CN102180941B

CN102180941B - 桦木酮酸衍生物及其制备和应用

Info

Publication number: CN102180941B
Application number: CN2011100596228A
Authority: CN
Inventors: 汤杰; 刘明耀; 仇文卫; 罗剑; 杨帆; 徐军; 李珍惜
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2031-03-11
Also published as: CN102180941A

Abstract

本发明涉及一种桦木酮酸衍生物及其制备和应用。以桦木酮酸或氢化桦木酮酸为原料，氮气保护、碱存在下与甲酸乙酯，草酸二乙酯，碳酸二乙酯或三氟乙酸乙酯缩合，25～66℃反应5～7小时，再与盐酸肼，盐酸羟胺或盐酸苯肼关环，78℃，反应1小时，所得产物经纯化得桦木酮酸衍生物，收率63％～85％。本发明通过在天然产物桦木酮酸C2，C3位引入并杂环，高效合成了系列新结构衍生物，工艺简便，且通过结构改造，显著增强了其抑制破骨细胞分化活性。

Description

桦木酮酸衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种桦木酮酸衍生物及其制备和应用，应用是指作为破骨细胞分化抑制剂用于制备抗骨质疏松药物，属于药物及其制备和应用技术领域。

背景技术

骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种与年龄相关的健康问题，以骨量减少和骨微结构退化为特征，致使骨的脆性增加而易于发生骨折的一种多因素所致的慢性系统性骨病(Sambrook P.et al.Lancet，2006，367，2010)。随着人类社会的老龄化，骨质疏松症发病率不断增加，据统计，我国1999年骨质疏松患者为1900万，预计到2050年将超过2亿。该病女性多于男性，尤其是绝经后妇女，骨质疏松症和骨折并发症发病率更高，男女比率约1∶8，严重影响老年人，尤其是老年妇女的生活质量。

骨的新陈代谢由破骨细胞(Osteoclast)介导的骨吸收与成骨细胞(Osteoblast)介导的骨形成之间巧妙平衡来维持，这种平衡一旦破坏，就会发生骨代谢异常。当破骨细胞的活性远超过成骨细胞的活性时，骨量减少，从而导致骨质疏松症的发生；反之，如果成骨细胞活性过高则会导致骨骼石化症(Boyle W.J.et al.Nature，2003，423，337；Teitebaum S.L.et al.Science，2000，289，1504)。骨的新陈代谢分为三个步骤：即骨的吸收，骨的形成和骨基质的矿化。骨质疏松症实际上就是骨的新陈代谢失衡的结果，因此，治疗骨质疏松症的药物按照其作用也可分为三类：即抑制骨吸收，促进骨形成和促骨矿化。抑制骨吸收的药物包括雌激素、降钙素、双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂等，主要通过抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞的活性来抑制骨吸收和减缓骨钙丢失。促骨形成的药物包括甲状旁腺素、氟化物、他汀类药物、细胞控制因子等，此类药物能刺激成骨细胞活性，使新生骨组织及时矿化成骨，减低骨脆性，增加骨密度及骨量。促骨矿化药物主要为钙剂和活性维生素D(VD、阿法骨化醇、骨化二醇、骨化三醇、双氢速甾醇)，是防治骨质疏松症的基础用药。以上这些药物的使用均有一些局限性及副作用，如：雌激素的使用会增加乳腺癌、中风、血栓等危险性，因此不能长期使用；双膦酸盐不利于吸收，经常会产生胃肠道不适；甲状旁腺素不能口服，长期使用可能会产生骨肉瘤，一般最长推荐使用时间不超过2年。因此迫切需要人们开发新的，更有效、更安全的预防和治疗抗骨质疏松的新药。

迄今，骨质疏松的治疗多以破骨细胞为靶点，可通过抑制破骨细胞前体分化成多核成熟的破骨细胞来降低骨降解速率、改善骨吸收。因此，抑制破骨细胞分化的骨吸收抑制剂是治疗骨质疏松的热点，正逐渐成为制药公司和各大药厂关注的焦点，这一类药物有望在未来几年成为治疗骨质疏松的一线药物而替代现有的临床用药。如欧洲人用药委员会(CHMP)于2009年12月份批准的安进公司(Amgen)的狄诺塞麦(Denosumab)是破骨细胞分化因子RANKL的单克隆抗体，能够与RANKL作用，中和成骨细胞分泌的RANKL，抑制破骨细胞的分化、成熟及活性，进而治疗骨质疏松(McClung MR.et al.N Engl J Med，2006，354，821)，该药品被认为有成为重磅炸弹药物的潜力。

与人工合成的小分子化合物相比，天然产物在成药性方面具有先天的优越性，因此从天然产物、特别是从高安全性天然产物的有效成分入手，寻找新颖的母核结构并进行构效关系研究，是发现成药性好、安全性高的抗骨质疏松药物的重要途径。近年来，一些天然三萜类化合物被报道具有抑制破骨细胞分化的作用，如黑升麻醇的糖苷ACCX能够抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化、成熟(Qiu S.X.et al.ChemBiol，2007，14，860)；五环三萜类乳香酸衍生物AKBA同样可以抑制破骨细胞的分化、成熟(Takada Y.et al.J Immun，2006，176，3127)；白桦脂酸(Betulinic acid)及其衍生物在抗肿瘤、抗艾滋、抗炎(TakadaY.et al.J Immun，2003，171，3278；Saleem M.et al.Oncogene，2004，23，5203)等方面具有良好的生物活性，同时具有一定促进成骨细胞分化活性的功能(Lo Y.-C.et al，J.Agric.Food Chem.2010，58，6643)，也是我国民间用草药接骨木中的主要成分之一(CN200410051613.4)。

发明内容

本发明的目的是通过对天然五环三萜类化合物桦木酮酸进行结构优化，得到活性更强的候选化合物桦木酮酸衍生物，为该类化合物进入临床研究奠定基础，为抗骨质疏松治疗药物研究提供条件。

本发明提供的桦木酮酸衍生物具有如下结构通式：

式中，R代表2-丙烯基或2-丙基，当R为2-丙烯基时，Het分别为

对应的桦木酮酸衍生物依次用自行设计的代号XJ-479；XJ-551；XJ-495；XJ-552；XJ-496；XJ-547；XJ-555表示。当R为2-丙基取代时，杂环取代基Het以及对应的桦木酮酸衍生物为

和XJ-481。

本发明的另一目的在于提供该类衍生物的制备方法。上述化合物I可通过以下步骤制得：

式中，R代表2-丙烯基或2-丙基；R’＝H、EtO₂C，EtO或CF₃；根据上述反应式，以桦木酮酸(R代表CH(CH₃)＝CH₂)或氢化桦木酮酸(R代表CH(CH₃)₂)i为原料，氮气保护、碱存在下分别与甲酸乙酯，草酸二乙酯，碳酸二乙酯，或三氟乙酸乙酯缩合得到化合物ii，溶剂为无水四氢呋喃，所用的碱包括甲醇钠，或叔丁醇钾，反应温度控制在25℃～66℃之间，反应时间5～7小时，所得化合物ii无需纯化，直接用于下一步反应，即化合物ii在氮气保护下，分别与盐酸肼，盐酸羟胺，或盐酸苯肼关环，溶剂采用醇类和水，醇主要为乙醇，反应温度78℃，反应时间1小时，所得产物经硅胶柱层析纯化得桦木酮酸衍生物I，收率63％～85％。

本发明还有一个目的是该类桦木酮酸衍生物在治疗骨质疏松药物中的应用，通过对破骨细胞分化抑制活性筛选，发现上述方法得到的该类桦木酮酸衍生物具有显著抑制破骨细胞分化的活性。这类衍生物抑制破骨细胞分化的活性多数IC₅₀＜5μM，高于五环三萜类天然产物白桦脂酸(IC₅₀＝25μM)。

本发明的优点在于通过对天然产物桦木酮酸进行结构改造，在C2，C3位引入系列并杂环，高效合成了系列新型的桦木酮酸衍生物，合成方法简便，且通过该部位的结构改造，显著增强了该类化合物抑制破骨细胞分化的活性。

具体实施方式

实施例1：桦木酮酸衍生物XJ-479的制备

0.5g桦木酮酸i溶解于20mL无水四氢呋喃中，氮气保护下加入0.24g甲醇钠、0.34mL甲酸乙酯，室温反应5小时，反应液浓缩，加入30mL水，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，分出有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂乙酸乙酯后得0.4g化合物ii，无需提纯直接用于下一步。

0.4g ii与0.56g盐酸肼加入10mL乙醇与0.76mL水的混合溶液中，氮气保护下回流1小时。反应液加入50mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂乙酸乙酯后所得粗产物用硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)得0.35g桦木酮酸衍生物I，用XJ-479代表，产率85％；

¹H-NMR(CDCl₃)：7.22(1H，s)，4.76(1H，s)，4.62(1H，s，)，2.97(1H，m)2.63(1H，d，J＝15Hz)；ESI-HRMS(m/z)[M+H]⁺＝479.3632。

实施例2：桦木酮酸衍生物XJ-551的制备

0.5g桦木酮酸i溶解于20mL无水四氢呋喃中，氮气保护下加入0.55g叔丁醇钾、1mL草酸二乙酯，室温反应5小时，蒸去溶剂四氢呋喃后，加入30mL水，乙酸乙酯(60mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水20mL洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得化合物0.5g化合物ii，无需提纯直接用于下一步。

0.5g ii、0.56g盐酸肼及0.8mL水加入10mL乙醇中，氮气保护下加热，回流1小时，反应液冷却后加入50mL水，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后所得粗产物用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化得0.4g桦木酮酸衍生物XJ-551，产率72％；¹H-NMR(DMSO-d₆)：13.2(1H，brs)，12.2(1H，brs)，4.72(1H，s)，4.58(1H，s)，4.22(2H，q，J＝6.7Hz)，2.96(1H，m)，2.88(1H，d，J＝15.3Hz)，2.2(1H，m)，2.12(1H，d，J＝9.9Hz)，1.95(2H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+H]⁺＝551.3843。

实施例3：桦木酮酸衍生物XJ-552的制备

采用类似于实施例2的方法制备XJ-552，不同之处在于以盐酸羟胺代替盐酸肼，得0.34g桦木酮酸衍生物XJ-552，产率71％；¹H-NMR(CDCl₃)：4.68(1H，s)，4.56(1H，s)，4.33(2H，q，J＝7.1Hz)，2.96(1H，m)2.72(1H，d，J＝16Hz)，2.21(2H，m)，1.91(3H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+Na]⁺＝574.3503。

实施例4：桦木酮酸衍生物XJ-495的制备

0.5g桦木酮酸i与0.55g叔丁醇钾加入20ml无水THF与20ml碳酸二乙酯混合溶液中，氮气保护下加热回流反应7小时，反应液冷却后加入30mL水，乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后得0.45g化合物ii，产物无需提纯直接用于下一步。

0.45g ii，0.56g盐酸肼与0.76mL水加入10mL乙醇中，氮气保护下回流1小时，反应液冷却后加入50mL水，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂后粗产品用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得0.39g桦木酮酸衍生物XJ-495，产率80％；¹H-NMR(DMSO-d6)：4.76(1H，s)，4.62(1H，s)，2.97(1H，m)，2.31(2H，m)，2.12(1H，d，J＝9.9Hz)；ESI-HRMS(m/z)[M+H]⁺＝495.3602。

实施例5：桦木酮酸衍生物XJ-496的制备

采用类似于实施例4的方法制备XJ-496，不同之处在于以盐酸羟胺代替盐酸肼，得0.40g桦木酮酸衍生物XJ-496，产率80％；¹H-NMR(DMSO-d₆)：4.76(1H，s)，4.62(1H，s)，2.97(1H，m)2.23(2H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+Na]⁺＝518.3724。

实施例6：桦木酮酸衍生物XJ-547的制备

采用类似于实施例2的方法制备XJ-547，不同之处在于第一步以三氟乙酸乙酯代替草酸二乙酯为酰化试剂，0.45g桦木酮酸得0.37g桦木酮酸衍生物XJ-547，产率71％；¹H-NMR(DMSO-d₆)：13.1(1H，s)，4.72(1H，s)，4.65(1H，s)，2.55(1H，d，J＝15.2Hz)，2.26(1H，m)，2.12(2H，m)；ESI-HRMS(m/z)[M+Na]⁺＝569.3325。

实施例7：桦木酮酸衍生物XJ-555的制备

采用类似于实施例1的方法制备XJ-555，不同之处在于第二步以盐酸苯肼代替盐酸肼，0.45g桦木酮酸得0.42g桦木酮酸衍生物XJ-555，产率78％；¹H-NMR(CDCl₃)：8.23-7.32(6H，s)，4.72(1H，s)，4.65(1H，s)，2.97(1H，m)2.63(1H，d，J＝15Hz)。

实施例8：桦木酮酸衍生物XJ-481的制备

采用类似于实施例1的方法制备XJ-481，不同之处在于第一步以0.45g自制氢化桦木酮酸为原料，得0.37g桦木酮酸衍生物XJ-481，产率63％。¹H-NMR(CDCl₃)：7.22(1H，s)，2.97(1H，m)2.63(1H，d，J＝15Hz)；ESI-HRMS(m/z)[M+H]⁺＝481.3608。

实施例1-8所用原料桦木酮酸或氢化桦木酮酸为市售分析纯。其他试剂均为市售分析纯。

实施例9：桦木酮酸衍生物抑制破骨前体细胞分化测试

原理：单核的破骨前体细胞系在分化细胞因子RANKL的诱导下，能够逐渐融合分化为多核的成熟破骨细胞。破骨前体细胞不具备溶解骨质的能力，只有分化成熟的破骨细胞才具有溶解骨质的能力，因此，破骨细胞的分化水平能够反应其溶骨能力。

方法：将RAW264.7接种到96孔培养板中，3000细胞/孔。待细胞贴壁过夜后，设置对照组(加50ngl/mlRANKL)和实验组(加50ng/mlRANKL和5-20μM剂量桦木酮酸衍生物)组，隔天换液，培养3-5天。等对照组细胞融合完全后，用37℃预热的蒸馏水洗细胞一次，加入丙酮固定30秒，37℃预热的蒸馏水洗细胞三次，然后进行TRAP染色，在显微镜下计数TRAP阳性的多核细胞数(核多余3个)，得到破骨细胞形成百分数。首先选择5μM，10μM，20μM浓度的桦木酮酸衍生物进行抑制活性测试，如化合物在20μM浓度没有表现出明显的抑制活性，则不作进一步分析，如化合物在5μM浓度仍表现出较好的抑制活性，则进一步测试2.5μM，1μM，0.5μM及0.1μM的抑制活性。测试结果：筛选结果是当化合物为各种浓度时对破骨细胞分化的百分抑制率，百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数。

桦木酮酸衍生物抑制破骨细胞前体RAW264.7分化的测试结果，见表1：

表1

^a百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数

表1结果显示，化合物XJ-479，XJ-481在5μM浓度仍表现出很高的抑制活性，进一步测试其浓度为1μM，0.5μM及0.1μM的抑制活性，结果见表2。表2中的百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数。

表2

^a百分抑制率＝100％-破骨细胞形成百分数

测试结果显示XJ-479IC₅₀小于100nM。

实施例10：XJ-479对破骨细胞前体细胞毒性试验

实验原理：磺酰罗丹明染色法(Sulforhodamine B(SRB)是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞活性呈良好的线形关系，故可用做细胞活性的定量分析。

方法：在96孔培养版中接入破骨前体细胞，3000细胞/孔，设置对照组和加药组。待细胞贴壁厚，加入不同浓度的药物处理，72小时后SRB测细胞活性。SRB用1％醋酸配成0.4％溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸(TCA)固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50％TCA液50μl(终浓度为10％)固定；4℃放置1小时。倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μl SRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1％醋酸液洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/l非缓冲Tri s碱液(pH10.5)溶解。用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值。

结果与评价：结果是加入不同剂量的XJ-479后对前体破骨细胞增殖有一定影响，半抑制浓度在25～50μM之间。但是在低浓度0.01-5μM没有太大影响。本发明使用的浓度在5μM以内，因此可以排除由于细胞毒性或者影响细胞增殖导致的影响。

实施例11：XJ-479阻止小鼠卵巢切除导致的骨质疏松

原理：切除卵巢导致小鼠骨质疏松的模型是模仿中年妇女闭经后导致骨质疏松。在人体中，闭经或因子宫和卵巢疾病，行卵巢切除术的妇女，易发生骨质疏松。主要是因为雌激素降低，直接影响小肠钙的吸收功能。骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例地不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。

方法：选C 57BL/6小鼠，8周龄雌鼠30只，切除卵巢20只，双侧切除一小块脂肪作为对照组10只，手术5天后取存活健康小鼠，随机分组，切除卵巢的10只一组，一组皮下注射同剂量DMSO，另一组皮下注射XJ47910mg/kg，分别隔天皮下注射给药三个月，每周称体重一次，并按体重变化调整给药量。一个月时每组各取一部分老鼠切胫骨染TRAP看破骨细胞活性，三个月时心脏取血处死老鼠，然后进行树脂包埋脊柱。常规切片，进行骨质染色和骨质计量学分析。

结果与评价：

结果是小鼠处死后，将经过XJ-479处理的加药组和对照组的小鼠脊柱固定、包埋、切片、染色，进行统计分析。与对照假手术组比较，卵巢切除组小鼠，破骨细胞活性增加，骨质发生显著疏松，加药治疗组破骨细胞活性和骨质流逝程度明显小于手术组。说明XJ-479治疗能够抑制卵巢切除导致的骨质流失，因此能够抑制卵巢切除导致的骨质疏松。

综上所述，该类桦木酮酸衍生物作为破骨细胞分化抑制剂，在制备预防、延缓或治疗由破骨细胞介导的骨质疏松症，风湿性关节炎，类风湿性关节炎，牙周炎及癌症骨转移造成的骨破坏等相关疾病药物中具有重要用途。

Claims

1.一种桦木酮酸衍生物，其特征在于，该桦木酮酸衍生物具有如下结构：

式中，R代表2-丙烯基或2-丙基，

当R为2-丙烯基取代时，杂环取代基Het分别为如下结构式

当R为2-丙基取代时，杂环取代基Het的结构式为

2.一种制备权利要求1的桦木酮酸衍生物方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

式中，R代表2-丙烯基或2-丙基；R’为H、EtO₂C，EtO或CF₃；当R为2-丙烯基取代时，杂环取代基Het分别为如下结构式

当R为2-丙基取代时，杂环取代基Het的结构式为

第一步，将桦木酮酸或氢化桦木酮酸作为原料i，氮气保护和碱存在下，原料i与酰化试剂缩合反应，缩合反应温度控制在25°C~66°C之间，反应时间5~7小时，得到化合物ii，化合物ii无需纯化，直接用于下一步反应；

第二步，在氮气保护下，将1份质量盐酸肼，盐酸羟胺，或盐酸苯肼以及20-30份质量溶剂加入到1份质量化合物ii中，反应温度78°C，反应时间1小时，化合物ii与盐酸肼，盐酸羟胺，或盐酸苯肼关环，最后将所得产物经硅胶柱层析纯化得桦木酮酸衍生物I，收率63%~85%；

上述第一步所用的碱是甲醇钠，或叔丁醇钾；

上述第一步的酰化试剂为甲酸乙酯，草酸二乙酯，碳酸二乙酯或三氟乙酸乙酯；

上述第二步的溶剂采用醇类和水，醇类为乙醇，两者的剂量为乙醇：水=10:0.76-0.8体积比。

3.根据权利要求2所述的制备桦木酮酸衍生物方法，其特征在于，所述的第一步中原料i与酰化试剂缩合反应是先将1份质量桦木酮酸i溶解于40份质量的无水四氢呋喃中，然后在氮气保护下加入0.5份质量的碱和0.7份质量的酰化试剂进行缩合反应。

4.一种如权利要求1所述的桦木酮酸衍生物在制备治疗骨质疏松药物中的应用。