CN104788518A - 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的制备方法及其脂质调节方面的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物药物领域，具体涉及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(I)，本发明公开了其制备方法：用保藏号NRRL 1086菌株对槲皮素进行生物转化获得。本发明还公开了其脂质调节方面的用途。

Description

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的制备方法及其脂质调节方面的用途

技术领域：

本发明涉及生物药物领域，具体涉及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷及其制备方法，本发明还公开了其脂质调节方面的用途。

背景技术：

高血脂症(hyperlipidemia)是以血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)与低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)过高或高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平过低为症状的一种疾病。随着生活水平的不断提高，人们在日常生活中摄入糖脂过多，饮食结构改变的同时缺乏足够的运动，高血脂症的发病率逐年升高。近年来，由高血脂症诱发的动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死、高血压等心脑血管疾病发病率高达8％，严重危害着人类的健康。高血脂的预防和早期控制是防治心脑血管疾病发生的重要手段。而目前用于高血脂治疗的药物多为化学合成，不仅价格昂贵而且副作用较多，因此寻找天然的脂质调节药物意义重大。

槲皮素是一类含多个酚羟基的生物类黄酮化合物，具有抗氧化、抗炎、降低血压、保护心肌缺血等多种生物活性作用。另外大量研究表明，作为一种类黄酮物质其对脂质代谢也具有一定调节作用。然而槲皮素水溶性较低，生物利用度较差限制了其临床应用。

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物转化能专一地催化特定的反应并且具有高度的立体结构选择性；与化学催化相比，无需繁琐的保护与脱保护操作，具有高效、环保的优点，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。槲皮素结构上含有多个酚羟基，结构具有一定的可塑性，因此我们选用一种微生物对其进行结构修饰，特异性地催化3位羟基糖基化，以期解决其生物利用度差的问题，使其相应的药理活性能更好地临床上得到应用。

发明内容：

本发明公开了结构式I的化合物： 

命名为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物。

表1 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷¹H-NMR和¹³C-NMR数据如下：

药理试验证明，本发明的结构式I化合物具有优异的脂质调节方面效果。

本发明的结构式I化合物优选用生物转化方法以槲皮素为底物进行转化制备，方法如下：

为了寻找适宜转化槲皮素成槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷的菌种，本发明共筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL 1086菌种对槲皮素具有较强的转化能力(见表2)。

筛选所用液体培养基(PDA)：200g新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液 加葡萄糖20g、KH₂PO₄ 3.0g、MgSO₄ 0.75g、Vb₁ 10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加NaOH或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：槲皮素溶于乙醇，配成10mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液中(30ml)加1ml样品溶液，使每瓶菌液含槲皮素10mg。同条件培养24h后，终止反应，过滤菌体，发酵液用2倍量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏合并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。

转化产物的薄层鉴定：

薄层条件如下：

薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。

展开剂：氯仿∶甲醇∶甲酸(85∶15∶0.5)上行法展开。

显色剂：三氯化铁的乙醇溶液。

操作：

转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，充分展开后取出自然晾干，喷以三氯化铁显色。转化结果见表2。

表2 微生物转化槲皮素筛选结果

从筛选结果看，有2种菌可以转化，其中NRRL 1086，经测算，转化率可达85％。Absidia coerulea虽为糖基化转化但转化率较低。因此，本发明选用菌株G.deliquescens.NRRL 1086，以槲皮素为原料来制备槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明公开了一种制备式I化合物的制备方法：用保藏号为G.deliquescens.NRRL 1086菌株对槲皮素进行生物转化获得。

更优选的方法是：以槲皮素为底物，利用保藏号为G.deliquescens.NRRL 1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养24h，终止反应，用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过硅胶柱层析分离即得。

其中有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯的一种或几种。更优选乙酸乙酯。

硅胶柱层析分离用氯仿和甲醇进行梯度洗脱。

培养基含10～30％的马铃薯煎煮液、KH₂PO₄、MgSO₄、维生素B₁和葡萄糖，培养基pH＝5.0～7.0。其中按20％马铃薯煎煮液100ml计，培养基中各组分优选的含量为KH₂PO₄含0.1～0.5g；MgSO₄含0.05～0.5g；葡萄糖0.5-2.5g。

最为优选的制备方法是：将保藏号为G.deliquescens.NRRL 1086的菌株由斜面接种到液体培养基中，置28℃，转速为180r/min的摇床中培养24h成为种子液，种子液转接至发酵液后继续培养24h，加入转化底物；继续培养24h后终止催化反应，过滤菌体，发酵液用2倍量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏，浸膏经硅胶拌样后柱层析分离；以氯仿-甲醇为洗脱系统。转化产物经甲醇重结晶，得到黄色粉末状转化产物。

药理试验证明，本发明的结构式I化合物具有显著的脂质调节作用，以下是试验方法及结果：

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷在脂质调节方面研究

实验动物： 

健康、雄性ICR小白鼠60只，体重20±2g；

实验方法： 

将小鼠在23±2℃，相对湿度50％-70％的SPF屏障系统内饲养，饲喂基础饲料7d后，称重，空腹16h后眼眶静脉丛采血，测定血清中TC(总胆固醇)含量，根据TC水平随机分为6组，每组10只，即正常对照组、模型对照组、阳性对照组(依折麦布1.0mg/kg)、以及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷低剂量组(15mg/kg)、中剂量组(30mg/kg)、高剂量组(50mg/kg)。所有小鼠均给予高脂高糖饲料，自由采食饮水。自造模第1天起，除正常对照组和模型对照组灌服蒸馏水外，其余各给药组分别灌胃给予相应剂量的药物，每日1次，灌胃容积为1ml/100g体重，连续6周。

指标测定： 

每周记录小鼠体重。给药6周后小鼠禁食12h，眼眶静脉丛取血，一份加入肝素制备抗凝血，另一份离心取血清。给药6周后，全自动生化分析仪检测小鼠血清血脂生化指标TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)，肝功能生化指标AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)；同时称量肝组织质量，计算肝指数，并测定肝脏脂肪含量、胆固醇含量、SOD(超氧化物歧化酶)活性和MDA(丙二醛)含量。

实验结果： 

1、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对小鼠体重增加和肝指数的影响

从上表可以看出，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷高、中、低剂量组小鼠体重增长、肝指数均低于正常对照组。由此表明槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷能显著降低高血脂症小鼠的肝指数，而对体重增长无显著影响。

2、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对高血脂症小鼠血脂的影响

由上表可见，与正常对照组相比，在高脂造模6周后，模型对照组小鼠血清TC、LDL-C含量显著升高。与高脂模型组相比，试验低剂量组、中剂量组小鼠血清TC含量显著降低；加入槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的三个剂量组小鼠血清TG、LDL-C含量显著降低，HDL-C含量升高；说明槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷能有效缓解小鼠高血脂症状，使其血脂指标恢复正常水平。

3、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对高血脂症小鼠肝功能的影响

从上表可以看出，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠血清AST活性显著升高；表明高脂高糖饲料对小鼠肝功能造成一定损伤并影响其机能。与高脂模型组相比，试验低剂量组、高剂量组小鼠血清AST活性显著降低，表明槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷能够修复高脂高糖饮食造成的肝功能损伤，使其恢复至正常水平。

4、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对小鼠肝脏TC、TG、SOD和MDA的影响

比较高脂模型组和正常对照组可知，高脂血症小鼠在血脂升高的同时，肝脏中TG、TC水平及MDA含量也显著升高，SOD活性显著下降。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷能降低高脂血症小鼠肝脏中TG、TC水平。其中中、高剂量组效果明显。试验结束时还发现高脂模型组小鼠肝脏色泽黄腻，脆弱，呈典型脂肪肝病变，而槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷3个剂量组的肝脏细胞与正常对照组接近，为血红色，组织较坚韧。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷能显著降低高脂血症小鼠肝脏中MDA含量，并对高脂血症小鼠肝脏中SOD活性有显著升高的作用。

通过药理实验证明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷能显著降低高血脂症小鼠的肝指数，而对体重增长无显著影响。并且其三个剂量均能降低小鼠血清TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平；低、中剂量能降低血清TC含量；表明槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷具有明显的脂质调节作用，其中低剂量降脂作用较优。另外，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的低、高剂量能降低小鼠血清AST活性，对肝脏具有一定的保护作用，从而调节肝脏中脂质正常代谢。槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖苷能显著降低高脂血症小鼠肝脏中脂质过氧化产物MDA含量，并提高SOD活性，这提示槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷可能通过提高机体内相关抗氧化酶的活性，降低体内自由基的水平，改善高脂血症小鼠氧化-抗氧化失衡状态，减少因高脂血症产生的过量自由基对机体的损伤作用。通过上述药理实验可以看出槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷一方面可以降低血脂中TC、TG、LDL-C水平，并提高HDL-C水平，改善血脂状况；另一方面可以通过保护肝脏，从而调节脂质正常代谢。

本发明的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷可与药学上可接受的载体混合，用于制备治疗用药物组合物。可制备成药剂学上通用的剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、透皮贴剂、缓释剂、注射剂等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。

具体实施方式

实施例1

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的制备：

转化采用两步培养法，菌种NRRL 1086由4℃的固体斜面接种至液体PDA培养基(培养基按100ml 20％马铃薯煎煮液中含KH₂PO₄ 0.3g；MgSO₄ 0.75g；葡萄糖10g；维生素B₁ 0.01g配制，液体培养基分装至150mL的三角瓶，每瓶装液30mL)，至摇床中培养24h(28℃，180r/min)，即为种子液；将种子液在无菌条件下转移至液体PDA培养基(培养基组成同前)中，在摇床中继续培养24h。每瓶加1ml槲皮素乙醇溶液(20mg/ml)，培养24h后终止反应。发酵液用2倍量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏280mg，称取100-200目硅胶1.2g与残渣均匀拌样，柱层析200～300目30g干法装柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，在氯仿-甲醇＝85∶15的洗脱馏分中，可得目标转化产物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，经甲醇重结晶，得到淡黄色粉末120mg。

其核磁数据见表1。

实施例2

片剂

取实施例1制得的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷100g与淀粉50g，糊精50g混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。

Claims (9)

1.结构式I的化合物或其药学上可接受的溶剂化物：

2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物的制备方法，其特征是：用保藏号为NRRL 1086菌株对槲皮素进行生物转化获得。

3.权利要求2的制备方法，其中生物转化方法如下：以槲皮素为底物，利用保藏号为NRRL 1086的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养24h，终止反应，发酵液用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，得浸膏，通过硅胶柱层析分离得到目标化合物。

4.权利要求3的制备方法，其中有机溶剂包括：乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲醇等。

5.权利要求3的制备方法，培养基含10～30％的马铃薯煎煮液、KH₂PO₄、MgSO₄、维生素B₁和选自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一种或几种的碳源，培养基pH＝5.O～7.O。

6.权利要求3的制备方法，其中按20％马铃薯煎煮液100ml计，KH₂PO₄ 0.1～0.5g；MgSO₄ 0.05～0.5g；葡萄糖0.5-2.5g(或蔗糖0.5-2.5g)。

7.权利要求2的制备方法，其中菌种在培养前先进行活化，活化时间20～30h。

8.一种药物组合物，其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药学上可接受的载体。

9.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物用于脂质调节方面的用途。