CN108707636A - 采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法 - Google Patents

采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，属生物制药技术领域。该方法包括采用海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16的保藏号为CCTCC NO：M 2013154。本发明采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，转化率高，由于该方法利用微生物胞内酶进行催化，因此不易失活且可以重复使用，产物易于分离纯化，显著降低成本。

Description

采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法
技术领域
本发明属生物制药技术领域，具体涉及采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法。
背景技术
葛根素是从豆科植物野葛等植物中提取的异黄酮葡萄糖碳苷，是中药葛根的主要活性成分之一，具有如降血压、抗肿瘤和抗氧化等多种生物活性，其分子式为C21H20O9，分子量为416.4。
由于葛根素的水溶性较低（6.24g/L），通过结构修饰进行糖基化，可提高其溶解度。如：蒋洁蓉等（Jiang JR, Yuan S,Ding JF, et al. Appl Microbiol Biotechnol,2008,81, 647-657.）以氧化微杆菌糖基化葛根素，得到7-O-葡萄糖苷葛根素（CASRN：1163249-06-6）与7-O-异麦芽糖苷葛根素（CASRN：1163249-07-7），转化率分别为40%和5%。
通过生物转化对天然产物进行结构修饰，具有转化反应条件温和，转化产物简单易分离等优点，糖基化修饰后，化合物溶解度可显著提高。但是，现有技术中，通过生物转化法制备糖基化葛根素，还存在转化率不高，胞外酶易失活不能重复使用，成本较高等问题。
发明内容
本发明目的是提供采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，转化率高，由于该方法利用微生物胞内酶进行催化，因此不易失活且可以重复使用，产物易于分离纯化，显著降低成本。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，包括采用海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16的保藏号为CCTCC NO：M 2013154。
优选的技术方案中，所述糖基供体为蔗糖。
在本发明中反应溶剂是亲水性有机溶剂和pH为4.0~9.0缓冲液的混合物，所述亲水性有机溶剂的体积百分含量为10%~30%，所述亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇中的一种或者两种以上的混合物。
优选的技术方案中，海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16固定化后在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应；所述固定化方法如下：将海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀，再滴至CaCl2溶液中，得到固定化细胞；所述海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液的OD680为4.0-6.0，CaCl2溶液的浓度为10-40g/L，海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合后海藻酸钠的浓度为10-50g/L；固定化细胞包埋量为20~60%。
优选的技术方案中，转化体系中，葛根素的浓度为5~80g/L，蔗糖的浓度为50~500g/L；固定化细胞与转化体系的体积比为5～50:100，所述转化体系是在反应溶剂中添加葛根素和蔗糖后形成的；反应温度为15~45℃，反应时间为1~36h。
优选的技术方案中，海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16采用发酵培养基在20~40℃发酵培养6~24h，所述发酵培养基含有如下成分：蔗糖 5~40 g/L，酵母粉2~30 g/L，KH2PO4 0.5~5 g/L，MgSO4 0.1~2g/L，pH 6~8。
在本发明中，糖基化葛根素采用如下方法纯化：反应结束后，过滤收集固定化细胞，采用AB-8型大孔树脂层析分离滤液中的糖基化葛根素。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：本发明提供了采用海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16制备糖基化葛根素的方法，该菌株能够产生催化葛根素糖基化反应的胞内酶，因此催化酶不易失活、易于重复使用，产物易于分离。申请人巧妙的将固定化技术与非水相体系相结合，不仅实现了糖基化葛根素的高效制备，而且产物易于分离，微生物细胞能够重复使用，显著降低了生产时间和成本。
附图说明
图1 果糖基-β(2,6)-葛根素的分子结构。
图2显示了果糖基-β(2,6)-葛根素的H-H COSY谱图。
图3显示了果糖基-β(2,6)-葛根素的C-H HSQC谱图。
图4显示了果糖基-β(2,6)-葛根素的HMBC谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
实施例1 生产糖基化葛根素的微生物的筛选及鉴定
从本实验室保存的多株菌中筛选生产糖基化葛根素的微生物，其中包括海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16。
发酵培养基：蔗糖 15g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 3g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0。
生产糖基化葛根素的菌种的筛选：取各菌株的平板培养物，以发酵培养基培养12h后，取发酵液5 mL，加入到150 mL带塞三角瓶中，另外加入底物溶液（其中含DMSO 20% (v/v)，葛根素20 g/L，蔗糖100 g/L）至总体积达到20 mL，于30℃、160 r/min条件下转化24 h，转化液样品以HPLC检测。HPLC检测结果，显示海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16具有较高的糖苷化芒果苷活性。
菌种鉴定：以通用方法提取海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16的基因组，进行16S rDNA片段PCR扩增、纯化及序列测定。以测序的16S rDNA序列利用BLAST程序与GenBank数据库进行相似性比较分析，再次证实菌株NJ16为海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）。该菌株已送中国典型培养物保藏中心进行专利菌种保藏，保藏信息如下：
分类命名为海洋微杆菌NJ16 Microbacterium thalassium NJ16，保藏日期为2013年4月22日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013154。
实施例2 制备海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16固定化细胞
配制发酵培养基：蔗糖 25 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO4 2.5 g/L， MgSO4 0.3 g/L，pH7.0。
将40 ml发酵培养基装入250 ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20 min后，接种海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16，于30℃、180 rpm振荡发酵培养12小时，所得发酵液作为种子液接种至5L发酵罐中，发酵罐中发酵培养基装液量70%，接种量3%；然后在30℃、搅拌转速300 rpm条件下发酵培养，通气量3 vvm，发酵培养6小时。将发酵液在5000 r/min离心10min，收集细胞并以生理盐水重新悬浮，调节OD680nm为 4.5。
配制60g/L的海藻酸钠溶液，将其放入高压灭菌锅中在121℃温度下灭菌20 min，然后放入已灭菌的无菌操作台中冷却至室温。
取以上配制的海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液按体积比为3:7混合均匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至35g/L的CaCl2溶液中，在4℃冰箱中放置12h进行固定化，此时固定化细胞包埋量为30%。用无菌水清洗固定化细胞小球，然后放入无菌水中在4℃冰箱内保存。
其中固定化细胞包埋量=海洋微杆菌NJ16悬浮液的体积/（海洋微杆菌NJ16悬浮液的体积+海藻酸钠溶液的体积）*100%。
实施例3在非水相体系中生产糖基化葛根素
5L非水相转化体系：将pH 6.5、浓度为1/15 mol/L的磷酸缓冲液 （溶质为Na2HPO4、KH2PO4）与二甲基亚砜按照体积比为9:1混合，加入终浓度为50g/L的葛根素，400g/L的蔗糖，得到5L非水相转化体系。将2L固定化细胞（实施例2制备）加入5L非水相转化体系中，在30℃、搅拌转速200r/min条件下转化36h。反应结束后，过滤回收固定化细胞，滤液以10倍柱床体积的蒸馏水（冰乙酸调节pH至4.0）稀释，经AB-8大孔树脂吸附（层析柱40×800 mm，流速20 ml/min），然后用10倍柱床体积的蒸馏水（冰乙酸调节pH至4.0）洗去残余的糖基供体，接着用10%-30%的甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，经40℃旋转蒸干得到产物。产物为白色粉末。
产物鉴定：
HRMS给出准分子离子峰m/z 577.1563[M-H]-，元素组成为C27H29O14，M-H计算值577.1557，表明产物分子式为C27H30O14，与葛根素相比较增加了C6H10O5，C6H10O5为一个残糖基，推测转化产物是葛根素单糖基化衍生物。
产物的1H NMR显示出δ 8.29 (1H, s), 7.93 (1H, d, J=8.7 Hz), 6.98 (1H,d, J=8.7 Hz), 7.40 (2H, d, J=8.5 Hz), 6.80 (2H, d, J=8.7 Hz)等7个烯氢信号，为葛根素类异黄酮特征信号峰。δ 4.81 (1H, d, J=9.1 Hz)应为葛根素母核上葡萄糖的端基氢信号，且端基为β-构型。与葛根素的NMR数据对照，数据基本无差异，表明葛根素母核未发生变化，仅仅增加了1个糖基。
产物的13C NMR显示出27个碳信号（有两个碳信号重叠），其中15个位于180-110ppm范围，为葛根素母核骨架碳信号，11个位于90-60 ppm 范围，应为2个糖基上的碳信号，与底物碳谱数据对照，其中位于δ 73.4 ppm 次甲基为葛根素母核上葡萄糖的端基碳，以C-C键与苷元相连，位于δ 104.1 ppm 季碳推测其为另一糖基的端基碳。
具体的碳谱和氢谱数据如下数据如下：H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) =9.48(1H, s, OH4'), 8.29(1H, s, H2), 7.93(1H, d, 8.7 Hz, H5), 7.40(2H, d, 8.5Hz, H2', H6'), 6.98(1H, d, 8.7 Hz, H6), 6.80(2H, d, 8.7 Hz, H3', H5'), 4.81(1H,d, 9.1 Hz, H1''), 3.93-3.96(2H, m, H2'', H4'''), 3.79-3.89 (2H, m, H5'', H6'''),3.48-3.61 (3H, m, H6''，H5''', H6'''), 3.29-3.42 (6H, m, H3'', H4'', H6'', 2H1''',H3'''); 13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 174.9(C4), 160.9(C7), 157.1(C9&C4'),152.6(C2), 130.0(C2'&C6'), 126.2(C5), 123.0(C3), 122.5(C1'), 116.8(C10), 114.9(C6&C3'), 112.5(C8), 104.1(C2'''), 82.1(C5'''), 79.7(C3'''), 78.4(C3''), 76.7(C4'''),75.1(C5''), 73.4(C1''), 70.7(C2''), 70.3(C4''), 62.3(C6''), 61.5(C6'''), 61.1(C1''')。
根据氢谱、碳谱及2D NMR（图2-4），确定连接的糖基为β-D-呋喃果糖。化合物氢谱数据显示葛根素母核上4'-OH及7-OH的信号存在，推测糖基连接在葛根素母核上的葡萄糖残基上。葛根素母核葡萄糖上的羟基苷化会使该-OH所在碳原子产生一个明显的低场位移，葡萄糖上C-6''信号（62.3 ppm）比苷化前（61.5 ppm）向低场位移了+0.8 ppm，表明连接果糖的一端是在葡萄糖上C-6''位；而2D NMR数据表明连接果糖的另一端是在果糖C-2'''位。
综合以上结果，确定产物为果糖基-β(2,6)-葛根素，纯度>95%，结构式如图1。
经HPLC检测，发现在上述葛根素糖基化反应中，底物的转化率为93%。
实施例4：固定化细胞批次转化葛根素糖苷产物
将实施例3中回收的固定化细胞，加入5L非水相转化体系：将pH 6.5、浓度为1/15 mol/L的磷酸缓冲液（溶质为Na2HPO4和KH2PO4）与二甲基亚砜按照体积比为8:2混合，然后加入终浓度为50g/L的葛根素，400g/L的蔗糖。转化反应在30℃、搅拌转速为200r/min条件下转化36h，经检测底物转化率为90%。过滤回收固定化细胞，重复上述步骤5次，底物转化率分别为90%、88%、88%、86%和85%，表明该固定化细胞催化稳定性好，可降低生产成本，缩短制备时间。
实施例5：固定化条件和非水相体系对糖基化葛根素产物的影响
固定化条件（海藻酸钠浓度、CaCl2溶液浓度）和非水相体系中有机溶剂对产物形成均产生不同影响，因此，考察了表1所示的4种不同条件下，底物的转化率，其他条件同实施例2和3。
表1 不同固定化条件和有机溶剂对底物转化率的影响
注：上述海藻酸钠浓度是指菌悬液与海藻酸钠溶液混合后海藻酸钠的浓度；葛根素浓度是指葛根素在反应溶剂中的浓度。

Claims (7)

1.采用微生物细胞制备糖基化葛根素的方法，其特征在于包括采用海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应，得到糖基化葛根素的步骤；海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16的保藏号为CCTCC NO：M 2013154。
2.根据权利要求1所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于所述糖基供体为蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于反应溶剂是亲水性有机溶剂和pH为4.0~9.0缓冲液的混合物，所述亲水性有机溶剂的体积百分含量为10%~30%，所述亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇中的一种或者两种以上的混合物。
4.根据权利要求3所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16固定化后在非水相中催化葛根素和糖基供体进行反应；所述固定化方法如下：将海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀，再滴至CaCl2溶液中，得到固定化细胞；所述海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液的OD680为4.0-6.0，CaCl2溶液的浓度为10-40g/L，海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合后海藻酸钠的浓度为10-50g/L；固定化细胞包埋量为20~60%。
5.根据权利要求4所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于转化体系中，葛根素的浓度为5~80g/L，蔗糖的浓度为50~500 g/L；固定化细胞与转化体系的体积比为5～50:100，所述转化体系是在反应溶剂中添加葛根素和蔗糖后形成的；反应温度为15~45℃，反应时间为1~36h。
6.根据权利要求5所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于海洋微杆菌（Microbacterium thalassium）NJ16采用发酵培养基在20~40℃发酵培养6~24h，所述发酵培养基含有如下成分：蔗糖 5~40 g/L，酵母粉2~30 g/L，KH2PO4 0.5~5 g/L，MgSO4 0.1~2g/L，pH 6~8。
7.根据权利要求6所述制备糖基化葛根素的方法，其特征在于糖基化葛根素采用如下方法纯化：反应结束后，过滤收集固定化细胞，采用AB-8型大孔树脂层析分离滤液中的糖基化葛根素。
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