地在三天之后完成。在其他实例中，酵母的量和/或菌株以及发酵的持续时间和温度可以随本领域技术人员已知的各种方法而变化。在某些实例中，使用酶来澄清和/或沉降残液或提高在果渣提取物中的提取收率。这种酶的实例包括果胶酶、或源自黑曲霉(Aspergillus niger)的酶的共混物，所述源自黑曲霉(Aspergillus niger)的酶商购得自诸如Scott Laboratories。这些酶可以在发酵之前或期间添加到果渣提取物。

在某些实施方案中，在发酵之前和/或之后，对青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物进行过滤。过滤能够根据本领域内技术人员已知的普通方法来实施。在特定实例中，通过合适的筛孔尺寸的筛子如USP网(典型地120目)或类似的布过滤器(例如商购得自Millipore Corporation的过滤器)对提取物进行过滤。

在特定实施方案中，制备圆叶葡萄果渣提取物的方法还包括对青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物进行浓缩，使得各提取物在液体中包含20％～50％的固体如至少25％、至少30％、至少35％、至少37％、至少40％、至少42％、至少44％、至少46％或至少48％。在特定实例中，对提取物进行浓缩，以使得各提取物在液体中包含约40％固体。能够使用普通已知的用于浓缩试样的方法以对青铜色和紫色提取物进行浓缩，包括本文中所公开的样品浓缩方法。

在特定实例中，为了制备在40％固体下的圆叶葡萄果渣提取物，将圆叶葡萄果渣提取物干燥至粉末形式并在40％固体水平下在水中重新构造。或者，更接受的商业方法是使用分批或连续工艺在真空下通过蒸发除去提取溶剂而浓缩。分批工艺涉及在对容器夹套进行加热以提供能量来升高溶剂蒸气压的同时将提取物放入在20～29”水银真空下的容器中。溶剂蒸气在容器外部冷凝且冷凝速率控制冷凝物的温度。相同的原理适用于连续蒸发工艺，但具有如下优势，即冷凝物暴露在高温下的时间段缩短。两种工艺都可应用于本文中所述的圆叶葡萄果渣提取物的浓缩。

在特定实施方案中，将青铜色和紫色果渣分别进行提取并在将青铜色和紫色果渣提取物在期望比例下合并之前对各种提取物进行过滤。在某些实例中，该方法还包括对合并的圆叶葡萄果渣提取物进行发酵以除去提取的糖。在一个实例中，通过例如在发酵之前和之后对提取物进行过滤，使用超过一个的过滤步骤。在某些实例中，所述方法还包括对提取物进行浓缩，如本文中所述的。例如，通过真空蒸发除去提取物溶剂，对提取物进行浓缩。

现在已经发现，在提取方法的任一上述实例中，整个紫色葡萄能够取代葡萄果渣。紫色圆叶葡萄果渣提取物包括：(a)整个紫色圆叶葡萄的提取物；(b)源自整个葡萄之外的紫色圆叶葡萄果渣的提取物；或(c)(a)和(b)的混合物。整个紫色葡萄包含作为源自葡萄果渣之外的花色素苷的源的葡萄汁，且当从整个葡萄进行溶剂提取时，现在已经发现这些花色素苷惊奇地增强了鞣花酸在青铜色和紫色圆叶葡萄提取物的混合物中的溶解度。然而，通过有色果实或除紫色圆叶葡萄之外的有色果实如蓝莓、黑莓或树莓果实的副产物，也能够提供花色素苷的其他源。在其他实例中，花色素苷源自果实加工流的产物如果汁浓缩物或果实加工流的副产物如从果泥加工流分离的果皮。源自整个圆叶葡萄或其他有色果实的其他花色素苷大大提高了鞣花酸的溶解度，其是圆叶葡萄中的期望的抗氧化剂。

在提取方法的某些实施方案中，通过以1:5～1:12(重量:重量)的比例对整个紫色圆叶葡萄和青铜色圆叶葡萄果渣同时进行提取，生产了圆叶葡萄果渣提取物。在其他实例中，生产了提取物，所述提取物包含(a)整个紫色圆叶葡萄对(b)青铜色和紫色圆叶葡萄果渣的混合物之比为1:7～1:16(重量:重量)的(a)和(b)的提取物。在其他实施方案中，圆叶葡萄果渣提取物衍生自任意组合的整个紫色圆叶葡萄、青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣，其中在起始材料(整个葡萄和果渣)中花色素苷对鞣花酸之比为0.5:1～5:1(重量:重量)。在其他实例中，圆叶葡萄果渣提取物衍生自与花色素苷的其他源(例如整个紫色圆叶葡萄或其他有色果实如黑莓、树莓、红醋栗或蓝莓果实、或任一这些果实的废物流)组合的青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣，其中花色素苷对鞣花酸之比为0.5:1～5:1(重量:重量)。

D.具有抗氧化剂活性的组合物

本文中公开了具有改善的抗氧化剂活性的组合物。在某些公开的实施方案中，所述组合物包括具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物与源自圆叶葡萄之外的源(例如日本虎杖的根提取物)的具有至少5％最小纯度的反式-白藜芦醇，其中圆叶葡萄的多酚对反式-白藜芦醇之比为0.1/1～10/1(重量对重量)，由此提供具有抗氧化剂活性的组合物。这些和所有其他具体实例和实施方案旨在作为本发明的特定实施方案，且不用于限制本发明的范围，任一具体实例也不旨在暗示本发明被限定至特定特征，除非另有说明。

在某些实例中，所述组合物包括：圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物，其具有至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少12％或至少14％的总的多酚含量；和源自圆叶葡萄之外的源的反式-白藜芦醇，其具有至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％的最小纯度。在特定实例中，所述组合物包括具有约4％多酚含量的圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物和源自圆叶葡萄之外的源的具有至少98％最小纯度的反式-白藜芦醇。

在某些实施方案中，所述组合物包括圆叶葡萄果渣提取物，其在液体中具有20％～50％的固体，例如至少23％、至少25％、至少30％、至少35％、至少37％、至少40％、至少42％、至少44％、至少46％或至少48％。在特定实例中，提取物在液体中包括约40％的固体。

在其他实施方案中，所述白藜芦醇包括至少5％的反式-白藜芦醇，例如至少10％的反式-白藜芦醇、至少20％的反式-白藜芦醇、至少30％的反式-白藜芦醇、至少40％的反式-白藜芦醇、至少50％的反式-白藜芦醇、至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％的反式-白藜芦醇。在特定实施方案中，白藜芦醇包括提取自日本虎杖(Polygonum cuspidatum)根的至少50％的反式-白藜芦醇，例如至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％的反式-白藜芦醇。设想了其他反式-白藜芦醇源能够用于公开的组合物中，包括合成的反式-白藜芦醇。

在特定实施方案中，所公开的抗氧化剂组合物的圆叶葡萄多酚对反式-白藜芦醇之比为至少0.1:1(重量对重量)，例如0.25:1、0.5:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.9:1或1:1(重量对重量)。在其他实施方案中，圆叶葡萄多酚对反式-白藜芦醇之比可以高达10:1(重量对重量)，例如2:1、3:1、4:1、5:1、7.5:1或9:1(重量对重量)。在特定实例中，所公开的抗氧化剂组合物的圆叶葡萄多酚对反式-白藜芦醇之比为0.75:1(重量对重量)。

在特定实施方案中，所公开抗氧化剂组合物的圆叶葡萄果渣提取物对反式-白藜芦醇之比为0.2/1～50/1(重量对重量)，例如0.5:1、1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、22:1、25:1、30:1、35:1、40:1或45:1(重量对重量)。

在某些实施方案中，所公开的具有抗氧化剂活性的组合物的总ORAC为每mg多酚至少21μmol Trolox当量(μmol TE/mg多酚)，例如至少22μmol TE/mg多酚、至少24μmol TE/mg多酚、至少26μmolμmolTE/mg多酚、至少28μmol TE/mg多酚或至少30μmol TE/mg多酚。在一个实例中，所公开组合物的总ORAC为24μmol TE/mg多酚。

所公开组合物的某些实例还包括接骨木提取物、紫色胡萝卜提取物、赋形剂(例如甘油、山梨糖醇、胶体二氧化硅或天然香料添加剂)或其组合。例如，能够包括接骨木提取物和紫色胡萝卜提取物以向组合物提供颜色或提供另外的抗氧化剂活性。

在所述方法特别公开的实施方案中，将抗氧化剂组合物进一步与源自圆叶葡萄之外的源的多酚(例如花色素苷)合并。在特定实施方案中，合并所述组分，使得抗氧化剂组合物包括至少10％的多酚，例如高达35％的多酚，例如12～32％。在特定公开的实例中，所述接骨木提取物提供圆叶葡萄/接骨木混合物中至少四分之一的总的多酚，例如在圆叶葡萄/接骨木混合物中三分之一到三分之二的总的多酚且至少五分之一如25％～90％的花色素苷。

在特定实施方案中，提取物包括青铜色圆叶葡萄果渣提取物和不是得自青铜色圆叶葡萄果渣的其他花色素苷，其中所述其他花色素苷得自紫色整个圆叶葡萄的提取物，其中所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色整个圆叶葡萄的提取物是溶剂提取物；和/或源自红醋栗、蓝莓、黑树莓、红树莓或蓝莓的果实的含花色素苷的提取物。

任一所公开组合物都能够用于非饮料食品、饮料、或液体或固体膳食增补物中。在某些实例中，将公开的组合物用作饮料。本文中的组合物(尤其是食品、饮料和膳食增补物组合物)能够用一种或多种营养物、尤其是一种或多种维他命和/或矿物质来强化。这种维他命和矿物质的非限制性实例包括铁、锌、铜、钙、磷、烟酸、硫胺、叶酸、泛酸、碘、维他命A、维他命C、维他命B2、维他命B3、维他命B6、维他命B12、维他命D、维他命E和维他命K。商购获得的维他命和矿物质的源也可包括在本组合物中。

在某些实例中，食品和饮料组合物还能够包括一种或多种膳食纤维。“膳食纤维”是指抵抗哺乳动物的酶的消化的复杂碳水化合物，例如在植物细胞壁和海藻中发现的或由微生物发酵产生的碳水化合物。这些复杂碳水化合物的实例是麸、纤维素、半纤维素、果胶、树胶和粘液、海藻提取物和生物合成胶。纤维素纤维的源包括蔬菜、水果、种子、谷物和人造纤维(例如由细菌合成的)。也能够使用商业纤维如提纯的植物纤维素或纤维素粉。天然存在的纤维包括源自整个柑桔皮、柑橘白色内皮、甜菜、柑橘果肉和泡状体固体(vesiclesolid)、苹果、杏、和西瓜皮的纤维。

通过常规方法如使用食品等级的酸性缓冲剂能够将饮料酸度调节至并保持在期望范围内。典型地，在上述范围内的饮料酸度是用于微生物抑制的最大酸度与所期望饮料口味的最佳酸度之间的平衡。在某些实例中，所述饮料组合物的pH值约2～约8、如约2～约4.5、或约2.7～约4.2。

有机和无机食用酸可以用来调整饮料组合物的pH。酸能够以其未解离的形式或其相应的盐的形式存在，包括钾或钠的磷酸氢盐、钾或钠的磷酸二氢盐。在某些实例中，所述酸包括柠檬酸、苹果酸、富马酸、己二酸、磷酸、葡糖酸、酒石酸、抗坏血酸、醋酸、磷酸、丙酮酸或其混合物。酸化剂还能够充当抗氧化剂以稳定饮料组分。常用的抗氧化剂的实例包括但不限于抗坏血酸、EDTA(乙二胺四乙酸)及其盐。

E.制备具有抗氧化剂活性的圆叶葡萄组合物的方法

具有抗氧化剂活性的圆叶葡萄果渣提取物组合物能够通过各种方法制得。例如，通过在适当情况下将所有组分单独或以合适组合一起的方式溶解、分散或要不混合在水中，并利用机械搅拌器对混合物进行搅拌，直至所有成分都溶解或充分分散，能够制备所述组合物。可以将单独的溶液或混合物合并。最终的混合物能够任选地在合适工艺条件下用巴氏法灭菌或无菌填充以提高储存稳定性。

在某些实例中，将具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物与源自圆叶葡萄之外的源的白藜芦醇合并，其中所述白藜芦醇具有至少5％(例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的最小纯度，其中圆叶葡萄多酚对反式-白藜芦醇之比为0.1/1～10/1(重量对重量)，例如0.75/1，由此生产具有抗氧化剂活性的圆叶葡萄果渣提取物和反式-白藜芦醇的混合物。所公开的方法还包括在将圆叶葡萄果渣提取物与反式-白藜芦醇合并之前制备圆叶葡萄果渣提取物。

在一个特定实例中，通过将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色圆叶葡萄果渣提取物合并来制备圆叶葡萄果渣提取物。在其他实例中，通过同时提取青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣的混合物来制备圆叶葡萄果渣提取物；在某些情况中，果渣被包含在整个紫色圆叶葡萄中，使得能够对青铜色果渣和紫色圆叶葡萄的混合物实施提取。根据已知方法如压碎、压制、提取、过滤(几次)和通过真空蒸发对提取物进行浓缩，随后冷冻，能够制备圆叶葡萄果渣提取物。在一个实例中，仅将水用于提取工艺且不向提取物自身添加其他组分(例如溶剂、载体或防腐剂)。所述工艺在降低其他分子如大部分糖的存在的同时保持多酚化合物的条件下实施。在其他实例中，将乙醇或乙醇与水的混合物用于提纯工艺。在特定实例中，提纯工艺能够还包括将酶用于澄清或辅助提取。例如，能够将源自黑曲霉的酶的共混物或果胶酶用于这些用途。商业实例包括源自Scott Laboratories的Scottzyme KS和ScottzymePEC5L。

在其他实例中，通过利用具有至少2％总的酚浓度的圆叶葡萄果渣提取物，制备组合物。例如，可商购的具有至少2％总的酚浓度的圆叶葡萄提取物能够用于制备所公开的具有抗氧化剂活性的组合物。

在特定实例中，通过将圆叶葡萄果渣提取物和白藜芦醇与果实提取物合并，制备具有抗氧化剂活性的组合物，其中所述果实提取物以足以充分提高鞣花酸在圆叶葡萄果渣提取物中的溶解度的量存在。

另一个公开的实施方案是通过将圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)果渣提取物与源自圆叶葡萄之外的源的白藜芦醇合并来制备抗氧化剂组合物的方法，其中圆叶葡萄果渣提取物多酚对反式-白藜芦醇之比为0.1/1～10/1(重量对重量)，且制得的组合物具有至少2％多酚含量。所述圆叶葡萄果渣提取物可以任选地在其与源自圆叶葡萄之外的源的白藜芦醇合并之前进行浓缩。在某些实例中，将圆叶葡萄果渣提取物和白藜芦醇与源自圆叶葡萄之外的源(例如花色素苷的源)的多酚合并，所述多酚例如源自如下物质的提取物中的一种或多种：接骨木、红醋栗、蓝莓、黑树莓、红树莓、黑莓、越桔、云莓、花楸果、醋栗、石榴、葡萄或紫色胡萝卜。

在特定实施方案中，所述方法包括将青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物和具有至少5％多酚含量的接骨木果提取物的混合物与日本虎杖根提取物合并。在特定实例中，日本虎杖根提取物是至少98％的白藜芦醇，和/或圆叶葡萄果渣提取物是青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物的混合物。在所述方法的某些实施方案中，将青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物以0.1～10的比例合并或者不然的话，青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物以0.1～10的比例存在。

在另一个实施方案中，对青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物分别或一起进行溶剂提取以得到含溶解的鞣花酸的青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物的混合物，然后将青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物的混合物浓缩至例如至少40％的固体含量。将浓缩的青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物的混合物与源自圆叶葡萄果渣提取物之外的源的白藜芦醇合并以得到抗氧化剂混合物，使得在抗氧化剂混合物中圆叶葡萄果渣提取物多酚对反式-白藜芦醇之比为0.1/1～10/1(重量对重量)，且制得的抗氧化剂组合物具有至少2％的多酚含量。

在所述方法的其他实施方案中，通过例如将有色果实提取物添加到抗氧化剂组合物，将抗氧化剂组合物进一步与源自圆叶葡萄之外的源的多酚(例如花色素苷)合并。在其他实施方案中，花色素苷源自圆叶葡萄的果渣之外的源，例如花色素苷源自在提取工艺期间引入的圆叶葡萄的果汁。在特定实施方案中，合并所述组分，使得抗氧化剂组合物包括至少10％的多酚，例如高达35％的多酚，例如12～32％。

F.用于抑制(例如防止)细胞老化的方法和试剂盒

所公开的组合物具有惊奇的协同亲脂性抗氧化剂活性。已知的是，氧化应激是在正常老化下的中心机制。还已知的是，亲脂性抗氧化剂能够抑制各种皮肤损伤。基于这些观察，公开了例如通过抑制或降低自由基的产生或活性，用于抑制细胞老化的方法。在一个实例中，将一定剂量的组合物给药到需要抗氧化剂活性的对象且所述剂量足以抑制或减少与细胞老化相关的一个或多个过程如对象中自由基的形成或活性。

所述组合物还可用于治疗与氧化应激相关的任何疾病。本提取物和合并的组合物能够用于减轻、防止或治疗与慢性发炎疾病如糖尿病、癌症、动脉粥样硬化和其他心血管疾病以及与中枢神经系统或脑的变性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的发病机制相关的氧化应激。

所述方法的某些实施方案，通过施加只包含圆叶葡萄果渣提取物或者还组合有包括但不限于白藜芦醇的其他活性成分的溶液或局部软膏，抑制或减少在皮肤细胞中自由基的形成或活性，从而改善皮肤品质。在一个实例中，溶液或局部软膏包括公开的圆叶葡萄果渣提取物而不含白藜芦醇。在另一个实例中，溶液或局部软膏包括公开的圆叶葡萄果渣提取物和白藜芦醇两者，例如圆叶葡萄多酚对白藜芦醇之比为约0.75:1(重量对重量)的圆叶葡萄果渣提取物。在另外的其他实例中，所述组合物包括源自圆叶葡萄之外的源如源自接骨木果提取物的多酚(例如花色素苷)。所述方法能够由临床医生或其他卫生保健提供者来实施，或能够设计为家用。所述方法能够减少与老化相关的皮肤变化的出现，从视觉上减轻人皮肤的皱纹，并提高皮肤的纹理品质。还提供用于改善皮肤品质的组合物和试剂盒，其能够包括公开的具有抗氧化剂活性的组合物(包括口服或局部的)，或者圆叶葡萄提取物和一种或多种其他抗老化组合物如一种或多种其他抗氧化剂。

圆叶葡萄果渣提取物组合物可以被包括在皮肤品质改善试剂盒中以用于家用或由临床医生如内科医生或美容师使用。试剂盒能够包括：将组合物施加到皮肤的涂布器；和使用说明书。说明书能够是书写的或数字形式(例如录像带、DVD或CD)的以与电子装置如计算机、CD播放器、mp3播放器或DVD播放器等一起使用。在另一个实例中，试剂盒适合家用。在某些实例中，试剂盒在两个分开的容器中或在单个容器中作为单种组合物包括圆叶葡萄组合物和一种或多种其他抗老化化合物如另一种抗氧化剂(例如维他命C、维他命E、硒和/或β-胡萝卜素)。

G.具有药物载体的组合物

所公开的圆叶葡萄果渣提取物和组合物能够用于抑制一种或多种氧化过程，例如与细胞事件如细胞老化相关的自由基的形成。所述组合物能够包括药物载体和单独或与白藜芦醇组合的至少一种公开的圆叶葡萄果渣提取物，所述白藜芦醇源自圆叶葡萄之外的源。在某些实施方案中，组合物还包含源自圆叶葡萄之外的多酚的补充源。药物载体能够为药物或非药物用途，例如在用于特定目的如药品销售之前需要或不需要规章批准的用途。然而，如本文中所使用的“药物组合物”是指包含药物相容性载体的组合物。在并入的美国专利申请13/056,536、13/056,559和13/784,566号中对合适的药物载体进行了更详细说明。

H.所公开提取物和组合物的给药

在特定实例中，将组合物以非饮料食品、饮料或膳食增补物的形式口服给药到哺乳动物对象如人。在另一个实例中，将组合物局部施用到哺乳动物对象如人的皮肤表面。

所施用药剂的治疗有效量随期望效果和所治疗对象而变化。在一个实例中，所述方法包括每天将至少1mg组合物给药到对象(例如人对象)。例如，能够每天向人给药至少1g或至少10g组合物，例如每天1g～5g、每天5g～10g，例如每天7g。在一个实例中，向对象给药至少5g包括圆叶葡萄果渣提取物和白藜芦醇的组合物。在其他实例中，向对象口服给药至少6.3g这种组合物。所述剂量能够以分开的剂量(例如每天2、3或4次分开的剂量)或以每天单一剂量的方式给药。

在特定实例中，按照多次每天给药方案向对象给药治疗组合物，例如至少连续两天、连续10天等，并可以持续数周、数月或数年的周期。在一个实例中，每天给药所述组合物并持续至少30天如至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月的时间段。

通过如下非限制性实例进一步显示了本发明的主题内容。

实施例

实施例1

确定鞣花酸在圆叶葡萄果渣提取物中的溶解度

该实例显示了在未浓缩的和浓缩的提取物中青铜色对紫色果渣提取物的各种具体比例对鞣花酸溶解度的影响。青铜色和紫色提取物的混合物提高鞣花酸的溶解度。

对分开发酵的青铜色和紫色果渣提取物进行加热，然后在100ml总体积下按表1中所示的比例进行混合。

表1

在1×浓度下青铜色/紫色果渣提取物的各种比例

青铜色(ml)	紫色(ml)
		75	25
65	35
		50	50
25	75

制得的提取物混合物为1×浓度，因为未对分开的青铜色和紫色果渣提取物进行浓缩。1×浓度典型地包含约2％的固体溶液(100g溶液等于2g干提取物)。将约20毫升各个比例的提取物混合物转移到相应玻璃试管中并用箔盖封。将试样在85℃下加热30分钟，然后从热源移走并冷却至室温。然后通过0.45μm PTFE过滤器w/GMF对试样进行过滤并通过HPLC/MS进行分析以确定其鞣花酸含量。还通过相同方法对分开的青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物进行了分析，以确定在青铜色和紫色果渣提取物两者中鞣花酸的基线值并确定花色素苷在紫色果渣提取物中的含量。然后，通过具有在254nm下的UV-VIS检测的反相HPLC，与离子阱质量检测器串联，使用在[M-H]^-＝301amu下的提取离子色谱(EIC)，确定了试样中鞣花酸的总面积。

为了制备在40％固体下的各种比例的青铜色/紫色果渣提取物，将1×下分开的青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物干燥成粉末形式并在水中重构以生产含40％固体的液体。然后根据重量(wt)而不是体积将这两种分开的溶液混合成各种比例。将所评价的各种比例示于表2A和2B中。

表2A

确定鞣花酸在1×浓度下各种比例的青铜色/紫色提取物中的溶解度

表2B

确定鞣花酸在约20×浓度或40％固体含量下各种比例的青铜色/紫色提取物中的溶解度

将约10毫升各个比例的提取物混合物转移到相应玻璃试管中并用箔盖封。将试样在85℃下加热30分钟，然后从热源移走并冷却至室温。然后通过0.45μm PTFE过滤器w/GMF对试样进行过滤并通过HPLC/MS进行分析以确定其鞣花酸含量。还通过相同方法对分开的青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物进行了分析，以确定在青铜色和紫色果渣提取物两者中鞣花酸的基线值并确定花色素苷在紫色圆叶葡萄果渣提取物中的含量。使用经过验证的试验方法C2505，与离子阱质量检测器串联，使用在[M-H]^-＝301amu下的提取离子色谱(EIC)，确定试样中鞣花酸的总面积。

将紫色与青铜色圆叶葡萄果渣提取物混合，提高鞣花酸在混合物中的溶解度。这些研究发现，65％～35％的青铜色对紫色果渣提取物之比(体积对体积)足以提高鞣花酸在两种果渣提取物在1×浓度下的混合物中的最大溶解度。此外，在40％固体含量下，鞣花酸的溶解度继续随着紫色圆叶葡萄果渣提取物在混合物中的含量的升高而升高。这些发现表明，在40％固体含量下，更大量的鞣花酸以固体形式存在，从而更高含量的紫色果渣提取物可用于完全溶解存在于混合物中的所有鞣花酸。这些研究还表明，花色素苷，例如包含在紫色圆叶葡萄果渣提取物中的花色素苷，影响包含在青铜色圆叶葡萄果渣提取物中的鞣花酸的溶解度。

实施例2

抗老化膳食增补物及其制备

在WO 2010/014870和WO 2010/014873中公开了膳食增补物，消耗所述膳食增补物以防止或抑制与细胞老化相关的一种或多种过程，通过参考将所述专利申请并入。

膳食增补物包括关于剂量的说明书。例如说明书能够显示，5ml液体增补物(约一茶匙)能够在进餐之前每天服用并用作抗老化增补物以抑制与细胞老化相关的一种或多种过程。

实施例3

圆叶葡萄果渣提取物和日本虎杖根提取物的混合物的抗氧化容量

该实例显示了日本虎杖提取物和圆叶葡萄果渣提取物的混合物的更高的抗氧化容量，其是通过氧自由基吸收容量(ORAC)测定法测量的。

使用ORAC测定法对两种植物学提取物的抗氧化容量单独或以组合的方式进行了评价。该测定法已经用于测量广泛的食品和饮料的抗氧化容量并是包含在USDA ORAC数据库中的数据的基础。通过该试验能够测量亲水性抗氧化容量和亲脂性抗氧化容量两者。

对如下试样进行了分析：(1)标准化成最小98％反式-白藜芦醇(实际含量为100％反式-白藜芦醇)的干燥/粉末状日本虎杖茎提取物；(2)含14.4％总多酚含量的干燥/粉末状圆叶葡萄果渣提取物(青铜色对紫色果渣之比为2:1)；和(3)上述干燥/粉末状日本虎杖和干燥/粉末状圆叶葡萄果渣提取物以1:5.36(重量:重量)比例的混合物(总多酚含量为混合物的27.5％且圆叶葡萄多酚对反式-白藜芦醇之比为0.75:1)。对亲水性、亲脂性和总ORAC值进行了测量(总ORAC值是亲水性和亲脂性值之和)并将结果表示为每毫克多酚的μmol Trolox当量(μmol TE/mg多酚)。将结果示于表3中。

表3

试样1～3的亲水性、亲脂性和总ORAC值，以μmol TE/mg多酚表示

试样提取物	ORAC亲水性	ORAC亲脂性	ORAC总计
				(1)日本虎杖(100％白藜芦醇)	29.85	1.46	31.31
(2)圆叶葡萄果渣(14.4％的多酚)	9.69	0.06	9.74
				(3)混合物-预测的加和	21.19	0.86	22.05
(3)混合物-实际值	21.83	4.35	26.18

如表3中所示，测量的混合物的亲水性ORAC值与基于两种提取物的加和效果而预测的值类似。然而，测量的混合物的亲脂性ORAC值比预测的加和值大五倍，导致总的ORAC值提高20％。表4显示的结果以每克材料的ORAC值表示(相对表3中所示的每mg多酚)。如表4中所示，当将值以每克材料的ORAC表示时，圆叶葡萄果渣提取物和日本虎杖茎提取物的混合物在产生亲脂性抗氧化容量方面的协同效应得以保持。

表4

试样1～4的亲水性、亲脂性和总ORAC值，以每克材料的ORAC值表示

提取物试样	ORAC亲水性	ORAC亲脂性	ORAC总计
				(1)日本虎杖(100％白藜芦醇)	29,852	1,457	31,309
(2)圆叶葡萄果渣(14.4％的多酚)	1,356	8	1,364
				(3)混合物-预测的加和	5,830	236	6065
(3)混合物-实际值	6,003	1,197	7200

尽管通过上述实例显示了添加的白藜芦醇的优异的抗氧化效果，但是圆叶葡萄/白藜芦醇混合物的改进的抗氧化活性不限制于该实施例3中所试验的圆叶葡萄和白藜芦醇的特定比例。

实施例4

接骨木果提取物对鞣花酸在圆叶葡萄果渣提取物中的溶解度的影响

如实施例1中所示，将紫色果渣提取物添加到青铜色果渣提取物，增强包含在青铜色果渣提取物中的鞣花酸的溶解度。在浓缩至40％固体含量的提取物中这种效果明显更大(相对2％的固体含量)。

接骨木果提取物包含大量花色素苷(但不是鞣花酸)并由此实施实验以确定通过添加源自接骨木果提取物的花色素苷是否影响圆叶葡萄果渣提取物(青铜色和紫色果渣混合物)内溶解的鞣花酸的含量。该实例显示，通过添加接骨木果提取物明显提高了圆叶葡萄果渣提取物内溶解的鞣花酸的含量，可能是由于其花色素苷含量。该实施例中试验的特定量不限制发明自身，而仅作为权利要求书范围内的工作实施方案的具体实例而包括在发明内。尽管有时将接骨木果提取物以小浓度(小于0.5％)的方式用作食品着色剂，但在这些实验中添加的接骨木果提取物的相对量远高于仅用作食品着色剂的量。例如，接骨木果提取物粉末能够为接骨木果提取物粉末和圆叶葡萄提取物粉末的合并重量的至少20％、30％、40％、50％、60％或65％。另外，在合并的粉末中花色素苷对鞣花酸的重量比超过0.5:1、1:1、10:1或20:1，例如在实验例4中所提供的实例中，在合并的粉末中花色素苷对鞣花酸的重量比为24:1。该实例还显示，添加的花色素苷不需要存在于原始提取材料中，但能够还存在于在初始提取之后混合在一起的提取物(或甚至粉末形式的提取物)中。

仅出于说明目的，在(1)干燥粉末状圆叶葡萄果渣提取物(青铜色对紫色果渣之比为2:1)和(2)上述圆叶葡萄果渣提取物和干燥粉末状接骨木果提取物(含6.5％的花色素苷)以1:1.86(重量:重量)比例的混合物中，测量了鞣花酸浓度。在提供40％、20％、10％和2％固体的各种浓度下制备了各种试样的溶液。将各种溶液在85℃下加热30分钟，从热源移走并冷却至室温(1小时完成)。然后通过0.45μm PTFE过滤器w/GMF对试样进行过滤并通过HPLC/MS进行分析以确定其溶解的鞣花酸含量。通过具有在254nm下的UV-VIS检测的反相HPLC，与离子阱质量检测器串联，使用在[M-H]^-＝301amu下的提取离子色谱(EIC)，对鞣花酸的总面积进行了分析。将结果示于表5中。

表5

接骨木果提取物(花色素苷)对圆叶葡萄果渣提取物中溶解的鞣花酸含量的影响

在接骨木果提取物粉末的重量大于圆叶葡萄果渣提取物粉末重量的条件下得到的这些结果清晰显示，圆叶葡萄果渣提取物/接骨木果提取物比圆叶葡萄果渣提取物的贡献所预测的，包含明显更大量(40～65％以上)的溶解的鞣花酸。尽管圆叶葡萄果渣提取物是由青铜色和紫色果渣提取物的混合物制备的并由此包含源自紫色果渣的花色素苷(其促进鞣花酸的溶解度)，但添加足够量的来自圆叶葡萄之外的源(接骨木果提取物)的花色素苷出乎意料地大大提高了鞣花酸的溶解度。

通过测量总的鞣花酸在圆叶葡萄果渣提取物中的绝对值以了解在上述条件下溶解了多大比例的总的鞣花酸含量，确认该出乎意料的结果。为了确定包含在试样内的总鞣花酸的绝对值，将各种干粉(试样1和2)溶于DMSO中并按上述测定了其鞣花酸含量(通过具有在254nm下的UV-VIS检测的反相HPLC，与离子阱质量检测器串联，使用在[M-H]^-＝301amu下的提取离子色谱(EIC)，对鞣花酸的总面积进行了测量)。下表(6和7)显示，通过內源圆叶葡萄果渣花色素苷并通过添加源自接骨木果提取物的外源花色素苷增大了变为溶解的总鞣花酸的百分比。

表6

圆叶葡萄果渣花色素苷对圆叶葡萄果渣提取物中总鞣花酸溶解度的影响

表6显示，圆叶葡萄果渣提取物(源自紫色果渣)中的內源花色素苷升高了变为溶解的总鞣花酸的百分比。固体含量的升高水平伴随着內源花色素苷含量的升高，由此溶解的鞣花酸的百分比从包含在圆叶葡萄果渣提取物内总鞣花酸含量的34％升至50％。然而，最大值仅50％总鞣花酸含量的圆叶葡萄果渣提取物被源自紫色果渣的內源花色素苷溶解。

表7

接骨木果提取物(花色素苷)对圆叶葡萄果渣提取物中总的鞣花酸溶解度的影响

表7显示，包括另外的和源自接骨木果提取物的外源花色素苷大大地且出乎意料地提高了包含在圆叶葡萄果渣提取物内的鞣花酸的溶解度，使得超过50％、60％或甚至70％的可溶性鞣花酸被溶解。随着固体含量的升高，总的花色素苷(內源和外源)的含量也升高且可溶性鞣花酸的百分比从圆叶葡萄果渣提取物的总鞣花酸含量的51％提高至75％。而且，在与单独的圆叶葡萄果渣提取物相比时，添加源自接骨木果提取物的外源花色素苷在所有固体含量水平下都增强了鞣花酸的溶解度。实际上，在40％的固体水平下，添加源自接骨木提取物的外源花色素苷使得溶解75％的总鞣花酸内容物，而源自紫色果渣的內源花色素苷仅溶解50％的总鞣花酸内容物。总之，尽管在紫色圆叶葡萄果渣中发现的花色素苷增强了圆叶葡萄果渣提取物的鞣花酸的溶解度，但是足够量的来自圆叶葡萄之外源的其他花色素苷在鞣花酸溶解度方面提供更惊奇的升高。该实例显示了将其他花色素苷添加到圆叶葡萄果渣提取物(或甚至青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物的混合物)的惊奇结果，并显示，所述其他花色素苷不必存在于所提取的原始原料中，但该实例不将本发明限制为该实施例4中所试验的特定比例。

实施例5

从包含在整个葡萄中的果渣的提取

先前的实例已经公开了圆叶葡萄果渣的使用(例如仅果渣，其中果汁包含小于仅果渣的重量的1％)。在那些实例中，圆叶葡萄果渣提取物得自将青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物以各种比例合并。青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物可以在其以特定比例合并之前分别制备，或青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣可以在各种比例下合并，然后同时提取。

除了紫色圆叶葡萄果渣能够包含在具有其全部原始果汁或从其已提取不超过5％或10％果汁内容物的整个圆叶葡萄中之外，该实例中公开的方法类似。因此使用包含紫色圆叶葡萄果渣组分的整个紫色圆叶葡萄代替紫色圆叶葡萄仅果渣。尽管整个青铜色圆叶葡萄还可以取代青铜色圆叶葡萄果渣，但在该实例中，不使用整个青铜色圆叶葡萄，而仅使用青铜色果渣。因此，该实例中的起始材料为青铜色圆叶葡萄仅果渣、紫色圆叶葡萄仅果渣和整个紫色圆叶葡萄。整个紫色圆叶葡萄(其包括部分压碎或压缩的整个紫色圆叶葡萄)能够添加到青铜色圆叶葡萄仅果渣或添加到青铜色和紫色圆叶葡萄仅果渣的混合物。青铜色和紫色圆叶葡萄仅果渣的混合物能够同时用整个紫色葡萄提取。当将整个紫色圆叶葡萄与青铜色圆叶葡萄仅果渣混合以同时提取这两种起始材料时，制得的提取物能够以各种比例再次添加到紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物。据认为，在整个紫色圆叶葡萄(但不是整个青铜色圆叶葡萄)中发现的花色素苷将另外的花色素苷贡献给提取物，所述提取物出乎意料地溶解提取物中的鞣花酸，有助于保持起始材料的全部多酚内容物。

在其他实施方案中，带色的(含花色素苷)果实加工废物流如蓝莓果皮，能够与青铜色圆叶葡萄果渣混合，或除了整个紫色圆叶葡萄之外，或作为整个紫色圆叶葡萄的替代，还能够混入青铜色和紫色圆叶葡萄仅果渣的混合物。蓝莓果皮是该实例中“废物流”的一部分，条件是其为生产蓝莓果汁或蓝莓果泥的副产物。蓝莓果皮典型地作为源自蓝莓果汁和/或果泥生产过程的废物而被丢弃，但其能够替代性地用作花色素苷的其他源以溶解圆叶葡萄果渣提取物中的鞣花酸。尽管该实例公开了带色果实加工废物流(例如蓝莓果皮)的使用，但能够使用紫色圆叶葡萄和/或紫色圆叶葡萄果渣之外任意源的花色素苷(例如花色素苷富集的果汁浓缩物或提取物)。源自带色果实(例如黑色、红色、蓝色或紫色果实)的果汁浓缩物是花色素苷的特别富集源，其能够与青铜色和紫色圆叶葡萄果渣提取物一起提取以期望增强鞣花酸在提取物中的溶解度。

如前所述，在合并的溶剂提取物中，青铜色圆叶葡萄果渣对紫色圆叶葡萄果渣之比为10:1(重量:重量)～1:10(重量:重量)。

在某些实例中，合并的溶剂提取物包含的提取物包括整个紫色圆叶葡萄对青铜色圆叶葡萄果渣之比为1:5～1:12(重量:重量)，或者从中制备。

在其他实例中，溶剂提取物由如下构成或由其制备：整个紫色圆叶葡萄对青铜色和紫色圆叶葡萄果渣的混合物之比为1:7～1:16(重量:重量)。

在起始材料(青铜色圆叶葡萄仅果渣、紫色圆叶葡萄仅果渣和整个紫色圆叶葡萄)中花色素苷对鞣花酸之比为0.5:1～5:1(重量:重量)。在其他实例中，所述比例为至少1:1、2:1或3:1和/或不超过5:1或4:1。在其他实例中，在合并的起始材料中花色素苷对鞣花酸的重量比为超过0.5:1、1:1、10:1或20:1。在其他实例中，在合并的起始材料中花色素苷对鞣花酸的重量比为不超过30:1、40:1或50:1。

所有其他步骤如利用热水的提取、利用酶的处理、过滤、发酵、浓缩和多酚含量能够与本文中先前实例中所述的其他提取方法中的相同。

实施例6

在衍生自(A)青铜色/紫色仅果渣的混合物和(B)与紫色仅果渣混合的整个紫色葡萄和青铜色圆叶葡萄仅果渣的提取物中鞣花酸溶解度的比较

圆叶葡萄中鞣花酸的存在在葡萄(Vitus物种)中是独特的。如实施例1中所述，将紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物添加到青铜色圆叶葡萄仅果渣的提取物，增强了鞣花酸的溶解度。已经发现，花色素苷(在紫色，但不是在青铜色，圆叶葡萄/果渣中发现的)介导部分或全部这种效果。如实施例1中所示，青铜色:紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物比例为2:1，足以在1×浓度(2％固体)下产生鞣花酸在提取物中溶解度的最大提高，但所述方法不限于产生仅溶解度的最大提高。另外实施了实验以确定，将完全或部分压碎的整个紫色圆叶葡萄(代替紫色仅果渣)添加到青铜色仅果渣是否同样提高了鞣花酸在圆叶葡萄提取物中的溶解度。术语“仅果渣”是指葡萄的从其除去了至少95％果汁内容物的葡萄果渣，而“整个葡萄”是指包含至少90％(在某些实例中为至少95％)葡萄原始果汁内容物的葡萄。

以中试规模试验的方式制备了两种圆叶葡萄果渣提取物(A和B)。关于提取物A，将青铜色圆叶葡萄仅果渣和紫色圆叶葡萄仅果渣分别在热水中提取并然后混合为2:1(重量:重量)的比例(青铜色圆叶葡萄仅果渣的提取物:紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物)。然后按前述将合并的提取物过滤、发酵、再过滤并浓缩至40％的固体。通过对青铜色圆叶葡萄仅果渣和整个紫色葡萄以8.7:1(重量:重量)的比例(青铜色仅果渣:整个紫色葡萄)进行提取并单独提取紫色圆叶葡萄仅果渣，然后以15:1(重量:重量)的比例对制得的提取物进行混合使得青铜色圆叶葡萄仅果渣的提取物、紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物和整个紫色圆叶葡萄的提取物之比为13.8:1:1.6，制备了提取物B。在重量基础上，整个紫色葡萄制得约25％的果渣并由此提取物B还能够被描述为青铜色圆叶葡萄仅果渣和紫色圆叶葡萄仅果渣的提取物的比例(青铜色:紫色，重量对重量)为10:1的混合物。按关于提取物A所述的，对提取物B进行过滤、发酵、再过滤并浓缩至40％的固体。

将提取物A和B的试样干燥(冷冻)成粉末形式。为了确定各提取物的总鞣花酸含量，将粉末试样溶于DMSO中并通过HPLC/MS(验证过的试验方法C2505)进行了分析。通过具有在254nm下的UV-VIS检测的反相HPLC，与离子阱质量检测器串联，使用在[M-H]^-＝301amu下的提取离子色谱(EIC)，对鞣花酸的总面积进行了评估。为了确定可溶性鞣花酸的含量，在提供40％和2％固体的各种浓度下制备了提取物A和B的溶液。将各溶液在85℃下加热30分钟，从热源移走并冷却至室温(1小时完成)。然后通过具有GMF的0.45μm PTFE过滤器对试样进行过滤并按上述进行了分析。将结果示于表8和9中。

表8

提取物A和B在2％固体水平下可溶性鞣花酸的含量

表9

提取物A和B在40％固体水平下可溶性鞣花酸的含量

这些结果显示，提取物A和B的鞣花酸溶解度在两种浓度(2％和40％的固体)下基本相同。这不是预期的，因为青铜色对紫色圆叶葡萄果渣提取物之比，在提取物A中为2:1而在提取物B中为10:1(包括由整个葡萄贡献的果渣)。由此，添加整个紫色圆叶葡萄作为起始材料，比实施例1中所预测的更大程度上显著增强了鞣花酸的溶解度。

如实施例1中所示，在青铜色仅果渣的提取物对紫色仅果渣的提取物之比大于2:1(例如3:1或如实施例中所示的25:75的紫色/青铜色之比)下在1×浓度(2％固体)下仅果渣的提取物的混合物，产生的鞣花酸溶解度的增大(4.4％)可以忽略。在2:1、1:1和1:2的青铜色:紫色之比下观察到了鞣花酸溶解度的类似升高(约10％)，这表明，鞣花酸溶解度的最大升高需要至少2:1的青铜色仅果渣对紫色仅果渣的提取物之比(或至少1份紫色对2份青铜色)。当前的实验表明，当将花色素苷以整个紫色圆叶葡萄(与紫色仅果渣相对)的形式引入时，在10:1的青铜色:紫色圆叶葡萄果渣比例(或1份紫色对10份青铜色)下能够实现鞣花酸溶解度的最大升高。这还是令人惊奇的，因为紫色圆叶葡萄内几乎所有(>95％)的花色素苷内容物都位于果皮内，所述果皮是果渣的成分。当前实验由此惊奇地发现，以整个葡萄的形式添加甚至非常少量的其他花色素苷，大大提高了圆叶葡萄仅果渣的提取物的鞣花酸溶解度。溶解度的这种升高伴随着任何整个葡萄的添加而发生，并随整个葡萄的量的增大而升高。本发明不限制为添加特定量的整个葡萄，尽管特定实例是其中起始材料(果渣和整个葡萄)的混合物包含重量比为0.5:1的花色素苷:鞣花酸的实例且在其他实例中所述重量比不超过5:1。

鉴于可以应用所公开发明的原理的许多可能实施方案，所以应理解，所示实施方案仅是本发明的优选实例且不应解释为限制本发明的范围。并不旨在用最佳特征(例如用于提供最佳鞣花酸溶解度的材料比)的鉴定将本发明限制为具体最佳条件。相反，本发明的范围由权利要求书限定。因此我们主张落在这些权利要求的范围和主旨内的所有内容作为我们的发明。

Claims (36)

1.一种生产具有提高的鞣花酸溶解度的圆叶葡萄提取物的方法，所述方法包括：

将青铜色圆叶葡萄果渣提取物与紫色整个圆叶葡萄提取物合并，并且

将紫色圆叶葡萄果渣提取物与所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和所述紫色整个圆叶葡萄提取物合并以生产所述圆叶葡萄提取物，

其中所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色整个圆叶葡萄提取物是溶剂提取物，并且

其中生产所述圆叶葡萄提取物，包括以1:5～1:12(重量:重量)范围内的比例对紫色整个圆叶葡萄和青铜色圆叶葡萄果渣进行提取，以及以3:1～10:1(重量:重量)范围内的比例对青铜色圆叶葡萄果渣和紫色圆叶葡萄果渣进行提取。

2.权利要求1的方法，其中所述圆叶葡萄提取物具有至少2％的多酚含量。

3.权利要求2的方法，其中所述圆叶葡萄提取物具有至少约4％的总多酚含量，其中术语“约”定义为±0.5。

4.权利要求1～3中任一项的方法，其中将所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物与所述紫色整个圆叶葡萄提取物合并，包括将青铜色圆叶葡萄果渣与紫色整个圆叶葡萄合并，并且通过同时提取而从所述青铜色圆叶葡萄果渣和紫色整个圆叶葡萄生产提取物。

5.权利要求1的方法，其还包括溶剂提取紫色圆叶葡萄果渣和溶剂提取青铜色圆叶葡萄果渣以提供仅果渣的提取物，然后将所述仅果渣的提取物与源自所述青铜色圆叶葡萄果渣和整个紫色圆叶葡萄的提取物合并。

6.权利要求1的方法，其中将所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物与所述紫色整个圆叶葡萄提取物合并，包括在将所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物与所述紫色整个圆叶葡萄提取物合并以生产具有至少2％多酚含量的所述圆叶葡萄提取物之前，制备所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和所述紫色整个圆叶葡萄提取物。

7.权利要求1～3中任一项的方法，其中所述溶剂提取物是水提取物。

8.权利要求1的方法，其中制备所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物、所述紫色圆叶葡萄果渣提取物和/或所述紫色整个圆叶葡萄提取物，还包括(a)在合并之前单独地或(b)在合并之后一起，对所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物和/或所述紫色整个圆叶葡萄提取物进行过滤以生产具有至少2％多酚含量的圆叶葡萄提取物。

9.如权利要求1～3中任一项的方法，其还包括在对所述圆叶葡萄提取物进行过滤之前或之后对所述圆叶葡萄提取物进行发酵以从所述圆叶葡萄提取物除去提取的糖。

10.权利要求9的方法，其中在对所述圆叶葡萄提取物进行过滤之后对所述圆叶葡萄提取物进行发酵。

11.权利要求1～3中任一项的方法，其中将所述圆叶葡萄提取物浓缩至在液体中具有20％～50％的固体。

12.权利要求11的方法，其中将圆叶葡萄提取物浓缩至在液体中具有约40％的固体，其中术语“约”定义为±0.5。

13.权利要求11的方法，其中通过在对所述圆叶葡萄提取物过滤之后对所述圆叶葡萄提取物进行浓缩，对所述圆叶葡萄提取物进行浓缩，使得所述圆叶葡萄提取物在液体中包含20％～50％的固体。

14.权利要求13的方法，其中所述圆叶葡萄提取物在液体中包含约40％的固体，其中术语“约”定义为±0.5。

15.权利要求1～3中任一项的方法，其还包括将赋形剂或其他成分添加到所述圆叶葡萄提取物。

16.权利要求1～3中任一项的方法，其还包括将白藜芦醇或花色素苷添加到所述圆叶葡萄提取物。

17.一种组合物，所述组合物通过权利要求1～16中任一项的方法制得。

18.权利要求17的组合物，其中所述圆叶葡萄提取物具有至少2％的多酚含量。

19.权利要求17的组合物，其中所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色整个圆叶葡萄提取物与源自红醋栗、蓝莓、黑树莓、红树莓或黑莓的果实的提取物合并。

20.权利要求19的组合物，其中源自红醋栗、蓝莓、黑树莓、红树莓或黑莓的果实的所述提取物源自果实加工废物流。

21.一种抑制细胞氧化的方法，其包括向需要的对象给药足以在所述对象中防止或抑制细胞氧化的、权利要求17～20中任一项的组合物。

22.权利要求21的方法，其中抑制细胞氧化包括在摄取所述组合物的对象中防止或抑制自由基的形成或活性。

23.一种圆叶葡萄提取物组合物，所述圆叶葡萄提取物组合物包含青铜色圆叶葡萄果渣溶剂提取物、紫色圆叶葡萄果渣溶剂提取物和紫色整个圆叶葡萄溶剂提取物，其中在合并的溶剂提取物中，青铜色圆叶葡萄果渣对紫色圆叶葡萄果渣之比为3:1～10:1(重量:重量)，以及紫色整个圆叶葡萄对青铜色圆叶葡萄果渣之比为1:5～1:12(重量:重量)且所述圆叶葡萄提取物具有至少2％的多酚含量。

24.权利要求17或权利要求23的组合物，其中将所述组合物提供在非饮料食品、饮料、膳食增补物或美容组合物中。

25.权利要求17或权利要求23的组合物，其中所述青铜色圆叶葡萄果渣提取物和紫色圆叶葡萄果渣提取物总共包含20～50％的固体。

26.权利要求17或权利要求23的组合物，其中所述组合物包含抗氧化剂增补物。

27.权利要求23的组合物，其还包含源自圆叶葡萄之外的源的白藜芦醇和/或源自圆叶葡萄之外的源的花色素苷。

28.权利要求27的组合物，其还包含白藜芦醇。

29.权利要求28的组合物，其中所述白藜芦醇源自日本虎杖提取物。

30.权利要求27的组合物，其还包含源自圆叶葡萄果渣之外的源的花色素苷。

31.权利要求30的组合物，其中所述花色素苷源自带色的果实。

32.权利要求31的组合物，其中所述带色的果实包含红醋栗、蓝莓、黑树莓、红树莓和黑莓中的一种或多种。

33.权利要求30的组合物，其中所述花色素苷源自果实加工废物流。

34.权利要求1的方法，其中生产所述圆叶葡萄提取物，包括生产这样的提取物，所述提取物以(a)整个紫色圆叶葡萄对(b)青铜色和紫色圆叶葡萄仅果渣的混合物之比为1:7～1:16(重量:重量)范围内的比例包含由(a)和(b)组成的提取物。

35.权利要求1的方法，其中所述紫色整个圆叶葡萄提取物含有花色素苷，并且源自所述紫色整个圆叶葡萄提取物的花色素苷对鞣花酸之比在0.5:1～24:1(重量:重量)范围内。

36.权利要求1的方法，其中生产所述圆叶葡萄提取物，包括从起始材料的混合物生产提取物，所述起始材料包含0.5:1～5:1(重量:重量)范围内的花色素苷:鞣花酸比例。