CN101412743B - 2α-羟基取代白桦酮酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物药物领域，具体涉及2α-羟基取代白桦酮酸(I)，本发明公开了其制备方法：用保藏号为NRRL 5646菌株对白桦酮酸进行生物转化获得。本发明还公开了其抗肿瘤的用途。

Description

2α-羟基取代白桦酮酸的制备方法

技术领域

本发明涉及生物药物领域，具体涉及2α-羟基取代白桦酮酸及其制备方法，本发明还公开了其抗肿瘤的用途。 

背景技术

当今临床使用的抗肿瘤药物中约40％药物来源于植物，其中白桦酮酸对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒活性，已成为抗肿瘤药物理想的筛选对象。但白桦酮酸的官能团较少，结构修饰的位点有限，主要集中在A-环和E-环的20-位及28-位，对其他位点的结构修饰报道较少。 

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物体系中可产生多种酶，催化不同的生物转化反应。如氧化、还原、酯化、水解、环化、缩合及裂解等反应。生物转化具有高度的立体结构选择性，能专一地催化特定的反应，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。 

发明内容

本发明公开了结构式I的化合物： 

命名为2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物。2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯的¹³C-NMR数据如下：

      表1 2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯的¹³C-NMR数据 

药理试验证明，本发明的式I化合物具有优异的抗肿瘤效果。 

本发明的式I化合物优选用生物转化方法以白桦酮酸为底物进行转化制备，方法如下： 

为了寻找适宜转化白桦酮酸成2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯菌种，本发明共筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL5646菌种对白桦酮酸具有较强的转化能力(见表1)。 

筛选所用液体培养基：200克新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液加葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb1 10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加NaOH或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。 

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。 

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，参见：Nair，M.S.R.，andBasile，D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn.天然产物杂志(Jounal of Natural Products)1993，56(9)：1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：白桦酮酸溶于乙醇，配成10.0mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液(30ml)加0.5ml样品溶液，使每瓶菌液含白桦酮酸5mg。同条件培养120h后，中止反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏和并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。 

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。 

转化产物的薄层鉴定： 

薄层条件： 

1.薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。 

2.展开剂：乙酸乙酯：石油醚(1：3)上行法展开。 

3.显色剂：10％硫酸乙醇溶液。 

操作： 

转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，充分展开后取出自然晾干，喷以10％的硫酸乙醇，电吹风加热显色。转化结果见表1。 

         表1 微生物转化白桦酮酸筛选结果 

从筛选结果看，有四种菌可以转化，其中NRRL5646转化效果最好，经测算，转化率可达60％，而其余三种转率均较低，转化率不足0.5％。因此，本发明选用菌株NRRL.5646，以白桦酮酸为原料来制备2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯。 

本发明公开了一种制备式I化合物的制备方法，用保藏号为NRRL 5646菌株对白桦酮酸进行生物转化获得。 

更优选的方法是：以白桦酮酸为底物，利用保藏号为NRRL 5646的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养3～8天，终止反应，用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过硅胶柱层析分离即得。 

其中有机溶剂选自乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲苯、甲酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇、四氢呋喃中的一种或几种。更优选乙酸乙酯。 

硅胶柱层析分离为用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱。 

培养基含10～30％的马铃薯煎煮液、KH₂PO₄、MgSO₄、维生素B1和选自葡萄糖、蔗糖、芽糖、淀粉中一种或几种的碳源，培养基pH＝5.0～7.0。为重量百分比。 

其中按20％马铃薯煎煮液100毫升计，培养基中各组分优选的含量为KH₂PO₄含0.1～0.5克；MgSO₄含0.1～0.5克；葡萄糖或蔗糖含0.5-2.5克。 

最为优选的制备方法是：将保藏号为NRRL.5646的菌株由斜面接种到液体培养基中，置28℃，转速为180r/m的摇床中培养48小时成为种子液，种子液转接至发酵液后继续培养24小时，加入转化底物；继续培养144小时后终止催化反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏A；菌体用乙醇提取，回收乙醇，得到提取浸膏B，将两种浸膏合并，浸膏经硅胶拌样后柱层析分离；以石油醚与乙酸乙酯为洗脱系统。转化产物经乙酸乙酯重结晶，得到白色粉末状转化产物。 

药理试验证明，本发明的结构式I化合物具有优异的抗肿瘤作用，以下是试验方法及结果： 

2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯对小鼠S-180(表格中简称式I化合物)的抑制作用 

实验方法：在无菌条件下取S-180小鼠的实体肿块，用剪刀剪碎，经匀浆器磨成匀浆(加生理盐水)，每只小鼠皮下接种2.0×10⁶个细胞。实验用小鼠随机分成空白对照组(生理盐水)、阳性药对照组(5-氟尿嘧啶)、2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯给药组(0.025g/kg、0.1g/kg、0.4g/kg)。每组10只小鼠，各组小鼠于接种后24小时开始给药，每天一次，连续给药10天。给药停止后处死小鼠，剥离肿块称重。体内抑瘤作用于表5。 

     表2 2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯对小鼠S-180的抑制作用

注：与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01 

由表2可见，本发明的2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯对肿瘤的抑制效果显著。 

本发明的2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯，可单独或与其它药物联合使用。一般地，本发明的2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯用于治疗时，剂量范围为1-900mg/天，也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使用剂量超出该范围。 

本发明的2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯可与药学上可接受的载体混合，用于制备治疗用药物组合物。可制备成药剂学上通用的剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、透皮贴剂、缓释剂、注射剂等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。 

具体实施方式

实施例1 

2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯的制备： 

底物白桦酮酸110mg溶于11mL无水乙醇；菌种NRRL.5646由4℃的固体斜面接种至液体培养基(培养基按100毫升20％马铃薯煎煮液中含KH₂PO₄0.2克；MgSO₄0.1克；葡萄糖1克；微生素B₁ 0.01克配制，液体培养基分装至150mL的三角瓶，每瓶装液30mL)，至摇床中培养48小时(28℃，180r/m)，肉眼观察到大量的白色颗粒状菌体，即为种子液；将种子液在无菌条件下转移至液体培养基(培养基组成同前)中，在摇床中继续培养24小时。可见大量菌体时加入转化底物；加样培养144小时后终止反应。过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏和并，得浸膏0.5g，称取100-200目硅胶1.5g与残渣均匀拌样，柱层析200～300目15g干法装柱，乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，在乙酸乙酯-石油醚＝1：60的洗脱馏分中，可得目标转化产物2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯，经乙醇水重结晶，得到白色针晶60mg。

其碳谱见表1。 

实施例2 

片剂 

取实施例1制得的2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯100g与淀粉50g，糊精50g混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。

Claims (2)

1.结构式I的化合物的制备方法，包括：

以白桦酮酸为底物，利用保藏号为NRRL 5646的菌株，将底物和该菌株在培养基中共培养3～8天，终止反应，用有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过硅胶柱层析分离即得，

其中有机溶剂选自乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲苯、甲酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇、四氢呋喃中的一种或几种；

其中硅胶柱层析分离为用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯∶石油醚＝1∶60的洗脱馏分；

其中按20％马铃薯煎煮液100毫升计，培养基中KH₂PO₄含0.1～0.5克；MgSO₄含0.1～0.5克，葡萄糖或蔗糖含0.5-2.5克。

2.权利要求1的制备方法，其中有机溶剂是乙酸乙酯。