CN102443027B - 果糖基化葛根素及其制备方法与用途 - Google Patents

果糖基化葛根素及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及葛根素的新衍生物、生物转化方法及其药物应用。本发明公开了一种结构如下式（I）所示的新型果糖基化葛根素，其制备方法为在水相或非水相的体系中用生物转化的方法使葛根素转化为果糖基及果糖寡糖基葛根素，在葛根素107.5g/L时，单果糖基-β(2,6)-葛根素浓度达111.7g/L，果糖基化葛根素转化率达90%。利用AB-8大孔树脂吸附与梯度洗脱，得到纯度达97%以上符合药规的产品，提取收率达80%以上。经试验，果糖基葛根素对急性心肌缺血具有作用，在体外能显著抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-23和人慢粒白血病细胞株K562的增殖，并且该类寡糖基化葛根素低毒性，在制备治疗心脑血管疾病和/或肿瘤疾病的药物方面具有良好应用前景。

Description

果糖基化葛根素及其制备方法与用途
技术领域
本发明属生物制药技术领域，具体涉及葛根素的新衍生物、生物转化方法及其药物应用。 
背景技术
葛根素(puerarin)是从豆科植物野葛(puerarialobata(Willd.)Ohwi)及葛根藤(P.thomaonii Benth)中提取，分离得到的异黄酮葡萄糖碳苷，化学名为7，4’-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮，呈白色针状结晶，能溶于水，但溶解度小(6.24g/L)，其水溶液为无色或微黄色，分子量为416.37。葛根素是中药葛根中主要活性成分之一，是一种天然的低毒有效的心脑血管系统疾病治疗药物，药理作用广泛，临床上已用于降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量；扩张冠状血管，改善正常和缺血心肌的代谢；对脑循环、周围血管及微循环有影响；除此以外，葛根素还有降血糖降血脂、抗氧化、抗肿瘤等作用(姚丹，丁选胜.中国临床药理学与治疗学，2008，13，468-474.)。 
目前葛根素制剂有葛根素注射液、滴眼剂、冻干粉针剂，实际使用中主要以注射给药应用于临床(吴燕红，苏子仁，赖小平等.中药新药与临床药理，2004，15(4)：259-261.)。由于葛根素在水中的溶解度较低，临床应用时需加入助溶剂，以提高溶解度。目前临床应用的葛根素注射液大多需加入高浓度丙二醇做助溶剂，不仅增加成本，也因为药液粘度过大，给生产造成过滤上的麻烦，同时不溶性杂质增加，对人体产生一定的毒副作用，致使用药安全性降低。为方便应用，需要改善葛根素溶解性和生物利用度。据相关文献报道，目前的方法主要通过对葛根素进行糖基化结构修饰或采用特殊剂型有效改善葛根素溶解性。迄今，国内外关于葛根素的糖基化结构修饰的报道如下：2004年，Li等人(Li D，Park S H，Shim J H，et al.Carbohyd Res，2004，339，2789～2797.)首次报道了体外酶法糖基化葛根素，由来源于嗜热芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶催化合成得到了C-6”醇羟基上糖基代的葡萄糖基-α-(1，6)-葛根素(CASRN：824959-75-3)及麦芽糖基-α-(1，6)-葛根素(CASRN：824959-76-4)。催化反应在1％(w/v)葛根素，3％(w/v)可溶性淀粉为糖基供体的条件下，55℃反应45min，产物转化率达70％。两转化产物经制备 液相色谱分离纯化后，经测定其水溶性较葛根素分别提高了14倍和168倍。蒋洁蓉等(Jiang J R，Yuan S，Ding J F，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2008，81，647-657.)利用氧化微杆菌糖基化葛根素，获得7-O-葡萄糖苷葛根素(CASRN：1163249-06-6)与7-O-异麦芽糖苷葛根素(CASRN：1163249-07-7)。催化反应在4g/L葛根素，50g/L蔗糖为糖基供体条件下，30℃反应48h，7-O-葡萄糖苷葛根素摩尔转化率为40％，7-O-异麦芽糖苷葛根素摩尔转化率为5％。两转化产物经制备液相色谱分离纯化后，其水溶性较葛根素分别提高了18倍和100倍。Huang等(Huang W，Ochiai H，Zhang X Y，et al.Carbohyd Res，2008，343，2903-2913.)利用一种乙酰基半乳糖苷酶，以三甘露糖乙酰氨基葡萄糖恶唑啉为糖基供体，在20％DMSO中对葛根素进行糖基化转化，得到相应的糖苷化合物Puerarin-GlcNAcMan3(CASRN：1093135-90-0)。催化反应在4.16g/L葛根素，13g/L三甘露糖乙酰氨基葡萄糖恶唑啉为糖基供体条件下，23℃反应2h，Puerarin-GlcNAcMan3摩尔转化率为60％，该糖基化产物的制备及相关性质未见报道。Choi等(Choi C H，Kim S H，Jang J H，et al.J Sci Food Agric，2010，90：1179-1184.)利用来源于脂肪嗜热芽孢杆菌的麦芽淀粉酶(BSMA)糖基化葛根素，分别获得葡萄糖基-α-(1，6)-葛根素、麦芽糖基-α-(1，6)-葛根素和葡萄糖基-α-(1，3)-葛根素(CASRN：1219937-73-1)，在10g/L葛根素时，产物总转化率为56.7％。Yu等(Yu C G，Xu H D，Huang G D，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2010，86：863-870.)以40％乙醇处理氧化微杆菌后，改变了细胞通透性，氧化微杆菌可使7-O-葡萄糖苷葛根素转变为7-O-果糖苷葛根素(CASRN：1223091-93-7)。张连文等(中国发明专利申请号：200910068855.7；公开号：CN 101575631A)以半乳糖转移酶糖基化葛根素，催化反应在9.12g/L葛根素，4g/L UDP-半乳糖为糖基供体条件下，得到半乳糖基-α-(1，4)-葛根素(CASRN：1196677-60-7)，其溶解度是葛根素的12倍。 
葛根素糖苷化后，水溶性得到显著提高，糖苷化修饰后分子结构的变化不影响葛根素的药效，但提供了一种高浓度给药的葛根素糖苷化合物。相关报道如下：Chung等(Chung M J，Sung N J，Park C S，et al.Eur J Pharmacol，2008，578，159-170.)以等摩尔的葡萄糖基-α-(1，6)-葛根素(CASRN：824959-75-3)和麦芽糖基-α-(1，6)-葛根素(CASRN：824959-76-4)的混合物为水溶性葛根素糖苷化产物，在HepG2细胞与C57BL/6J小鼠中的药理实验表明：水溶性葛根素糖苷化产物保持了与葛根素相同的抗氧化活性及降低低密度脂蛋白氧化作用的药效。蒋洁蓉等(Jiang J R，Yuan S，Ding J F，et al.Appl  Microbiol Biotechnol，2008，81，647-657.)以7-O-葡萄糖苷葛根素(CASRN：1163249-06-6)进行的体外药物代谢动力学实验表明：7-O-葡萄糖苷葛根素与葛根素相比表现了更好的药物代谢动力学性能，7-O-葡萄糖苷葛根素的血浆半衰期(t1/2)和平均滞留时间(MRT)分别是葛根素的2倍和2.8倍，该性能有可能增加7-O-葡萄糖苷葛根素的生物利用度。袁生等(中国发明专利申请号：200710021700.9)以7-O-葡萄糖苷葛根素或7-O-异麦芽糖苷葛根素及其药物组合物制成用于治疗和预防心脑血管疾病的药物。张连文等(中国发明专利申请号：200910068855.7；公开号：CN 101575631A)以主动脉血管平滑肌为生理模型，将葛根素和半乳糖基-α-(1，4)-葛根素对血管平滑肌的舒张作用进行比较，发现半乳糖基-α-(1，4)-葛根素的舒张作用好于葛根素。 
由于葛根素较差的水溶性，利用生物转化方法进行葛根素糖基化修饰时，转化前葛根素浓度普遍较低(均不超过10g/L)，产物摩尔转化率也较低(均不超过70％)，这些局限性给获得足够产物进行心脑血管及肿瘤相关疾病的药理实验及后期的工业化生产都带来了相当的难度。 
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种新型的果糖基化葛根素。 
本发明的另一个目的是所述果糖基化葛根素的制备方法，具体地，该方法以烟草节杆菌(拉丁文学名：Arthrobacter nicotianae XM6，分类命名：烟草节杆菌XM6，于2010年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010164)在水相或非水相生物转化果糖基化葛根素。 
本发明又一个目的是提供所述果糖基化葛根素在治疗心脑血管相关疾病的药物制备中的用途。 
本发明再一个目的是提供所述果糖基化葛根素在治疗肿瘤相关疾病的药物制备中的用途。 
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。 
一方面，本发明提供一种果糖基化葛根素，所述果糖基化葛根素具有下式(I)所示的结构： 
其中，R1和R2分别独立地选自氢、甲基、乙基、甲酰基、乙酰基、甲氨基和硫酸基；R为果糖单糖基或2至5个果糖连接的寡糖基，其结构如式（II）所示： 
其中n=0～4。 
另一方面，本发明提供用于制备上述果糖基化葛根素的方法，所述方法包括采用具有果糖基化酶活力的发酵液或发酵液上清或纯化的果糖基化酶或其重组表达蛋白，对含有葛根素的转化液进行生物转化反应，使葛根素转化为果糖基化葛根素。 
优选地，所述方法还包括转化结束后，去除转化液中的菌体细胞或菌体蛋白等杂质，然后将经树脂纯化得到的目标馏分旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛根素粉末或晶体。 
优选地，所述发酵液或发酵液上清由具有果糖基化葛根素活力的微生物发酵获得；进一步优选地，所述微生物为烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianaeXM6)(CCTCC M2010164)。 
优选地，用于微生物发酵的发酵培养基包含：蔗糖5-80g/L，蛋白胨5-50g/L，KH2PO4 0.4-4g/L，CaCl2 0.5-5g/L，MnSO4 0.1-2g/L，pH 6-8；发酵条件优选为：25～40℃，10～400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌通气，转速通气量为1～6vvm，10～400rpm，发酵6-48小时；进一步优选地，发酵培养基包含蔗糖15g/L，蛋白胨25g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 2g/L，MnSO4 0.2g/L，pH7.5；发酵条件进一步优选为：30℃，240rpm摇瓶振荡16小时或发酵罐搅拌通气，转速通气量为4vvm，300rpm，发酵6小时。 
优选地，所述生物转化反应在水相或非水相中进行； 
其中，所述水相转化条件包括：采用10～400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌，葛根素浓度大于0.1g/L至饱和，糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物，葛根素与糖基供体摩尔比为1∶1～1∶200，加入占反应体系10％-50％的发酵液或发酵液上清(含果糖基化酶10-100U/mL)，在任意一种pH 4～8的缓冲溶液中进行，转化温度为25～40℃，反应时间为6～96小时；优选条件为：以10g/L葛根素，100g/L蔗糖为糖基供体，加入20％的发酵液上清(含果糖基化酶30U/mL)，于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化12小时。 
所述非水相转化条件包括：采用10～400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌，5～50％选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、甲醇、丙酮或乙醇的一种或几种的亲水性有机溶剂，葛根素浓度为5～200g/L，优选葛根素浓度5～120g/L，糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物，葛根素与糖基供体摩尔比为1∶1～1∶200，加入10％-50％的发酵液或发酵液上清(含果糖基化酶10-100U/mL)，在任意一种pH4～8的缓冲溶液中，转化温度为25～40℃，反应时间为6～96小时；优选条件为：采用20％的DMSO，107.5g/L葛根素，350g/L蔗糖为糖基供体，加入20％的发酵液上清(含果糖基化酶30U/mL)，于1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化72小时。 
优选地，所述树脂纯化为将含有果糖基化葛根素的转化液通过AB-8大孔树脂的吸附，可选地，如为非水相转化，该吸附在将转化液中的有机溶剂低温蒸发去除或将有机溶剂稀释至低于2％体积比的条件下进行；吸附后先采用洗脱液洗去残余的糖基供体，然后采用洗脱液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素；进一步优选地，采用10倍柱床体积pH 4～4.5的蒸馏水洗去残余的糖基供体，然后采用5～30％的甲醇或乙醇溶液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素。 
优选地，所述方法还包括采用洗脱液洗脱回收残余葛根素；进一步优选地，采用100％甲醇或乙醇洗脱回收残余葛根素。 
优选地，所述果糖基化酶或其重组表达蛋白为β-D-呋喃果糖苷酶或其重组表达蛋白。 
更优选地，所述β-D-呋喃果糖苷酶是来源于节杆菌属细菌，其分子量约60kDa，N端前5个氨基酸序列分别为ATEPV。 
又一方面，本发明还提供所述果糖基化葛根素在制备治疗心脑血管相关疾病的药物中的用途。 
再一方面，本发明还提供所述果糖基化葛根素在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。 
优选地，所述药物为注射剂或口服制剂。 
以下是本发明的详细描述： 
为了完成本发明之目的，本申请采取如下技术方案： 
根据本发明的一个实施方式，本发明提供一种如式（I）所示新型的果糖基化葛根素： 
其中，R1和R2分别选自的取代基是氢基，甲基，乙基，甲酰基，乙酰基，甲氨基和硫酸基中的一种。 
式（I）中，R为式（II）所示： 
其中n=0～4。R为果糖单糖基或2至5个果糖连接的寡糖基。 
该化合物由酶法制备，可以用各种通常的方法如色谱分离、液相萃取、重结晶方法进行纯化。该化合物的结构可以通过元素分析，红外光谱，可见紫外光谱，核磁共振谱，单晶X-Ray衍射手段进行表征。 
根据本发明的另一个实施方式，本发明提供一种生物转化果糖基化葛根素的方法。 
本发明采用具有葛根素果糖基化酶活力的发酵液、或发酵液上清（胞外酶）、或该酶的重组表达蛋白，加入到含有葛根素的水相或非水相转化液中，使葛根素转化为果糖基化葛根素；转化结束后，转化液中的菌体细胞或菌体酶蛋白经加热沉淀、离心去除；然后转化液经AB-8大孔树脂进行分离，目标馏分旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛根素粉末或晶体。 
上述具有葛根素果糖基化活力的微生物菌种可以是任何果糖基化葛根素的微生物或糖苷酶，特别是烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)。 
上述具有葛根素果糖基化活力的胞外酶、或该酶的重组表达蛋白为β-D-呋喃果糖苷酶或β-D-呋喃果糖苷酶重组表达蛋白。 
上述β-D-呋喃果糖苷酶由节杆菌属细菌所产生。 
所述培养基的营养物质没有特别的限制，可以是任何一种合适于微生物生长的营养介质，如任何以淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖为碳源，以玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉等为氮源的培养基。上述用于发酵培养的培养基是：蔗糖5-80g/L，蛋白胨5-50g/L，KH2PO4 0.4-4g/L，CaCl2 0.5-5g/L，MnSO40.1-2g/L，pH 6-8。 
上述用于发酵培养的条件是：25～40℃，10～400rpm摇瓶振荡或5L发酵罐搅拌通气，转速通气量为1～6vvm，10～400rpm，发酵6-48小时。 
上述生物转化方法，转化反应可在水相或非水相中进行，转化温度范围在25～40℃，10～400rpm摇瓶振荡或5L发酵罐搅拌，反应时间6～96h。(1)水相转化条件为：葛根素浓度大于0.1g/L至饱和，糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物，葛根素与糖基供体摩尔比为1∶1～1∶200，在任意一种pH4～8的缓冲溶液中；(2)非水相转化条件为：采用5～50％的亲水性有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、甲醇、丙酮、乙醇，葛根素浓度5～200g/L，优选葛根素浓度5～120g/L，糖基供体为果糖、蔗糖或两者混合物，葛根素与糖基供体摩尔比为1∶1～1∶200，在任意一种pH4～8的缓冲溶液中； 
上述含有果糖基化葛根素的转化液通过AB-8大孔树脂的吸附，是将转化液中的有机溶剂低温蒸发去除或将有机溶剂稀释至低于2％体积比的条件下进行吸附；第一步洗脱液为10倍柱床体积pH4～4.5的蒸馏水(乙酸调节pH)洗去残余的糖基供体，第二步洗脱液为5～30％的甲醇或乙醇溶液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素，第三步洗脱液为100％甲醇或乙醇洗脱回收残留葛根素。 
上述经树脂纯化得到的果糖基化葛根素溶液旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛根素粉末或晶体。 
根据本发明的又一种实施方式，本发明提供一种新型葛根素糖基化衍生 物在制备治疗心脑血管相关疾病的药物中的用途。 
用本发明的单果糖基-β(2，6)-葛根素可制成任何一种药剂学上所述的剂型的药物；在所述的剂型中优选注射剂或口服制剂。 
利用本发明的化合物单果糖基-β(2，6)-葛根素对大鼠心肌缺血T波幅度变化的试验表明：受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素的剂量分别为12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg均能显著减少由垂体后叶素引发的T波振幅，并且对于T波的减少幅度小于葛根素，说明受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素能比葛根素更为有效地抗心肌缺血作用。利用本发明的化合物单果糖基-β(2，6)-葛根素对心肌缺血大鼠心率的实验结果表明，注射垂体后叶素后2min内各组大鼠均出现心率明显下降，2～10min各组心率开始恢复。与对照组相比，受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素的不同剂量组均能加快心肌缺血大鼠心率的恢复，并且单果糖基-β(2，6)-葛根素低剂量组的恢复时间快于葛根素组。说明受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素对心肌缺血导致的心率失常具有一定的治疗作用。本发明所述果糖基化葛根素可制备成治疗心脑血管疾病的药物。 
根据本发明的再一种实施方式，本发明提供一种新型葛根素糖基化衍生物在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。 
用本发明的单果糖基-β(2，6)-葛根素可制成任何一种药剂学上所述的剂型的药物；在所述的剂型中优选注射剂或口服制剂。 
利用本发明的化合物单果糖基-β(2，6)-葛根素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人慢粒白血病细胞株K562体外增殖抑制的试验表明：单果糖基-β(2，6)-葛根素作用48小时后均可减少MDA-MB-231细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组比较，当单果糖基-β(2，6)-葛根素剂量达到50μmol/L时有差异(P＜0.05)，剂量在100μmol/L时有显著性差异(P＜0.01)，当剂量达到150和200μmol/L时该差异具有极显著性(P＜0.001)，对MDA-MB-231细胞的抑制率分别达到44.04％和59.42％，说明单果糖基-β(2，6)-葛根素能明显抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖，且抑制率随剂量增加而增加。单果糖基-β(2，6)-葛根素作用48小时后均可减少K562细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组比较，当单果糖基-β(2，6)-葛根素在低剂量1μmol/L其结果就有显著性差异(P＜0.05)，剂量在100、150和200μmol/L时该差异具有极显著性(P＜0.001)，对K562细胞的抑制率分别达到16.41％、29.84％和46.41％，说明单果糖基-β(2，6)-葛根素能明显抑制人慢粒白血病细胞株K562的增殖，且抑制率随剂量增加而增加。说明受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素在体外对肿瘤细胞具有一定的抑制作用。本发明所述果糖基化葛根素可制备 成治疗肿瘤疾病的药物。 
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于： 
首先，本发明人发明了一种新的果糖基化葛根素，实验证明这种新型葛根素衍生物对于心肌缺血导致的心律失常具有一定的治疗作用，可以有效用于治疗心脑血管疾病，并且实验同时证明这种新型葛根素衍生物在体外对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人慢粒白血病细胞株K562有显著的抑制作用，可以用于治疗肿瘤疾病，这都丰富了葛根素糖基化衍生物作为药物的来源，而现有的葛根素糖苷化衍生物未见这方面的报道； 
其次，相比葛根素，这种新型果糖基化葛根素的溶解度更好，药理活性高，弥补了葛根素产品的缺陷，使用药的安全性提高，疗效增加，是一种具有较好发展前景的新药产品； 
再次，本发明人还提供了该新型果糖基化葛根素的生物转化方法。在现有利用生物转化方法进行葛根素糖基化修饰时，由于葛根素较差的水溶性，葛根素浓度普遍较低(均不超过10g/L)，产物摩尔转化率也较低(均不超过70％)，而采用本发明的生物转化方法，所获得的单果糖基-β(2，6)-葛根素浓度达111.7g/L，底物转化率达90％以上，解决了现有技术中所存在的技术难题，有利于利用该产物进行心脑血管及肿瘤相关疾病的药理试验及后期的工业化生产。 
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中： 
图1为水相生物转化葛根素的HPLC图谱，该图中：保留时间14.910min的峰为葛根素，保留时间10.131min的峰为单果糖基-β(2，6)-葛根素，保留时间6.130min的峰为双果糖基-β(2，6)-葛根素，保留时间5.409min的峰为三果糖基-β(2，6)-葛根素，保留时间5.144min的峰为四果糖基-β(2，6)-葛根素，保留时间4.968min的峰为五果糖基-β(2，6)-葛根素。 
图2为非水相生物转化葛根素的HPLC图谱，该图中：保留时间13.735min的峰为葛根素；保留时间7.450min的峰为单果糖基-β(2，6)-葛根素，保留时间4.603min的峰为双果糖基-β(2，6)-葛根素；保留时间4.192min的峰为三果糖基-β(2，6)-葛根素。 
图3为单果糖基-β(2，6)-葛根素的1HNMR谱图。 
图4为单果糖基-β(2，6)-葛根素的13CNMR谱图。 
图5为单果糖基-β(2，6)-葛根素的H-H COSY谱图。 
图6为单果糖基-β(2，6)-葛根素的C-H HSQC谱图。 
图7为单果糖基-β(2，6)-葛根素的高分辨质谱图。 
图8为葛根素的1HNMR谱图。 
图9为葛根素的13CNMR谱图。 
图10为双果糖基-β(2，6)-葛根素的1HNMR谱图。 
图11为双果糖基-β(2，6)-葛根素的13CNMR谱图。 
图12为双果糖基-β(2，6)-葛根素的H-H COSY谱图。 
图13为双果糖基-β(2，6)-葛根素的C-H HSQC谱图。 
图14为双果糖基-β(2，6)-葛根素的高分辨质谱图。 
图15为三果糖基-β(2，6)-葛根素的质谱图。 
图16为四果糖基-β(2，6)-葛根素的质谱图。 
图17为五果糖基-β(2，6)-葛根素的质谱图。 
生物材料的保藏信息 
拉丁文学名：Arthrobacter nicotianae XM6，分类命名：烟草节杆菌XM6，于2010年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2010164。 
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。 
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。 
实施例1：采用水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素
将40ml发酵培养的培养基2(培养基组成见表1)放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min后，接入烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)，于30℃，180rpm振荡发酵培养16小时作为种子液接种至5L发酵罐中，接种量5体积％，发酵罐装液量3L，发酵罐灭菌方式与摇瓶相同。在30℃，300rpm发酵培养，通气量3vvm，发酵培养6小时(OD约10左右)后8000rpm离心20min，收集上清酶液，测定上清酶液中含果糖基化酶30U/mL。其中，酶活力的测定采用以下方法： 
底物溶液的配制：0.4g葛根素，10g蔗糖充分溶解在100mL 1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)中。反应体系：取2mL 1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)加入18mL底物溶液中，置于30℃中反应10min，后立即取出100μL加入 900μL的甲醇中终止反应，作为空白对照。同时另取2mL酶液加入18mL底物溶液中，置于30℃中反应10min，后立即取出100μL加入900μL的甲醇中终止反应，作为样品。之后用HPLC进行测定。酶活力单位定义为：在30℃条件下，每分钟转化1μmol葛根素所需酶的量为一个活力单位(1U即1μmol/min)。比活力定义(U/mL)：单位体积(mL)酶液中具有的酶活力(U)数。 
将600ml上清酶液加入至总体积3000ml含有10g/L葛根素(购自南京泽朗医药科技有限责任公司)，100g/L蔗糖，1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)的5L发酵罐中，30℃，300rpm进行葛根素糖基化反应，12小时后，45℃加热2小时终止转化反应。转化液经HPLC检测，果糖基化葛根素转化率达95％。结果参考图1。 
将上述含有果糖基化葛根素的转化液经AB-8大孔树脂的吸附(层析柱40×600mm，流速10ml/min)，然后用10倍柱床体积pH4～4.5的蒸馏水(冰乙酸调节pH)洗去残余的糖基供体，接着用5％-30％的甲醇溶液梯度洗脱，分别获得果糖基化葛根素(纯度＞97％)，最后用100％甲醇洗脱去除色素与葛根素。 
纯度＞97％的果糖基化葛根素分别于45℃旋转蒸发或冷冻干燥后得到单果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体7.9g，双果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体16.8g，三果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体3.3g，四果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体3.2g，五果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体2.2g。 
经测定，在25℃时，单果糖基-β(2，6)-葛根素溶解度为26.0g/L，双果糖基-β(2，6)-葛根素溶解度为280.8g/L，分别是相同条件下葛根素溶解度(5.2g/L)的5倍和54倍。 
上述单果糖基-β(2，6)-葛根素：HR-MS：m/z 577.1563[M-H]-，元素组成为C27H29O14(图7)，M-H计算值577.1557；在DMSO的1H-NMR和13C-NMR化学位移的特征分别如下： 
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：8.29(1H，s，H-2)，7.93(1H，d，J＝8.7Hz，H-5)，6.98(1H，d，J＝8.7Hz，H-6)，7.40(2H，d，J＝8.5Hz，H-2′/H-6′)，6.80(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′/H-5′)，9.48(1H，s，4′-OH)，4.81(1H，d，J＝9.1Hz，H-1″)，3.93-3.96(2H，m，H-2″/H-4″′)，3.79-3.89(2H，m，H-5″/H-6″′)，3.48-3.61(3H，m，H-6″，H-5″′，H-6″′)，3.29-3.42(6H，m，H-3″，H-4″，H-6″，2H-1″′，H-3″′)(图3、图5、图6) 
13C-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：174.9，160.9，157.1，152.6，130.0，126.2，123.0，122.5，114.9，112.5，116.8，104.1(C-2″′)，82.1(C-5″′)，79.7，78.4，76.7， 75.1(C-5″)，73.4，70.7，70.3，62.3(C-6″)，61.5(C-6″′)，61.1(图4)。 
葛根素1H-NMR和13C-NMR化学位移的特征分别如下： 
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：8.33(1H，s，H-2)，7.97(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，7.01(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)，7.41(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′/H-6′)，6.83(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′/H-5′)，9.52(1H，s，4′-OH)，4.85(1H，d，J＝9.0Hz，H-1″)，4.05(1H，s，H-2″)，3.52，3.75(2H，m，2H-6″)，3.26-3.36(3H，m，H-3″，H-4″，H-5″)(图8) 
13C-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：175.1，161.2，157.2，152.7，130.1，126.4，123.2，122.6，117.0，115.19，112.7，81.8(C-5″)，78.8，73.6，71.0，70.6，61.5(C-6″)(图9)。 
双果糖基-β(2，6)-葛根素：HR-MS：m/z 739.2080[M-H]-，元素组成为C33H39O19(图14)，M-H计算值739.2086；在DMSO的1H-NMR和13C-NMR化学位移的特征分别如下： 
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：8.29(1H，s，H-2)，7.95(1H，d，J＝8.7Hz，H-5)，6.97(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)，7.40(2H，d，J＝8.6Hz，H-2′/H-6′)，6.80(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′/H-5′)，9.48(1H，s，4′-OH)，4.81(1H，d，J＝9.2Hz，H-1″)，3.92-3.99(3H，m，H-2″，H-4″′，H-4″″)，3.69-3.87(4H，m，H-6″，H-5″，H-5″′，H-6″″)，3.48-3.58(5H，m，H-6″，H-3″′，H-6″′，H-5″″，H-6″″)，3.25-3.42(8H，m，H-3″，H-4″，2H-1″′，H-6″′，2H-1″″，H-3″″)(图10、图12、图13)。 
13C-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：174.7，160.7，156.9，152.4，129.8，126.0，122.9，122.4，116.6，114.8，112.3，104.2，104.0，81.9(C-5″″)，80.1，79.6，78.3，76.3，76.0，75.5(C-5″′)，75.1(C-5″)，73.3，70.6，70.4，62.7(C-6″)，62.4(C-6″′)，62.0(C-6″″)，61.1，60.8，(图11)。 
三果糖基-β(2，6)-葛根素：ESI-MS：m/z 925.3[M+Na]+，元素组成为C39H50O24Na(图15)；四果糖基-β(2，6)-葛根素：ESI-MS：m/z 1064.3[M-H]-，元素组成为C45H59O29(图16)；五果糖基-β(2，6)-葛根素：ESI-MS：m/z1226.5[M-H]-，元素组成为C51H69O34(图17)。 
实施例2：采用非水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素
将40ml发酵培养的培养基2(培养基组成见表1)放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min后，接入烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)，于30℃，180rpm振荡发酵培养16小时作为种子液接种至5L发酵罐中，接种量5％，发酵罐装液量3L，发酵罐灭菌方式与摇瓶相同，30℃，300rpm发酵培养，通气量3vvm，发酵培养6小时(OD约 10左右)后8000rpm离心20min，收集上清酶液，测定上清酶液中含果糖基化酶30U/mL。 
将600ml上清酶液加入至总体积3000ml含有107.5g/L葛根素，350g/L蔗糖，20％DMSO的1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.86)的5L发酵罐中，30℃，300rpm振荡转化，72小时后，45℃加热2小时终止转化反应。转化液经HPLC检测：单果糖基-β(2，6)-葛根素达111.7g/L，双果糖基-β(2，6)-葛根素达28.3g/L，三果糖基-β(2，6)-葛根素达2.3g/L，果糖基化葛根素衍生物转化率达90％。结果参考图2。 
上述含有果糖基化葛根素的转化液稀释10倍后经AB-8大孔树脂的吸附(层析柱40×600mm，流速10ml/min)，然后用10倍柱床体积pH4～4.5的蒸馏水(冰乙酸调节pH)洗去残余的糖基供体，接着用5％-30％的甲醇溶液梯度洗脱，分别获得果糖基化葛根素(纯度＞97％)，最后用100％甲醇洗脱去除色素与葛根素。 
纯度＞97％的果糖基化葛根素分别于45℃旋转蒸发或冷冻干燥后得到单果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体270g，双果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体68g，三果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体5g。 
实施例3：采用非水相生物转化葛根素获得果糖基化葛根素
将40ml发酵培养的培养基2(培养基组成见表1)放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min后，接入烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)，于30℃，180rpm振荡发酵培养16小时后(OD约10左右)，8000rpm离心20min，收集上清酶液，上清酶液中含果糖基化酶30U/mL。 
将4ml上清酶液至总体积20ml含有107.5g/L葛根素，350g/L蔗糖，20％DMSO的磷酸盐缓冲液(pH6.86)的250ml具塞三角瓶中，30℃，180rpm振荡转化，72小时后，45℃加热2小时终止转化反应。转化液经HPLC检测：单果糖基-β(2，6)-葛根素达111.7g/L，双果糖基-β(2，6)-葛根素达28.3g/L，三果糖基-β(2，6)-葛根素达2.3g/L，果糖基化葛根素转化率达90％。 
上述含有果糖基化葛根素的转化液稀释10倍后经AB-8大孔树脂的吸附(层析柱20×600mm，流速10ml/min)，然后用10倍柱床体积pH4～4.5的蒸馏水(冰乙酸调节pH)洗去残余的糖基供体，接着用5％-30％的甲醇溶液梯度洗脱，分别获得果糖基化葛根素(纯度＞97％)，最后用100％甲醇洗脱去除色素与葛根素。纯度＞97％的果糖基化葛根素分别于45℃旋转蒸发或冷 冻干燥后得到单果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体1.8g，双果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体0.5g，三果糖基-β(2，6)-葛根素粉末或晶体0.03g。。 
实施例4：不同发酵和转化条件对产物形成的影响
将40ml发酵培养的培养基(培养基组成见表1)放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20min后，接入烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae XM6)(CCTCC M2010164)，在不同的发酵条件下(发酵条件见表2)振荡发酵培养后，8000rpm离心20min，收集上清酶液，上清酶液中含果糖基化酶10-100U/mL。以20％上清酶液加入至转化体系中，在不同转化条件下(转化条件见表2)，振荡转化后45℃加热2小时终止转化反应，转化液经HPLC检测。 
不同菌种发酵条件以及转化条件，对葛根素糖基化产物的形成均产生不同影响，表1和表2列出了在不同条件下进行葛根素糖基化反应时主要产物单果糖基化葛根素与双果糖基化葛根素的摩尔转化率的变化。 
表1培养基成分的不同配比组成 
表2不同条件下单果糖基-β(2，6)-葛根素(P1)与双果糖基-β(2，6)-葛根素(P2)的摩尔转化率 
从表2中结果可以看出，非水相转化优点在于转化体系中葛根素浓度可增加至120g/L，在优选的非水相转化条件下，非水相转化率可达90％，转化产物浓度显著提高(在107.5g/L葛根素时，转化总产物可达140g/L以上)，且可通过溶剂的选择与比例调控转化产物，非水相转化的这些优势将有利于工业化生产。 
实施例5：单果糖基-β(2，6)-葛根素在血液中的代谢动力学实验
1.仪器和色谱条件 
HPLC分析采用DIONEX，色谱柱为Discovery HS C18柱(250×4.6um，5um)，进样体积为20μl，柱温为30℃，检测器为UVD170U，检测波长254nm，流动相：A，水，B，色谱级甲醇，A∶B＝80∶20，流速1ml/min。 
2.实验动物 
Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，体重180-220g，雌雄各半，由南通大学医学实验中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)20080010。 
3.实验方法 
3.1样品采集 
SD大鼠随机分成2组，每组5只，实验前禁食12小时。葛根素及单果糖基-β(2，6)-葛根素分别溶解于20％的1，2-丙二醇生理盐水中，按50mg/kg的剂量给予大鼠尾静脉注射葛根素和单果糖基-β(2，6)-葛根素。服用后经t＝0min、4min、7min、17min、40min、60min、120min、180min后，眼眶采集0.5ml血液置于肝素钠处理过的离心管中，立即以3000rpm的条件下 离心分离15min，分离血浆以备分析。 
3.2样品处理 
精密取血浆100μl置试管中，再加入400μl甲醇沉淀蛋白，于漩涡混合器上混合5min，然后10000rpm离心10min，上清液用于HPLC分析。 
3.3数据分析 
按照3.2制备的葛根素及单果糖基-β(2，6)-葛根素样品的血浆浓度用外标法计算得到。得到的数据用药代动力学统计软件进行分析。 
4.结果 
从葛根素及单果糖基-β(2，6)-葛根素的主要代谢动力学参数(表3)可见，单果糖基-β(2，6)-葛根素的t1/2，MRT(0-t)和MRT(0-∞)的值明显高于葛根素，表明葛根素衍生物在血液中的滞留时间与葛根素相比得到延长，因而有利于其在体内有较长的作用时间。同时葛根素衍生物的AUC(0-t)和ACU(0-∞)值显著高于葛根素，表明葛根素衍生物与葛根素相比具有更高的生物利用度。 
表3葛根素及单果糖基-β(2，6)-葛根素在大鼠中的代谢动力学参数(n＝5) 
t1/2＝清除的半衰期 
CL＝全身清除率 
AUC＝浓度-时间曲线下的面积 
MRT＝平均滞留时间 
实施例6：单果糖基-β(2，6)-葛根素对大鼠急性心肌缺血的保护作用实验
1.实验材料 
垂体后叶素注射液购自南京新百药业有限公司，生理盐水注射液购自南京小营药业有限公司，二甲基亚砜、丙二醇、无水乙醇均采用色谱级。葛根素购自南京泽朗医药科技有限责任公司，单果糖基-β(2，6)-葛根素由本发明方法制备，经高效液相色谱检测纯度在99％以上。 
2.实验动物 
Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，体重180-220g，雌雄各半，由南通大学医学实验中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)20080010。 
3.试验方法 
取对垂体后叶素敏感的SD大鼠50只适应性饲养3天后，随机分为溶剂组、葛根素组和单果糖基-β(2，6)-葛根素低、中、高三组，每组SD大鼠10只。所给药物均用10％的丙二醇溶液助溶，均给药0.5ml，溶剂组使用丙二醇生理盐水溶液，葛根素组使用葛根素丙二醇生理盐水溶液，剂量为50mg/kg，单果糖基-β(2，6)-葛根素组使用丙二醇生理盐水溶液，剂量分别为12.5mg/kg，25mg/kg，50mg/kg。给药后5min，各组大鼠静脉缓慢注射Pit 0.5U/kg复制急性心肌缺血模型，观察注射Pit后15s、30s、1min、5min、10min时各组大鼠的心电图变化，计算以上各时间点的心率和T波的幅度变化。 
4.统计方法 
数据采用 表示，采用t检验。P＜0.05，表示差异有显著性；若P＜0.01，表示差异非常显著；若P＜0.001，表示差异极端显著。 
5.结果 
5.1葛根素衍生物对大鼠心肌缺血T波幅度变化的影响 
表4单果糖基-β(2，6)-葛根素(P1)对心肌缺血大鼠T波幅度变化的影响(N＝10， ) 
注：与溶剂组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 
实验结果表明，受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素的剂量分别为12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg均能显著减少由垂体后叶素引发的T波振幅，并且对于T波的减少幅度小于葛根素，说明受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素能比葛根素更为有效地抗心肌缺血作用。 
5.2葛根素衍生物对心肌缺血大鼠心率的影响 
表5单果糖基-β(2，6)-葛根素(P1)对心肌缺血大鼠心率的影响(N＝10， ) 
实验结果表明，注射垂体后叶素后2min内各组大鼠均出现心率明显下降，2～10min各组心率开始恢复。与对照组相比，受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素的不同剂量组均能加快心肌缺血大鼠心率的恢复，并且单果糖基-β(2，6)-葛根素低剂量组的恢复时间快于葛根素组。说明受试样品单果糖基-β(2，6)-葛根素对心肌缺血导致的心率失常具有一定的治疗作用。 
实施例7：单果糖基-β(2，6)-葛根素对肿瘤细胞增殖的抑制作用实验 
1.细胞株与药品 
人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，购自上海复蒙基因生物科技有限公司；人慢粒白血病细胞株K562，购自中国科学院上海细胞研究所细胞库；葛根素，购自南京泽朗医药科技有限责任公司；单果糖基-β(2，6)-葛根素由本发明方法制备，经高效液相色谱检测纯度在99％以上。 
2.实验药物及溶液配制 
药液储液：称取8.32mg葛根素粉末，溶于2mLDMSO中，配制成10mmol/L的葛根素；称取11.56mg单果糖基-β(2，6)-葛根素粉末，溶于2mLDMSO中，配制成10mmol/L的单果糖基-β(2，6)-葛根素；以0.22μm滤器过滤，1000μL/doff分装，-20℃存储，同时0.22μm滤器过滤高浓度DMSO以备对照组之用。 
细胞培养液：取RPM I-1640培养基(粉剂)1包，溶于800mL三蒸水中，磁力搅拌器搅拌至少半小时，至完全溶解，补加NaHCO3 2g，充分溶解后定容至1L。用0.22pm孔径的滤膜过滤除菌，加入血清，使血清终浓度为10％，4℃贮存。 
PBS磷酸盐缓冲液：在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2PO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液PH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟，低温保存。 
MTT应用液：称取500mgMTT粉剂，溶于100m1PBS中，搅拌溶解后，0.22pm孔径的滤膜过滤除菌，分装后4℃避光保存备用。 
三联液：取SDS 25g，异丙醇12.5mL，浓HCl 2.5mL用三蒸水定容至1L，低温保存。 
3.主要试剂与仪器 
高效液相色谱仪(美国戴安型号：P600)；酶标仪(Molecular Devices公司型号：spectra MAX 190/GEMINIXS)；CO2培养箱(Forma公司型号：3111)；低速离心机(Thermostat型号：PICO-17)；倒置显微镜(leica公司型号：DMIL)；水平脱色摇床(南京大学仪器公司型号：TY-80S)；胎牛血清(Hyclone公司)；小牛血清(GibacoBRL公司)；RPMI1640(美国Gibco公司)；Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司)；Streptomycin Sulfate(AMRESCO公司)；Trypsin(AMRESCO公司)；MTT(AMRESCO公司)。 
4.细胞培养 
MDA-MB-231细胞在含体积分数为10％灭活胎牛血清、100U青霉素和链霉素的RPMI-1640完全培养基，于37℃5％CO2饱和湿度孵箱内培养。 
K-562细胞在含体积分数为10％灭活小牛血清、100U青霉素和链霉素 的RPMI-1640完全培养基，于37℃5％CO2饱和湿度孵箱内培养。 
5.实验方法 
5.1MDA-MB-231细胞毒性试验 
取对数生长期的MDA-MB-231细胞(一次性培养瓶)，弃培养液。加10mLPBS洗一次，弃PBS后，加入3mL0.25％胰蛋白-0.04％EDTA，37℃消化3min后，向其中加入5mL完全培养基中和反应，吹打后将细胞转入15mL离心管中，1000rpm离心3分钟。配细胞悬液，用适量的完全培养基调整细胞浓度为3×104/mL。将细胞加入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μL，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5％CO2)常规培养。待细胞生长至50％-70％加入各浓度药液。取10mmol/L葛根素及单果糖基-β(2，6)-葛根素储液，用PBS梯度稀释药液至1000、500、100、50、10、5、1和0.1μmol/L，每孔加药20μL，药物终浓度分别为100、50、10、5、1、0.5、0.1和0.01μmol/L。DMSO溶剂对照组加入20μL PBS中含有相应药物溶剂，空白组加入20μLPBS。每个药物浓度设6个复孔。将培养板放回细胞培养箱，48小时后加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，继续在培养箱中孵育4小时后，倒扣掉上清，吸水纸拍干，每孔加200μLDMSO，摇床避光震摇15分钟，使结晶物充分溶解。用全自动酶标仪在490nm测定吸光值，计算平均抑制率，抑制率(％)＝(对照组A490-实验组A490)/对照组A490)，实验重复3次。 
5.2K562细胞毒性试验 
取对数生长期的K-562细胞调整浓度至1×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔加入细胞悬液90uL，实验组以不同终浓度(1、5、10、20、50、100、150、200μmol/L)葛根素及单果糖基-β(2，6)-葛根素处理，每孔加药10uL，DMSO溶剂对照组加入20μL PBS中含有相应药物溶剂，空白组加入20μLPBS。每个药物浓度设6个复孔。将培养板放回细胞培养箱，48小时后加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，继续在培养箱中孵育4小时后，每孔加入三联液100uL，过夜待结晶充分溶解。振荡器震荡20min用全自动酶标仪在490nm处测定吸光值，计算平均抑制率，抑制率(％)＝(对照组A490-实验组A490)/对照组A490)，实验重复3次。 
6.统计处理 
采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据采用 表示。 
7.实验结果 
7.1葛根素衍生物对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响 
表6不同浓度葛根素和单果糖基-β(2，6)-葛根素作用48h对MDA-MB-231细胞增殖的影响 
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。 
MTT法分析后统计结果说明(见表6)，葛根素和单果糖基-β(2，6)-葛根素作用48小时后均可减少MDA-MB-231细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组比较，当单果糖基-β(2，6)-葛根素剂量达到50μmol/L时有差异(P＜0.05)，剂量在100μmol/L时有显著性差异(P＜0.01)，当剂量达到150和200μmol/L时该差异具有极显著性(P＜0.001)，对MDA-MB-231细胞的抑制率分别达到44.04％和59.42％，说明单果糖基-β(2，6)-葛根素能明显抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖，且抑制率随剂量增加而增加。 
7.2葛根素衍生物对人慢粒白血病细胞株K562增殖的影响 
表7不同浓度葛根素和单果糖基-β(2，6)-葛根素作用48h对K562细胞增殖的影响 
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。 
MTT法分析后统计结果说明(见表7)，葛根素和单果糖基-β(2，6)-葛根素作用48小时后均可减少K562细胞的细胞数目。与相同时间内的对照组比较，当单果糖基-β(2，6)-葛根素在低剂量1μmol/L其结果就有显著性差异(P＜0.05)，剂量在100、150和200μmol/L时该差异具有极显著性(P＜0.001)，对K562细胞的抑制率分别达到16.41％、29.84％和46.41％，说明单果糖基-β(2，6)-葛根素能明显抑制人慢粒白血病细胞株K562的增殖，且抑制率随剂量增加而增加。 

Claims (20)

1.一种果糖基化葛根素，其特征在于，所述果糖基化葛根素具有下式(I)所示的结构：
其中，R1和R2分别独立地选自氢、甲基、乙基、甲酰基、乙酰基、甲氨基和硫酸基；R为果糖单糖基或2至5个果糖连接的寡糖基，其结构如式(II)所示：
其中n＝0～4。
2.如权利要求1所述的果糖基化葛根素的制备方法，其特征在于，所述方法包括采用具有果糖基化酶活力的发酵液或发酵液上清或纯化的果糖基化酶，对含有葛根素的转化液进行生物转化反应，使葛根素转化为果糖基化葛根素；所述发酵液或发酵液上清由具有果糖基化葛根素活力的微生物发酵获得，所述微生物为烟草节杆菌，所述烟草节杆菌为Arthrobacter nicotianaeXM6，其保藏编号为CCTCC M2010164；所述果糖基化酶为保藏编号为CCTCC M2010164的烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae XM6的上清酶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括转化结束后，去除转化液中的菌体细胞或菌体蛋白杂质，然后将经树脂纯化得到的目标馏分旋转蒸发或冷冻干燥后得到果糖基化葛根素粉末或晶体。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，用于微生物发酵的发酵培养基包含：蔗糖5-80g/L，蛋白胨5-50g/L，KH2PO40.4-4g/L，CaCl20.5-5g/L，MnSO40.1-2g/L，pH6-8。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，发酵条件为：25～40℃，10～400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌通气，转速通气量为1～6vvm，10～400rpm，发酵6-48小时。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵条件：30℃，240rpm摇瓶振荡16小时或发酵罐搅拌通气，转速通气量为4vvm，300rpm，发酵6小时。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基包含蔗糖15g/L，蛋白胨25g/L，KH2PO42g/L，CaCl22g/L，MnSO40.2g/L，pH7.5。
8.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述生物转化反应在水相或非水相中进行。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述水相转化条件包括：采用10～400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌，葛根素浓度大于0.1g/L至饱和，糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物，葛根素与糖基供体摩尔比为1：1～1：200，加入占反应体系10％—50％的含果糖基化酶10-100U/mL的发酵液或发酵液上清，在任意一种pH4～8的缓冲溶液中进行，转化温度为25～40℃，反应时间为6～96小时。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述水相转化条件包括：以10g/L葛根素，100g/L蔗糖为糖基供体，加入20％的含果糖基化酶30U/mL的发酵液上清，于1/15mol/L、pH6.86的磷酸盐缓冲液的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化12小时。
11.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述非水相转化条件包括：采用10～400rpm摇瓶振荡或发酵罐搅拌，5～50％选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、丙酮或乙醇的一种或几种的亲水性有机溶剂，葛根素浓度为5～200g/L，糖基供体为果糖或蔗糖或两者混合物，葛根素与糖基供体摩尔比为1：1～1：200，加入占反应体系10％—50％的含果糖基化酶10-100U/mL的发酵液或发酵液上清，在任意一种pH4～8的缓冲溶液中，转化温度为25～40℃，反应时间为6～96小时。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述非水相转化条件中所述葛根素浓度为5～120g/L。
13.如权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于，所述非水相转化条件包括：采用20％的DMSO，107.5g/L葛根素，350g/L蔗糖为糖基供体，加入20％的含果糖基化酶30U/mL的发酵液上清，于1/15mol/L、pH6.86的磷酸盐缓冲液的5L发酵罐中，30℃，300rpm搅拌转化72小时。
14.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述树脂纯化为将含有果糖基化葛根素的转化液通过AB-8大孔树脂的吸附，该吸附在将转化液中的有机溶剂低温蒸发去除或将有机溶剂稀释至低于2％体积比的条件下进行；吸附后先采用洗脱液洗去残余的糖基供体，然后采用洗脱液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述树脂纯化为非水相转化。
16.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，采用10倍柱床体积pH4～4.5的蒸馏水洗去残余的糖基供体，然后采用5～30％的甲醇或乙醇溶液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素。
17.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，采用10倍柱床体积pH4～4.5的蒸馏水洗去残余的糖基供体，然后采用5～30％的甲醇或乙醇溶液梯度洗脱或阶段洗脱分别得到果糖基化葛根素。
18.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括采用洗脱液洗脱回收残余葛根素。
19.如权利要求18所述的制备方法，其特征在于，采用100％甲醇或乙醇洗脱回收残余葛根素。
20.如权利要求1所述的果糖基化葛根素在制备治疗心脑血管相关疾病和/或肿瘤相关疾病的药物中的用途。
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