CN105796568A - 用于调控激酶级联的药物组合物及其使用方法 - Google Patents

用于调控激酶级联的药物组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于调控激酶级联的药物组合物及其使用方法。本发明涉及一种药物组合物，这种药物组合物包括2?(5?(4?(2?吗啉基乙氧基)苯基)吡啶?2?基)?N?苯甲基?乙酰胺或其药学上可接受的盐以及一种药学上可接受的载体。

Description

用于调控激酶级联的药物组合物及其使用方法
本申请是申请日为2008年10月20日，申请号为200880120233.8(国际申请号为PCT/US2008/011977)，发明名称为“用于调控激酶级联的药物组合物以其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2007年10月20日递交的美国临时专利申请序列号第60/999,943号的优先权。上述申请的全部内容在此通过引证全部并入本文。
技术领域
本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包括2-(5-(4-(2-吗啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙酰胺(化合物(I))以及它的药学上可接受的盐，例如，甲磺酸盐。本发明还涉及这种组合物的使用方法。
背景技术
本发明涉及一种二芳基化合物及其药学上可接受的盐，包括甲磺酸盐，所述二芳基化合物及其药学上可接受的盐能够有效的用于治疗或者预防某些疾病或者紊乱。更具体的，本发明涉及化合物2-(5-(4-(2-吗啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙酰胺，即，化合物(I)，或者其药学上可接受的盐，化合物(I)具有如下分子式：(说明书第1页图)(I)，其药学上可接受的盐包括一种甲磺酸盐。
美国专利第7,300,931号具体的公开并要求保护化合物(I)。该专利也公开了化合物(I)在治疗细胞增殖性紊乱方面的应用。
化合物(I)及其药学上可接受的盐是有效地Src酪氨酸激酶抑制剂，可以用于治疗或者预防某些疾病或者紊乱，包括癌症、细胞增殖性紊乱、微生物感染、过度增殖性紊乱、黄斑水肿、骨质疏松症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系统机能失调、II型糖尿病、肥胖症、移植排异、听力丧失、中风、动脉硬化症、慢性神经性疼痛、乙型肝炎和自身免疫性疾病。美国专利第2007/0015752号、PCT/US2008/004847中描述了使用化合物(I)治疗并预防这些疾病或者紊乱的发生。
本发明公开了某种药物组合物，这种药物组合物包括化合物(I)或者其药学上可接受的盐。
发明内容
本发明提供了一种用于口服给药、静脉内给药、肌肉内给药或者皮下给药的药物组合物，这种药物组合物包括每剂量2毫克到400毫克的化合物(I)或者其药学上可接受的盐和一种药学上可接受的载体，每日给药2次到3次。在一个方面，所述剂量是10毫克到300毫克。在另一个方面，所述剂量是20毫克到250毫克。在另一个方面，所述剂量是40毫克到200毫克。在另一个方面，所述剂量是60毫克到160毫克。在一个方面，所述剂量每日给药2次。在另一个方面，所述剂量每日给药3次。
本发明提供了一种用于口服给药、静脉内给药、肌肉内给药或者皮下给药的药物组合物，这种药物组合物包括每剂量4毫克到800毫克的化合物(I)或者其药学上可接受的盐和一种药学上可接受的载体，该组合物每日给药一次。在一个方面，所述剂量是20毫克到600毫克。在另一个方面，所述剂量是40毫克到500毫克。在另一个方面，所述剂量是80毫克到400毫克。在另一个方面，所述剂量是120毫克到320毫克。
本发明提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括化合物(I)的甲磺酸盐。
本发明提供了一种药物组合物，其中，所述组合物是被口服给药的。在另一个方面，本发明所述组合物是被静脉内给药的。在另一个方面，本发明所述组合物是被肌肉内给药的。在另一个方面，本发明所述组合物是被皮下给药的。
本发明提供了一种药物组合物，其中，这种药物组合物可以与一种或者一种以上的抗癌治疗剂或者抗癌试剂结合给药。在一个方面，本发明的药物组合物与抗癌试剂吉西他滨结合给药。在另一个方面，本发明的药物组合物与抗癌试剂奥沙利铂(oxaliplatin)结合给药。
本发明提供了一种治疗或者预防一种疾病或者紊乱的方法，该方法包括给药这里所描述的药物组合物，其中，所述疾病或者紊乱选自：癌症、细胞增殖性紊乱、微生物感染、过度增殖性紊乱、黄斑水肿、骨质疏松症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系统机能失调、II型糖尿病、肥胖症、移植排异、听力丧失、中风、动脉硬化症、慢性神经性疼痛、乙型肝炎和自身免疫性疾病。在一个方面，所述疾病或者紊乱是癌症。在一个方面，所述癌症选自肾癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、白血病、卵巢癌、上皮细胞癌和食道癌。在另一个方面，所述癌症选自晚期恶性肿瘤、实性肿瘤、和恶性淋巴瘤。在一个方面，所述疾病或者紊乱是一种细胞增殖性紊乱。在一个方面，所述细胞增殖性紊乱选自银屑病、糖尿病性视网膜病和黄斑变性。在一个方面，所述疾病或者紊乱是一种微生物感染。在一个方面，所述微生物感染选自细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、和病毒感染。在一个方面，所述疾病和紊乱选自过度增殖性紊乱、黄斑水肿、骨质疏松症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系统机能失调、II型糖尿病、肥胖症、移植排异、听力丧失、中风、动脉硬化症、慢性神经性疼痛、乙型肝炎和自身免疫性疾病。
本发明提供了一种调节免疫系统活性的方法，包括给药这里描述的药物组合物。
本发明提供了本发明所述药物组合物在制备用于治疗或者预防一种疾病或者紊乱的药物中的应用，所述疾病或者紊乱选自癌症、细胞增殖性紊乱、微生物感染、过度增殖性紊乱、黄斑水肿、骨质疏松症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系统机能失调、II型糖尿病、肥胖症、移植排异、听力丧失、中风、动脉硬化症、慢性神经性疼痛、乙型肝炎和自身免疫性疾病。在一个方面，所述疾病或者紊乱是癌症。在一个方面，所述癌症选自肾癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、白血病、卵巢癌、上皮细胞癌和食道癌。在另一个方面，所述癌症选自晚期恶性肿瘤、实性肿瘤、和恶性淋巴瘤。在一个方面，所述疾病或者紊乱是一种细胞增殖性紊乱。在一个方面，所述细胞增殖性紊乱选自银屑病、糖尿病性视网膜病和黄斑变性。在一个方面，所述疾病或者紊乱是一种微生物感染。在一个方面，所述微生物感染选自细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、和病毒感染。在一个方面，所述疾病和紊乱选自过度增殖性紊乱、黄斑水肿、骨质疏松症、心血管疾病、眼部疾病、免疫系统机能失调、II型糖尿病、肥胖症、移植排异、听力丧失、中风、动脉硬化症、慢性神经性疼痛、乙型肝炎和自身免疫性疾病。
本发明提供了本发明所述药物组合物在制备用于调节免疫系统活性的药物中的应用。
附图说明
图1A一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对Src自动磷酸化作用的影响；图1B一种图表，指出了在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对Src自动磷酸化作用的影响。
图2A一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对黏着斑激酶磷酸化作用的影响；图2B一种图表，指出在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对黏着斑激酶磷酸化作用的影响。
图3A一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对Shc磷酸化作用的影响；图3B一种图表，指出了在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对Shc磷酸化作用的影响。
图4一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对paxillin磷酸化作用的影响。
图5A一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对caspase-3分裂的影响；图5B一种图表，指出了在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对caspase-3分裂的影响。
图6A一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对总磷酸化酪氨酸水平的影响；图6B一种图表，指出了在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对总磷酸化酪氨酸水平的影响。
图7是一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对血小板衍生生长因子受体(PDGFR)自动磷酸化作用的影响。
图8A是一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对黏着斑激酶自动磷酸化作用的影响；图8B是一种图表，指出了在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对黏着斑激酶自动磷酸化作用的影响。
图9A是一种图表，指出了在c-Src/NIH-3T3细胞中AZ28和化合物(I)对表皮生长因子受体(EGFR)自动磷酸化作用的影响；图9B是一种图表，指出了在HT-29细胞中AZ28和化合物(I)对表皮生长因子受体(EGFR)自动磷酸化作用的影响。
图10A、图10B、图10C和图10D是一系列图表，描述了在全细胞中对Src激酶活性的抑制作用。图10A显示了化合物(I)在c-Src/NIH-3T3细胞中对Src自动磷酸化作用的影响；图10B显示了化合物(I)在HT-29细胞中对Src自动磷酸化作用的影响；图10C显示了在c-Src/NIH-3T3细胞中对Src转磷酸化作用的影响；图10B显示了化合物(I)在HT-29细胞中对Src自动磷酸化作用的影响。
图11是一种描绘全细胞中同达沙替尼相比化合物(I)对蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)选择性的附图。所述达沙替尼是目前在临床试验中广泛使用的腺苷三磷酸-竞争性的Src抑制剂。
图12是一种图表，表示了达沙替尼对达沙替尼和伊马替尼有抵抗性的白血病细胞的影响。
图13是一种图表，表示了化合物(I)对达沙替尼和伊马替尼有抵抗性的白血病细胞的影响。
图14显示了在HT-29细胞中，与达沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生长抑制曲线和GI50值。
图15显示了在SKOV-3细胞中，与达沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生长抑制曲线和GI50值。
图16显示了在A549细胞中，与达沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生长抑制曲线和GI50值。
图17显示了在K562细胞中，与达沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生长抑制曲线和GI50值。
图18显示了在MDA-MB-231细胞中，与达沙替尼(BMS354825)相比，化合物(I)的生长抑制曲线和GI50值。
图19显示了使用5-溴脱氧尿核苷试验测定的Gemzar和化合物(I)的结合在L3.6pl细胞株中的生长抑制曲线和GI50值。
图20显示了使用5-溴脱氧尿核苷试验测定的Gemzar和化合物(I)在L3.6pl细胞株中的生长抑制曲线和GI50值。
图21显示了在不同浓度的化合物(I)中从用于测定体内转移的正位前列腺模型中的得到的肿瘤重量。
图22显示了在以2.5毫克/一剂每日两次、5.0毫克/一剂每日两次和达沙替尼7.5毫克/一剂每天二次治疗之后，第二周IVIS跟踪研究结果。
图23是一种棒状图，显示了抗-HBV效力的筛选结果和细胞毒性。
图24是一种描绘化合物(I)在老鼠异种移植物中口服效力的图表。在HT29(一种人类结肠癌细胞株)老鼠细胞中，化合物(I)比达沙替尼显示了较高的口服效力。
图25A-D显示了每只C57BL/6小鼠在不同的颅内GL261神经胶质瘤幸存者研究治疗组中的重量增加。
图26显示了在不同的颅内GL261神经胶质瘤幸存者研究治疗组中，经过40天时间后每个治疗组小鼠的平均体重。
图27显示了枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen)和化合物(I)在MCF-7细胞中的协同生长抑制效果。
具体实施方式
在下面随后的描述中列出了本发明所述的一种或者多种实施方式的详细内容。尽管在本发明的实践或者检验中可以使用与本发明中所描述的相类似或者等价的任意方法以及物质，但下面描述的是优选的方法以及物质。通过下面的描述，本发明所述的其他特征、目的以及优点将是显而易见的。在下述的具体说明中，除非文章中明确指示，否则所述的单数形式也包括复数。除非特别定义，这里使用到的所有的技术术语以及科技术语与发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。如产生矛盾，将以本说明书为准。这里所提及的所有的出版物、专利申请、专利、以及其他参考文献的全部内容在此引入作为参考。
化合物(I)是一种合成的，具有口服生物利用率和高选择性的Src酪氨酸激酶抑制剂。化合物(I)靶向肽底物结合位点但不向其他已知的Src酪氨酸激酶抑制剂一样靶向三磷酸腺苷的结合位点，因此，在同种类中更为优选。在定义对肿瘤细胞生物活性中，化合物(I)显示出对黏着斑激酶(FAK)、Shc、桩蛋白(Paxillin)的Src-催化的转磷酸化作用和对Src激酶的自动磷酸化作用，具有的IC50在大约20nM。据显示，化合物(I)能够诱导p53表达并刺激Caspase-3和PARP裂解，这些都能导致肿瘤细胞凋亡。
化合物(I)可以有效的治疗多种类型的实体肿瘤细胞型以及许多白血病，包括对伊马替尼和/或达沙替尼具有抵抗力的疾病。与目前正在发展中并且在市场上可以商业购得的Src激酶抑制剂不同，化合物(I)不竞争结合三磷酸腺苷的结合位点。由于他不抑制PDGFR、EGFR、JAK1、JAK2、Lck和ZAP70，因此化合物(I)具有极高的选择性。化合物(I)在抑制Bcr/Abl方面的效力比达沙替尼低10-100倍。由于达沙替尼和伊马替尼甲磺酸盐一起的Bcr/Abl抑制作用以及被证明与心脏毒性有关，因此化合物(I)基本不会引起心脏中毒。
根据体内功效，在HT29细胞(人结肠癌细胞)异种移植鼠模型中，化合物(I)对肿瘤细胞增殖作用的抑制作用比达沙替尼有效5倍。在PC3-MM2(人前列腺癌)原位抑制鼠模型中，化合物(I)对原发瘤的生长和淋巴结的转移显示了强烈的抑制作用。
由于激酶被包含于各式各样正常细胞信号转导途径(例如，细胞生长、细胞鉴别、细胞存活、细胞粘附、细胞迁徙，等等)的调节过程中，通常认为激酶在多种疾病和紊乱中起作用。因此，激酶信号级联的调控可能是一种重要的治疗或者预防这些疾病的方法。这样的疾病和紊乱包括，例如，癌症、骨质疏松症、心血管疾病、免疫系统功能紊乱、II型糖尿病、肥胖症和移植排异反应。
化合物(I)或其药学上可接受的盐能够有效的调控所述的激酶信号级联中的一个成员。许多蛋白激酶以及磷酸酶是已知的，并且它们是治疗学的发展所针对的目标。参见，例如，Hidaka与Kobayashi于1992年的在Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol《药理学与毒性学年鉴》32：377-397中发表的文献；Davies等人于2000年在Biochem.J.《生物化学杂志》351：95-105中发表的文献，上述文献通过引证在此全部并入本文。
激酶中的一个家族——蛋白酪氨酸激酶，被划分为两个大的家族：受体酪氨酸激酶，或者表示为RTK(例如，胰岛素受体激酶(IRK)，表皮生长因子受体(EGFR)，成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，血管内皮生长因子受体(VEGFR-2或者Flk 1/KDR)，以及神经生长因子受体(NGFR))，以及非受体酪氨酸激酶，或者表示为NRTK(例如，Src家族(Src，Fyn，Yes，Blk，Yrk，Fgr，Hck，Lck，以及Lyn)，Fak，Jak，Abl以及Zap 70)。参见，例如，Parang与Sun于2005年在Expert Opin.Ther.Patents《治疗学专利的专家观点》15：1183-1207中发表的文献，上述文献通过引证在此全部并入本文。
由于Src激酶在各种癌症中所起到的作用，这些激酶成为许多研究的学科，这些研究涉及Src抑制剂作为癌症治疗剂的进展，包括高度转移的癌症细胞的生长。寻找Src抑制剂作为各种癌症的治疗剂，这些癌症包括，例如，结肠癌，癌症前期的结肠病变，卵巢癌，乳腺癌，上皮癌，食道癌，非小细胞肺癌，胰腺癌，以及其他癌症。参见，例如，Frame于2002年在Biochim.Biophys.Acta《生物物理学报》1602：114-130中发表的文献，以及Parang与Sun于2005年在Expert Opin.Ther.Patents《治疗学专利的专家观点》15：1183-1207中发表的文献。
可以将对于其他激酶的抑制用于治疗以及调控其他类型的疾病以及障碍。例如，可以通过给药血管内皮生长因子(VEGF)受体酪氨酸激酶抑制剂来抑制或者预防各种眼部疾病。酪氨酸磷酸酶PTP-1B和/或糖原磷酸化酶的抑制剂能够为II型糖尿病或者肥胖提供治疗。p561ck抑制剂能够有效的治疗免疫系统障碍。其他的靶位包括人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶，血栓素合成酶，表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFRTK)，p55fyn，等等。
化合物(I)可以是在Src肽底物位点发生结合的Src信号抑制剂。在c-Src(527F，组成性激活及转化)转化的NIH3T3细胞以及人类结肠癌细胞(HT29)中对本发明化合物(I)的活性进行了研究。例如，在这些细胞系中，化合物(I)表现出以一种剂量依赖的形式降低了已知Src蛋白底物的磷酸化水平，并且与生长抑制效应建立了良好的关联。
尽管不希望受到理论的限制，但可以确信在细胞外的某些激酶(例如，Src)的构象与细胞内的构象存在显著的差别，因为在细胞内，许多激酶被包埋在多蛋白信号复合体中。因此，由于在分离的激酶中不能很好的形成所述的肽底物结合位点(如Src X-射线结构所示)，可以确信肽底物结合抑制剂对于分离的激酶的活性而言应当是微弱的。在分离的激酶检测中，在这一位点上发生结合要求所述的抑制剂捕获到非常少量的完整蛋白质，所述的完整蛋白质在分离的酶检测中在细胞内具有同样的构象。为了能够被探测到，需要大量过量的抑制剂来消耗所述的大量的酶，其中所述的酶来自于所述检测的催化性循环。
然而，对于基于细胞的检测而言，由于可以预期能够形成所述的肽结合位点，因而不需要大量过量的抑制剂。在基于细胞的Src检测中，SH2&SH3结构域结合蛋白已经改变了所述Src的构象，因而所述的肽底物结合位点已经完全形成。因此，低浓度的所述抑制剂能够除去来自于所述催化性循环的酶，因为所有的酶都呈现出紧密结合的构象。
绝大多数的已知的激酶抑制剂都是ATP(三磷酸腺苷)竞争性的，并且在一组分离的激酶检测中表现出较差的选择性。然而，本发明中所述的化合物(I)被认为是肽底物结合抑制剂。因此，针对分离的酶例如Src的传统的高生产量的化合物的筛选不会导致本发明所述化合物(I)的发现。
近来有相当多的文献支持这样的观点：以pp60c-src(Src)为靶向，是一种具有广泛用途的癌症治疗方法，且不会产生严重的毒性。例如，那些显示出增强的表皮生长因子(EGF)受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)信号、或者过表达所述相关的Her-2/neu受体的肿瘤，具有组成性激活的Src以及增强的肿瘤入侵性。对于这些细胞中的Src的抑制诱发生长停滞，引发细胞凋亡，并且翻转了转化了的表型(参见Karni等人(于1999年)在Oncogene《致癌基因》18(33)：4654-4662中发表的文献)。已知Src活性的异常升高使得转化细胞以锚定不依赖性的形式进行生长。这显然是由于胞外基质信号以等同于有丝分裂信号的形式增强了FAK(黏着斑激酶)/Src途径中的Src活性，并且从而阻碍了本应正常被激活的细胞凋亡机制。因此在肿瘤细胞中进行FAK/Src的抑制能够诱发细胞凋亡，因为本应在从所述的胞外基质中被释放出来之后才被正常激活的细胞凋亡机制被引发了(参见Hisano等人(于1997年)在Proc.Annu.Meet.Am.Assoc.Cancer Res.38：A1925中发表的文献)。此外，在Src受到抑制时注意到血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达减弱，并且来自于这些Src抑制细胞系的肿瘤表现出向生成血管方向的发展的减弱(参见Ellis等人(于1998年)在Journal ofBiological Chemistry《生物化学杂志》273(2)：1052-1057中发表的文献)。
例如，大鼠的Src基因的剔除仅会导致一种缺陷，即破骨细胞不能够形成皱褶缘并且因此不能进行骨的再吸收。然而，通过在这些大鼠中插入激酶缺陷性Src基因，能够挽救所述破骨细胞的骨的再吸收功能(参见Schwartzberg等人(于1997年)在Genes&Development《基因的研究发展》11：2835-2844中发表的文献)。这表明可以在不引发仅已知的毒性的前提下在体内对Src激酶的活性进行抑制，这是因为所述的Src蛋白的存在显然足以补充并且激活存在于以破骨细胞为主的信号复合体(osteoclast essential signaling complex)中的其他蛋白酪氨酸激酶(这些蛋白酪氨酸激酶对于维持破骨细胞的功能而言是必不可少的)。
由于已经发现在越来越多的人类肿瘤中存在Src的过度活化，已经提议将Src作为癌症治疗中的“通用”靶位(参见Levitzki(于1996年)在Current Opinion in Cell Biology《细胞生物学的现代主张》8，239-244中发表的文献；Levitzki(于1996年)在Anti-Cancer DrugDesign《抗癌症药物的设计》11，175-182中发表的文献)。对于Src的抑制在癌症治疗方面所产生的可能的效益是由自分泌生长因子环作用所引发的对于不受控制的细胞生长的抑制所产生的效益的四倍，是当从所述细胞基质中逃离后引发细胞凋亡而导致的对于转移的抑制所产生的效益的四倍，是经由降低的血管内皮生长因子(VEGF)水平以及低毒性所形成的对于肿瘤的血管生成作用的抑制所产生的效益的四倍。
据报道，前列腺癌细胞中同时含有过表达的桩蛋白以及p130cas，并且是过度磷酸化的(参见Tremblay等人于1996年在Int.J.Cancer《癌症研究杂志》68，164-171中发表的文献)，其因此可以作为Src抑制剂的首要靶位。
在某些实施方案中，所述癌症的类型包括实体肿瘤和非实体肿瘤。在特定的实施方案中，所述实体肿瘤选自CNS(中枢神经系统)肿瘤、肝癌、大肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、头部和颈部肿瘤、外阴癌和皮肤赘生物包括恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌。在其他的实施方案中，非实体瘤包括淋巴增殖性疾病，所述淋巴增殖性疾病包括白血病和淋巴瘤。在其他的实施方案中，所述疾病是转移性疾病。
如下表所示，本发明化合物(I)表现了广泛的实体肿瘤活性。
本发明的化合物(I)还可以与一种或者一种以上的抗癌疗法和/或一种或一种以上抗癌制剂结合使用用于治疗癌症或者细胞增殖性疾病，所述抗癌疗法例如放射疗法，所述一种或一种以上的抗癌制剂选自由抗增生性试剂、细胞毒剂、细胞生长抑制剂、和化学治疗剂及其盐和衍生物所组成的组中。根据某些实施方案，本发明化合物(I)可以与任意一种药物相结合用于治疗一种癌症或者细胞增殖紊乱，所述药物选自由一种生物碱、烷基化剂、抗肿瘤抗生素、代谢拮抗剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、核苷类似物、多药抵抗性转换剂、DNA接合剂、微管结合药物、毒素和一种DNA拮抗物所组成的组中。本发明所属领域普通技术人员可以识别如上所述被分为一种或一种以上特定化学治疗剂种类的化学治疗剂。
根据优选的实施方案，本发明化合物(I)可以与一种或者一种以上试剂结合使用用于治疗一种癌症或者细胞增殖紊乱，所述试剂选自由代谢拮抗剂(例如，吉西他滨(gemcitabine))、局部异构酶I和II的抑制剂、烷基化剂和微管抑制剂(例如，红豆杉醇)，以及酪氨酸激酶抑制剂(例如，surafenib)、表皮生长因子激酶抑制剂(例如，特罗凯(tarceva)或者厄洛替尼(erlotinib)、铂复合物(例如，奥沙利铂(oxaliplatin))；和ABL激酶抑制剂(例如，格列卫(Gleevec)或者甲磺酸伊马替尼(Imatinib))所组成的组中。
生物碱包括，但是不局限于，多西他塞(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)、紫杉醇(紫杉酚)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、长春花碱(vinblastine)、长春花新碱、去乙酰长春酰胺(vindesine)。
烷基化剂包括，但是不局限于，白血福恩(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌酰硫烷(piposulfan)、苯佐替派(benzodepa)、5-双乙撑亚胺3-6-甲对苯醌(carboquone)、双二甲磷酰胺乙酯(meturedepa)、双氮丙啶膦酰氨甲酸乙酯(uredepa)、六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯亚胺三嗪、三亚乙基磷酰胺、三乙基三磷酸胺、苯丁酸氮芥、chloranaphazine、环磷酰胺(cyclophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐、苯丙氨酸氮芥novemebichin、培磷酰胺胆甾醇对苯乙酸氮芥、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、亚硝脲氮芥(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、环己亚硝脲(lomustine)、嘧啶亚硝脲(nimustine)、甲基环己亚硝脲雷莫司汀、氮烯唑胺(dacarbazine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、二溴卫矛醇(mitolactol)、双溴丙基哌嗪(pipobroman)、替莫唑胺(temozolomide)。
抗生素及其类似物包括，但是不局限于，阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮乙酰丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、卡柔比星、嗜癌菌素、cromomycins、放线菌素、道诺红菌素、6-重氮基-5-氧-l-正亮氨酸、亚德里亚霉素、表柔比星、伊达比星、美诺立尔(menogaril)、丝裂霉素、麦可酚酸(mycophenolic acid)、nogalamycine、橄榄霉素(olivomycins)、匹来霉素(peplomycin)、吡喃阿霉素(pirarubicin)、光辉霉素(plicamycin)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycine)、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素(tubercidin)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)。
代谢拮抗剂包括但是不局限于，二甲叶酸(denopterin)、依达曲沙(edatrexate)、6巯基嘌呤(6-MP)、氨甲蝶呤、吡曲克辛(piritrexim)、蝶罗呤(pteropterin)、脱氧助间型霉素(2′-DCF)、雷替曲塞(tomudex)、三甲曲沙(trimetrexate)、cladridine、氟达拉滨(fludarabine)、硝咪硫鸟嘌呤(thiamiprine)、环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶核苷、carmoftir、阿拉伯胞嘧啶糖苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、乙嘧替氟(emitefur)、5-氟脱氧尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、替加氟(tegafur)、羟基尿素(hydroxyurea)和氨基甲酸乙酯(urethan)。
铂复合物包括但是不局限于，卡铂(Caroplatin)、顺铂、米帕(miboplatin)、奥沙利铂。
抗有丝分裂试剂或者微管接合剂包括但是不局限于，长春花新碱(vincristine)和长春花碱(vinblastine)和紫杉酚。
当与其他的抗增生试剂一起使用时，本发明化合物(I)可以提高(例如，协同增效)这些制剂的活性。进一步地，这些协同增效作用能够使本发明化合物(I)、其他的抗增生试剂或者他们两者都以比较低的剂量给药，和/或可以显著地提高任意给定的剂量下所述化合物的抗增生性质。下表提供了使用本发明化合物(I)和其他的抗增生试剂联合治疗的结果。
在一个实施方案中，化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用于治疗、预防或者缓解宿主所患有的脑部癌症。在本发明的另一个方面，本发明包括本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或者预防或者防止主题患上脑部癌症的药物中的应用。为了预防或者防止患上脑部癌症，化合物(I)及其药学上可接受的盐在宿主发展成脑部癌症之前给药。作为选择，本发明所述化合物可以用来在宿主中治疗脑部癌症。用于治疗、预防或者缓解宿主所患有的脑部癌症的化合物(I)或其药学上可接受的盐可以被包括在激酶信号级联的调节过程中，例如，一种激酶抑制剂、一种非三磷酸腺苷竞争性抑制剂、一种酪氨酸激酶抑制剂、一种蛋白激酶磷酸酶抑制剂或者一种蛋白质-酪氨酸磷酸盐1B抑制剂。
术语“脑部癌症”包括多种癌症。可以使起源于脑本身的实体脑肿瘤，例如本领域已知的几种原发性脑癌。术语“脑部癌症”涉及恶性肿瘤，即，侵略性的生长并蔓延、通过占领健康细胞的空间或吸收健康细胞血液和养分而压倒健康细胞的肿瘤。不会侵略性蔓延的肿瘤叫做良性肿瘤。良性肿瘤的严重性通常要小于恶性肿瘤，但是良性肿瘤也会在脑部产生问题。也可以是转移性脑瘤，代表其他癌症传播到脑部，例如，肺部肿瘤或者乳房肿瘤传播到脑部。
通过形成脑部肿瘤的脑部细胞和在显微镜下肿瘤的外观可以将脑部肿瘤进行分类。原发性脑肿瘤起因于任意脑部肿瘤，或者脑部的特点结构。GHa细胞支持脑部神经元，起源于这些细胞的肿瘤叫做神经胶质瘤。脑周围的脑膜也可以发展成肿瘤，这些肿瘤叫做脑膜瘤。包括在脑其他结构中的其他类型的肿瘤包括室管膜瘤。最常见的原发性脑肿瘤是神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤和原发性神经外胚叶瘤(髓质母细胞瘤)。
本发明提供了一种治疗、预防或者缓解所患有的恶性胶质瘤的方法，恶性胶质瘤是一种恶性的、快速生长的中枢神经系统星形细胞瘤，通常可以是大脑半球的星形细胞瘤。恶性胶质瘤的同义词包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)、巨细胞恶性胶质瘤、和多形性恶性胶质瘤。恶性胶质瘤是最常见的恶性原发性脑部肿瘤，并且已经证实很难被治疗。这些肿瘤常常侵略并渗透周围的脑组织。恶性胶质瘤由胶质细胞而产生，胶质细胞存在于脑部和脊髓中，是一种能够形成包围并保护其他神经细胞的组织的细胞。恶性胶质瘤主要由星形交织细胞组成，星形的胶质细胞叫星形胶质细胞。术语“神经胶质瘤”包括任意类型的脑部肿瘤，例如，星形细胞瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤。根据细胞复制速度和渗透附近组织的可能性，星形细胞瘤可以被归为四个等级。第一等级(等级I)或者第二等级(等级II)的星形细胞瘤是非恶性细胞瘤，被认为是低等级的星形细胞瘤。第三等级(等级III)和第四等级(等级IV)的星形细胞瘤是恶性的并且被认为是高等级的星形细胞瘤。等级II的星形细胞瘤被称为间变性星形细胞瘤。等级IV的星形细胞瘤被称为多形性胶质母细胞瘤。
本发明提供了治疗、预防或者缓解所患有的成神经管细胞瘤的方法。成神经管细胞瘤是一种非常恶性的原发性脑部肿瘤，起源于小脑或者后颅窝。原来认为成神经管细胞瘤是一种神经胶质瘤，但是现在已经知道，成神经管细胞瘤是头部原发性神经外胚叶瘤(PNET)家族的一种。
由于存在于骨幕之下，发生于小脑的肿瘤被认为是幕下肿瘤，骨幕是将脑部的大脑半球与小脑分离的厚膜。成神经管细胞瘤的另一个属于是幕下原发性神经外胚叶瘤(PNET)。成神经管细胞瘤是发生于脑部的最常见的原发性神经外胚叶瘤(PNET)。脑部所有的原发性神经外胚叶瘤(PNET)都是侵入性的且生长快速的肿瘤，与大部分脑部肿瘤不同，脑部的原发性神经外胚叶瘤(PNET)通过脑脊髓液(CSF)传播并且常常转移到脑部和脊柱不同的位置。最容易发生成神经管细胞瘤的年龄是7岁。百分之七十的成神经管细胞瘤发生于16岁以下的少年。成人尤其容易患有促结缔组织增生的成神经管细胞瘤，这类肿瘤很少发生在50岁以上的人群中。
本发明提供了用于治疗、预防或者缓解所患有的成神经细胞瘤的方法，成神经细胞瘤是在神经组织中形成的癌症。成神经细胞瘤细胞通常与胚胎或者胎儿中发现的最初发展的神经细胞非常类似。属于神经(neuro)表示“神经(nerves)”，而术语“胚细胞瘤”是指感染不成熟或者发展中细胞的癌症。神经元(神经细胞)是脑和脊髓的主要组成部分，也是将脑和脊髓与身体其他部分连接在一起的神经的主要组成部分。成神经细胞瘤通常开始于肾上腺，同时也可以开始于脊髓。成神经细胞瘤是儿童期最常见的颅外实体癌症。在2007年，成神经细胞瘤是婴儿期最常见的癌症，在美国每年的新增的发病率大约为650。接近百分之五十的成神经细胞瘤病例发生在两岁以下的孩子身上。成神经细胞瘤是一种神经内分泌肿瘤，起源于交感神经系统或者SNS的任意神经脊原因。作为自主神经系统的一束，交感神经系统(SNS)是一种利用脑及身体信息并负责战逃反应(fight-or-flight response)”的神经网络，能够产生肾上腺素(adrenaline)或者肾上腺素(epinephrine)。
本发明提供了用于治疗、预防或者缓解所患有的神经上皮瘤的方法，所述神经上皮瘤是神经上皮的恶性肿瘤。神经上皮瘤通常发现在孩子和年轻的成人中。神经上皮瘤最经常发生在胸腔壁、骨盆中，或者比较少见的，发生在骨骼或者软组织中。用于诊断的过程可以包括血液检查和尿液检查，感染骨骼的X射线以及全身和肺部、骨髓吸引术、CT检查和荧光检查。治疗方法包括外科疗法、放射疗法和化学疗法。尤因氏肉瘤是一类外周神经上皮瘤的实施例。
激酶已经显示出对脑部癌症发生作用。多形性胶质母细胞瘤的基因表达曲线已经显示了酪氨酸激酶对神经胶质瘤的转移/侵入所起到的作用。例如，PYK2是一种非受体酪氨酸激酶的黏着斑族成员；他与成纤维细胞外围发生的由Src-诱导增加的肌动蛋白的聚合作用密切相关。根据在培养过程中PYK2诱导的恶性胶质瘤的细胞迁移作用的过表达，PYK2对神经胶质瘤转移/侵入的作用变得更加清楚。PYK2的活化水平与四种恶性胶质瘤细胞系(SF767、Gl 12、T98G和Ul 18)的转移表型正向相关。对多形性胶质母细胞瘤(GBM)原地侵入过程中活化的PYK2的分析显示了在渗透性多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中的强烈染色(参见Hoelzinger et al，Neoplasia，vol.7(1)7-16)。因此，使用化合物(I)或其药学上可接受的盐对激酶受体进行调节可以有效用于治疗、预防或者防止患有脑部癌症，例如多形性胶质母细胞瘤。
做为选择，化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用于治疗、预防或者防止宿主患有肾脏癌症。本发明的另一个方面包括本发明所述化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解所患有的肾脏癌症的药物中的应用。为了预防或者防止患有肾脏癌症，化合物(I)或者其药学上可接受的盐可以在宿主发展成肾脏癌症之前被给药。作为选择，化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用来治疗宿主患有的肾脏癌症。
肾脏可以发生几种类型的癌症。肾细胞癌(RCC)是最常见的形式，大约85％的肾脏癌症是肾细胞癌(RCC)。本发明提供了预防或者治疗肾细胞癌(RCC)的方法。本发明也提供了预防或者治疗其他类型的肾脏癌症的方法，其他类型的肾脏癌症包括，例如，肾盂癌(在肾脏中收集尿液的位置中心处形成的癌症)；肾胚细胞瘤，肾胚细胞瘤是通常在5岁以下儿童体内发生的肾脏癌症；明细胞癌，也叫做明细胞腺癌和中肾瘤(通常发生在女性生殖道的一种肿瘤类型，在显微镜下观察这种肿瘤的细胞时，可以清楚的看到这些细胞的内部)；肾腺癌(一种肾脏肿瘤的类型，其特点为在至少一些肿瘤上发生指状投影)；和肾横纹肌肉瘤，肾横纹肌肉瘤是一种罕见的高侵略性的肿瘤，常常发生在成年群体中。
在肾细胞癌(RCC)中，癌(恶性)细胞在肾小管线中生长并发展成肿瘤块。虽然在一个和两个肾脏内部可以产生一个以上肿瘤，但在大多数情况下，只有单一的肿瘤产生。肾细胞癌(RCC)的特点在于缺乏早期危险体征、具有多变的临床表现、对放射物和化学疗法有抵抗力、并且是罕见的而且对于免疫治疗试剂，例如干扰素α和白细胞间介素(IL)-2是可再生的。在过去，肾细胞癌(RCC)肿瘤被认为衍生自肾上腺体；因此，也经常使用术语“肾上腺样瘤”。
肾细胞癌的组织起源是最接近的肾小管上皮组织。肾脏癌症或者是间歇性(非遗传性)形式或者是遗传性形式，这两种形式都与染色体3短臂(3p)的结构变化有关。对高风险患有肾脏癌症的家族进行遗传研究，克隆其变种会导致肿瘤形成的基因。这些基因既是肿瘤抑制基因(VHL，TSC)也是致癌基因(MET)。已经识别出至少4种遗传性综合症与肾细胞癌有关：(1)冯希佩尔一林道综合症(von Hippel-Lindau(VHL))，(2)遗传性的乳头状肾脏癌(HPRC)，(3)与Birt-Hogg-Dube综合症(BHDS)有关的家族性肾嗜酸粒细胞腺瘤(FRO)和(4)遗传性肾脏癌(HRC)。
肾细胞癌(RCC)很难预测，主要因为，在将近30％的具有局部疾病的病人中，40％的病人在除去原发性肿瘤后肿瘤发生远距离的转移。肾细胞癌的发病年龄每年上涨3％。根据美国癌症学会的数据显示，在2007年，美国诊断出大约51,500例肾脏恶性肿瘤病例，其中，大约12,500例死亡；肾细胞癌占这些发病率和死亡率的80％。根治性肾切除术是局部肾细胞癌(RCC)的主要治疗方法。然后放射治疗和可利用的化学治疗剂对恶化并转移的肾细胞癌(RCC)无效。
使用干扰素-α和白细胞介素(interluckin)-2进行免疫治疗只对小部分患有转移性肾细胞癌(RCC)的病人有效，并且毒性是非常大的。最近，已经开发了很多激酶抑制剂用于治疗肾脏癌症，例如格列卫(Gleevec)及其他新型试剂，例如，索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)，这些激酶抑制剂通过靶向多重受体激酶起到抗血管生成作用，对免疫治疗不起作用的病人显示活性。但是，这些治疗方法并不是没有限制的。例如，已经发现，格列卫(Gleevec)的作用仅限于某种类型的肿瘤并且也可以发展出抗药性。同时，有人建议病人在服用舒尼替尼(sunitinib)时应当注意监视心血管的副作用，例如，高血压。同时，对治疗并预防肾脏癌症的方法存在改进的需要。
作为选择，本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用于治疗、预防或者防止宿主患有肝脏癌症。本发明的另一个方面包括本发明所述化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解所患有的肝脏癌症的药物中的应用。为了预防或者防止患有肝脏癌症，化合物(I)或者其药学上可接受的盐可以在宿主发展成肝脏癌症之前被给药。作为选择，化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用来治疗宿主患有的肝脏癌症。
在肝脏中可以发展出几种类型的癌症。肝细胞性肝癌(HCC)占所有肝脏癌症的80-90％。本发明提供了一种治疗或者预防肝细胞性肝癌的方法肝细胞性肝癌(HCC)开始于肝细胞中，肝细胞是肝脏细胞的主要类型。大约四分之三的原发性肝癌属于这种类型。肝细胞性肝癌(HCC)具有不同的生长方式。其中一些开始于逐渐长大的单一肿瘤。只在疾病末期的时候波及到肝脏的其他部分。肝细胞性肝癌(HCC)还可以同时在肝脏的许多位点开始，并且不会只生成单一肿瘤。
本发明还提供了用于治疗其他种类的肝脏癌症的方法，其他种类的肝脏癌症包括，例如，肝胆管型肝癌，肝胆管型肝癌开始于胆的胆管中；血管肉瘤和血管内皮瘤也是两种其他类型的癌症，开始于肝脏的血管中。这些肿瘤生长十分快速。通常在发现他们的时候，他们已经开始散布，手术切除和治疗并不会产生很大帮助；肝胚细胞瘤是一种产生在孩子身上的癌症，通产发生于四岁以下的儿童身上。
已经显示出激酶在肝脏癌症中发挥作用。例如，已知存在在人类肝细胞性肝癌(HCC)中的变化是原癌基因致癌基因(MET)的过表达、扩增或者突变，致癌基因(MET)编码酪氨酸激酶致癌基因(MET)的受体蛋白(参见，Tward et al.，PNAS，vol.104(37)14771-14776)。同时，已经显示在体外和体内的液体流动条件下，FAK被包含于整合素调节的癌细胞粘附和循环的早期事件中。人们认为激酶可能参与固定的粘附相互作用的建立过程中，所述固定的粘附相互作用能够使附着的肿瘤细胞抵抗剪切力(参见，Sengbusch et al.，AmericanJournal of Pathology，vol166(2)585-595)。在2007年，肝脏癌症是世界范围内由癌症导致死亡的第三大主要原因，是世界上第六大最常见的癌症。世界范围内每年有600,000人呗确诊患上肝脏癌症，且此发病率呈上升趋势。因此，对于治疗、预防或者防止肝脏癌症发生的方法存在改进的需要。
根据本发明另一个实施方案，本发明提供了一种用于治疗、预防或者防止宿主患有白血病的方法，所述方法包括对病人给药本发明所述化合物(I)。在其他的实施方案中，本发明提供了一种治疗白血病的方法，包括向宿主给药一种治疗有效量的本发明化合物(I)和至少一种其他的治疗剂，所述治疗剂选自由抗增生试剂、细胞毒剂、细胞生长抑制剂和化学治疗剂及其盐或者衍生物所组成的组中。根据某些实施方案，本发明化合物可以与一种或一种以上药物联合使用，用于治疗宿主白血病，所述药物选自由生物碱、烷基化剂、抗肿瘤抗生素、代谢拮抗剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、一种核苷类似物、一种多药抵抗性转换剂、一种DNA接合剂、微管结合药物、一种毒素和一种DNA拮抗物所组成的组中。本发明所属领域普通技术人员可以识别如上所述被分为一种或一种以上特定化学治疗剂种类的化学治疗剂。
白血病是一种骨髓和血液的恶性肿瘤，其以不受控制的血细胞生长为特点。白血病通常被分为四种类型：急性或慢性髓细胞性白血病和急性或慢性淋巴细胞性白血病，其中急性或慢性髓细胞性白血病包括骨髓髓元素(白细胞，红细胞，巨核细胞)的白血病，急性或慢性淋巴细胞性白血病包括淋巴腺细胞白血病。白血病的治疗一般取决于白血病的类型。白血病的标准治疗方法通常涉及化疗和/或骨髓移植和/或放射治疗。见例如，美国专利号6645972的公开，该专利在此通过引证全部并入本文。
白血病的化学疗法可以包括两个或两个以上的抗癌药物的结合使用。目前大约40种不同的药物用于治疗白血病，这些药物可以单独使用，也可以结合使用。其他治疗白血病的方法还包括多药耐药性的转换，该方法包括使用一种试剂，这种试剂能够降低恶性细胞所受到的化疗药物的破坏性影响(并导致难治或复发)的机制；和生物治疗法，包括使用单克隆抗体，在单克隆抗体中，毒素附着在一种抗体上，这种抗体与恶性细胞所携带的互补抗原发生反应；和细胞因子(例如，干扰素、白细胞介素、细胞集落刺激因子(CSFs))，细胞因子是一种自然产生的化学物质，能够刺激血细胞的生成并帮助治疗后快速恢复血细胞计数。这些药物的例子包括多药耐药性转向剂PSC833、单克隆抗体美罗华(Rituxan)和以下细胞因子：促红细胞生长素(Erythropoetin)和红细胞生成素，这些细胞因子能够刺激生产红细胞；G-CSF、GM-CSF、非格司亭(filgrastim)和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Sargramostim)，和重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子能够刺激生产白色细胞；和刺激生产的血小板的血小板生成素。
已经发现许多核苷类似物都具有抗癌活性。核苷类似物的例子包括阿拉伯胞嘧啶糖苷、氟达拉滨(Fludarabine)、吉西他滨(Gemcitabine)和克拉曲滨(Cladribine)，这些核苷类似物是目前在治疗白血病白血病过程中使用的重要药物。β-L-OddC((-)-β-L-二氧戊环-胞嘧啶核苷、曲沙他滨(购自Shire生物化学股份有限公司)也是一种核苷类似物，这种核苷类似物首先是有Belleau等人作为一种抗病毒剂而公开的(欧洲专利第337713号，该专利通过引证在此全部并入本文)并且能够表现出具有有效的抗癌活性(参见文献：K.L.Grove et al.，Cancer Res.(癌症研究)，55(14)，3008-11，1995；K.L.Grove etal.，Cancer Res.(癌症研究)，56(18)，4187-4191，1996，K.L.Grove et al.，NucleosidesNucleotides(核苷核苷酸)，16：1229-33，1997；S.A Kadhim et al.，Can.Cancer Res.，57(21)，4803-10，1997)。在临床研究中，已经有报道证明β-L-OddC对白血病病人具有显著的活性(参见Giles et al.，J.Clin.Oncology，VoI 19，No 3，2001)。
Bcr-AbI酪氨酸激酶抑制剂，例如STI-571(格列卫伊马替尼甲磺酸盐，购自诺华(Novartis)制药有限公司)，已经显示出重要的抗白血病活性且尤其适用于慢性粒细胞白血病。例如STI-571已经成为靶向Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制作用的病人的一种很有前途的治疗方法。然而，虽然具有重要的血液学和细胞发生反应，但仍然会产生对Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂的抵抗性，尤其在慢性粒性白血病发展阶段。对于Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(lmatinib)、达沙替尼(Dasatinib)、AZD0530。
因此，对用于治疗之前已经用Bcr-Abl酪氨酸抑制剂治疗过并对Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂产生抗药性的白血病病人的药物的发展还存在很大的需要。因此，在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗宿主白血病的方法，该方法包括对之前已经用Bcr-Abl酪氨酸抑制剂治疗过并对Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂产生抗药性的白血病病人给药一种治疗有效量的本发明所述化合物(I)。进一步地，本发明提供了一种用于联合给药治疗宿主体内白血病的方法，该方法包括对病人联合给药Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂和治疗有效量的本发明所述化合物(I)。在一种优选的实施方案中，所述联合给药是向已经用Bcr-Abl酪氨酸抑制剂治疗过并对Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂治疗方法产生抗药性的白血病病人给药。
如下表所示与现有的治疗剂相比，本发明化合物(I)显示抗白血病活性。
本发明所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以用来治疗其他与细胞增殖有关的疾病，例如，银屑病(psoriases)。
如这里所述，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗、预防或者缓解宿主所患有的听力丧失。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解宿主所患有的听力丧失的药物中的应用。为了预防或者防止患上听力丧失，所述化合物可以在噪声接触之前给药或者在接触到导致听力丧失的药物之前给药。这样的药物包括化学治疗药物(例如，靶向毛细胞的以铂为基础的药物)和氨基糖苷类抗生素。本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可以与某些抗癌药物一起提供一种协同效应(增效效应)。例如，可以通过主要人类肿瘤组织试验可以筛选到促进抑制剂，尤其可以寻找到与其他已知的抗癌药物具有的协同作用。另外，所述蛋白激酶抑制剂还可以减少某些抗癌药物的毒性(例如，对耳蜗和肾脏有毒的以铂为基础的药物)，从而允许剂量增加。
做为选择，本发明的化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗宿主的听力丧失。在这个实施方案中，在开始出现听力丧失之后给药本发明化合物，从而减少听力丧失水平。本发明的化合物(I)及其药学上可接受的盐还可能涉及激酶级联的调控，例如一种激酶抑制剂、一种非腺苷三磷酸竞争性抑制剂、一种酪氨酸激酶抑制剂、一种Src抑制剂或者一种黏着斑激酶(FAK)调节剂。虽然不希望局限于任何理论，但是普遍相信，给药激酶抑制剂能够预防耳蜗毛细胞的细胞凋亡，从而预防听力丧失。在一个实施方案中，对患有听力丧失的宿主给药本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐从而预防进一步的听力丧失。在另一个实施方案中，对患有听力丧失的宿主给药本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐，从而恢复损失的听力。尤其是，在噪声接触之后，耳蜗毛细胞之间紧密的细胞结合点以及细胞-细胞外基质的相互作用被破坏并处于紧张状态。这些紧密的细胞接合点的紧张状态通过一种复杂的信号导致细胞中的细胞凋亡，在所述复杂的信号途径中，酪氨酸激酶作为分子开关，对黏着斑激酶有影响，从而将细胞基质分裂信号传递到细胞核。普遍相信，给药激酶抑制剂能够预防在这些级联中发生的细胞凋亡。
对于暴露于噪声中的耳蜗中发生的细胞凋亡的识别，为噪声诱发的听力丧失(NIHL)的预防提供了许多种新的可能(参见Hu等人于2000年在Acta.Otolaryngol.120，19-24中发表的文献)。例如，在耳朵的圆窗处给药抗氧化药物，能够保护耳朵免受噪声诱发的听力丧失(NIHL)(参见Hight等人于2003年在Hear.Res.《耳朵研究》179，21-32中发表的文献；Hu等人在Hear.Res.《耳朵研究》113，198-206中发表的文献)。具体的，在南美栗鼠体内给药FDA(食品及药品管理局)认可的抗氧化化合物(N-L-乙酰半胱氨酸(L-NAC)以及水杨酸盐)能够减轻噪声诱发的听力丧失(参见Kopke等人于2000年在Hear.Res.《耳朵研究》149，138-146中发表的文献)。此外，Harris等人近期描述了利用Src-蛋白酪氨酸激酶抑制剂预防噪声诱发的听力丧失(NIHL)(参见Harris等人于2005年在Hear.Res.《耳朵研究》208，14-25中发表的文献)。因此，可以设想，给药本发明所述的调控激酶活性的化合物能够有效的治疗听力丧失。
细胞粘着或者细胞压力的改变能够通过整联蛋白的激活以及蛋白酪氨酸激酶的磷酸化作用激活各种信号，其中所述的蛋白酪氨酸激酶包括Src家族酪氨酸激酶。Src的相互作用与修饰细胞骨架的信号途径发生关联，并且激活了各种蛋白激酶级联，这些蛋白激酶级联控制细胞的存活以及基因的转录(参见Giancotti与Ruoslahti于1999年在Science《科学》285，1028-1032中发表的文献)。事实上，近来的研究结果已经表明，耳蜗外毛细胞(OHC)在被暴露于强烈的噪声中之后在所述的细胞底部发生分离，经受凋亡细胞的死亡。具体的，已经认为在代谢作用诱发的以及机械作用诱发的耳蜗感官细胞的细胞凋亡的发生中均涉及到所述的Src蛋白酪氨酸激酶信号级联。在一项最近的研究中，Src抑制剂为免受4小时、106dB的4kHz的倍频带噪声的影响提供了防护，这表明在被暴露于噪声中之后，耳蜗外毛细胞中的Src蛋白酪氨酸激酶可能被激活了(参见Harris等人于2005年在Hear.Res.《耳朵研究》208，14-25中发表的文献)。因此，本发明所述的能够调控Src活性的化合物能够有效的用于治疗听力丧失。
本发明涉及治疗、预防或者缓解宿主所患有的骨质疏松症的方法。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解宿主所患有的骨质疏松症的药物中的应用。所述方法包括向宿主给药有效量的本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐，从而治疗、预防或者缓解宿主所患有的骨质疏松症。为了治疗、预防或者缓解宿主所患有的骨质疏松症，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在发展为骨质疏松症之前给药。做为选择，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗宿主的骨质疏松症。在这个实施方案中，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在骨质疏松症开始之后被给药给宿主，从而减少骨质疏松程度。
已经证明，Src的缺陷与大鼠的骨质疏松症相关，这是由于破骨细胞的功能缺失导致的(参见Soriano等人于1991年在Cell《细胞》64，693-702中发表的文献)。已知缺乏白细胞介素-1受体相关性激酶M(IRAK-M)的大鼠发展成为严重的骨质疏松症，这与破骨细胞的加速分化、破骨细胞的半衰期的增大、以及它们的活化相关(参见Hongmei等人于2005年在J.Exp.Med.《药学专家杂志》201，1169-1177中发表的文献)。
多核破骨细胞来自于单核噬菌细胞的融合，并且在骨的形成以及重塑中起到重要的作用，这种作用是通过骨的再吸收来实现的。破骨细胞是多核的、末端分化的细胞，能够降解矿化的基质。在正常的骨组织中，在由成骨细胞引起的骨的形成与由破骨细胞引发的骨的再吸收之间存在一种平衡。当这种动态的并且高度规则的过程中的平衡被破坏时，骨的再吸收会超过骨的形成，从而导致定量的骨损失。由于破骨细胞对于骨的形成以及重塑是必不可少的，增加其数量和/或活性会导致与全身的骨损失相关的疾病的产生(例如，骨质疏松症)，也会导致其他与局部的骨损失相关的疾病的产生(例如，风湿性关节炎，牙周疾病)。
破骨细胞以及成骨细胞均支配涉及蛋白激酶的多数的细胞信号途径。破骨细胞活化是由于骨质粘附作用、细胞骨架重排、连接区域的形成、以及极性波缘膜的形成所引发的。可以确信，蛋白酪氨酸激酶2(PYK2)参与了信号从所述的细胞表面至所述的细胞骨架的传递，因为在破骨细胞中由粘着所引发的信号使其发生了酪氨酸的磷酸化以及活化(参见Duong等人于1998年在J.Clin.Invest《临床研究杂志》.102，881-892中发表的文献)。近来的证据已经表明，蛋白酪氨酸激酶2(PYK2)蛋白水平的降低导致了对于体外破骨细胞的形成以及骨的再吸收的抑制(参见Duong等人于2001年在J.Biol.Chem.《生物化学杂志》276，7484-7492中发表的文献)。因此，对于蛋白酪氨酸激酶2(PYK2)或者其他蛋白酪氨酸激酶的抑制可能通过减少破骨细胞的形成以及骨的再吸收，从而降低骨质疏松的程度。因此，尽管不希望受到理论的限制，但可以设想，给药本发明所述的化合物将能够调控激酶(例如，蛋白酪氨酸激酶)的活性并且因此导致对于破骨细胞的形成和/或骨的再吸收的抑制，从而治疗骨质疏松症。
Src酪氨酸激酶作为用于骨疾病的有希望的治疗靶向，其作用已经被Src剔除小鼠的研究以及体外细胞试验所证实，这表明Src在破骨细胞(阳性)以及造骨细胞(阴性)中起到有规则的作用。在破骨细胞中，Src在运动性、极性、存活性、活化(皱褶缘的形成)以及粘着中起到关键的作用，这种作用是通过介导各种信号转导途径，特别是细胞因子以及整联蛋白信号来实现的(参见Parang与Sun于2005年在Expert Opin.Ther.Patents《治疗学专利的专家观点》15，1183-1207中发表的文献)。此外，大鼠的Src基因的靶向破坏诱发了骨质疏松症，并且在其他的组织或者细胞中不表现出任何明显的形态学异常或者功能异常，其中所述的骨质疏松症是一种以骨的再吸收的减少为特征的障碍(参见Soriano等人于1991年在Cell《细胞》64，693-702中发表的文献)。所述的骨质疏松性显型src-/-大鼠是细胞自治的，并且其成因是成熟破骨细胞的缺失，其通常表达高水平的Src蛋白(参见Horne等人于1991年在Cell《细胞》119，1003-1013中发表的文献)。通过限制Src酪氨酸激酶的有效性，Src抑制剂被认为能够减轻骨的分解并且促进骨的形成，其中所述的Src酪氨酸激酶能够激发破骨细胞的活性并且抑制造骨细胞。由于破骨细胞通常表达高水平的Src，对于Src激酶活性的抑制对于骨质疏松症的治疗而言可能是有效的(参见Missbach等人于1999年在Bone《骨》24，437-449中发表的文献)。
如这里所述，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗、预防或者缓解宿主所患有的肥胖症。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于预治疗、预防或者缓解宿主所患有的肥胖症的药物中的应用。为了预防肥胖症，所述化合物可以在宿主发展成肥胖症开始之前给药。做为选择，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以用来治疗宿主体内的肥胖症。
肥胖症与糖尿病以及在胰岛素应答组织中出现的胰岛素抗性的增强有关联，其中所述的胰岛素应答组织是例如骨骼肌，肝脏，以及白色脂肪组织(参见Klaman等人于2000年在Mol.Cell.Biol.《分子细胞生物学》20，5479-5489中发表的文献)。胰岛素在葡萄糖稳态、脂质代谢、以及能量平衡的调节中起到至关重要的作用。胰岛素信号是由于胰岛素与所述的胰岛素受体(IR)发生结合而引发的，所述的胰岛素受体是一种受体酪氨酸激酶。胰岛素的结合唤起了磷酸化事件的级联，其开始于所述的胰岛素受体(IR)在多发性酪氨酰残基上的自动磷酸化作用。自动磷酸化作用增强了胰岛素受体(IR)的激酶活性并且激发了下游的信号事件。蛋白酪氨酸激酶的刺激效应以及蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制效应很大程度上定义了所述胰岛素的作用。适当的胰岛素信号将血糖浓度的大幅度波动降低到最小，并且确保将足够的葡萄糖运送至细胞。由于胰岛素的刺激导致了多发性酪氨酰磷酸化事件的发生，因而增强一种或者多种蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的活性能够导致胰岛素抗性的产生，其可以导致肥胖症。事实上，已经报道在包括肥胖症在内的几种胰岛素抗性状态中存在增强的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性(参见Ahmad等人于1997年在Metabolism《代谢学》46，1140-1145中发表的文献)。因此，尽管不希望收到理论的限制，但给药本发明所述的化合物能够调控激酶(例如，蛋白酪氨酸磷酸酶)的活性，从而治疗宿主的肥胖症。
胰岛素信号开始于经由酪氨酸的磷酸化作用而发生的胰岛素受体(IR)的活化，并且在由葡萄糖转运蛋白GLUT4将葡萄糖吸收至细胞中时达到顶点(参见Saltiel与Kahn于2001年在Nature《自然》414，799-806中发表的文献)。随后必须对上述活化的胰岛素受体进行灭活，并且返回到基态，可以确信这一过程中涉及到蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)(参见Ahmad等人于1997年在J.Biol.Chem.《生物化学杂志》270，20503-20508中发表的文献)。对大鼠体内编码蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)的基因进行破坏，会导致胰岛素敏感并且增加对由膳食诱发的肥胖症的抗性(参见Elchebly等人于1999年在Science《科学》283，1544-1548中发表的文献；Klaman等人于2000年在Mol.Cell.Biol.《分子细胞生物学》20，5479-5489中发表的文献)。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B缺陷型大鼠的肥胖程度的减轻的原因是脂肪细胞群的显著减少，而不是脂肪细胞数量的减少(参见Klaman等人于2000年在Mol.Cell.Biol.《分子细胞生物学》20，5479-5489中发表的文献)。此外，蛋白酪氨酸磷酸酶-1B缺陷型大鼠的消瘦伴随着基础代谢率以及总能量消耗的增加，而解耦联蛋白mRNA的表达没有发生显著的改变。对于蛋白酪氨酸磷酸酶-1B基因的破坏证明，改变蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性能够调控体内的胰岛素信号以及由膳食诱发的肥胖症。因此，尽管不希望受到理论的限制，但给药本发明所述的能够调控胰岛素信号(例如，蛋白酪氨酸磷酸酶-1B活性)的化合物，能够有效的治疗宿主的肥胖症。
如这里所述，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗、预防或者缓解宿主所患有的糖尿病。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于预治疗、预防或者缓解宿主所患有的糖尿病的药物中的应用。为了预防糖尿病，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以在宿主发展成糖尿病开始之前给药。做为选择，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以用来治疗宿主体内的糖尿病。
II型糖尿病(T2DM)是一种错配(dysregulated)能量代谢障碍。能量代谢很大程度上受到激素胰岛素的控制，激素胰岛素是一种有效的合成代谢制剂，其促进蛋白质、碳水化合物以及脂质的合成以及存储，并且抑制它们的分解以及释放回所述的循环当中。胰岛素的作用是在其与酪氨酸激酶受体发生结合时被激发的，其导致了自动磷酸化作用并且增强了所述激酶的催化活性(参见Patti等人于1998年在J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.《基础临床生理学与药理学杂志》9，89-109中发表的文献)。酪氨酸的磷酸化作用导致胰岛素受体底物(IRS)蛋白与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的p85调节亚基发生相互作用，从而导致所述酶的活化并且使其命中一个特异的亚细胞位置，这取决于所述细胞的类型。所述的酶生成所述的脂质产物3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3，4，5)P3)，其调节许多蛋白质的定位以及活性(参见Kido等人于2001年在J.Clin.Endocrinol.Metab.86，972-979中发表的文献)。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在胰岛素刺激的葡萄糖吸收以及存储、脂解作用的抑制以及肝脏基因表达的调节方面起到至关重要的作用(参见Saltiel等人于2001年在Nature《自然》414，799-806中发表的文献)。显性干扰型磷脂酰肌醇3-激酶的过表达能够阻止葡萄糖的吸收以及谷氨酸转运蛋白4GLUT4向质膜的转移(参见Quon等人于1995年Mol.Cell.Biol.《分子细胞生物学》15，5403-5411中发表的文献)。因此，给药本发明所述的能够调控激酶(例如，磷脂酰肌醇3-激酶)活性、并且因此导致葡萄糖吸收的增加的化合物，能够有效的治疗糖尿病。
第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)是许多细胞类型中的磷脂酰肌醇3-激酶信号的主要调节剂，并且由于其对于磷脂酰肌醇3-激酶途径的抗细胞凋亡、增殖性以及肥大性活性具有对抗性，因而具有肿瘤抑制剂的功能(参见Goberdhan等人于2003年在Hum.Mol.Genet.《人类分子遗传学》12，R239-R248中发表的文献)。尽管不希望受到理论的限制，但可以确信第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)通过所述3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3，4，5)P3)分子的去磷酸化作用削弱了所述的磷脂酰肌醇3-激酶途径，将这种重要的脂质第二信使降解为二磷酸-4，5-磷脂酰肌醇(PtdIns(4，5)P2)。在最近的一项研究中，利用小干扰RNA(siRNA)减少50％的内源性第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)蛋白，能够增强3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇水平的胰岛素依赖性增加，并且增强葡萄糖的吸收(参见Tang等人于2005年在J.Biol.Chem.《生物化学杂志》280，22523-22529中发表的文献)。因此，尽管不希望受到理论的限制，但可以设想，给药本发明所述的能够调控第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)的活性、并且因此导致葡萄糖吸收的增加的化合物(I)及其药学上可接受的盐，能够有效的治疗糖尿病。
3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3，4，5)P3)水平同样受到含SRC同源(SH2)结构域的II型肌醇5’磷酸酶(SHIP)蛋白家族——SHIP1以及SHIP2的控制(参见Lazar与Saltiel于2006年在Nature Reviews 5，333-342中发表的文献)。含SH2结构域的II型肌醇5’磷酸酶(SHIP 2)在骨骼肌中进行表达，在其他胰岛素敏感性组织中催化3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3，4，5)P3)转化成二磷酸-4，5-磷脂酰肌醇(PtdIns(4，5)P2)(参见Pesesse等人于1997年在Biochem Biophys.Res.Commun.《生物化学与生物物理学研究通讯》239，697-700中发表的文献；Backers等人于2003年在Adv.Enzyme Regul.《酶调节进展》43，15-28中发表的文献；Chi等人于2004年在J.Biol.Chem.《生物化学杂志》279，44987-44995中发表的文献；Sleeman等人于2005年在Nature Med.《自然药学》11，199-205中发表的文献)。含SH2结构域的II型肌醇5’磷酸酶(SHIP 2)的过表达显著的降低了胰岛素刺激性3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3，4，5)P3)水平，这与被提议的含SH2结构域的II型肌醇5’磷酸酶对于磷脂酰肌醇3-激酶下游效应物质的活化的削弱能力相一致(参见Ishihara等人于1999年在Biochem.Biophys.Res.Commun.《生物化学与生物物理学研究通讯》260，265-272中发表的文献)。
如这里所述，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗、预防或者缓解宿主所患有的眼部疾病。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于预治疗、预防或者缓解宿主所患有的眼部疾病的药物中的应用。为了预防眼部疾病，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以在宿主发展成眼部疾病开始之前给药。做为选择，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以用来治疗宿主体内的眼部疾病，例如，视网膜黄斑病变，视网膜病，以及黄斑水肿。
生理学上无血管的角膜可能发生威胁视力的新血管形成反应。所述的增生性视网膜病变，主要是糖尿病性视网膜病变以及与年龄相关的视网膜黄斑变性的特征是血管的渗透性增强，从而导致视网膜水肿和视网膜下液聚集，以及易于出血的新血管的增殖。血管的生成，从先前存在的毛细血管中形成新的血管的过程，是正常的生长过程以及诸多的病理过程中很重要的一部分。血管内皮生长因子(VEGF)，作为血管生成作用的复杂级联中的一种重要介导体以及一种有效的渗透因素，对于新的治疗剂而言是一个有吸引力的靶向。血管内皮生长因子是两种膜结合酪氨酸激酶受体的配位体，所述的两种膜结合酪氨酸激酶受体是血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)以及血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)。配位体的结合触发了血管内皮生长因子受体的二聚作用以及转磷酸化作用，并且随后伴随着胞内酪氨酸激酶结构域的活化。继而发生的胞内信号轴导致了血管内皮细胞的增殖、迁移、以及存活。因此，尽管不希望受到理论的限制，但可以设想，给药本发明中所述的化合物能够有效的治疗眼部疾病，例如，视网膜黄斑病变，视网膜病变和/或黄斑水肿，其中，所述的化合物能够调控激酶活性，例如，酪氨酸激酶的活性，并且引起对于血管生成和/或新血管形成的抑制。
视网膜黄斑病变的特征是血管内皮生长因子介导的视网膜渗漏(血管渗透性的增强)以及眼底小血管的异常生长(血管生成)。已经在糖尿病性视网膜病变以及与年龄相关的视网膜黄斑变性中的新血管膜中识别出了血管内皮生长因子，并且在糖尿病性视网膜病变中，新血管形成的严重程度与上述因子的眼内水平存在关联(参见Kvanta等人于1996年在Invest.Ophthal.Vis.Sci.《调查性眼科学与视觉科学》37，1929-1934中发表的文献；Aiello等人于1994年在N.Engl.J.Med.《新英格兰医学杂志》331，1480-1487中发表的文献)。血管内皮生长因子在这些模型中的治疗对抗性导致视网膜新血管形成以及脉络膜新血管形成被显著的抑制，同时也导致了血管渗透性的降低(参见Aiello等人于1995年在Proc.Natl.Acad.Sci.《美国科学院院刊》，美国，92，10457-10461中发表的文献；Krzystolik等人于2002年在Arch.Ophthal.《眼科学档案》120，338-346中发表的文献；Qaum等人于2001年在Invest.Ophthal.Vis.Sci.《调查性眼科学与视觉科学》42，2408-2413中发表的文献)。因此，尽管不希望受到理论的限制，但可以设想，给药本发明中所述的化合物(I)及其药学上可接受的盐能够有效的治疗眼部疾病，例如，视网膜黄斑病变，视网膜病变和/或黄斑水肿，其中，所述的化合物化合物(I)及其药学上可接受的盐能够调控血管内皮生长因子的活性，并且引起对于血管生成和/或新血管形成的抑制。
如这里所述，本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可能用来治疗、预防或者缓解宿主所患有的中风，所述宿主具有很高的患上中风的风险、正在患有中风或者已经发生过中风。本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐能够被用在治疗处于中风后恢复期的宿主的方法中。本发明的另一个方面包括化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解宿主所患有的中风的药物中的应用。
中风，也被称为脑血管意外(CVA)，是一种急性的神经损伤，是由于动脉的封闭或者血管的破裂而导致的大脑部分区域的血液供应阻断。所述的血液供应被阻断的大脑部分区域不再接收到由所述血液带来的氧和/或营养。所述的脑细胞被损坏或者坏死，从而削弱了那部分大脑区域具有的功能以及来自于那部分大脑区域的功能。如果氧气被剥夺超过60至90秒，脑组织将终止其功能，并且在几分钟之后将遭受不可逆的损伤，可能导致所述组织的死亡，即，梗死。
中风分为两种主要的类别：缺血性中风和出血性中风，其中，缺血性中风是指堵塞供给脑部的血管，出血性中风是指血液泄漏进入脑中或者分布在大脑周围。大多数中风是缺血性中风。缺血性中风通常分成血栓形成的中风、脑栓塞、全身性灌注不足(脑分水岭梗死)、或者静脉血栓形成。在血栓形成的中风中，在受到影响的动脉中形成血栓，形成的血栓，即血块会逐渐的使动脉管腔变窄，从而阻止血液流到末梢组织中。这些血块通常围绕动脉粥样硬化斑块形成。根据形成血栓的血管种类不同，血栓形成的中风可以被分为两种。大血管的血栓形成性中风包括公有的和内部颈动脉、椎动脉和Willis循环动脉血管中风。小血管形成的中风包括脑内动脉中风、Willis循环分支血管中风、大脑中动脉血管中风和从脊椎末梢上升的动脉中风和基底动脉中风。
血栓，即使是非闭塞性的血栓，也能够导致栓塞性中风，只要所述的血栓在其成为栓塞处发生中断。栓塞指的是在发源于别处的动脉血流中存在的移动的粒子或者碎片。栓塞性中风指的是由栓塞引起的到达大脑部分区域的动脉通路的封闭。栓塞通常都是血液凝块儿，但其也可以是一个从动脉粥样硬化的血管中脱落的斑块，或者是许多其他的物质，包括脂肪，空气，并且甚至是癌细胞。由于栓塞是来自于别处的，因而局部治疗仅仅能解决临时性的问题。因此，必须识别出所述栓塞的来源。有四种类型的栓塞性中风：具有已知的心脏来源的血栓；具有可能的心脏来源或者大动脉来源的(来自于经胸廓超声心动图或者经食管超声心动图)血栓；具有动脉来源的血栓；以及具有未知来源的血栓。
系统性低灌注是指流向身体的所有部分的血液减少。其最常见的原因是由于心搏停止或者心律不齐、或者心脏输出量的减少而导致的心脏泵的衰竭，而这些都是由心肌梗塞、肺部栓塞、心包积液、或者流血造成的。血氧不足(即，低血氧含量)可能促进了所述的低灌注。由于这种血液流动的减少是全局性的，脑部的所有部分都可能受到影响，特别是所述的“分水岭”区域，这一区域是由主要的脑动脉供给的边缘带区域。血液流动至这些区域不必然停止，但取而代之的是，可能在脑部损伤发生处血液流动降低。
脑部静脉的功能是将所述的血液排放回身体。当静脉由于形成血栓的原因而发生闭塞，所述的血液排放被阻滞并且所述的血液倒流，引发脑水肿。这种脑水肿能够导致缺血性中风以及出血性中风。这通常发生在罕见疾病窦静脉血栓形成中。
利用本领域已知的各种技术中的一种或者多种在宿主或者宿主体内诊断中风，所述的技术是例如，神经系统检查，血液检测，CT扫描(不利用对比度增强手段)，MRI(磁共振成像)扫描，多普勒超声，以及动脉造影术(即，在所述血流中注射进不透射线的物质之后，动脉的X光片)。如果通过造影证实了中风，则进行各种其他的研究，以确定是否存在外围来源的栓塞。这些研究包括，例如，针对所述颈动脉的超声/多普勒研究(用来检测颈动脉狭窄)；心电图(ECG)以及超声波心动图(用来识别心律不齐以及作为结果产生的心脏凝块儿，所述的心脏凝块儿能够通过血流蔓延至脑血管中)；霍尔特氏心电图研究，用来识别间歇性心律不齐，以及大脑血管系统的血管造影片(如果认为出血是来源于动脉瘤或者动静脉畸形)。
本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可以有效的用于治疗、预防或者缓解中风或者与中风有关的症状的方法中，所述化合物(I)及其药学上可接受的盐可以在中风发生之前、期间或者之后调控激酶信号级联。在一个实施方案中，这里描述的可以有效用于治疗、预防或者缓解中风或者与中风有关的症状的方法中的本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐是一种激酶信号级联的变构抑制剂，可以在中风发生之前、期间或者之后起作用。在一个方面，例如，所述化合物是一种酪氨酸激酶抑制剂。在一种实施方案中，这里描述的可以有效用于治疗、预防或者缓解中风或者与中风有关的症状的方法中的本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐是一种激酶信号级联的非腺苷三磷酸竞争性抑制剂，可以在中风发生之前、期间或者之后起作用。
已经表明，在中风的过程中对于Src活性的抑制能够提供对于大脑的保护(参见Paul等人(于2001年)在Nature Medicine《自然医学》vol.(卷)7(2)：222-227中发表的文献，上述文献的全部内容通过引用全部并入本文)。血管内皮生长因子(VEGF)，它的产生是为了对缺血性损伤进行应答，已经证明它能够提高血管的渗透性。研究表明，在发生中风之后，所述的Src激酶能够调节大脑中由血管内皮生长因子介导的血管渗透性(VP)，而在中风之前以及之后给药Src抑制剂减轻了水肿，增加了脑部的灌注并且在损伤发生之后减小了梗塞的体积(参见Paul等人于2001年发表的文献)。因此，Src抑制剂能够有效的用于预防、治疗或者改善中风发生之后的次级损伤。
本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐能够预防、治疗或者缓解中风或者与中风有关的症状。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于预防、治疗或者缓解中风或者与中风有关的症状的药物中的应用。中风的症状包括突然麻木或者虚弱，特别是身体单侧的突然麻木或者虚弱；突然意识模糊或者发音困难或者无法理解谈话内容；双眼或者单眼突然无法视物；或者突然的没有原因的剧烈头痛。
对于中风的治疗通常分为三个阶段：预防，中风发生之后立即采取的治疗，以及中风后的恢复。预防首发或者复发中风的治疗是以治疗中风的潜在危险因素为基础的，所述的潜在危险因素是例如，高血压，高胆固醇，心房颤动，以及糖尿病。急性中风的治疗是尝试在中风发生的时候对其进行终止，通过快速溶解引起缺血性中风的血液凝块儿或者通过阻止出血性中风的流血的方式。中风后的恢复是帮助个体克服由中风的损伤所导致的伤残。药物治疗是最常见的治疗中风的方法。用于预防或者治疗中风的最常见的药物类型是抗血栓形成剂(例如，抗斑块剂以及抗凝血剂)以及血栓溶解剂。向宿主给药所述的化合物，其中所述的宿主具有患中风的危险、正患有中风或者曾经患有中风，给药的时间是在中风的发生之前、发生的过程中、发生之后、以及上述时机的任意组合。本发明中所述的化合物可以单独给药，以药物组合物的形式给药，或者与各种已知的治疗中的任意一种进行组合治疗，所述的已知的治疗是，例如，抗斑块药物(例如，阿司匹林，克拉匹多，双嘧达莫)，抗凝血剂(例如，华法林)，或者溶解血栓类药物(例如，组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)，瑞替普酶(reteplase)，尿激酶，链激酶，替奈替普酶(tenectaplase)，兰替普酶(lanoteplase)，或者阿尼普酶(anistreplase))。
本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可以用于治疗、预防、缓解宿主动脉硬化症或者其症状的方法中，所述宿主是指有风险患有或者已经患有动脉硬化症的宿主。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解动脉硬化症的药物中的应用。
动脉硬化症是一种影响动脉血管的疾病，并且其通常被称为动脉的“硬化”。它是由所述动脉内的多个斑块的形成所引发的。动脉粥样硬化斑块尽管可以通过动脉的扩张来补救，但其最终会导致斑块的破裂以及动脉的狭窄(即，变窄)，上述情况继而会导致由所述动脉供血的器官的血液供应补足。或者，如果用于进行补救的动脉扩张处理过度，会导致动脉瘤的最终结果。这些并发症是慢性的、缓慢发展的并且是累积的。最常见的，柔软的斑块突然破裂，引发血液凝块儿的形成(即，血栓)，所述的血液凝块儿迅速的减慢或者终止血液流动，上述情况继而会导致由上述动脉供血的组织死亡。这种灾变性事件被称为梗死。例如，冠状动脉患有的冠状动脉血栓症会引发心肌梗塞，通常被认为是心脏病发作。当动脉粥样硬化斑块缓慢的堵塞冠状动脉的内衬并且随后突然破裂，完全的封闭所述动脉并且阻止血液向下游流动时，就会发生心肌梗塞。
使用任何一种临床试验和/或实验室试验，例如，物理学检查、放射性试验或者超声试验和血液分析就可以诊断病人是否患有动脉硬化症和急性心肌梗塞。例如，医生或者临床上可以通过听取宿主动脉的声音来检测异常的流动声音，也叫做杂音。使用听诊器放置在收到影响的动脉上可以听到杂音。做为选择，或者另外，临床医师或者内科医师也可以检查脉冲，例如，检查腿上或者脚上的脉冲，来确诊一些异常情况，例如，虚弱或者失神。内科医师或者临床上可以进行血液研究来检查胆固醇含量或者检查心脏酵素水平，从而检测异常情况，所述心脏酵素例如肌酸激酶、肌钙蛋白和乳酸脱氢酶。例如，肌钙蛋白亚单位I或者T对心肌具有非常特殊的作用，能够在造成永久性损伤之前浓度大量上升。在胸痛时表现肌钙蛋白阳性的现象可以准确地预告在不久的将来发生心肌梗死的高可能性。其他诊断动脉硬化症和/或心肌梗死到检验法包括，例如，用于测定宿主心跳速率和规律性的EKG(心电图)；用于测定脚关节/臂指数的胸部X射线，并将脚关节处的血压与臂处的血压相比较；动脉的超声分析；重要部分的CT扫描；血管造影术；运动应力试验，核心脏扫描；和心脏的核磁共振成像(MRI)和电子发射断层扫描(PET)扫描。
由Src引起的细胞信号转导被认为在血管渗透性的增强中起到关键性的作用，血管的渗透性被称为血管渗透性(VP)。血管内皮生长因子(VEGF)，它的产生是为了对缺血性损伤进行应答，已经表明它能够提高血管的渗透性，其中所述的缺血性损伤包括，例如心肌梗塞。研究表明，对于Src激酶的抑制降低了由血管内皮生长因子介导的血管渗透性(VP)(参见Parang与Sun(于2005年)在Expert Opin.Ther.Patents《治疗学专利的专家观点》vol.(卷)15(9)：1183-1206中发表的文献，上述文献的全部内容通过引用全部并入本文)。经过Src抑制剂处理过的大鼠表明，与未经处理的大鼠相比，在心肌梗塞之后与血管的外伤或者损伤相关联的组织损伤降低了(参见，例如，由Cheresh等人申请的美国专利申请第20040214836号以及第20030130209号，上述文献的全部内容通过引证在此全部并入本文)。因此，Src的抑制能够有效的用于预防、治疗或者改善由于动脉硬化症而产生的损伤所带来的次级损伤，例如，心肌梗塞。
本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐能够用于预防、治疗或者缓解动脉硬化症或者与动脉硬化症有关的症状。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐在制备用于预防、治疗或者缓解动脉硬化症或者与动脉硬化症有关的症状的药物中的应用。动脉硬化症通常不显示任何症状，除非他已经严重的使动脉变窄或者限制血液流通，或者除非造成了突然的栓塞。动脉粥样斑和狭窄血管发生的症状可以出现在任何位置例如，心、脑、其他的最重要的器官和腿部或者几乎在身体内的任何地方。动脉硬化症最初的症状可能是疼痛或者在运动期间由于身体需要更多的氧气时引起的痛性痉挛，当缺少氧气传递到心脏时，人会感觉胸痛(绞痛)，当缺少氧气传递到腿部时，人会感觉腿部痛性痉挛。动脉供给脑部血液量的减少会导致眩晕或者短暂性缺血性发作(TIA′s)，这时，中风的症状会持续少于24小时。一般地，这些症状会逐渐产生。
心肌梗塞的症状被定义为不同程度的胸部疼痛、不适、发汗、虚弱、恶心、呕吐、以及心律不齐，有些时候会导致失去知觉。胸部疼痛是急性心肌梗塞的最常见的症状，并且通常被描述为紧缩感、压迫感、或者压榨感。疼痛可能蔓延至下颌，颈部，臂部，背部，以及上腹部，最通常蔓延至左臂或者颈部。当胸部疼痛持续时间超过30分钟时，其更有可能是由心肌梗塞引发的。患有心肌梗塞的宿主可能表现出呼吸短促(呼吸困难)，特别是当心肌收缩性的减弱是由于所述的梗塞足以引发左心室衰竭以及肺部充血或者甚至肺部水肿而产生的情况。
本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐可以单独被给药，也可以处于药物组合物中给药，或者与各种已知的用于动脉硬化症的治疗中的任意一种进行联合治疗，所述的已知的用于动脉硬化症的治疗是，例如，降胆固醇类药物(例如，他汀类)，抗血小板药物，或者抗凝血剂。
本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐在治疗、预防、缓解神经性疼痛的方法中的应用，所述神经性疼痛例如慢性神经性疼痛，具有患神经性疼痛的危险、患有神经性疼痛、或者曾经患有神经性疼痛的宿主所具有的症状。本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防、缓解神经性疼痛的药物中的应用。
神经性疼痛也叫做神经痛，在疼痛程度上不同于普通受到伤寒之后的疼痛。神经性疼痛通常表现为一种持续的烧灼痛和/或“如针扎”或者“遭电击”之类的感觉。受伤寒的疼痛和神经性疼痛之间的区别是由于“普通”程度不同而产生的。受伤寒的疼痛只不过刺激到疼痛神经，而神经性疼痛通常对同一面积内的疼痛感觉神经和非疼痛感觉神经都有刺激作用(例如，响应接触、温暧、冰冷的神经)，从而生产一种正常状态下脊髓和大脑不会收到的信号。
神经性疼痛是一种复杂的、慢性的疼痛状态，并且通常伴随着组织损伤。发生神经性疼痛时，所述的神经纤维本身可能被破坏、功能紊乱或者损伤。这些被破坏的神经纤维向其他疼痛中心发出不正确的信号。所述的神经纤维损伤所带来的影响包括在所述损伤的位点处以及所述损伤周围的区域发生神经功能的变化。
使用本领域已知的一种或一种以上实验室方法和/或临床方法可以诊断宿主或者病人所患有的神经性疼痛，所述方法例如，物理学检查。
已经证明，c-Src能够调节N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的活性(参见Yu等人(于1999年)在Proc.Natl.Acad.Sci.《美国科学院院刊》，美国，vol.(卷)96：7697-7704中发表的文献，上述文献的全部内容通过引用全部并入本文)。研究表明，PP2，一种低分子量的Src激酶抑制剂，降低了所述的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NM2亚基的磷酸化作用(参见Guo等人(于2002年)在J.Neuro.《神经学杂志》vol.(卷)22：6208-6217中发表的文献，上述文献的全部内容通过引用全部并入本文)。因此，对于Src的抑制继而抑制了所述N-甲基-D-天冬氨酸受体的活性，能够有效的用于预防、治疗或者改善神经性疼痛，例如慢性神经性疼痛。
本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐能够用于预防、治疗或者改善神经性疼痛或者由神经性疼痛带来的症状，其中所述的神经性疼痛是例如慢性神经性疼痛。神经性疼痛的症状包括射伤疼痛和烧灼疼痛，刺痛和失去知觉。
本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐可以单独被给药，也可以处于药物组合物中给药，或者与任何一种已知的治疗方法结合给药，例如，止痛药、鸦片样物质、三环抗忧郁药、抗惊厥药和5-羟色胺降肾上腺素再吸收抑制剂。
本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用于治疗、预防、缓解宿主乙型肝炎或者其症状的方法中，所述宿主是指有患上乙型肝炎风险的宿主。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗、预防或者缓解乙型肝炎的药物中的应用。
所述的乙型肝炎病毒，是嗜肝DNA病毒家族中的一个成员，由一种蛋白质核心例子与包埋该蛋白的外层脂质基包膜组成，其中所述的蛋白质核心例子中含有病毒基因组，所述的病毒基因组以带有单链区域的双链DNA的形式存在。所述的包膜蛋白参与了病毒的结合以及向易感染细胞中的释放。所述的内衣层(inner capsid)重新部署了在病毒mRNA发生转录的细胞核中的DNA基因组。生成了三种编码所述包膜蛋白的次基因组转录体，以及一种编码所述的X蛋白的转录体。第四个前基因组RNA进行转录，其被输出至细胞溶质中并且对所述的病毒聚合酶以及核心蛋白进行了翻译。聚合酶以及前基因组RNA在装配核心例子时发生壳体化，所述的聚合酶蛋白使得从前基因组RNA至基因组DNA的逆转录发生。之后，所述的成熟的核心例子经由正常的分泌途径离开了所述的细胞，在离开的途中获得了包膜。
乙型肝炎是少数几个已知的将逆转录作为复制过程中的一部分的非逆转录病毒中的一个。其他的利用逆转录的病毒包括，例如，人T细胞白血病病毒(HTLV)或者人类免疫缺陷病毒(HIV)。
在乙型肝炎病毒(HBV)的感染过程中，所述的宿主免疫应答负责对肝细胞的损伤以及病毒的清除产生应答。由于先天性的免疫应答在这些过程中不起到主要的作用，适应性的免疫应答，特别是病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，促成了与乙型肝炎病毒的感染相关的几乎全部的肝损伤。通过杀死被感染细胞，以及通过生成能够从存活的肝细胞中清除乙型肝炎病毒的抗病毒细胞因子，细胞毒性T淋巴细胞也能够清除所述的病毒。尽管肝损伤是由所述的细胞毒性T淋巴细胞引发并且介导的，但抗原非特异性炎性细胞能够恶化由细胞毒性T淋巴细胞诱导的免疫病理学作用，而血小板能够促进细胞毒性T淋巴细胞在肝脏中的积累。
可以利用各种临床检测和/或实验室检测中的任意一种为宿主诊断乙型肝炎，所述的临床检测和/或实验室检测是例如，身体检查，以及血液分析或者血清分析。例如，对血液或者血清进行检测，看其中是否存在由所述的宿主产生的病毒抗原和/或抗体。在一项常规的乙型肝炎检测中，对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)进行探测，用来筛选是否存在感染。在受到某一病毒感染的过程中，第一个出现的可以被探测到的是该病毒的抗原；然而，在感染的前期，这种抗原可能并不存在，并且在所述感染的后期可能探测不到这种抗原，因为它已经被所述的宿主清除了。在这个“空窗期(window)”，所述的宿主仍旧处于感染状态但其已经成功的清除了所述的病毒，所述的乙型肝炎核心抗原的免疫球蛋白M(IgM)抗体(anti-HBcIGM)可能是该疾病的唯一的血清学证据。
在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)出现后不久，另外一种名字叫做乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抗原也将出现。传统意义上，宿主血清中乙型肝炎e抗原的出现与病毒复制的超高速率相关；然而，所述的乙型肝炎病毒的某些变异体根本不产生所述的“e”抗原。在所述感染发生的自然过程中，所述的乙型肝炎e抗原可能被清除，并且在此之后针对所述“e”抗原的抗体(anti-HBe)将立即出现。这种转变通常与病毒复制的戏剧性衰退有关联。如果所述的宿主有能力清除所述感染，最终所述的乙型肝炎表面抗原将变得不可探测，并且随后针对所述的乙型肝炎表面抗原的抗体(anti-HBs)也将变得不可探测。乙型肝炎表面抗原呈阴性、但针对乙型肝炎表面抗原的抗体呈阳性的人，可能是已经清除了感染，或者是先前接种过疫苗。许多乙型肝炎表面抗原呈阳性的人可能存在非常稀少的病毒繁殖，并且因此其患有长期并发症的危险很小，或者将这种感染传播给别人的危险很小。
Src在乙型肝炎病毒的复制中发挥作用。所述的病毒编码的转录因子HBx在所述的乙型肝炎病毒的传播所需的步骤中激活Src(参见，例如，Klein等人(于1999年)在EMBO J.《EMBO杂志》vol.(卷)18：5019-5027中发表的文献；Klein等人(于1997年)在Mol.Cell.Biol.《分子细胞生物学》vol.(卷)17：6427-6436中发表的文献)，上述文献的全部内容通过引用全部并入本文)。因此，对于Src的抑制继而抑制了由Src介导的乙型肝炎病毒(HBV)的传播，能够有效的用于预防、治疗或者改善乙型肝炎或者由乙型肝炎所带来的症状。
本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐能够预防、治疗或者缓解乙型肝炎或者与乙型肝炎有关的症状。一般在接触到病毒之后30-180天内，就会发展出现乙型肝炎的症状。然而，大约有一半感染乙型肝炎症状的病人没有出现任何症状。所述乙型肝炎的症状通常好比是流感、并且包括，例如，食欲下降；疲劳；恶心和呕吐、全身瘙痒；肝脏疼痛(例如，右腹部、下部肋骨架之下)、黄疸症和排泄功能方面的变化。
本发明所述的化合物(I)或其药学上可接受的盐可以单独被给药，也可以处于药物组合物中给药，或者与任何一种已知的乙型肝炎治疗方法结合给药，例如，α干扰素、拉米夫定(lamivudine)(Epivir-HBV)和博路定(baraclude)(恩替卡韦(entecavir))。
如这里所述的，本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用来调节宿主体内的免疫系统活性，从而预防或者防止自身免疫性疾病，例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、脓毒病和狼疮以及移植排异反应和过敏性疾病。本发明的另一个方面包括本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于调节免疫系统的药物中的应用。做为选择，所述化合物(I)或其药学上可接受的盐可以用来治疗宿主的自身免疫性疾病。例如，所述化合物(I)或其药学上可接受的盐可以减少症状的严重程度或者阻挡自身免疫性疾病的逐渐恶化。
自身免疫性疾病是一类由自身耐受性的崩溃而引发的疾病，由于自身耐受性发生崩溃，所述的适应性免疫系统对自身抗原进行应答，并且介导细胞以及组织的损伤。自身免疫性疾病可能是器官特异性的(例如，甲状腺炎或者糖尿病)，或者是全身性的(例如，全身性红斑狼疮)。T细胞调控着所述的适应性免疫系统的由细胞介导的免疫应答。在正常的情况下，T细胞表达抗原受体(T细胞受体)，所述的抗原受体识别与自身主要组织相容性复合分子的外源蛋白质的肽片段。在T细胞受体(TCR)的刺激发生后最先被识别到的事件是Lck以及Fyn的活化，这种活化导致了存在于免疫受体酪氨酸活化基序中的酪氨酸残基上发生了T细胞受体的磷酸化作用(参见Zamoyska等人于2003年在Immunol.Rev.《免疫学回顾》191，107-118中发表的文献)。酪氨酸激酶，例如Lck(它是蛋白质酪氨酸激酶Src家族中的一个成员)，在细胞信号以及细胞增殖的调节中起到至关重要的作用，其中所述的细胞信号以及细胞增殖是由肽以及蛋白质的酪氨酸残基的磷酸化作用导致的(参见Levitzki于2001年在Top.Curr.Chem.《现代化学论》211，1-15中发表的文献；Longati等人于2001年在Curr.DrugTargets《现代药物靶向》2，41-55中发表的文献；Qian与Weiss于1997年在Curr.Opin.CellBiol.《细胞生物学的现代观点》9，205-211中发表的文献)。因此，尽管不希望受到理论的限制，但可以设想，给药本发明中所述的能够调控酪氨酸激酶(例如，Src)活性的化合物可以有效的用于自身免疫性疾病的治疗。
上述的酪氨酸激酶lck以及fyn均在所述的T细胞受体途径中得到活化；因此，lck和/或fyn的抑制剂具有作为自身免疫性试剂的潜在效用(参见Palacios与Weiss于2004年在Oncogene《致癌基因》23，7990-8000中发表的文献)。Lck以及Fyn主要是由T细胞在它们大部分的生命期限内进行表达的。通过对动物以及细胞系进行的研究，已经证明了Lck以及Fyn在T细胞的形成、动态平衡以及活化中所起的作用(参见Parang与Sun于2005年在ExpertOpin.The.Patents《治疗学专利的专家观点》15，1183-1207中发表的文献)。在自身免疫性疾病以及移植排斥中涉及到Lck的活化(参见Kamens等人于2001年在Curr.Opin.Investig.Drugs《药物研究的现代观点》2，1213-1219中发表的文献)。结果表明，lck(-)Jurkat细胞系(砷诱导淋巴细胞系)不能够增殖、生成细胞因子、并且产生胞内的钙、肌醇磷酸、以及酪氨酸的磷酸化作用的增加以应答T细胞受体的刺激(参见Straus与Weiss于1992年在Cell.《细胞》70，585-593中发表的文献；Yamasaki等人于1996年在Mol.Cell.Biol.《分子细胞生物学》16，7151-7160中发表的文献)。因此，一种抑制lck的试剂能够有效的阻止T细胞的功能，发挥免疫抑制剂的作用，并且具有治疗自身免疫性疾病的潜在效用，例如风湿性关节炎，多发性硬化症，以及狼疮，并且在移植排斥的区域以及过敏性疾病中具有潜在效用(参见Hanke与Pollok于1995年在Inflammation Res.《炎症的研究》44，357-371中发表的文献)。因此，尽管不希望受到理论的限制，但可以设想，给药本发明中所述的能够调控蛋白酪氨酸激酶Src家族中的一个或者多个成员(例如，lck和/或fyn)的活性的化合物可以有效的用于自身免疫性疾病的治疗。
本发明化合物(I)在小鼠、鼠、和狗体内的药代动力学特性显示化合物(I)具有口服生物相容性，并且其药物接触量和最大血浆浓度显示出剂量有关的增加。
已经发展出本发明化合物(I)的二盐酸盐和化合物(I)的甲磺酸盐。两种桥联的药代动力学研究显示本发明化合物(I)的这两种盐形式在鼠和狗体内具有相似的药代动力学曲线。因此，对本发明化合物(I)二盐酸盐的研究发现也适用于化合物(I)甲磺酸盐的研究。
化合物(I)是一种特异性并且选择性的Src激酶抑制剂，在抗癌细胞方面很有效，并且与已经获准的激酶抑制剂和正在研发过程中的激酶抑制剂相比，可以避免产生严重的副作用，例如心脏毒性。
本发明化合物(I)以纯净形式或者隔离形式(即，合成生产的形式)存在。
本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐可以通过常规方法制备，例如，通过美国专利第US2008/0221102号和PCT/US2008/006419号中描述的方法制备。
使用一种或者更多种药学上可接受的载体可以以一种常规的方式配置包含本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明所述的化合物(I)或其药学上可接受的盐可以被口服给药、经鼻给药、透皮给药、经肺部给药、吸入给药、口腔给药、舌下给药、腹膜内给药、皮下给药、肌内注射给药、静脉内给药、直肠给药、胸膜内给药、鞘内给药或者肠胃外给药。在一个实施方案中，本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐可以被口服给药。本领域普通技术人员可以识别各种给药途径的优点。
根据各种各样的因素可以选择使用本发明化合物(I)的给药方案，这些因素包括病人的类型、种类、年龄、体重、性别和医学状况；需要治疗的疾病的严重程度；给药途径；病人的肾脏和肝脏功能和使用的具体化合物或其盐。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于口服给药、静脉内给药、肌肉给药或者皮下给药的药物组合物，所述药物组合物包括一定量的本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐和一种药学上可接受的载体，所述量为每剂量包含2毫克到400毫克，每天给药两次或者三次。在另一个实施方案中，所述量为10毫克到300毫克。在另一个实施方案中，所述量为20毫克到250毫克。在另一个实施方案中，所述量为40毫克到200毫克。在另一个实施方案中，所述量为60毫克到160毫克。在一个实施方案中，所述剂量每日给药两次。在一个实施方案中，所述剂量每日给药三次。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于口服给药、静脉内给药、肌肉给药或者皮下给药的药物组合物，所述药物组合物包括一定量的本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐和一种药学上可接受的载体，所述量为每剂量包含4毫克到800毫克，每天给药一次。在另一个实施方案中，所述量为20毫克到600毫克。在另一个实施方案中，所述量为40毫克到500毫克。在另一个实施方案中，所述量为80毫克到400毫克。在另一个实施方案中，所述量为120毫克到320毫克。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于如上所述给药方式的药物组合物，其中，所述药物组合物包括化合物(I)的甲磺酸盐。在一个实施方案中，所述给药方式为口服给药。在另一个实施方案中，所述给药方式为静脉给药。在另一个实施方案中，所述给药方式为肌肉给药。在另一个实施方案中，所述给药方式为皮下给药。
配制并且给药本发明中公开的化合物(I)或其药学上可接受的盐的技术可以在Remington：the Science and Practice of Pharmacy《雷明顿药物科学与实践》，第19版，Mack出版公司，Easton，PA(1995年)中找到。在一种实施方式中，这里公开的化合物(I)或其药学上可接受的盐与一种药物上可接受的载体或者赋形剂相结合被用于进行药物的制备。适当的药学上可接受的载体包括惰性固体填充剂或者稀释剂以及无菌水溶液或者有机溶液。所述化合物I)或其药学上可接受的盐应当以足以提供在本发明所述的范围之内的期望的药剂剂量的量存在于所述的药物组合物中。
在一个实施方案中，制备本发明化合物(I)或其药学上可接受的盐用于口服给药，其中这里所公开的化合物(I)或其药学上可接受的盐与一种适当的固态载体或者液态载体或者稀释剂相结合，形成胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂、糖浆剂、液剂、悬浮剂等等。
所述片剂、丸剂、胶囊剂等等包含大约1到大约99重量百分数的活性成分和一种粘合剂、一种赋形剂、一种崩解剂、一种润滑剂和/或一种甜味剂，所述粘合剂例如黄蓍树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；所述赋形剂例如磷酸二钙；所述崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或者海藻酸；所述润滑剂例如硬脂酸镁；所述甜味剂例如蔗糖、乳糖、糖精、木糖醇等等。当单位剂量形式是一种胶囊剂时，除上述类型的材料之外该胶囊通常包含一种液态载体，例如一种脂肪油。
在某些实施方案中，可以存在各种各样的其它材料作为包覆层或者用于改善所述剂量单位的物质形式。例如，在某些实施方案中，用虫胶、糖或者二者的结合物包覆片剂。在某些实施方案中，糖浆剂或者酏剂除了所述活性成分之外还包括，作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的甲基和对羟基苯甲酸丙酯、一种着色剂和一种调味品，例如樱桃食用香料或者柑橘食用香料等等。
对于涉及肠胃外给药的一些实施方案，这里公开的化合物(I)或者其药学上可接受的盐可以与无菌水介质或者有机介质结合从而形成一种可注射溶液或者悬浮液。在一个实施方案中，可注射组合物是水等渗溶液或者悬浮液。所述组合物可以是无菌的和/或包含添加剂，例如防腐剂、稳定剂、加湿剂或者乳化剂、溶液助催化剂、调节渗透压力的盐和/或缓冲剂。此外，所述组合物还包含其他具有治疗价值的物质。所述组合物可以分别通过传统的混合、粒化或者包衣方法制备，并且作为选择分别包含大约0.1％到75％的所述活性成分，在另一个实施方案中，所述组合物包含大约1到50％的所述活性成分。
例如，使用溶剂，例如，芝麻油或者花生油或者水相丙二醇以及所述化合物(I)的水溶性药学上可接受的盐的水溶液可以制成可注射溶液。在某些实施方案中，可以在甘油、液态聚乙二醇和其在油剂中的混合物中制备分散剂。在常规的储存条件和应用条件下，这些制剂可以包含一种防腐剂，从而预防微生物生长。如这里所述的术语″肠胃外给药″和″通过肠胃外方式给药”是指除了肠内和局部给药方式之外的给药方式，所述局部给药通常是指注射。″肠胃外给药″和″通过肠胃外方式给药″包括但不仅限于，静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药、鞘内给药、囊内给药、眶内给药、心内给药、皮内给药、腹膜内给药、经气管给药、皮下给药、表皮下给药、关节内给药、包囊下给药、蛛网膜下给药、脊柱内给药和胸骨内的注射以及输液。
对于直肠给药，适当的药物组合物是，例如，局部给药制剂、栓剂或者灌肠剂。栓剂可以从脂肪乳剂或者悬浮液中方便的制备。所述组合物可以是无菌的，和/或包含添加剂，例如防腐剂、稳定剂、加湿剂或者乳化剂、溶液助催化剂、调节渗透压力的盐和/或缓冲剂。此外，所述组合物还包含其他具有治疗价值的物质。所述组合物可以分别通过传统的混合、粒化或者包衣方法制备，并且包含大约0.1％到75％的所述活性成分，在另一个实施方案中，所述组合物包含大约1到50％的所述活性成分。
在一些实施方式中，所述的化合物(I)或其药学上可以接受的盐被配制成通过经肺给药的方式传递所述的活性试剂，例如，给药含有所述活性试剂的气雾剂制剂，通过，例如，手动泵喷雾器、喷雾器或者定量吸入气雾剂(pressurized metered-dose inhaler)的形式。在某些实施方式中，适当的这种类型的制剂中还包括其他试剂，例如抗静电剂，使所述被公开的化合物保持有效的气雾剂形式。
用于传递气雾剂的药物传递装置包括一个带有计量阀的适当的气雾剂筒以及一个排气泄压阀外壳，所述的气雾剂筒中装有本发明中所述的药物气雾剂制剂，所述的排气泄压阀外壳适于承载所述的气雾剂筒并且允许进行药物的递送。所述的药物传递装置上的所述筒具有一个顶部空间，其占据了所述筒的全部体积的大约15％以上。通常，在溶剂、表面活性剂以及推进剂组成的混合液中将意在进行肺部给药的所述聚合物溶解、悬浮或者乳化。将所述的混合液在压力条件下保存于筒中，所述的筒利用计量阀进行密封。
为了实现经鼻给药，可以使用固态载体或者液态载体。所述固态载体包括一种粗粉末，这种粗粉末的颗粒尺寸在例如大约20微米到大约500微米的范围内，且所述制剂通过鼻腔通道快速吸入给药。在某些使用液态载体的实施方案中，所述制剂作为一种经鼻喷雾或者滴剂被给药，并且所述制剂包括油或者活性成分的水溶液。
本发明还包括能够快速分散的剂量形式，这种剂量形式又名″速释剂型″。具体的讲，本发明某些实施方案被配制成能够在一种较短的时间内释放其组合物的制剂，所述较短的时间例如，一般小于大约五分钟，在另一个实施方案中，小于大约九十秒，在另一个实施方案中，小于大约三十秒和在另一个实施方案中，小于大约十或者十五秒。这种制剂适合于通过多种途径对宿主给药，例如，通过插入体腔或者应用到湿润的体表或者开放性创伤上。
代表性地，一种″速释剂型″是一种能够口服给药的固态剂量形式，该固态剂量形式能够快速的在口中分散开，并因此不需要在吞咽时做很大努力，且所述化合物能够快速被吞下或者通过口腔粘膜吸收。在某些实施方案中，适当的快速分散的剂量形式还可以用于其他的应用中，所述应用包括创伤及其他身体损伤，和不能够通过外表供给水汽释放药物的疾病状态的治疗。
″速释剂型″在本领域内是已知的，参见例如，美国专利第5,578,322号和第5,607,697号中所述的不溶物微颗粒的泡腾剂量形式和快速释放包覆层；美国专利第4,642,903号和第5,631,023号的冷冻干燥泡沫和液体；美国专利第4,855,326号、第5,380,473号和第5,518,730号中的熔融纺丝剂量形式；美国专利第6,471,992号中的固态形式、游离形式的构造；美国专利第5,587,172号、第5,616,344号、第6,277,406号和第5,622,719号中的基于糖类的载体基质和一种液态粘合剂；以及其他本领域内已知的形式。
本发明化合物(I)及其药学上可接受的盐还可以被配制成为一种“脉冲释放”制剂，其中所述化合物或其药学上可接受的盐在一系列的释放(例如，脉冲)中从药物组合物中释放出来。所述化合物(I)及其药学上可接受的盐还可以被配制成″持续释放″制剂，其中所述化合物在持续的时间内连续地从药物组合物中释放出来。
本发明还包括一种制剂，例如液体制剂，所述液体制剂包括环状的或者非环状的装入胶囊中的或者制成溶剂的试剂，例如，环糊精、聚醚或者多糖(例如，甲基纤维素)，或者在另一个实施方案中，通过使用一种烷基醚间隔体基团或者多糖，能够将聚阴离子β-环糊精衍生物与钠磺酸盐基团一起从亲脂性腔中分离出来。在一个实施方案中，所述试剂是甲基纤维素。在另一个实施方案中，所述试剂是使用丁基醚间隔体基团从亲脂性腔中分离出来的聚阴离子β-环糊精衍生物和钠磺酸盐，例如，(购自CyDex，Overland，KS)。本领域普通技术人员可以计算适当的试剂/公开的化合物制剂比率，例如，通过制备试剂在水中的溶液，例如，按重量计算占40％的溶液；通过制备连续稀释液，例如制备20％、10％、5％、2.5％、0％(对照物)的溶液等等；通过加入过量的(与可以溶解的试剂的量相比过量)所述化合物；通过在合适的情况下混合，例如，加热、搅拌、超声处理，等等；通过离心或者过滤所得混合物从而获得上清液；和通过分析这里公开的化合物溶液的浓度。
本发明中所引用的全部出版物以及专利文献在此通过引用作为参考，就如同这些出版物或者文献中的每一篇都被具体的并且分别的指明在此引入作为参考一般。对于出版物以及专利文献的引用并不意味着认可其中任意一篇作为相关的现有技术，也不构成对其公开的内容或者日期的任何认可。本发明现在通过记载说明书的方式进行了描述，本领域技术人员将可以认识到，本发明可以以各种不同的实施方式进行实践，前述的说明书以及下述的实施例的目的在于描述，并不构成对后附的权利要求的限制。
定义
出于方便的目的，在这里总结了在说明书、实施例以及随后的权利要求中所使用到的某些术语。
蛋白激酶是酶中的一个大类，它催化了γ-磷酸从ATP(三磷酸腺苷)至蛋白质以及肽中的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)侧链或者酪氨酸(Tyr)侧链上的羟基基团的转移，并且最终参与控制各种重要的细胞功能，或许最显著的控制：信号转导，分化以及扩增。据估计，在人类体内存在大约2000种不同的蛋白激酶，并且尽管它们中的每一种针对特定的蛋白/肽底物进行磷酸化，但它们都以高度保守的方式与一种同样的次级底物进行结合。在已知的致癌基因产物中有大约50％是蛋白酪氨酸激酶(PTK)，并且已经表明，它们的激酶活性导致了细胞的转化。
所述的蛋白酪氨酸激酶(PTK)可以被划分为两个种类，膜受体蛋白酪氨酸激酶(例如，生长因子受体蛋白酪氨酸激酶)以及非受体蛋白酪氨酸激酶(例如，原致癌基因产物中的Src家族以及黏着斑激酶(FAK))。已经在多种人类癌症中报道了Src的过度活化，包括结肠癌，乳腺癌，肺癌，膀胱癌，以及皮肤癌，还有胃癌，多毛细胞白血病，以及成神经细胞瘤。
“抑制蛋白激酶信号级联中的一个或者多个成员”指的是所述的激酶信号级联中的一个或者多个成员受到作用，从而使得所述细胞的功能发生改变。蛋白激酶信号级联中的成员包括在所述的激酶信号途径中直接或者间接涉及到的任何的蛋白质，包括第二信使以及上游靶向和下游靶向。
“治疗”包括任何能够改善所述情况、疾病、紊乱等等的作用，例如，减轻、减少、调控或者消除所述情况、疾病、紊乱等等的作用。“治疗”或者“医冶”一种疾病状态包括：(1)预防疾病状态发生，也就是说，使有可能接触某种疾病或者有倾向发展患有某种疾病，但是还没有经历或者表现出疾病症状的宿主不发展出现所述疾病的临床症状；(2)抑制所述疾病，也就是说，使疾病或者其临床症状停止发展；或者(3)减轻所述疾病状态，也就是说，使所述疾病或者其临床症状产生暂时或永久的衰退。
“预防”所述的疾病状态包括使宿主疾病状态的临床症状不在进一步发展，即，抑制疾病的发病，其中所述的疾病状态并没有在宿主中形成，而所述的宿主可能被暴露于或者被预先安排在所述的疾病状态之中，但尚未体验到或者表现出所述疾病状态的症状。
“缓解”是指在宿主经历或者显示疾病状态症状之前，通过向宿主给药化合物来降低(减轻)宿主疾病状态临床症状的严重性，所述的宿主可能被暴露于或者被预先安排在所述的疾病状态之中。
“疾病状态”是指任何疾病、紊乱、情况、症状或者征兆。
如这里所述，术语“细胞增殖性紊乱”是指一种情况，在这种情况中，未调节的细胞和/或异常生长的细胞会导致不希望有的情况或者疾病产生，这种不希望有的疾病或者可能是癌症或者非癌症性疾病，例如，牛皮癣。如这里所述，术语“牛皮癣情况”或者“银屑病”是指一类疾病，这类疾病包括角化细胞过度增生、炎性细胞浸润和细胞因子变更。
在一个实施方案中，所述细胞增殖紊乱是癌症。如这里所述，所述术语“癌症”包括实体肿瘤，例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌恶性黑色素瘤、非黑素瘤性皮肤癌，以及血液学肿瘤和/或恶性肿瘤，例如，儿童期白血病和淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性淋巴肉芽肿(何杰金病)、淋巴细胞的淋巴瘤和皮肤起源的急性和慢性白血病，例如，成淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病或者慢性粒细胞性白血病、浆细胞肿瘤、淋巴肿瘤和与艾滋病有关的癌症。
除牛皮癣情况之外，所述能够使用本发明化合物治疗的增生性疾病的种类有表皮囊肿和皮样囊肿、脂肪瘤、腺瘤、毛细血管瘤和皮肤血管瘤、淋巴管瘤、痣病变、畸胎瘤、肾瘤、肌纤维瘤、成骨细胞瘤及其他发育异常物质，等等。所述增生性疾病还可以包括发育异常和诸如此类的疾病。
本发明所述的化合物的“有效剂量”指的是这样的量：当为患有疾病或者障碍的宿主给药时，能够引发所述宿主的疾病或者障碍减退的量。因此，本发明所述的化合物的有效剂量指的是这样的量：当为患有细胞增殖障碍的宿主给药时，能够引发所述宿主的细胞生长减退的量。给药给宿主的公开化合物的量将取决于具体的障碍，给药的方式，结合给药的化合物，如果存在的话，以及所述宿主的特征，例如一般健康状况，其他疾病，年龄，性别，基因型，体重以及对药物的耐受性。熟练的技术人员将有能力依据这些因素以及其他因素来确定适当的剂量。
本发明中所使用的所述术语“有效剂量”指的是当将本发明所述的化合物(I)或其药学上可接受的盐，或者所述化合物的组合作为一种抗增殖制剂单独给药或者结合给药时能够达到效果的量。例如，有效剂量指的是存在于一种制剂或者一种医学装置中的所述化合物(I)的量，所述的量使得将其给药至接受治疗的宿主或者宿主后足以引发生物学活性，例如，抗增殖活性，例如，抗癌症活性或者抗肿瘤活性。所述的化合物的组合任选的是一种协同的组合。正如在例如Chou与Talalay(于1984年)在Adv.Enzyme Regul.《酶调节进展》vol.(卷)22，pp.(页)27-55中发表的文献中所描述的，当所述的组合物进行结合给药时所产生的效果大于所述的组合物作为单一制剂进行单独给药时所产生的效果的相加时，就发生了协同作用。通常，在所述化合物的非最适宜浓度条件下能够最显著的证明这种协同效应。协同作用可以根据所述的组合比所述的单独组分具有更低的细胞毒性、或者增强的抗增殖效果、或者某些其他的有益效果来确定。
有效量的一种或者一种以上化合物可以与一种药学上可接受的载体一起配制，对人类或动物给药。因此，所述的化合物或者制剂可以经由例如口服、肠胃外、或者局部的路径进行给药，从而提供有效剂量的所述化合物。在另外的实施方式中，可以利用依照本发明而制备的所述化合物(I)或其药学上可接受的盐对一种医学装置进行涂层或者灌注，所述的医学装置是例如血管支架。
所述的术语“预防有效剂量”指的是能够预防或者降低患有不期望的细胞增殖的危险而给药的本发明所述化合物(I)或其盐的有效剂量。
本发明中所使用的“药理学作用”包括在宿宿主内所产生的、达到了治疗的预期目的的作用。在一种实施方式中，药理学作用指的是接受治疗的宿主的初始迹象(primaryindications)被预防、缓解、或者减轻了。例如，药理学作用应当是导致了接受治疗的宿主的初始迹象被预防、缓解、或者减轻了的作用。在另外一种实施方式中，药理学作用指的是接受治疗的宿主的初始迹象的障碍或者症状被预防、缓解、或者减轻了。例如，药理学作用应当是导致了接受治疗的宿主的初始迹象被预防或者减轻了的作用。
“药物组合物”指的是一种含有所述化合物(I)及其盐的制剂，其中所述的制剂以一种适合给药给宿主的形式存在。在一种实施方式中，所述的药物组合物以大批剂量的形式或者以单元剂量的形式存在。所述的单元剂量形式是各种形式中的任何一种，包括，例如，胶囊，静脉输液袋(IV bag)，片剂，气雾剂吸入器的单流向泵，或者是注射瓶。在单元剂量的组合物中的所述活性成分(例如，所述被公开的化合物或其盐、水合物、溶剂化物、或者异构体的制剂)的量是能够达到效果的剂量，并且根据具体涉及到的治疗方法而存在变化。本领域技术人员能够认识到，有些时候根据所述宿主的年龄以及状况对所述的剂量进行常规的改变是必要的。所述的剂量还将取决于所述的给药途径。可以预期各种不同的途径，包括，口服给药，经肺给药，直肠给药，胃肠外给药，透皮给药，皮下给药，静脉注射给药，肌肉注射给药，腹腔内给药，吸入式给药，口腔内给药，舌下给药，注射给药，鞘内注射给药，经鼻给药等等。用于局部或着透皮给药的本发明化合物的剂量形式包括粉剂、喷雾剂，软膏剂，糊剂，霜剂，乳剂，凝胶剂，溶液，贴剂和鼻吸剂。在一个实施方案中，活性化合物在无菌条件下与一种药学上可接受的载体、任意防腐剂、缓冲剂、或者需要的推进物相混合。
所述的术语“闪释剂型”指的是以快速分散的剂量形式存在的化合物制剂。
所述的术语“立即释放”定义的是化合物在相对短暂的时间段内从一种剂量形式中进行释放，通常达到大约60分钟。所述的术语“控释”的定义包括延迟释放，延长释放，以及脉冲释放。所述的术语“脉冲释放”定义的是药物从一种剂量形式中进行一系列的释放。所述的术语“持续释放”或者“延长释放”定义的是化合物在一段延长的时间内从一种剂量形式中进行连续的释放。
“宿主”包括哺乳动物，例如，人类，伴侣动物(例如，狗，猫，鸟，以及类似动物)，农场动物(例如，牛，羊，猪，马，家禽，以及类似动物)以及实验室动物(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，鸟，以及类似动物)。在一种实施方式中，所述的宿主是人类。
如这里所述，成语″药学上可接受的″是指一种化合物、材料、组合物、载体和/或剂量形式，这种化合物、材料、组合物、载体和/或剂量形式通过医学判断可以适用于与人类或者动物的组织接触，且不会引起过度的毒性、刺激作用、过敏反应或者其他的问题或者并发症，且具有合理的利益/风险比率。
这里使用的术语“药学上可接受的载体”是本领域内已知的，并且包括，例如，药学上可接受的材料、组合物或者媒介物，例如，一种液态的或者固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或者胶囊材料，这些材料可以包括在组合物中用于携带或者从一个器官或者身体的一部分向宿主的另一个器官或者身体的另外一部分传递组合物。每种载体必须是“可接受的”，这表示它能够与主体组合物的其他成分相兼容并且不会伤害到病人。在某些实施方案中，一种药学上可接受的载体是一种非发热物质。可以用作药学上可接受的载体的材料的实施例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及它的衍生物，例如羧甲基纤维素钠盐、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状的黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油剂，例如花生油、棉花子油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)雷明氏(Ringer′s)溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中可以使用的其他无毒的相容性物质。
″药学上可接受的赋形剂″是指一种对制备药物组合物有效的赋形剂，所述药物组合物通常是安全无毒的，且在生物学上或者其他方面不会产生令人不欢迎的影响。所述″药学上可接受的赋形剂″包括适用于兽医使用的赋形剂以及适用于人类药物应用的赋形剂。本发明说明书和权利要求书中使用的″药学上可接受的赋形剂″包括一个或者一个以上的这种赋形剂。
本发明化合物能够进一步形成一种盐。本发明化合物所有的这些形式可应该包含在要求保护的发明范围内。
本发明化合物(I)可以包括存在原子的同位素。本发明包括在本发明化合物中存在的原子的所有同位素。同位素是指具有相同的原子序数但是具有不同原子量的原子。作为常见的例子，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括C-13和C-14，这些常见的例子并不作为对本发明的限制。
化合物的“药物可接受的盐”指的是一种药物学上可以接受的盐类，并且所述的盐类具有所述母本化合物的预期的药物学活性。
这里所使用的“药物可接受的盐”指的是被公开的化合物(I)的衍生物，其中所述的母本化合物(I)通过被制成其酸式盐或者碱式盐而被修饰。药物可接受性盐的例子包括，但不局限于，碱性残基例如胺的矿物盐或者有机酸盐，酸性残基例如羧酸的碱金属盐或者有机盐，以及类似的盐。所述的药物可接受性盐包括所述母本化合物的常规的无毒性盐或者季胺盐，它们来自于，例如，无毒性无机酸或者有机酸。例如，这样的常规的无毒性盐包括，但不局限于，那些来自于无机酸以及有机酸的盐，选自2-乙酰氧基苯甲酸盐，2-羟基乙烷磺酸盐，醋酸盐，抗坏血酸盐，苯磺酸盐，安息香酸盐，重碳酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，乙二胺四乙酸盐，乙烷二磺酸盐，1，2-乙烷磺酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，葡糖酸盐，谷氨酸盐，羟基乙酸盐，对α羟乙酰氨基苯砷酸盐(glycollyarsanilate)，己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)，hydrabamic，氢溴酸盐，盐酸盐，氢碘酸盐，羟基马来酸盐，羟基萘酸盐，羟基乙磺酸盐，乳酸盐，乳糖酸盐，十二烷基磺酸盐，马来酸盐，苹果酸盐，扁桃酸盐，甲烷磺酸盐，napsylic，硝酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐，泛酸盐，苯乙酸盐，磷酸盐，多聚半乳糖醛酸盐，丙酸盐，水杨酸盐，硬脂酸盐，亚醋酸盐(subacetic)，琥珀酸盐，磺酸盐，磺胺酸盐，硫酸盐，丹宁酸盐，酒石酸盐，甲苯磺酸盐，以及普遍出现的氨基酸，例如，甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，等等。
其他的例子包括己酸，环戊烷丙酸，丙酮酸，丙二酸，3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸，苯乙烯酸，4-氯苯磺酸，2-萘基磺酸，4-甲苯磺酸，樟脑磺酸，4-甲基二环-[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸，3-苯丙酸，三甲基醋酸，叔丁基醋酸，己二烯二酸，以及类似的酸。本发明还包括下述方式形成的酸：存在于所述母本化合物中的一种酸性质子被一种金属离子所取代而生成的酸，或者是这种酸性质子与一种有机碱发生配位反应而生成的酸，其中所述的金属离子是，例如，碱金属离子，碱土金属离子，或者铝离子；所述的有机碱是例如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨基丁三醇，N-甲基葡糖胺，以及类似的有机碱。
本领域技术人员应当理解，所有涉及到的药学上可接受的盐包括这里定义该盐的溶剂加成形式(溶剂化物)或者结晶形态(多形体)。
术语″结晶多形体″或者″多形体″或者″结晶形态″是指一种晶体结构，其中化合物(I)(或者其盐或者溶剂化物)可以以不同的结晶存储排列形式结晶，且所有的化合物具有相同的化学组成。不同的结晶形态通常具有不同的X射线衍射图、不同的红外光谱、不同的熔点、不同的密度硬度、不同的晶体形状、不同的光学和电性质、不同的稳定性和不同的溶解度。再结晶溶剂、结晶速率、贮存温度及其他因素可以使一种结晶形态占主体地位。所述化合物的结晶多形体可以通过在不同的情况结晶来制备。
此外，本发明中所述的化合物(I)，例如，所述化合物(I)的盐，能够以水合或者非水合(无水的)的形式存在，或者以含有其他溶剂分子的溶剂化物的形式存在。水合物的非限制性例子包括一水合物，二水合物，等等。溶剂化物的非限制性例子包括乙醇的溶剂化物，丙酮的溶剂化物，等等。
“溶剂化物”指的是含有化学计量或者非化学计量的溶剂的溶剂加成的形式。一些化合物具有以结晶固体的状态锁住固定摩尔比率的溶剂分子的趋向，因而形成了一种溶剂化物。如果所述的溶剂是水，则形成的所述溶剂化物是水合物，当所述的溶剂是乙醇，则形成的所述溶剂化物是醇化物。当一个或者多个水分子与一种物质发生组合，并且所述的水在其中仍然以H2O的形态保持其分子状态，则形成水合物，这样的组合能够形成一种或者多种水合物。
本发明所述的药物可接受性盐可以通过常规的化学方法从化合物(I)中合成得到。一般的，可以通过将化合物(I)与化学当量剂量的适当的碱或者酸，或者二者的混合物进行反应，来制备这样的盐，其中所述的反应是在水中或者在有机溶剂中进行的，或者是在水以及有机溶剂的混合液中进行的；其中可以使用非水介质，例如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇，或者乙腈。适当的盐的列表可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences《雷氏药学大全》第18版中找到(Mack出版公司，1990年)。
本发明化合物(I)还可以被制备为一种前体药物，例如，一种药学上可接受的前体药物.术语″前药(pro-drug)″和″前体药物(prodrug)″在这里可以互换使用，涉及任意能够在体内释放活性母体药物的化合物。由于已知前提药物能够提高药物的许多合乎需要的性质(例如，溶解度、生物利用率、制备方法等等)。本发明化合物(I)可以以前体药物的形式给药。因此，本发明包括目前要求保护化合物(I)的前体药物、它的传递方法以及包含该前体药物的组合物。″前体药物″包括任何共价结合的载体，当将所述前体药物对患者给药时，所述载体在体内能够释放有活性的本发明的母体药物。本发明的前体药物可以通过改进存在于本发明化合物(I)中的功能基团来制备，改进方法可以是裂解所述化合物(I)，包括通过常规操作裂解或者在活体内裂解。
“联合治疗”(或者“共同治疗”)包括将本发明所述化合物(I)与至少一种第二试剂一起进行给药，作为一个具体的治疗方案的一部分，意在通过这些治疗试剂的共同作用来提供有益的效果。这种组合所产生的所述有益的效果包括，但不局限于，由所述治疗试剂的组合而引发的药物动力学的共同作用或者药效的共同作用。这些治疗试剂的结合给药通常是在一段规定的时间段内进行的(通常是分钟，小时，天或者周，取决于所选择的组合)。“联合治疗”可以、但通常并非意在包括本发明中作为分别的单一治疗方案的两种或者更多种这类治疗试剂的给药，这些治疗试剂顺带的并且随意的构成了本发明中所述的组合。
“联合治疗”意在包括以一种连续的方式给药这些治疗试剂，其中每种治疗试剂在不同的时间给药，也包括以一种本质上同时的方式给药这些治疗试剂，或者至少给药这些治疗试剂中的两种。本质上同时给药的方式可以通过例如向宿主给药单一胶囊的方式来完成，所述的胶囊中含有固定比例的每种治疗试剂，或者通过向宿主给药多个胶囊的方式来完成，所述的每一种胶囊为一种治疗试剂。每种治疗试剂的连续给药或者本质上同时给药的方式可能受到任意适当的途径的影响，所述的任意适当的途径包括，但不局限于，口服途径，静脉内途径，肌肉内途径，以及经由黏膜组织的直接吸收。所述的治疗试剂可以以同样的途径或者不同的途径进行给药。例如，可以以静脉内注射的方式给药所选择的组合中的第一种治疗试剂，而以口服的方式给药所述组合中的其他的治疗试剂。或者，例如，可以以口服的方式给药所有的治疗试剂，或者以静脉内注射的形式给药所有的治疗试剂。所述的治疗试剂的给药顺序并不是紧密苛求的。
“联合治疗”还包括将如上所述的治疗试剂进一步与其他生物活性成分以及非药物治疗(例如，外科手术或者放射性治疗)结合给药。当所述的联合治疗进一步包括一种非药物治疗时，所述的非药物治疗可以在任意适当的时间进行，只要通过所述治疗试剂与所述非药物治疗的组合的共同作用能够达到有益的效果即可。例如，在适当的情况下，当所述的非药物治疗与所述治疗试剂的给药在时间上发生分离，或许是几天或者甚至是几周，也仍然能够达到所述的有益效果。
在整篇说明书中，当组合物被描述为具有、包括、或者包含具体组分的时候，可以预期到所述的组合物同样是本质上由上述提及的组分组成，或者由上述提及的组分组成。类似的，当方法被描述为具有、包括、或者包含具体的方法步骤的时候，所述的方法同样是本质上由上述提及的方法步骤组成，或者由上述提及的方法步骤组成。进一步的，应当理解的是，这些步骤的顺序或者完成某些行为的顺序并非是实质性的，只要所述的发明仍然能够操作即可。并且，两个或者更多个步骤或者行为可以同时进行。
实施例
实施例1：化合物(I)的小规模合成
US20060160800A1描述了如下所述的初步合成。这一过程对小规模反应是十分有效的，所述小规模反应例如产生的产物质量高达50克的反应。
对于下列合成方法，除非另作说明，试剂和溶剂都按照商业供应者的说明使用。质子和碳核磁共振波谱源于Bruker AC 300或Bruker AV 300分光光度计，在300MHz下检测质子，在75MHz下检测碳。光谱给出ppm值(δ)和耦合常数，J，以赫兹为单位。四甲基硅烷被用作质子光谱的内标，对于碳光谱，溶剂峰作为参考峰。质谱和高效液相色谱质谱联用(LC-MS)数据来源于Perkin Elmer Sciex 100气压流电离(APCI)质谱仪。高效液相色谱质谱联用(LCMS)分析是通过利用连有254纳米紫外检测器的Luna C8(2)柱(100x4.6毫米)而获得，其中，使用一种标准溶剂梯度洗脱(方法B)。薄层色谱法(TLC)的运行是利用Analtech硅胶板，并通过紫外灯(UV)，碘或20wt％磷钼酸乙醇溶液观测。高效液相层析法分析是利用带有254纳米紫外检测的流行的C18柱(53x7毫米，Alltech)获得的，其中，使用一种标准溶剂梯度程序(方法A或方法B)。
方法A：
A＝含0.1v/v三氟乙酸的水溶液
B＝含0.1v/v三氟乙酸的乙腈溶液
时间(分钟) 流量(毫升/分钟) ％A ％B
0.0 3.0 95.0 5.0
10.0 3.0 0.0 100.0
11.0 3.0 0.0 100.0
方法B：
A＝含0.2v/v三氟乙酸的水溶液
B＝含0.2v/v三氟乙酸的乙腈溶液
时间(分钟) 流量(毫升/分钟) ％A ％B
0.0 2.0 95.0 5.0
4.0 2.0 5.0 95.0
N-苯甲基-2-(5-溴吡啶-2-基)乙酰胺的合成
将5-(5-溴代吡啶-2(1H)-基亚基)-2，2-二甲基-1，3-二氧六环-4，6-二酮(1.039克，3.46毫摩尔)、苯甲基胺(0.50毫升，4.58毫摩尔)和甲苯(20毫升)装入烧瓶中。在氮气存在的条件下，回流反应18小时，冷却后，放入冰箱冷冻。通过过滤收集产物，用己烷清洗得到大量的明亮的白色晶体(1.018克，96％)。
4-(2-(4-(4，4，5，5-四甲基[1，3，2]二杂氧戊硼烷-2-基)-苯氧基)乙基)吗啉的合成：
在0℃中，在不断搅拌的条件下，向4-(4，4，5，5-四甲基[1，3，2]二杂氧戊硼烷-2-基)-石炭酸(2.55克，11.58毫摩尔)，2-吗啉基-4-基乙醇(1.60毫升，1.73克，13.2毫摩尔)和三苯膦(3.64克，13.9毫摩尔)溶于二氯甲烷(60毫升)的溶液中逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)(2.82克，13.9毫摩尔)。将反应加热到室温，搅拌过夜。反应18小时后，再加入三苯基膦(1.51克，5.8毫摩尔)、2-吗啉基-4-基乙醇(0.70毫升，5.8毫摩尔和偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)(1.17克，5.8毫摩尔)。在室温下，继续搅拌反应2小时，浓缩反应产物，剩余物通过瞬时色谱法(在CHCl3中的含量为5％到25％的乙酸乙酯)而得到白色固体产物(2.855克，74％)。
2-(5-(4-(2-吗啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺化合物(I)的合成
将N-苯甲基-2-(5-溴代吡啶-2-基)乙酰胺(123毫克，0.403毫摩尔)、4-(2-(4-(4，4，5，5-四甲基[1，3，2]二杂氧戊硼烷-2-基)-苯氧基)乙基)吗啡(171毫克，0.513毫摩尔)和FibreCat 10071(30毫克，0.015毫摩尔)装于带有隔膜密封和搅拌棒的10毫升反应管中。然后加入乙醇(3毫升)，随后再加入含水碳酸钾溶液(0.60毫升，1.0M，0.60毫摩尔)。密封反应管并微波加热到150℃，反应10分钟。接着冷却反应物，浓缩除去大部分乙醇，随后溶于10毫升乙酸乙酯，连续的用水和饱和氯化钠溶液清洗。有机层用MgSO4干燥，过滤，浓缩得到白色固体。该白色固体同乙醚研磨而得到化合物(I)的白色粉末状固体(137毫克，79％)：mp135-137℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.70(d，IH，J＝2.0Hz)，7.81(dd，IH，J＝2.4Hz，J＝8.0Hz)，7.65(br s，IH)，7.49(d，2H，J＝8.8Hz)，7.37-7.20(m，6H)，7.01(d，2H，J＝8.8Hz)，4.49(d，2H，.7＝5.8Hz)，4.16(t，2H，J＝5.7Hz，3.82(s，2H)，3.78-3.72(m，4H)，2.84(t，2H，J＝5.7Hz)，2.62-2.58(m，4H)；HPLC(方法B)98.0％(AUC)，tR＝1.834分钟.；APCI MS m/z432[M+H]+。
实施例2：中等规模的化合物(I)二盐酸盐合成
本实施例概括的合成途径可以用于中等规模的反应中。方案1表示了至少50克化合物(I)二盐酸盐的批量生产方法。由六个步骤组成线性合成，第7步是制备一种试剂的步骤，该试剂是6-氟代吡啶-3-基硼酸(该试剂也可以商业购得)。顺序总产率为35％，其中平均产率为83％，最低产率步骤的产率为68％。在这7个步骤中只有一个步骤需要用到色谱技术。下面列出的过程在70克的规模下进行。
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1聚合物结合的二化合物(醋酸)二环己基苯基膦钯(II)，由Johnson Matthey，Inc公司生产，从Aldrich公司购得(编录号#590231)
第一步是威廉森醚合成法，该方法使用K2CO3粉末(3到3.5当量)作为碱基，使用氰化甲烷作为溶剂，在4-溴代苯酚(131克)和N-氯代乙基吗啉(化合物1作为盐酸盐；141克)之间进行合成。将各种成分混合并搅拌，回流整夜，得到较高的转化率(96.3-99.1％)。然后用二氯甲烷和正庚烷稀释，过滤反应混合物并蒸发，从而以基本上稳定的产率产生需要的产物2(216克)。注意，当含有相似的底物(即，4-溴代-3-氟代苯酚)时，转化率(即使在具有多次加热的情况下)通常是不高的(例如，59.9-98.3％)。烷基氯和所述K2CO3优选从Aldrich公司购买获得。如果持续的加热不能使反应完成，通过将粗品反应混合物溶解在4部分的甲烷中，并用4部分的15％的氢氧化钠水溶液冲洗除去苯酚，来方便的除去未反应的溴代苯酚。
第二步骤(Suzuki偶联反应)中需要的一种试剂是6-氟代吡啶-3-基硼酸(4)。这种试剂既可以通过商业途径购得，也可以通过在低温条件下(＜-60℃)在甲基叔丁基醚(TBME)中用n-丁基锂(1.2eq)进行5-溴代-2-氟代吡啶(3，102克)的锂-溴化物交换，随后加入三异丙基硼酸盐(1.65eq)而方便的制得。这个反应的两个阶段都是短暂的，总共的反应时间(包括添加时间)在大约3小时左右。使用24％的氢氧化钠水溶液对反应淬火，同时在有机层将产物与杂质相分离。一旦去掉水相层，就用盐酸中和并用乙酸乙酯提取。干燥有机层之后，用一些正庚烷稀释，浓缩使产物沉淀/结晶。过滤，从而以较高的纯度(96.4％AUC)和很好的产率(69克，79-90％；参见试验部分关于产率测定的记录)产生硼酸盐4，该产物不需要进一步纯化就可以被使用。
在线性顺序(Suzuki偶联反应)中的第二个反应步骤是一种简单的反应，将所有的试剂[化合物2(111克)、碳酸钠水溶液、二甲醚(DME)和Pd(PPh3)4(0.04eq)]装入反应烧瓶中，将反应物加热回流；将反应混合物脱气除去氧气。一旦反应完成(在7小时内)，下一步的工作包括在烧瓶的一侧(此处无明显的水相层)将反应溶液从有机盐中轻轻倒出(或者虹吸出)，冲洗烧瓶并干燥，从结合的有机物中除去溶剂。粗品化合物5从异丙醇/正庚烷中结晶出来，从而使该材料与粗品相比具有改善的纯度，但是仍然需要进行色谱分析法(硅胶与粗品的比例大约是8.5∶1)来获得足够纯净(＞98％)的材料；产率是68％(79.5克)。使用干净的化合物5事下面的步骤中不在需要进行色谱分析法，下一步骤是氟原子的氰化甲烷取代。
用氰化甲烷取代氟化物也是一种简单的反应，简单的室温条件下的结晶作用就可以以较高的产量和纯度提供干净的化合物6的粗产品。该反应包括，使用六甲基乙硅烷钾KHMDS(8eq)/四氢呋喃在-10℃下使氰化甲烷(6.5eq)形成“烯醇化物”，随后立即加入化合物5的氟化物(79克)。该反应是快速的，在用饱和盐水进行一小时淬火之后完成。干燥并蒸发有机溶剂，之后，所得粗品混合物只由两种组分组成，即需要的产品和一种更少的极性产物，这种极性产物是由氰化甲烷的表面自缩合作用形成的。将粗品混合物在异丙醇/正庚烷中搅拌，并静置过夜，从而导致产物完全结晶，将结晶过滤出来并洗涤，以很好的产率(64克，76％)产生高纯度(99.3％AUC)的化合物6。
在40％的硫酸(在甲醇中)中加热直到反应完全(25小时)可以完成化合物6(64克)的甲醇分解作用。随后冷却反应，用硫酸镁搅拌，将微量痕量的水解产品(ArCH2-CO2Me)转入产物中，然后加入到冷却的K2CO3水溶液中，同时用二氯甲烷提取。干燥并蒸发大部分的二氯甲烷，随后加入5％的乙酸乙酯(在庚烷中)，然后进一步浓缩至产生产物结晶。过滤固体产物并洗涤，得到高纯度(98.9％AUC)高产率(82％)的化合物7，其他的高纯度产物(4克)可以从母液中获得，总产率是61.7克(87％)。
该反应也包括酰胺化步骤，用各种组分(化合物7(61克)、苄胺(3eq)、和高沸点的苯甲醚)装入反应容器中，然后加热回流直到反应完全。冷却反应混合物以高纯度(98.9％)高产率(81％)得到目标化合物的完整的结晶。
最后一步是目标化合物二盐酸盐的形成。为了保证两个碱基位点的完全质子化，在完全的乙醇中进行反应，乙醇可以自如的溶解二盐酸盐。然后蒸发直至全干，用乙醇“驱逐”反应混合物两次从而去掉过量的氯化氢。将所得粘性油溶解于乙醇(2份)中，然后加入大体积(20份)的乙酸乙酯，同时快速搅拌。过滤，用乙酸乙酯(不含正庚烷)洗涤，并真空干燥，从而提供奶油色-白色粉末状的化合物(I)二盐酸盐。最后总共获得68克(产率97％)的高纯度(99.6％AUC)盐，该盐包括痕量的乙酸乙酯(4.8％重量/重量)、乙醇(0.3％重量/重量)、和正庚烷(0.6％重量/重量；在真空干燥之前用正庚烷进行最后的洗涤)。这些盐可以从热的乙醇/乙酸乙酯中结晶(与上面描述的沉淀法不同)，从而产生结晶珠，该结晶珠具有很低的俘获溶剂水平(只有0.26％重量/重量的乙酸乙酯和0.45％重量/重量的乙醇)并且可以自由流动。
4-(2-(4-溴代苯氧基)乙基)吗啉(化合物2)的制备
将化合物1(140.7克，0.756摩尔)、4-溴代苯酚(130.6克，0.755摩尔)、无水K2CO3粉末(367.6克，2.66摩尔，3.5eq)、和氰化甲烷(1.3升)装入5升的三颈圆底烧瓶中，该三颈圆底烧瓶装有机械搅拌器、带有转换接头的温度计、冷凝器和氮气入口管(在冷凝器的顶部)。在80℃下剧烈搅拌所述混合物(桨叶触到烧瓶的低端)过夜，随后用二氯甲烷(DCM)(500毫升)和正庚烷(200毫升)稀释并用硅藻土过滤。蒸发(旋转蒸发，然后真空蒸发)至干燥，产生淡黄色油状的化合物2(216.00克，产率100％，96.3％AUC，包括3.7％未反应的溴代苯酚)。这些材料不经过进一步纯化就可以使用。
1H NMR(CDCl3)δ2.57(t，4H)，2.79(t，2H)，3.73(t，4H)，4.08(t，2H)，6.78(d，2H)，7.37(d，2H).MS(来自LC/MS)：m/z 287.1[M+I].
通过2克的样品进行的试验证明溴代苯酚可以被方便的被去除，方法是首先将样品溶解于甲苯(8克)中并用8克的15％氢氧化钠水溶液洗涤；液相色谱显示回收所得的产品(1.97克；98.5％回收率)中没有未反应的溴代苯酚的痕迹。
6-氟代吡啶-3-基硼酸(化合物4)的制备：
搅拌并冷却(干冰-丙酮浴)无水甲基叔丁基醚(TBME)(620毫升；在装备有机械搅拌器、带有转换接头的温度计、冷凝器和氮气入口管的3升三颈圆底烧瓶中)，将其加入(通过注射器加入)到2M的BuLi(352毫升，0.704摩尔，1.2eq)中。在13分钟内，向这种快速搅拌的、冷却的(＜-75℃)混合物中加入化合物3(102.2克，0.581摩尔)在无水甲基叔丁基醚(TBME)(100毫升)中的溶液，在此期间，内部温度上升到-62℃。继续搅拌反应物45分钟(将温度维持在-62℃到-80℃之间)，随后快速、连续的添加4份三异丙基硼酸盐(总量180克，0.957摩尔，1.65eq)。在添加将近完成的时候，内部温度达到-33℃。随后在冷水浴中再进行45分钟的搅拌(内部温度下降至-33℃到-65℃)，去掉冷水浴使搅拌混合物在50分钟内自己升温到-22℃。之后在15分钟内加热(通过水浴加热)到6℃，将所述搅拌的反应混合物放置到冰水浴中，在氮气条件下用冷却的氢氧化钠(160克)在水中(500毫升)的溶液淬火。一旦添加完成，内部温度是20℃。在室温条件下搅拌混合物1.5小时。倒掉水层，用350毫升浓缩的盐酸中和到pH值大约为7，然后用乙酸乙酯(3x 1升)提取。这是pH值大约为8-9，因此，使用大约15毫升浓缩的HCl将水层的PH值调节到大约为7，并进一步用乙酸乙酯(2x1升)提取。干燥(Na2SO4)结合了乙酸乙酯的萃取物，过滤并浓缩到体积大约为150毫升。搅拌浓缩物，分部分加入正庚烷(总体积大约为300毫升)，使产物沉淀/结晶。过滤，用正庚烷(100毫升、300毫升，之后在用300毫升)洗涤固体并风干，从而产生灰白色固体状的标题产物(68.6克，产率是79-90％；液相色谱纯度为96.4％，核磁共振展示大约5.5％w/w的正庚烷)，该产物不经过进一步纯化就可以成功的被使用。质谱联用(LC/MS)显示这是如下两种物质的混合物，较高分子量物质的密度起主要作用(注意如果假定成分中只有硼酸盐时，反应产率是79％，如果假定成分中之后环硼酸盐的话，反应产率为90％)：
1H NMR(CDCl3)δ7.14(dd，1H)，8.27(ddd，1H)，8.39(br s，2H，2OH)，8.54(fine d，1H)。MS(来自LC/MS)：m/z 143.0[M+1；对于硼酸盐]且370.0[M+1；对于上述环硼酸盐].
4-(2-(4-(6-氟代吡啶-3-基)苯氧基)乙基)吗啉(化合物5)的制备：
将化合物2(110.7克，0.387摩尔)、化合物4(71.05克，0.477摩尔，1.23eq)和二甲醚(DME)(700毫升)装入2升的三颈圆底烧瓶中，该三颈圆底烧瓶装有机械搅拌器、带有转换接头的温度计、冷凝器和氮气入口管(在冷凝器的顶部)。通过向搅拌后的溶液中快速通入氮气5分钟对所得的搅拌溶液脱气，随后，加入脱气后的碳酸钠(121.06克，1.142摩尔，3eq)在水(250毫升)中的溶液和固体pd(pph3)4(19.8克，0.044eq)。在末次添加完成之后，用氮气纯化容器中位于反应混合物上部的空间，然后在80℃-85℃(内部温度)条件下搅拌混合物7小时，随后冷却到室温由于缺少水相层，轻轻倒出上清液，留下无机盐(还有吸附的水)。用50％的二氯甲烷/乙酸乙酯(2x 250毫升)洗涤含有无机盐的反应烧瓶，相倒出的上清液中加入洗涤物。干燥结合的有机物(Na2SO4)，过滤并蒸发直至干燥，产生暗褐色的油状物(148克)。向这种油状物中加入150克50％的正庚烷/异丙醇(IPA)，随后搅拌、冷却(通过冰水浴冷却)，再次结晶。加入额外的正庚烷(50克)过滤所得固体、洗涤并风干，产生48克的淡褐色固体。之后，蒸发滤液直至干燥，在100毫升50％的正庚烷/异丙醇(IPA)中搅拌反应混合物，随后加入更多的正庚烷(大约100毫升)，停止反应并放入冰箱中结晶。过滤所得固体、用正庚烷洗涤并风干，得到61克的胶状固体。蒸发所得滤液产生一种油状物(34克)，这种油状物中含有非常少的极性杂质，所述极性杂质包括Ph3P＝O，因此，将其分别放入2N的盐酸(240毫升)和乙酸乙酯(220毫升)中。去掉底部水相层，然后与乙酸乙酯一起搅拌，用碳酸钠将pH值中和到大约为7-8。干燥乙酸乙酯层，过滤并蒸发至干燥(22克)。将48克、61克和22克部分在DCM包裹的硅胶(1.1千克)中进行色谱分离。用二氯甲烷(DCM)(400毫升)、50％二氯甲烷(DCM)/乙酸乙酯(5升)洗提，然后用包含增加量的甲醇/Et3N(最开始含有1.5％甲醇/1％Et3N，最后含有5％甲醇/3％Et3N)的50％的二氯甲烷(DCM)/乙酸乙酯(8升)洗提，产生77.68克的粘性油状物(纯度98.0％)，随后立刻在搅拌的正庚烷(300毫升)中结晶。过滤、用正庚烷洗涤并风干，产生75.55克的固体化合物5(98.7％AUC)。按照对上述24克样品所进行的一样，通过从包括Ph3P＝O的较早的色谱馏分中除去杂质Ph3P＝O，获得其他纯的化合物5(总量为3.9克，98.6-99.3％AUC)，随后蒸发结晶。化合物5的总产率为79.5克(68％)。
1H NMR(CDCl3)δ2.59(t，4H)，2.84(t，2H)，3.75(t，4H)，4.16(t，2H)，6.97(dd，1H)，7.01(d，2H)，7.46(d，2H)，7.92(ddd，1H)，8.37(fine d，1H).MS(来自LC/MS)：m/z 303.2[M+I].
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)氰化甲烷(6)的制备：
在3升三颈圆底烧瓶上装有机械搅拌器、带有转换接头的温度计、另外的漏斗和氮气入口管(在漏斗的顶部，通过鼓泡器提供正压)。通过快速的氮气流通过鼓泡器，除去阻聚剂并用KHMDS(415.8克，2.08摩尔)和无水四氢呋喃(1升)装入所述烧瓶中。搅拌并冷却(冰/甲醇浴冷却，溶液的内部温度为-8℃)KHMDS/四氢呋喃溶液，然后在22分钟内将其逐滴加入到乙腈(MeCN)(70克)在四氢呋喃(110毫升)中的溶液中，随后立即以相对快的速度(4分钟)加入化合物5(79.06克，0.262摩尔)在四氢呋喃(400毫升)中的溶液，此时，反应混合物的内部温度达到10℃。持续冷却(1小时)使温度下降到-6℃，然后通过薄层色谱法显示反应完全。随后，用饱和盐水(1升)淬火反应混合物30分钟(内部温度为-3℃)，并用乙酸乙酯(500毫升)稀释。之后，除去水相层，干燥有机溶液(无水硫酸钠)并过滤，蒸发至干燥(成一种油)，随后完全溶解于异丙醇(IPA)(150毫升)中，用正庚烷(300毫升)稀释，加入晶种(通过将大约100毫克的粗品油状物溶解于异丙醇(IPA，大约150毫克)中，并用正庚烷(大约2.5毫升)稀释获得)，然后静置整夜。在搅拌打碎结晶固体之后，过滤固体，用250毫升2∶1正庚烷/异丙醇(IPA)洗涤，然后用正庚烷洗涤多次，风干，产生64.38克结晶的黄褐色固体状标题产物6(产率为76％)。从滤液中获得另外的5.88克较少的纯物质。
1H NMR(CDCl3)δ2.59(t，4H)，2.84(t，2H)，3.74(t，4H)，3.97(s，2H)，4.17(t，2H)，7.02(d，2H)，7.46(d，1H)，7.51(d，2H)，7.87(dd，1H)，8.77(fine d，1H).MS(来自LC/MS)：m/z324.4[M+I].
甲基2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)醋酸盐(7)的制备：
向2升的单颈圆底烧瓶中装入化合物6(64.00克，0.198摩尔)和甲醇(360克)，随后缓慢、小心的逐滴加入硫酸(240克)，回流搅拌(115℃油浴)所得均匀溶液直到反应完全(25小时，还有0.8％的未反应的起始材料)和3.5％的ArCH2CO2H。冷却一段时间之后，加入硫酸镁(75克)，搅拌混合物并静置45分钟(组合物中含有96.3％的产物、0.8％未反应的起始材料和2.5％ArCH2CO2H)。然后缓慢的将该反应混合物加入到快速搅拌的冷却的混合物中，该混合物是二氯甲烷(DCM)(2升)和碳酸钾(450克)水(600毫升)溶液的混合物。将所得乳状剂静置整夜。虹吸抽出有机溶液中清澈的部分，用水和二氯甲烷(DCM)反复处理剩余的部分，将清澈的有机物与虹吸出来的原始部分相结合。结合的有机物被干燥(无水硫酸钠)、过滤并浓缩到体积为大约1.2升，随后，加入300毫升的5％的乙酸乙酯(在正庚烷中)和正庚烷，再次浓缩混合物(加热旋转蒸发)，从而除去二氯甲烷(DCM)。此时，加入15毫升乙酸乙酯，搅拌加热的材料直到开始出现结晶，搅拌直到结晶过程几乎完全，然后静置并冷却到室温完成结晶作用。随后过滤固体，用300毫升5％的乙酸乙酯(在正庚烷中)和正庚烷(100毫升)洗涤，然后彻底风干，产生57.74克(产率为82％)淡黄色固体状的化合物7(98.9％AUC)。从滤液中获得另外的3.94克较少的纯净的产物(97.9％AUC)(总产率为87％)。
1H NMR(CDCl3)δ2.60(t，4H)，2.84(t，2H)，3.74(重叠并且s，6H)，3.89(s，2H)，4.17(t，2H)，7.01(d，2H)，7.34(d，1H)，7.49(d，2H)，7.80(dd，1H)，8.74(fine d，1H).MS(来自LC/MS)：m/z 357.4[M+I].
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺(化合物(I)自由基)的制备：
向1升的单颈圆底烧瓶中装入化合物7(61.4克，0.172摩尔)、苄胺(55.6克，0.519摩尔，3eq)和无水甲氧基苯(300克)，然后回流搅拌直到反应基本完全(23小时，165℃油浴温度；内部温度147℃)，然后冷却直至接近室温。用甲苯(1毫升)稀释一部分的反应混合物(1毫升)从而得到这部分的完全结晶。然后将这些晶种加入到反应混合物中，静置，直到全部的反应混合物生成结晶成为单一单元。向其中加入甲苯(150毫升)，搅拌混合物从而打碎固体。向其中加入正庚烷/甲苯(1∶1，100毫升)，进一步粉碎固体混合物。最后，加入正庚烷(50毫升，然后25毫升)再次进一步的粉碎混合物，在过滤固体之前静置反应混合物30分钟。过滤固体，先后用2∶1的甲苯/正庚烷(300毫升)，1∶2的甲苯/正庚烷(300毫升)，和正庚烷(2x300毫升)洗涤过滤所得固体，然后干燥(先是空气干燥，然后高真空干燥)产生60.16克(产率是81％)白色固体状的标题产物(＞98.9％AUC)。从原始液体中获得另外的2.5克较少的纯净的产物(97.4％AUC)。
1H NMR(CDCl3)δ2.60(t，4H)，2.83(t，2H)，3.74(t，4H)，3.82(s，2H)，4.18(t，2H)，4.49(d，2H)，7.01(d，2H)，7.2-7.35(m，6H)，7.49(d，2H)，7.64(brt，1H)，7.81(dd，1H)，8.69(fine d，1H).MS(来自LC/MS)：m/z 432.5[M+I].
4-(2-(4-(6-(2-(苯甲基胺)-2-氧基乙基)吡啶-3-基)苯氧基)乙基)-吗啉-4-氯化苯镁(化合物(I)二盐酸盐)的制备。
向搅拌的化合物(I)(自由基，60.00克)在完全乙醇(600毫升)的悬浮液中加入170毫升2.5M的盐酸(在乙醇中)，加入25毫升的乙醇从而冲洗烧瓶的几个侧壁。在室温条件下搅拌所得的均匀溶液(20分钟)，然后蒸发至接近干燥(从而起泡)。在加入乙醇(2x 150毫升)洗涤之后，将残余物溶解在乙醇(150毫升)中，然后缓慢的加入正庚烷直到所得混合物呈现饱和状态(从出现浑浊到出现剩余物共需要33毫升)。然后静置整夜，形成两层。之后加入额外的正庚烷(250毫升)，这时仍不能诱导产生结晶，因此将反应混合物浓缩直到体积大约为200毫升，此时，反应混合物仍然是均质的。将这种浓稠的均质溶液逐滴加入到快速(机械)搅拌的乙酸乙酯(2升)中，在加入完成之后，用25毫升的乙醇洗涤原始烧瓶，然后向快速搅拌的混合物中加入一个漏斗。继续持续快速搅拌反应混合物大约一小时，然后过滤混合物并且将所得固体(部分成胶的)用乙酸乙酯(300毫升)洗涤，之后，用正庚烷洗涤。一旦开始使用正庚烷洗涤，所得固体会产生更多的胶体。将玻璃状陶瓷质的布氏漏斗和他的内含物一起包裹(用毛巾纸包裹/橡胶带包裹)，然后立刻放入真空干燥炉中。在-45℃下真空干燥整夜，在氮气条件下打开真空，包含产物(起泡沫的固体)的布氏漏斗立刻被放入拉链封闭的背袋中，然后，在氮气条件下(手套带)转移到瓶中，并将起泡沫的固体粉碎成粉末。第二天晚上在高度真空(-45℃)条件下干燥，只产生1.3克的额外重量损失。经过第三天晚上的高真空(-45℃)干燥可以获得基本上稳定的重量，此时的重量损失只有0.2克。最后得到的材料重量为68.05克(产率97％)，包括0.29eq((4.8％重量/重量)的乙酸乙酯、0.035eq(0.3％重量/重量)的乙醇和0.03eq(0.6％重量/重量)的正庚烷。纯度是99.6％。
1H NMR(二甲基亚砜-(I6)δ3.1-3.3(m，2H)，3.45-3.65(m，4H)，3.8-4.0(m，4H)，4.11(s，2H)，4.32(d，2H)，4.57(t，2H)，7.19(d，2H)，7.2-7.4(m，5H)，7.88(d，2H)，7.93(d，1H)，8.68(dd，1H)，8.99(br t，1H)，9.10(fine d，1H)，11.8(br s，1H).MS(来自LC/MS)：m/z432.5[M+1自由基]。
元素分析(对于C26H29N3O3·2HCl·0.035乙醇·0.29乙酸乙酯·0.03正庚烷·0.8H2O)：
a.计算百分比(％)：C，60.03；H，6.54；N，7.65；Cl，12.91
b.观测百分比(％)：C，59.85/59.97；H，6.54/6.47；N，7.67/7.67；Cl，13.10/13.24
计算的FW：534.63(由于1H NMR对H2O不敏感，因此这里并没有考虑0.8H2O的值，这个值在处理这种极易吸湿的粉末过程中可能是上升的)。
测定这些材料中乙基氯化物水平，测定结果是98ppm。同时分析样品，测定结果发现包含5,800ppm的正庚烷。
分析这些样品的另一部分，得到下列结果：99.6％AUC、1640ppm乙醇、41,480ppm乙酸乙酯，5600ppm正庚烷、未检测到甲氧基苯和120ppm的乙基氯化物。
使用上述干燥的盐也可以发展盐的重结晶过程。这种过程只有在处理高度纯净的粗品盐(包含剩余的乙醇)时才能很好的发挥作用，所述高度纯净的粗品盐是通过浓缩盐酸盐形成反应混合物而产生的。
将盐(575毫克)溶解于两倍重量的纯乙醇(1.157克)中，然后在氮气条件下加热。向这种加热后的溶液(搅拌的)中加入1.6克25％的乙醇(在乙酸乙酯中)，随后加入乙酸乙酯得到一种混浊的溶液。将这种混浊的加热后的溶液冷却到室温，在冷却过程中发生结晶作用。在结晶作用完成之后(2小时)，过滤收集结晶的固体，用无水乙酸乙酯(大约40毫升)洗涤，并真空干燥，从而产生424毫克可随意流动的固体状的化合物(I)的二盐酸盐(细小的珠粒，99.8％AUC)，其中只包含0.05eq(0.45％重量/重量)的乙醇和0.015eq(0.26％重量/重量)的乙酸乙酯。使用异丙醇/乙酸乙酯能够获得稍微好一些的回收率(从586毫克中获得460毫克)，但同时，溶剂捕获水平也更好[0.085eq(1.0％重量/重量)的异丙醇和0.023eq(0.4％重量/重量)的乙酸乙酯]。
实施例3：化合物(I)二盐酸盐的大规模合成
这里使用的试剂或者溶剂是从供货商处购买得到的。通过高压液相色谱、气相色谱/质谱联用、或者1H NMR监控反应过程。使用Analtech硅胶板进行薄层色谱(TLC)分析并且通过紫外(UV)灯(254纳米)观测。在Agilent1100系列仪器上进行高压液相色谱(HPLC)。使用Bruker AV 300可以获得质子核磁共振谱图和碳原子的核磁共振谱图，其中在300MHz下获得质子的核磁共振谱图，在75MHz下获得碳原子的核磁共振谱图。使用溶剂的峰作为质子谱图和碳原子谱图的参照峰。
4-(2-(4-溴代苯氧基)乙基)吗啉(化合物2)的制备
向装配有回流冷凝器和测温传感器的50升夹套反应器中装入4-(3-氯代丙基)吗啉(2.44千克，0.54摩尔)、4-溴代苯酚(2.27千克，0.54摩尔，1.0当量)，制成粉末状的碳酸钾(6.331千克，1.88摩尔，3.50当量)和二甲基甲酰胺(DMF，12.2升)并搅拌。随后，江反应混合物加热到60-65℃然后搅拌过夜。在17.5小时之后，将反应混合物冷却到20-25℃。将反应混合物倒入不同的反应器中，这里的反应器装配有底部阀门。当温度维持在20-30℃时，向反应器中加入水(48.7升)。分离各个相。用甲基三丁基乙醚(MTBE)(2x 24.4升)提取水相层。向结合的有机相中加入Dl水(18.3升)，然后加入6M的氢氧化钠(18.2升)。将混合物搅拌2-5分钟，然后分离各相。用水(24.4升)和盐水(24.4)洗涤有机相，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩，从而产生3370克黄色油状物(89％，粗产品，通过高压液相色谱测定AUC为99.4％)。
6-氟代吡啶-3-基硼酸(化合物4)的制备
一种72升的反应器上装配有回流冷凝器和测温传感器。向这种反应器中加入5-溴代-2-氟代吡啶(1.17升，0.568摩尔)、甲苯(18.2升)和三异丙基硼酸盐(3.13升，0.68摩尔，1.2当量)并搅拌。向反应器中加入四氢呋喃(4.4升)然后将反应混合物冷却到-35℃到-50℃之间。当温度维持在-35℃到-45℃之间时，小心的向反应器中加入正丁基锂(2.5M的正庚烷溶液，5.44升，0.68摩尔，1.2当量)。5小时后，认为反应完全，将反应混合物加热到温度大约为-15℃到-20℃之间。向反应中加入2M盐酸(11.80升)同时将反应温度维持在大约-15℃到0℃之间。在18℃到23℃条件下搅拌反应混合物(16小时)，分离各相。用6M氢氧化钠(6.0升)提取有机相。在反应器中混合酸性和碱性的水相，加入6M的盐酸(2.5升)直到pH值达到7.5。然后向水相中加入氯化纳(6.0千克)。用THF(3x 20升)提取水相。用硫酸镁干燥结合的有机相并浓缩产生1300克黄褐色固体(81％粗产率)。
4-(2-(4-(6-氟代吡啶-3-基)苯氧基)乙基)吗啉(化合物5)的制备
向72升装配有回流冷凝器、喷射管、鼓泡器和测温传感器的反应器中装入6-氟代吡啶-3-基硼酸(2.84千克、1.24当量)、4-(2-(4-溴代苯氧基)乙基)吗啉(4.27千克，1.0当量)和二甲醚(DME)(27升)。开始搅拌并且向反应混合物中加入碳酸钠(4.74千克，3.0当量)在去离子水(17.1升)中的溶液。向反应混合物中通入氩气鼓泡50分钟。在氩气环境下，向反应混合物中加入四(三苯基膦)合钯(750克，0.04当量)在二甲醚(DME)(1.0升)中的料浆。将反应混合物加热到75℃-85℃并且搅拌过夜(17小时)。冷却反应混合物使温度在18℃-22℃之间。向反应器中加入去离子水(26.681千克)和甲基叔丁基醚(26.681升)病搅拌5分钟。分离各个相，并且用甲基叔丁基醚(2x 26.7升)提取水相。用2M盐酸(1x 15.0升，3x 21.8升)提取结合的有机相。然后将水相倒回反应器中并加入乙酸乙酯(26.7升)。使用6M的氢氧化钠(26.7升)将pH值调节到6.2，同时将温度维持在15-25℃之间。分离各个相，用乙酸乙酯(2x26.7升)提取水相。用硫酸镁干燥结合的有机相并且浓缩产生4555克残余物(101％粗产率，通过高效液相色谱测定AUC为67.1％)。
4-(2-(4-(6-氟代吡啶-3-基)苯氧基)乙基)吗啉(化合物5)的制备
使用硅胶色谱分析法纯化粗产品(575克)，使用甲醇/乙酸乙酯/正庚烷(先后使用30％乙酸乙酯/正庚烷，50％乙酸乙酯/正庚烷、75％乙酸乙酯/正庚烷、100％乙酸乙酯和5％甲醇/乙酸乙酯)洗提。通过薄层色谱法(TLC，10％甲醇/二氯甲烷，Rf＝0.3)得到的纯馏分进行浓缩，得到420克淡褐色的固体(73％回收率，通过高效液相色谱测定AUC＞99.9％)。
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)氰化甲烷(化合物6)的制备
向5升的烧瓶中加入1M六甲基二硅基胺基钠(NaHMDS)(2.0升，5.0当量)在四氢呋喃中的溶液，并将温度冷却到-20℃到-15℃之间。当温度维持在-10℃范围内时，在20分钟的时间内向烧瓶中装入氟化物(119.7g，1.0当量)在四氢呋喃(500毫升)中的溶液。在20分钟内向烧瓶中加入氰化甲烷(82.5毫升，4.0当量)在四氢呋喃(170毫升)中的溶液，同时维持温度低于-10℃。随后搅拌反应混合物一小时。向反应中按照一定速率加入盐水(1.5升，12.6vol.)，同时维持温度低于10℃。然后加热溶液至室温，分离各个相。使用硅藻土过滤混合物并用四氢呋喃(先后用1x200毫升，1x 100毫升)洗涤。用甲苯(750毫升)提取水相。用硫酸镁干燥结合的有机相，过滤并用甲苯(2x250毫升)洗涤，并浓缩至干燥。向反应物中加入甲苯(1升)并将反应物浓缩至再次干燥，产生169.8克的油状物。在50℃下向油状物中加入甲基叔丁基醚(1190毫升，7vol.)，搅拌15分钟。在50℃条件下，10分钟内加入正庚烷(850毫升，5vol.)。然后在1.5小时内将反应混合物冷却至室温并搅拌2小时。过滤所得料浆，用1∶4的MBTE/正庚烷(2x 100毫升)洗涤，在烘箱中45℃条件下干燥过夜，从而产生102.3克的灰白色固体(80％粗产率，通过高效液相色谱测定AUC为98.8％)。
甲基2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)醋酸盐(化合物7)的制备
将腈类6(101克)和甲醇(1.01升，10vol.)装入3升的烧瓶中，该烧瓶装备有搅拌棒和温差电偶式测温仪。在15分钟内，向溶液中逐滴加入浓缩的硫酸(175毫升，10.0当量)，同时维持温度低于60℃。随后向溶液中逐滴加入30％的发烟硫酸(124毫升)同时维持溶液温度低于60℃。然后使用加热罩加热回流所述溶液并搅拌过夜。当认为反应完全时，将温度冷却到20℃。向另一个烧瓶(22升)中加入饱和碳酸氢钠(10.7升)和二氯甲烷(1.1升)，将温度冷却到15℃。同时维持温度小于20℃，将反应混合物添加到所述碳酸氢钠/二氯甲烷混合物中，搅拌15分钟淬火并分离各个相。用二氯甲烷(1x550毫升，1x300毫升)提取水相。用硫酸镁干燥结合的有机相并浓缩至干燥，产生105克橙黄色固体(94％粗产率，通过高效液相色谱测定为AUC为97.7％)。
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺(化合物(I))的制备
将酯类化合物7(103克)、甲氧基苯(513毫升，5vol.)和苯甲胺(94毫升，3.0当量)装入3升的烧瓶中，该烧瓶装备有温差电偶式测温仪和高架搅拌棒。将反应混合物加热到142℃并搅拌2天。将反应混合物冷却到45-50℃并继续搅拌两个小时。在一个小时内，向反应混合物中逐滴加入正庚烷(1.5升)，然后在三个小时内将反应混合物溶液冷却到室温，在搅拌过夜。过滤所得浆液，先后用4∶1的甲氧基苯/正庚烷(200毫升)和正庚烷(3xlOO毫升)洗涤。在烘箱内干燥整夜，得到112.1克黄褐色固体状的产物(90％产率，通过高效液相色谱法测定AUC为99.6％)。单一正庚烷异构体的使用对充分测定残余溶剂是必不可少的。参加图5所述的化合物(I)的1H NMR。
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺二盐酸盐(化合物(I)二盐酸盐)的制备
向2升烧瓶中加入乙醇(1.0升)，并向该烧瓶中缓慢的加入乙酰氯(62.5毫升，3.0当量)并搅拌40分钟。在30分钟内向所得溶液中加入化合物(I)(100克)，同时维持温度为30℃。将所得溶液的质量浓缩到270克。向浓缩后的溶液中在20分钟内加入乙酸乙酯(2升)同时进行剧烈的搅拌。将反应混合物搅拌过夜然后在氮气条件下过滤从而产生2种不同的固体产物，分别是黄褐色的固体(73.5克)和黑色的固体克)。混合干燥的固体，产生的结合产率为99.9％。通过高效液体色谱分析表明纯度(AUC)为99.0％。
分析表明乙醇以2530ppm的浓度存在、乙酸乙酯以48,110ppm的浓度存在、乙基氯以170ppm的浓度存在、并且没有检测到正庚烷和甲氧基苯的存在。检测钯含量三次，测定值分别为29ppm、2ppm和小于1ppm。
化合物(I)二盐酸盐的结晶作用研究
下表中显示的试验旨在研究化合物(I)二盐酸盐不同的结晶作用和沉淀状况。
化合物(I)二盐酸盐的结晶作用研究
通过向大量的快速搅拌的乙酸乙酯中反向加入化合物(I)二盐酸盐在乙醇中的浓缩溶液，可以实现沉淀作用。对示范批次进行沉淀过程，产生两种不同的固体类型。使用物理方法分离这两种不同的固体类型并分别过滤。首先过滤出一种低密度的黄褐色固体(编号02BP11IE，74克，通过高效液相色谱法测定AUC为99.1％)，随后过滤出一种深黑色的固体(编号02BP11IF，43克，通过高效液相色谱法测定AUC为99.1％99.1％)。在真空烘箱中进行再次干燥，干燥之后，在混合之前，将两种固体中的每一种都取出一些样品用于分析。当差示扫描量热法(DSC)和X射线粉末衍射法(XRPD)的数据不同时，比较这两种样品的高效液体色谱数据。
使用高效液体色谱制备纯度大于99.0％(面积％)的产品。编号02BP11IE样品在大约198℃下显示单一的吸热反应，而编号02BP11IF样品在117℃和189℃条件下显示两个吸热反应。两个样品的X射线粉末衍射法(XRPD)数据也是不同的，编号02BP11IE样品观察到结晶，而编号02BP11IF样品好像是无固定形态的。从高效液体色谱数据、X射线粉末衍射法(XRPD)数据和差示扫描量热法(DSC)数据都可以证明这两种样品是相同材料的不同形式。
干燥两个编号的化合物(I)二盐酸盐(编号02BP11IE和编号02BP11IF)，并混合，从而得到一种新的化合物(I)二盐酸盐编号(编号02BP11IG)。化合物(I)二盐酸盐编号(编号02BP11IG)包括170ppm的乙基氯。
实施例4：2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺甲磺酰基盐 (化合物(I)MSA)
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)氰化甲烷(化合物6)的制备
在52分钟内向圆底反应器1中加入六甲基二硅基胺基钠(NaHMDS)(1.0M在四氢呋喃中的溶液，23.2升)并将温度冷却到-10℃以下。在氮气条件下，向箱护玻璃瓶中加入化合物5(1400克，1个重量)和四氢呋喃(7.0升，无水，5体积)。在氮气条件下，用气动搅拌棒搅拌该批次的反应。该批次不是完全可溶的，形成一种浑浊溶液。在41分钟内，通过一种5升添加漏斗向反应器1中加入化合物5的溶液。制备氰化甲烷(965毫升，无水的，0.69体积)在四氢呋喃(2.0升，无水的，1.43体积)中的溶液，并且在10℃以下在48分钟内使用同一个添加漏斗将此溶液添加到反应器1中(在反应器壁还有少量的黄色固体)。在-10℃以下老化混合物45分钟，将该批次作为样品进行分析，化合物5转化了0.03％(转化规格小于1.5％)。在制成样品1小时24分钟之后，在52分钟的时间内向反应器1中加入盐水(17.6升，12.6vol)，从而产生一种缓慢搅拌的批次(类似一种乳状液)。在一种24-英寸的聚丙烯漏斗上制备硅藻土滤垫(1026克硅藻土545在3.3升水中制浆，丢弃滤液)。使用抽水泵使用滤垫对该批次混合物过滤，用四氢呋喃(1.75升，1.25vol)洗涤反应器并，将洗涤液加入到滤饼中。将滤饼用另外一份四氢呋喃(1.75升，1.25vol)洗涤，总过滤时间为1小时17分钟。将滤液转移到反应器2中，并分离各个相，静置整夜(在氮气条件下，将批次反应物存储在反应器中)。排干有机相(大约34.5升)并用甲苯(8.1升，5.8vol)提取水相，搅拌16分钟并沉淀12分钟。也可以省略甲苯提取步骤，只是简单的在分离之后直接将甲苯加入到有机相中。去掉所得水相(大约19升)，然后结合有机相并用硫酸镁(1400克，1个重量，无水的)在反应器2中干燥有机相55分钟。使用24英寸的聚丙烯漏斗过滤批次混合物，将混合物过滤到箱护玻璃瓶中，所述24英寸的聚丙烯漏斗装备有一种串联过滤器，将批次混合物中冲入氩气并将其保存在低温空间(2-8℃)中，浓度待定。在随后的几天中，浓缩反应批次，得到一种残余物，并用甲苯(11.8升，8.4vol)，随后继续浓缩(水浴50±5℃)。在接近添加甲苯的时候，批次混合物是一种橙黄色浆状物，并在之后的浓缩过程中一直保持这种状态。总浓缩时间是5小时3分钟。
向反应器3中装入甲基叔丁基醚(13.9升，9.9体积，ACS)，然后加热到45±5℃。排干所述甲基叔丁基醚并使用大约2升的甲基叔丁基醚制浆，将批次反应物从烧瓶中导入反应器3中。向反应器3中加入剩余的甲基叔丁基醚，并将批次温度维持在45±5℃范围内，然后在此温度范围内静置反应批次混合物33分钟。然后在39分钟内向反应器3中加入正庚烷(10升，7.1体积，99％)，并维持批次温度在45±5℃范围内。切断热源，并且在4小时5分钟内将批次反应物冷却到25±5℃，并在此温度范围内静置批次混合物27小时4分钟。然后，使用抽水泵通过24-英寸聚丙烯漏斗(聚四氟乙烯(PTFE)包衣)过滤批次反应物，在氮气条件下掩护并吸干。总过滤时间是20分钟。在真空烘箱中，设定45±5℃，干燥橙黄色批次(净湿重1322克)48小时3分钟至恒重。将批次混合物转移到2个80盎司的褐色玻璃振击器(聚四氟乙烯线密封)并通入氩气(1217克的化合物6，理论值81％)。
甲基2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)醋酸盐(化合物7)的制备
向22升的反应器中装入化合物6(900克，2.78摩尔)和甲醇(9.0升，10体积，无水的)。在2小时11分钟内向悬浮液中加入硫酸(1115毫升，发烟的)，从而产生一种黑色的溶液。最高温度是65.5℃(目标是大约65℃)。在1小时49分钟内加入硫酸(1565毫升，1.74体积，浓缩的)，然后加热批次混合物直到出现明显的回流(74℃)，加热持续18分钟，将反应批次维持在这种温度在16小时57分钟。记录明显的适度回流直到回流停止，然后再次加热批次混合物在79-80℃条件下回流2小时15分钟。将批次混合物维持在该温度(80±5℃)条件下10小时57分钟然后终端热源；在26小时4分钟之后再次进行甲醇的加入(0.75升，0.8体积，无水的)，从而补充损失的溶剂体积。据估计，在蒸发过程中大约损失了2.5升-3.3升的溶剂。在42小时31分钟回流反应之后，进行高效液相色谱分析，分析结果表明化合物6的转化水平是0.6％(规格小于1.0％)。向反应器1和反应器2中分别加入亚甲基氯(4.8升，5.3vol)和碳酸氢钠溶液(48升，53.3vol，饱和的)。在2-8℃条件下储存碳酸氢钠溶液整夜，然后在第二天早上去掉碳酸氢钠溶液。在47分钟内分部分向反应器1中加入22升反应器中批次混合物中的一半(批次温度分别是12-13℃)，在44分钟内分部分向反应器2中加入22升反应器中批次混合物中的另一半(批次温度分别是14-15℃)。在伴随有二氧化碳(漩涡式强力通入)的情况下进行淬火。从每个反应器中将批次混合物转移到200升的反应器中，搅拌批次混合物16分钟，然后沉降25分钟，分离有机相。连续使用两部分甲基氯化物(5升，5.6体积和2.7升，3体积)提取水相，每个提取过程在15分钟内发生，同时搅拌，分别沉降6分钟和9分钟。将结合的有机相转移到反应器3中，用硫酸镁(900克，1wt，无水的)干燥35分钟。使用抽水泵通过装备有雪克斯金细呢并装备有串联过滤器(10微米，Pall p/N 12077)的24英寸聚丙烯漏斗过滤所述批次反应物。在旋转蒸发器上，2小时18分钟的时间内，在40±5℃(水浴温度)条件下浓缩滤液。在54分钟之后，固化批次混合物并形成小球。将这些溶解并继续浓缩。所述批次反应物(细微固体物和脆块状物的混合物)进行进一步的研磨，将其放回烧瓶中继续浓缩。将批次混合物转移到一种80盎司的褐色玻璃振击器中并通入氩气从而产生一种化合物7(871克，理论值88％)，所述80盎司的褐色玻璃振击器带有聚四氟乙烯线密封。
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺(化合物(I))的制备
向22升反应器中加入化合物7(650克，1.82摩尔)、甲氧基苯(3.25升，5体积，无水的)和苯甲胺(600毫升，0.92体积，3equiv)。在1小时44分钟的时间内，将该批次(大约18℃)加热到142±5℃，在30℃时出现溶解现象。将该批次维持在142±5℃条件下69小时30分钟，此时，进行高效液相色谱分析显示化合物7转化了0.9％(转化规格＜1.7％)。在5小时12分钟的时间内将该批次冷却到45-50℃(为了实现冷却的目的，一旦批次温度达到大约72℃，就向该批次中通入氮气流)。在此温度范围内，缓慢的搅拌批次混合物进行混合，在混合同时缓慢的增加批次反应物温度至52℃。在小于15分钟的时间内就可以使温度升高到50℃以上。将批次反应物老化2小时2分钟，一旦温度低于50℃，就在1小时56分钟的时间内向批次反应物中加入正庚烷(9.75升，15体积，99％)，维持批次温度在45-50℃范围内。然后停止加热，在10小时32分钟的时间内将批次反应物冷却到25℃，在大约20分钟的时间内将温度冷却到大约20℃。该批次反应温度维持在25℃以下的总时间大约是4小时50分(其中右2小时47分钟该批次反应的温度维大约20℃)。使用抽水泵通过24英寸聚丙烯过滤漏斗(装有聚四氟乙烯(PTFE)包衣)过滤批次混合物，用甲氧基苯/正庚烷(1.3升，4∶1)洗涤反应器然后将洗涤液倒入滤饼中。然后，连续用两部分正庚烷(分别是1.3升，0.65升)洗涤滤饼。总过滤时间是39分钟。将批次反应物(净湿重为1004克的化合物(I))转入三个玻璃托盘中，然后放置于真空烘箱内，设置温度50℃进行干燥，直至在96小时26分钟之后干燥至恒重。
2-(5-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基乙酰胺甲磺酰基盐(化合物(I)-MSA)的制备
将化合物(I)(520克，1.21摩尔)转移到反应器1中，使用丙酮(41.6vol，80vol，ACS)加速转移。在33分钟内将该批次加热到50±5℃，在温度达到30℃时出现溶解。使用安装有串联过滤器(Pall P/N12077，10微米)的转移泵将该批次反应物转移到另一个反应器中，然后重新加热，使温度从46℃升高到50±5℃。在12分钟内，将甲基硫酸(121.4克，1.05当量，99％，超纯)加入到淡黄色的批次反应物中，并停止加热。在经过十四分钟之后，可以观测到白色的固体，白色固体的数量逐渐增加，在59分钟之后会产生一种白色的悬浮物。经过7小时51分之之后，该批次反应物的温度在25±5℃范围内，将其进一步老化19小时21分钟(其中有10小时30分钟的时间内温度小于27℃)。使用抽水泵通过24英寸聚丙烯过滤漏斗(装有聚四氟乙烯(PTFE)包衣)过滤批次混合物，用丙酮(2.0升，澄清的，ACS)洗涤反应器然后将洗涤液倒入滤饼中。用不锈钢盖将滤饼盖住并通过氮气流将滤饼吸干。总过滤时间为21分钟。将批次反应物(净湿重为7644克)转入三个玻璃干燥托盘中，然后放置于真空烘箱内，设置温度25±5℃进行干燥，干燥时间为21小时54分钟。然后将批次混合物转移到两个80oz的棕色玻璃瓶中(用聚四氟乙烯连接的聚丙烯密封)，通入氩气并在-10℃到-20℃条件下储藏。
实施例5：对上升的单一剂量(RSD)和上升的多倍剂量(RMD)的剂量确定研究
根据在狗和老鼠体内进行的28天毒性研究结果选择起始剂量。在这些研究中，发现狗是更为敏感的物种。通过口服饲料给药法确定的最小毒性水平是0.5毫克/千克/剂量。在这一水平上，没有观察到任何临床征象、在体重方面的变化或者任意肉眼可见的变化。唯一被认为可能与实验物品有关的变化是丙氨酸氨基转移酶最低限度到中等程度的增加。在给药剂量达到0.5毫克/千克/剂量时，可以在动物体内发现很多微小的变化，但是与大剂量研究组相比，这一剂量造成的严重性较小并且感染较少的动物，并且不与任何临床征象相关。根据美国食品与药物管理局的指南，起始剂量被计算做对10％的啮齿动物产生严重毒性的每平方米剂量的十分之一(STDlO)，也就是说，2毫克。
为了确定单一剂量的化合物(I)的口服药代动力学，对上升的单一剂量(RSD)部分选择三个剂量水平，并且支持或者精制上升的多倍剂量(RMD)部分研究的剂量表。对于上升的单一剂量(RSD)部分研究选择的化合物(I)的剂量水平为2毫克、5毫克和10毫克(等量的游离碱)，作为一种口服溶液给药。
选择上升的多倍剂量(RMD)部份的剂量水平从而高效并且慎重的达到化合物(I)的最大耐药剂量。在预计更高剂量水平的毒性时，在剂量水平达到80毫克之后，逐步提高剂量，每次增加40毫克。每天对狗进行2次口服给药，可以观察到半衰期的范围为5-8小时。对于上升的多倍剂量(RMD)研究部分，根据安全性和可耐受性考虑，所选择的化合物(I)的剂量水平是2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、120毫克、160毫克或者更高(增量为40毫克)，作为口服溶液给药，每日给药两次。根据化合物(I)单一剂量的药代动力学和安全性考虑，剂量和给药的频率都可以是变化的。
实施例6：上升的单一剂量(RSD)和上升的多倍剂量(RMD)研究
为了确定化合物(I)的单一剂量的药代动力学(PK)，进行单一剂量增加的上升的单一剂量(RSD)研究。连续的3位病人参加剂量逐步增加的研究组。每个病人承受单一口服剂量的化合物(I)溶液，化合物(I)剂量分别为2毫克、5毫克或者10毫克(在给药之前和给药之后要求至少2个小时的禁食)，然后观察病人7天。如果没有产生毒性(如下面所定义的)，在上升的多倍剂量(RMD)研究部分，继续对该病人给药化合物(I)，每天定时给药2次，给药2个训环。
当作为多倍口服溶液对患有多重恶性肿瘤的病人给药时，为了确定化合物(I)的最大耐药剂量，进行多倍剂量增加的上升的多倍剂量(RMD)研究。上升的多倍剂量(RMD)研究部分按照如下方式进行：
第一循环
向3个病人给药口服溶液状的化合物(I)，给药剂量为2毫克、10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、120毫克、160毫克或者更高(增量为40毫克)，每日给药两次(间隔大约10小时，在给药之前和给药之后需要至少两个小时的禁食)，给药21天，为了延长进样的药代动力学，在第22天，对病人给药额外的剂量(AM)。第22天的给药只发生在第一个循环，随后所有的循环都只有21天的给药。
根据并发的药代动力学(PK)表现和安全性考虑，可以改变给药时间表。
如果被研究的人群在研究的第一部分或者第二部分发现明显的二级临床毒性(如下面的定义)，除非有其他证据清楚的显示这是疾病发展的结果，否则减少剂量增加的程度。对下个给药群体的剂量增量减少。
如果三位病人中的一位发展出剂量限制性毒性(DLT，如下面的定义)，则需要将被研究的群体从三人增加到六人。如果六位病人中只有一位，或者没有人显示剂量限制性毒性(DLT)，则将剂量增加到下一个水平(参见第6.3.1节)。如果三位病人或者六位病人中有两位或者两位以上的病人显示剂量限制性毒性(DLT)，则需要停止在此剂量水平下的治疗。对另外三位病人给药减少的剂量，每日给药两次。持续该过程直到MTD被确定。MTD的定义是仅仅使六位中不超过一位病人发展出剂量限制性毒性(DLT)的最高剂量。对另外十位病人在MTD剂量条件下给药，从而更好的定义化合物(I)安全的药代动力学和生物效应。如果产生剂量限制性毒性(DLT)的病人数目大约33％，则立即停止该剂量条件下的给药。仅次于该水平的剂量被认为是MTD，并且对额外的10位病人在该水平下进行试验。
第二循环
当一个研究群中的病人完成第一循环的排出时期且不产生剂量限制性毒性(DLT)时，对其进行为期21天的第二循环和7天的排出时间。在给药两个循环之后，对可以忍受化合物(I)并且疾病发展受到抑制的病人给药额外的化合物(I)循环(21天给药时间和7天排出时间)。
毒性的定义是一种副作用，这种副作用的起因可能、大概或者明确与调查性治疗有关。
在第一治疗循环过程中评价剂量限制性毒性(DLT)并且做出如下定义：
●美国国立癌症研究组织制定的不良反应评价标准NCI-CTCAE3.0版本定义的三级以上非血液型毒性。只有在有足够支持性护理条件下，恶心、呕吐、腹泻和电解质不平衡情况大于三级，才会被认为是剂量限制性毒性(DLT)；
●持续5天以上的4级嗜中性白细胞减少症；
●发热性的嗜中性白细胞减少症(定义为绝对嗜中性白细胞数量[ANC]＜1.0x 109/L并且发烧大于38.5℃)或者经过证明的3级以上感染并且绝对嗜中性白细胞数量(ANC)＜1.0x109/L；
●4级血小板减少症或者血小板减少到需要进行血小板输血的程度；
●由于毒性作用在第二循环中延迟给药大于14天。
研究持续时间
在如上所述的研究中，对每个病人在14周的时间内进行最多18次的定期访问，开始是筛选完成上升的单一剂量(RSD)研究的人，并进行头两个周期的上升的多倍剂量(RMD)给药。对只参加研究的上升的多倍剂量(RMD)部分的人群进行访问次数较少。在研究的最后，使用这些访问结果进行评估，为了评估7种剂量水平两个周期的给药，需要进行大约12个月的研究。在完成头两个周期的上升的多倍剂量(RMD)之后，其他的给药周期只对能够耐受化合物(I)并且疾病没有进一步发展的病人进行。
研究终点
按照如下所述评价研究终点。通过副作用和实验室评价方法(即血液分析、血清化学作用和尿分析)评价安全性。
按照如下方法评价药代动力学：使用有效的液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)生物分析方法分析化合物(I)的血浆水平。收集尿液并进行分析，从而提供消除和新陈代谢作用的半定量性评价。按照如下方法确定生物效应：收取样品确定血管内皮生长因子(VEGF)的血浆水平。另外，在外周血液单核细胞和肿瘤活组织检查中评价磷酸-Src Tyr419的水平和被选择底物的转磷酸化作用。对承受化合物(I)的MTD的病人和患有方便取得的肿瘤的病人群体进行活组织检查，并分析其生物效应。考虑到剂量的扩大，在第一周期末尾进行安全性参数的评价。在研究结束后对在头两个周期中收集的所有参数进行分析。
患者选择
参加本研究的病人必须满足如下所述的标准必要条件：
1.手写签名的书面知情同意书
2.年龄在18岁以上的成年人
3.证实已经患有转移性的或者不可切除的实体肿瘤或者恶性淋巴瘤，并且对这些肿瘤不存在标准的治疗方法或者缓解方法，或者标准的治疗方法或者缓解方法已经失效；患有经过治疗的脑部或者眼部转移瘤的病人也是合格的
4.皮质脑电图表现状态为0-2
5.预计寿命至少为14周
6.通过完全的嗜中性白细胞计数显示足够的骨髓储备(绝对嗜中性白细胞数量(ANC)＞1.5x 109/升、血小板计数(PLT)＞100x109/升或者血红蛋白(Hgb)＞10克/升)
7.通过血清胆红素、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨基酶(AST)和碱性磷酸酯酶(ALP)＜2.5x正常值上限(ULN)显示足够的肝功能
8.足够的肾脏功能(血清肌氨酸酐＜1.5x正常值上限(ULN)或者计算所得的肌酐清除率＞60毫升/分)
9.对同意进行肿瘤活组织检查的病人来讲，在研究进行前1星期中，具有正常的凝结曲线(PT/INR和aPTT值在制度规定的正常范围内)。
10.在筛选过程中，对于女性病人来讲妊娠检查试验应呈阴性，优选在第一天给药之前一周之内进行妊娠检查试验(对进行过双边卵巢切除术和/或子宫切除的病人不适用此条)
11.在对病人进行第一天给药之前28天时间内和最后一此给药之后六个月内，自愿避免性活动或者进行物理障碍避孕法
12.对于其他的10位将要进行MTD给药的病人和患有易取得的肿瘤的病人需要手写签字的肿瘤活组织检查书面知情同意书。
如果参加研究的病人出现以下情况，则不能再继续参加本研究：
1.经过上述抗癌治疗或者由于被研究的试剂产生大约一级严重性的不能解决的毒性
2.在第一次给药之前14天之内接受了或者接受过被研究试剂或者全身性抗癌试剂，或者如果被研究试剂的消除半衰期未知或者半衰期大约50小时的话，在第一次给药之前28天之内接受了这种试剂
3.在开始研究给药4星期内接受了大范围的放射疗法，包括胸骨、骨盆、肩胛骨、脊椎骨或者颅骨，或者在开始进行研究给药之前一周内接受了限于四肢的低剂量的缓和性放射疗法，或者还未从这种疗法的副作用中恢复
4.正在服用激素(即，雌性激素类避孕药、激素代替物、抗雌性激素)、抗血小板试剂或者抗凝结剂，例如下丙酮香豆素钠的病人，除了为了进行静脉内插管而服用预防性剂量的抗凝剂的病人
5.在第一天给药之前2周或者5个半衰期内，或者在研究期间使用细胞色素P450 3A4酶的烈性抑制剂或者诱导物
6.怀孕或者人工哺乳
7.在第一次给药前4周时间内进行大手术
8.进行过上胃肠道的大手术或者患有炎症性肠病、吸收不良综合征或者其他可能影响口服吸收的医学状况
9.出现末端器官失调、除了癌症之外的主要慢性疾病或者其他严重的伴随病况的病症或者症状，研究员认为不适合于继续参加本研究或者会对本研究方案造成破坏
10.患有心绞痛、冠状动脉病或者脑血管意外、短暂性缺血性发作或者需要进行治疗的心律不齐
11.有证据证明患有乙型肝炎或者丙型肝炎、人类免疫机能缺陷性(艾滋病病毒)传染病、凝固障碍、或者溶血性疾病，例如，镰刀形红细胞贫血病
研究过程
在对病人进行定期回访的时候进行如下操作。
知情同意书和完整病历
在筛选过程中收取知情同意书和完整的病历
上升的单一剂量(RSD)药代动力学(PK)取样
在第一天0小时(给药之前)、和给药后第1、2、3、4、6、9、11、24小时(第2天)、第48小时(第3天)、第96小时(第5天)和第168小时(第8天)收集血液进行药代动力学分析。在第一天的0小时(给药之前)、0-6小时、6-12小时、12-24小时和24-28小时收集尿液进行药代动力学分析(5个样品)。
按照如下的方法收集并制备血浆样品：从留置导管中吸取血液样品(大约2.0毫升)，或者通过Vacutainer收集管进行静脉穿刺收集血液样品(大约2.0毫升)，其中使用乙二胺四乙酸钾(K3)(度量-3毫升)作为抗凝血剂，在进行离心作用之前保持在冰中。在收集之后30分钟内对样品离心(在4℃下以2,000转/分的速度离心10分钟)。使用聚丙烯移液吸管立即吸取血浆，并在预先标记的聚丙烯传输管中将所得血浆分成两个体积相等的部分(大约400微升)。将所得血浆样品密封并立即放入冰箱中在-70℃下保存。
按照如下的方法收集并制备尿液样品：按照固定的时间间隔将尿液收集在尿液袋中。在大约4℃条件下储存尿液袋(冷冻或者在冰上放置)，知道完成收集过程。在收集之后，通过摇晃将每种尿液样品混合均匀。在每个收集时间间隔的末端，测定体积并记录在CRF中。为了进行尿液分析，通过移液吸管收集大约2毫升等份的尿液并通过量尺测量。为了进行药代动力学(PK)测量，从每个收集液中收集大约5毫升的尿液，将其分别转移到两个预先标记号的聚丙烯输送管中。将所得尿液样品盖严并立即放置在冰箱上，温度维持在-70℃。
上升的多倍剂量(RMD)药代动力学取样
在以下时间点收集血液样品(如上所述)进行药代动力学分析：
在第一阶段(对给药量为2毫克、5毫克、10毫克的病人取样20次；对给药量在10毫克之上的病人取样25次)：在第一天的0小时(在第一次AM给药之前)并在第1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、10小时(在PM给药之前)、11小时(PM给药1小时之后)；第2天0小时(AM给药之前)、1小时之后；第3天0小时(AM给药之前)、给药1小时之后；第8天0小时(AM给药之前)、给药1小时之后；第15天0小时(AM给药之前)、给药1小时之后；第22天0小时(AM给药之前，即，最后一次给药)、给药1小时之后；以及第1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、9小时、11小时、12小时(第23天)和第48小时(第24天)。
进行上升的单一剂量(RSD)研究的头三组病人(即接受2毫克、5毫克或者10毫克给药的病人)在第一天进行如下的药代动力学(PK)取样：第一天第0小时(AM给药之前)、第11小时(PM给药1小时之后)。
第二循环(5个样品)：在第29天第0小时(AM给药之前)；在第36天第0小时(AM给药之前)；在第43天第0小时(AM给药之前)；在第50天；和第57天。对于能够忍受进一步剂量给药并且疾病不会进一步发展的病人，以及在头两个循环之后选择进行继续给药循环的病人在随后每个循环开始给药前和给药结束后(最后一个给药2小时之后)进行药代动力学(PK)取样。
生命特征(上升的单一剂量(RSD)和上升的多倍剂量(RMD))
在下列时间内测定脉搏率、心脏收缩和舒张时的血液压力、呼吸和体温：筛选的时候、上升的单一剂量(RSD)和上升的多倍剂量(RMD)：在第一天的0小时(在第一次AM给药之前)、给药后第2小时和第8小时；在每个临床访问中。
在安静状态下(静坐至少5分钟)获得病人的脉搏率，脉冲计数30秒，乘以2从而记录每分钟的心跳次数。使用血压计在安静状态下(垂直静坐至少5分钟)获得病人的测定心脏收缩和舒张时的血液压力，每次测定都使用同样的胳膊。以毫米汞柱(mmHg)为单位记录血压。在安静状态下(垂直静坐至少5分钟)获得病人的呼吸，在30秒的时间内计算呼吸次数，乘以2从而记录每分钟的呼吸次数。使用口部或者耳部温度计在安静状态下(垂直静坐至少5分钟)获得病人的体温。
体重和身高
在以下时间测量病人的体重和身高，体重以千克为单位、身高以英寸为单位：筛选时；上升的多倍剂量(RMD)：第1天、第22天、第29天、第50天和第57天。
对安全性进行实验室评价
在以下时间收集血液进行血液学、血清化学作用和尿分析：筛选时；上升的单一剂量(RSD)：第2天、第3天和第8天；上升的多倍剂量(RMD)：第2天、第3天、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天和第57天。在头两个周期之后，对其他循环上的病人在随后每个循环的开始给药之前和给药完成之后进行安全性实验室评价。在研究开始之前一周之内对进行肿瘤活组织检查的病人进行PTANR和aPTT血液检查。
物理检查
在以下时间进行完全的身体检查：筛选时。在以下时间进行一部分身体检查从而更新身体所产生的变化：上升的单一剂量(RSD)研究期间：第一天和第八天；上升的多倍剂量(RMD)研究期间：第1天、第22条、第29条、第50条和第57条。
心电图(ECG)检验
在以下时间进行12导联心电图和long Lead II检查：筛选时；上升的单一剂量(RSD)研究期间：第1天给药后第1小时和第4小时和第8天；上升的多倍剂量(RMD)研究期间：第1天在给药后第1小时和第4小时，和第8天、第22天、第50天和第57天。经历过上升的单一剂量(RSD)的头三组病人(即给药2毫克、5毫克或10毫克的病人)只在上升的多倍剂量(RMD)研究部分的第8天、第22天、第50天和第57天进行心电图(ECG)检查。
妊娠诊断试验
在筛选过程中，从女性病人体内收集血液进行血清妊娠诊断试验，优选在给药第一天之前一周之内进行(对进行过双边卵巢切除术和/或子宫切除的病人不适用此条)。
副作用
在整个研究过程中检测副作用。在每次访问时，研究员从询问每个病人是否发生副作用开始，通常，根据情况适当的进行非直接询问，例如“从上次访问以来感觉如何？”或者直接询问并进行检测。
联合给药
在每次访问过程中如果同时使用其他任何药物、处方药或者成药，应记录在案，同时记录使用这些药物的原因。
生物学效应的评价
收集血液测定血浆中的血管内皮生长因子(VEGF)；在上升的多倍剂量(RMD)研究的第1天、第22天和第50天评价外周血液单核细胞(PBMC)中的Src何选择底物的磷酸化作用
对于符合活组织检验标准的病人，在进行第一日给药之前4周之内进行给药前的活组织检查，并在第20-22天进行给药后的活组织检查。在进行活组织检查的同时，收集血液测量生物学作用。另外，在第50天收集血液进行生物学作用分析。
伴随疗法
病人不允许使用任何慢性的能够作为细胞色素P450 3A4或者凝血作用强烈抑制剂或者诱导物的伴随性药物。例如，在进行第一天给药之前14天或者5个半衰期(两者更久的时间为准)之内以及整个研究过程中，禁止全身使用下列CYP3A4调节剂：
CYP3A4诱导剂：巴比妥类药物、酰胺咪嗪、依法韦仑(efavirenz)、肾上腺糖皮质激素、Modafinil(莫达非尼)、奈韦拉平、苯巴比妥、二苯乙内酰脲、利福平、圣约翰草(St.John’sWort)、曲格列酮、奥卡西平(oxcarbazepine)、吡格列酮、利福布汀。
CYP3A4抑制剂：乙胺碘呋酮、阿瑞匹坦、氯霉素、甲腈咪胍、克拉霉素、二乙基-二硫代氨基甲酸盐、地尔硫卓、红霉素、麦道氟康(Fluconazole)、氟伏草胺(Fluvoxamine)、吉士脱酮(Gestodene)、葡萄柚汁、伊马替尼、伊曲康唑、里素劳(Ketoconazole)、米非司酮(Mifepristone)、萘法唑酮、诺氟沙星、诺氟西汀、米贝拉地尔(mibefradil)、杨桃、异搏定、伏立康唑。
少量的使用抗凝结剂从而维持静脉伤口和导管不出现闭合。禁止同时使用激素(即，雌性激素类避孕药、激素代替物、抗雌性激素)(见下文，冲洗时间)。
冲洗时间
在上升的单一剂量(RSD)研究期间，单一剂量给药之后至少存在7天的冲洗时间或者观察时间。上升的多倍剂量(RMD)部份第一循环之后的冲洗时间是6天。两个连续的循环之间所有其他循环的冲洗时间是7天。
治疗适应性
如果发现有病人不经意的加入与本研究方案技术规范严重不符的时间，则应立刻停止对该病人进行本研究。严格根据给药时间表对病人进行评价。病人应根据指导在家完成研究日程表，从而跟踪他们的给药。在每周的定期访问中，病人应携带这份日程表和所有已经使用的和未被使用的给药瓶子道临床地点。在对病人进行新的研究药物供给之前，临床地点工作人员应当检查这些。每次复诊过程中，研究者应该询问病人是否在上次访问之后服用过任何伴随药物，确定服用这些药物是否会对本方案造成侵害，并记录所得数据和结论。
研究药物
在这些研究中提供作为游离碱2-(5-(4-(2-吗啉基乙氧基)苯基)吡啶-2-基)-N-苯甲基-乙酰胺甲磺酸盐的化合物(I)。以游离碱在溶液中的重量计算临床给药剂量。化合物(I)的甲磺酸盐是一种白色结晶性粉末，其化学分子式为C26H29N3O3.HO3SCH3，其分子量为527.63道尔顿。所述游离碱的分子量为431.53道尔顿。
一次给每个研究群体给药化合物(I)的甲磺酸盐粉末，该粉末存在于单位剂量瓶中，包括不同剂量的研究药物，相对应的剂量分别为：2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、120毫克、160毫克或者更高(游离碱等量)。为了确保安全性进行修饰的剂量水平也应在单位剂量瓶中制备并转交给临床地点。随着溶解，所得化合物(I)甲磺酸盐的溶液时澄清的，并且在单位剂量瓶中对病人给药，浓度范围是0.2到4.0毫克/毫升(游离碱等量)。
剂量和剂量方案
根据病人所属的剂量群对病人口服给药化合物(I)甲磺酸盐，即，上升的单一剂量(RSD)：2毫克、5毫克或者10毫克；上升的多倍剂量(RMD)：2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、40毫克、80毫克、120毫克、160毫克(游离碱等量)、或者更高，增量为40毫克。对于上升的多倍剂量(RMD)部份，在每个循环中，头21天的时间里每日给药2次化合物(I)(间隔大约10小时，在禁食至少2小时之后给药，给药之后再进行2小时的禁食)，随后经历7天的冲洗时间。只有第一循环例外，在第一循环中，在第22天给药额外的剂量，从而减轻延长的药代动力学(PK)取样。在第一循环，冲洗时间为6天。经历头两个上升的多倍剂量(RMD)循环之后，能够耐受这种研究药物并且疾病不在发展的病人可以被选择进行其他的给药循环。
向化合物(I)甲磺酸盐的单位剂量瓶中加入固定体积的无菌水并均匀摇动(逆向摇晃大约10次)直到获得澄清溶液。
在禁食至少2小时之后服用化合物(I)。但在任何时候饮水都是允许的。在现场管理下，病人将第一剂量的整个单位剂量瓶对其自己给药。使用20毫升的无菌水冲洗该瓶子并将所得物口服，完全喝完首次剂量。重复该过程。在此后2小时时间内不能进食。
对于上升的多倍剂量(RMD)，制备供给量为7天的化合物(I)溶液并在临床位点药房分给病人。病人每周回来一次，分别在第8天、第15天、第22天、第36天、第43天和第50天，并送回用后的瓶子。在第8天、第15天、第36天、第43天，使病人得到新的7日供给量。
剂量缓慢扩大的剂量改变
当发生2级毒性时，可以放缓剂量的扩大。下一研究群体的给药水平应该具有较小的增量，如下所示：
如果随着剂量水平的增加不在发生2级或更高的毒性，可以重新恢复最初的剂量增加日程表。
在剂量限制性毒性(DLT)中的剂量改变
当一个研究组的3位或6位病人中有两位病人发生剂量限制性毒性(DLT)时，停止剂量扩大。向下一个研究群给药减少的剂量，如下所述：
药代动力学分析
使用WinNonlin专业软件(Pharsight公司，Mountain View，CA，第4.1版)或其他适当的软件对个体血浆内化合物(I)浓度-时间数据进行非房室药代动力学分析。当来自个别病人的数据不能被分析时，使用平均血浆化合物(I)浓度-时间数据计算药代动力学参数。从血浆浓度中计算下列药代动力学参数：Cmax(最大血清浓度)、tmax(达到最大浓度的时间)、时间T时的AUCT(从零时间到最后可测量的浓度(CT)时间中浓度-时间曲线下面积)、AUCo-∞(从零时间到最后的浓度-时间曲线下面积)、X1A(末期半衰期)、Ae(在尿液中分泌的药物的量)。根据研究技师(pharmacokineticist)的经验来确定其他适合用于描述并解释药代动力学的参数。
生物学效应的评价
通过酶联免疫吸附测定来确定血管内皮生长因子(VEGF)的血浆水平。确定外周血液单核细胞中磷酸Src Tyr419水平和选择底物的转磷酸化作用。在MTD条件下进行治疗之前和之后的肿瘤活组织检查能够确定化合物(I)在移植Src激酶磷酸化作用方面的生物学作用，其中所述Src激酶的磷酸化作用可能涉及在肿瘤的扩增中。对MTD扩大研究组中的10位病人进行成对的活组织检查。将组织分成两半，其中一半通过常规病理学方法评价，另一半用于评价磷酸Src Tyr419水平和选择底物的转磷酸化作用。
疾病进程的评价
对于可测量的疾病，根据RECIST标准评价肿瘤反应(Therasse，P.，et.al.，NewGuidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors(评价实体肿瘤反应的新指南).J Nat Can Inst.2000，92(3)，p.205-216)。在基线和之后其他循环(2个循环)中获得测量值。所有有反应的病人(完全反应和部分反应)在第一次有记载的反应发生之后4周时，必须使用与基线测量时相同的测量方法对病人的反应进行确认。对于患有不可测量的疾病的病人，根据临床表现(肿瘤标记物、射线测量、超声、等等)评价反应。当骨骼变形时唯一病发的地点时，使用用于评价骨骼疾病反应的国际卫生组织标准来评价反应。通过在连续两个月的测量中肿瘤标记物上升25％或者疾病有明显的放射性发展来定义非可测量性疾病的发展。使用同样的方法重新评价肿瘤反应从而建立肿瘤测量基线。按照如下方式评价肿瘤反应：
目标病变
●完全性反应(CR)：所有目标病变消失
●部分反应(PR)：目标病变的最大直径(LD)之和减少至少30％，参照基线最大直径之和
●进行性疾病：参照开始治疗之后记录的最小最大直径(LD)之和数值，目标病变最大直径(LD)之和增加至少20％，或者出现一种或者一种以上新的病变
●稳定的疾病：参照开始治疗之后记录的最小最大直径(LD)之和数值，既没有足够缩小到部分反应资格，也没有足够增加到进行性疾病的资格
非目标病变
●完全性反应(CR)：所有目标病变消失
●不完全反应/稳定的疾病：一种或一种以上非目标病变的持久性
●进行性疾病：出现一种或一种以上新病变或者非目标病变存在明显的发展，或者两者皆发生
只有非目标病变的明确发展是个例外现象。但是，如果研究员相信只发生非目标病变的发展，则这些发展应该在四周之后进行CT检查来验证。使用与基线评价相同的方法在四周之后确认部分反应(PR)之上的肿瘤反应。
根据下面的表格确定目标病变和非目标病变中肿瘤反应所有可能的结合产生的全部临床反应：
CR＝完全性反应；IR＝不完全反应；PD＝进行性疾病；PR＝部分反应；SD＝稳定的疾病。
实施例7：细胞生长的抑制作用
与对照样品相比，抑制50％细胞生长所需的药物浓度作为GI50进行测量。在这里描述了本发明化合物(I)的GI50值测定方法。
HT29细胞株是一种美国国立癌症研究组织(NCI)规定的标准人类结肠癌细胞株。HT-29细胞从ATCC的第125传代获得，能够用于第126-151传代细胞的抑制作用。HT29细胞能够在补充有胎牛血清(1.5％体积/体积)和L-谷氨酰胺(2毫摩)的McCoy′s 5A培养基上按照常规方法培养。
c-Src 3T3是用定点突变的人类c-Src细胞株转染的老鼠成纤维细胞NIH 3T3正常细胞株，其中定点突变的人类c-Src细胞株中527位的酪氨酸被转变为苯基丙氨酸。这一突变导致“自体活化”的c-Src，由于527位酪氨酸的磷酸化作用导致Src折叠在其自身的SH2区域上，从而导致Src的自动抑制。当被转化为苯基丙氨酸时，苯基丙氨酸不会发生磷酸化作用，因此不会发生自动抑制。在这种情况下，一直具有高度活性的突变株Src能够将正常的老鼠成纤维细胞转变成迅速生长的肿瘤细胞。由于过度活跃的Src是促使这些细胞生长的主要因素(特别是当在低生长的血清条件下培养时)，通常认为所述化合物在抑制这一生长方面的活性是通过阻断Src信号完成的(例如，作为一种直接的Src激酶抑制剂或者作为一种作用于Src信号级联其他位点的抑制剂)。将所述细胞在补充有胎牛血清(2.0％体积/体积)、L-谷氨酰胺(2毫摩)和丙酮酸钠(1毫摩)的DMEM中按照常规方法培养。
在用于细胞生长抑制测定的5-溴脱氧尿核苷测定中，根据DNA合成期间结合的5-溴脱氧尿核苷的测得量确定细胞增殖的量。从罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)获得细胞增殖酶联免疫吸附5-溴脱氧尿核苷测定试剂盒(比色)并按照操作指南进行测定。
生长抑制作用用GI50表示。其中，GI50是指能够抑制50％细胞生长的样品剂量。生长抑制作用(GI)能够从公式GI＝(T0-Tnx100/T0-CONn)中计算得出，其中，T0是未处理细胞在“0”时刻的5-溴脱氧尿核苷生长量，Tn是处理过的细胞在第“n”天的5-溴脱氧尿核苷生长量，CONn是对照细胞在第“n”天的对照5-溴脱氧尿核苷生长量。推算GI50值，所得数据使用XL-Fit 4.0软件绘制曲线。
对促进生长的培养基进行胰蛋白酶化，并在96孔板的每个小孔中，将细胞在悬浮在190微升补充有1.05％FBS适当的培养基中(1000个HT-29细胞；2500个c-Src 3T3细胞)。在96孔板培养试验中，向c-Src 3T3培养基中补充10mM HEPES缓冲液。在96孔板的标准组织培养基中接种HT-29细胞，对涂布有聚-D-赖氨酸(BIOCOATTM)的96孔板接种c-Src 3T3细胞。为了增加二氧化碳的扩散，使用2毫米后的无菌橡胶栓抬起c-Src 3T396孔板的盖子进行培养。
接种的96孔板在37℃，5％二氧化碳条件下允许HT-29附着18-24小时，或者在37℃，10％二氧化碳条件下允许c-Src 3T3附着18-24小时。再接种18-24小时之后，使用5-溴脱氧尿核苷分析确定未处理细胞的最初生长量(T0)。将样品在二甲亚砜中重建并在中间时使用包含10％FBS的DMEM稀释。FBS的最终测定浓度是1.5％，二甲亚砜的最终测定浓度是0.05％。将样品分成10微升每份，加入三份，按照上述方法培养孔板大约72小时。其中包括阴性对照(煤介物)和阳性对照(例如，AZ(KX2-328))。对孔板进行5-溴脱氧尿核苷分析并按照上述对与GI50的方法分析所得数据。
所述结果显示在下表中。在下表中，数据是按照相对参照物的生长％列出的，因此，在指定浓度下较低的数表示所示化合物在一直肿瘤细胞株增长方面具有更大的效力。所有的化合物最初制备为20mM二甲亚砜储备溶液，然后用缓冲液稀释，进行体外肿瘤生长试验。NG是指没有细胞生长超过对照品，T是指在药物处理的小孔中的细胞数目小于对照中的细胞数目(即，细胞损失)。NT表示没有进行试验。化合物AZ(KX2-328)是一种腺苷三磷酸-竞争性酪氨酸激酶抑制剂，参见et al.，J.Med.Chem，47：871-887(2004)的描述。
如下表所示，获得本化合物(I)在其他细胞系中的GI50值。使用与上面对于HT29细胞株详细描述的标准肿瘤生长抑制作用测定确定这些GI50值，使用下列细胞系进行试验：结肠肿瘤细胞系KM 12、肺癌细胞系H460和肺癌细胞HneA549(所有都是NCI标准肿瘤细胞株)。
下面的表显示了与目前临床上使用的三磷酸腺苷竞争性Src抑制剂相比，化合物(I)对Src驱使的肿瘤细胞生长的抑制作用
下表显示了化合物(I)对脑肿瘤细胞系的抑制作用。按照实施例7中详细表述的相似的方法，使用标准肿瘤生长抑制试验确定GI50值。
化合物(I)和达沙替尼对脑肿瘤细胞系的GI50值：
下表显示了化合物(I)对肾部肿瘤的抑制作用。按照实施例部分详细表述的相似的方法，使用标准肿瘤生长抑制试验确定GI50值。
化合物(I)和达沙替尼对肾脏肿瘤细胞系的GI50值：
下表概括了化合物(I)对5种肝细胞性肝癌细胞系的抑制作用
下表显示了化合物(I)甲磺酸盐和达沙替尼在78小时在肝细胞性肝癌细胞系中的IC50和IC80(8.0x103细胞/孔，1.5％FBS)；IC50和IC80值来之标准化反应数据：
化合物(I)和达沙替尼对肾脏肿瘤细胞系的GI50值：
在100％的二甲亚砜中配制检测化合物的样品，从而获得20毫摩储备溶液；在4℃条件下存储。按照如下的方法确定IC50和IC80值。按照常规方式培养人肿瘤细胞系Huh7、WRL-68、PLC/PRF/5、Hep3B和Hep G2，并且在37℃，5％二氧化碳条件下保存在包含2％FBS的基础培养基中。将这些细胞接种在96孔板的每个小孔中，每个小孔接种4.0x103/190微升和8.0x103/190微升/孔。试验用培养基为基础培养基/1.5％FBS。在37℃下，在适当的二氧化碳环境中，在加入化合物(I)的甲磺酸盐(化合物(I)MSA)和达沙替尼之前，在96孔板中将细胞培养过夜。按照如下方式配制检测物质稀释溶液：将20毫摩尔储备溶液样品在基础培养基/1.5％FBS中按照1∶3的稀释法进行逐级稀释，产生20x浓度在131微摩到0.24纳摩范围内。10微升20x稀释液被添加到包含190微升癌细胞系的适当的孔中(n＝3)，产生的最终浓度在6561纳摩到0.012纳摩范围内。细胞的载体参照且无样品；细胞的培养基对照物、无样品，和0.03％二甲亚砜(存在于样品中的最高浓度的二甲亚砜)。在37℃，5％二氧化碳条件下对被治疗的细胞进行72小时的培养。在第三天，向每个小孔中加入10微升MTT(5毫克/毫升)。在MTT存在的条件下，在37℃，5％二氧化碳中培养细胞4小时。培养之后，向每个小孔中加入90微升10％十二烷基磺酸钠(+HCl)从而裂解细胞并溶解三苯基甲脂。然后，在37℃下，在5％二氧化碳环境中，将细胞培养整夜。使用BioTek Synergy HT多平台微板阅读器测量OD570值。使用GraphPad Prism 4统计软件确定生长抑制作用曲线IC50和IC80值。
实施例8：分离激酶的抑制作用
普遍认为在细胞外部Src的构造与在细胞内部Src的构造是有显著不同的，这是由于在细胞内部Src嵌和在多蛋白信号复合物中。因此，由于在分离的Src中没有很好的形成多肽底物结合位点(根据Src的X-射线显示的结构所知)，普遍相信抵抗分离的Src作为多肽底物结合抑制剂的活性将被减弱。为了结合在这些位点上，在分离酶试验中需要使用抑制剂捕获小百分率的与存在于细胞内部的Src具有相同构造的Src蛋白。这一过程需要大量过量的抑制剂来排除试验中催化循环的大量酶。
然而，在细胞内部，不需要这种大量过量的抑制剂，这是由于SH2&SH3区域结合蛋白已经被转移到Src构象中，因此肽底物结合位点已经被完整的形成了。在这种情况下，由于所有的酶都处于紧密结合的构象中，低浓度的抑制剂就可以出去催化循环中的酶。
KX2-328是AstraZeneca’s所公开的一种三磷酸腺苷-竞争性Src抑制剂(AZ28)，并且可以在这里描述的许多试验中用作阳性参照。KX2-328是具有式的化合物。应该注意到，化合物(I)对抗分离激酶具有较弱的活性，这是由于在细胞外部，没有很好的形成多肽结合位点。不希望局限于任何理论，普遍认为，相对于分离的激酶试验，这种活性上的差异是由于在细胞中的多肽结合位点被很好的形成了。多肽结合位点很好的形成是多蛋白信号复合物中参与结合蛋白的别构效应造成的。
下表表示了相对于参照(未处理的)分离激酶，在AstraZeneca三磷酸腺苷-竞争性抑制剂(KX2-328，AZ-28)或者化合物(I)存在的情况下分离激酶的活性百分比。
AstraZeneca三磷酸腺苷-竞争性抑制剂相对于三磷酸腺苷-竞争性抑制剂表现了典型的脱靶点激酶抑制作用活性，和较差的选择性，所述较差的选择性可以通过Abl、EGFRTK、Fyn、Lck、Lyn&Yes强抑制作用证明。相反对化合物(I)观察到了其对这些脱靶点激酶较弱的抑制作用
但是，从上面实施例中描述的实验可知，化合物(I)是Src促使的细胞生长的更为有效的抑制剂。在c-Src/NIH-3T3基因工程细胞株中，AZ28的GI50值是99纳摩，而化合物(I)的GI50值是13纳摩。且在NCI人类结肠癌细胞株HT29中，AZ28的GI50值是794nM，而化合物(I)的GI50值是13纳摩。
在其他的实施例中，滴定数据表明AZ28是分离的Src的有效的抑制剂(IC50＝8nM)。附着斑激酶的滴定数据显示AZ28对分离的附着斑激酶的效力小至少100倍(IC50＞500nM)。然而，滴定数据显示化合物(I)是分离的Src的作用较小的抑制剂(IC50分别为46微摩)。附着斑激酶的滴定数据显示化合物(I)对分离的附着斑激酶具有相似的效力(IC50＞48微摩)。
应当注意，AZ28与分离的Src相比对细胞生长的效力少10-100倍。由于全细胞中竞争性三磷酸腺苷的浓度比分离酶试验中的浓度高很多，所以这是三磷酸腺苷竞争性抑制剂的典型特征。化合物(I)显示对c-Src的IC50＝46mM。
实施例9：化合物对细胞内磷酸化水平的作用
使用化合物(I)或者AstraZeneca′s腺苷三磷酸竞争性Src抑制剂AZ28处理HT29(结肠癌)和c-Src527F/NIH-3T3(Src转化的)细胞系。AZ28可以作为一种阳性参照，显示在这些试验中确定的Src抑制剂起到的作用。在用化合物处理之后，细胞溶解，进行PAGE试验并用一组抗体做探针。选择抗体来确定化合物是否引起已知Src底物在磷酸化作用方面的变化。另外，还调查了酶切蛋白的磷酸化作用。此外，通过Caspase 3分裂计算细胞凋亡的感应现象。由于对药物浓度增加的响应去世是活性最可靠的指示剂，因此要对多剂量的各个化合物进行检测。
在1X浓度下，使用这些化合物在这两种细胞系的每一种中的GI50值绘制化合物(I)的剂量反应曲线。除了无药物的参照物“C”之外，还试验了三个其他的剂量：0.2X、5X和25X倍的GI50值。测定AZ28在这两种细胞系中相同倍数范围的GI50值，如图1所示，从而获得在两种细胞系中两种化合物响应Src-Y416自动磷酸化所需的理想的剂量。这些数据显示化合物(I)是一种细胞内部Src抑制剂。
图2显示了黏着斑激酶酪氨酸925的磷酸化作用，所述黏着斑激酶酪氨酸925是一种细胞内部已知的Src磷酸根转移作用底物。化合物(I)和AZ28能够抑制Src转磷酸化作用。这些数据显示化合物(I)是一种细胞内部Src抑制剂。
图3显示了Y239/240的磷酸化作用，所述Y239/240是一种已知的细胞内部Src磷酸根转移作用底物。化合物(I)和AZ28能够抑制Src转磷酸化作用。这些数据显示化合物(I)是一种细胞内部Src抑制剂。
图4显示了桩蛋白Y-31的磷酸化作用，所述桩蛋白Y-31是一种已知的细胞内部Src磷酸根转移作用底物。化合物(I)和AZ28能够抑制Src转磷酸化作用。这些数据显示化合物(I)是一种细胞内部Src抑制剂。注意：在HT29细胞中无论有没有加入药物，都不会检测出桩蛋白Y-31。
Caspase-3的分裂作用是细胞凋亡感应现象的一种很好的测量点。普遍已知，在HT29(结肠癌)和c-Src527F/NIH-3T3(Src转化的)细胞系中，AZ28在导致细胞凋亡方面是无效的。相反，如图5所示，化合物(I)在导致细胞凋亡方面很有效。
由于Src在HT29(结肠癌)和c-Src527F/NIH-3T3(Src转化的)细胞系中都有很高的活性，当Src活性被抑制时，可以看到的一个现象是总磷酸化酪氨酸水平的降低。图6显示这一现象对AZ28和化合物(I)都能观察到。所述数据表明化合物(I)是一种细胞内部Src抑制剂。
PDGF受体酪氨酸激酶在Y572/574上进行自动磷酸化。这并不被认为是一种细胞中直接的Src底物。普遍已知的是，AZ28是分离的PDGF受体酪氨酸激酶一种有效的抑制剂(参见实施例8中的表)。然而，如图7所示，对于AZ28可以观察到PDGF受体自动磷酸化作用的剂量反应减少。这样就可以假定这是一种间接作用。对于化合物(I)可以观察到一些作用，但是在某种程度上说，这一作用的效力较少。因此，在间接抗PDGF自动磷酸化作用的抑制作用方面，化合物(I)比AZ28具有更少的活性。如果没有加入药物的话(或者有药物加入)，在HT29细胞中都不会检测出PDGF受体酪氨酸激酶Y572/574。
黏着斑激酶Y397是一种主要地黏着斑激酶自动磷酸化作用位点，也是一种较差的Src转磷酸化作用位点。AZ28不是一种有效的黏着斑激酶抑制剂(参见实施例8中分离酶的数据)。尽管如此，图8中表示了在有AZ28存在的情况下，在c-Src527F/NIH3T3细胞中黏着斑激酶自动磷酸化作用的某些抑制作用。然而，在化合物(I)存在的情况下没有发现在c-Src527F/NIH3T3细胞中黏着斑激酶自动磷酸化作用的抑制作用。这种相反的情况也可以发现在NCI人类结肠癌细胞株HT29中。
实施例8中显示的分离酶的数据表明，AZ28是一种有效的EGFR酪氨酸激酶抑制剂。据此，图9中肿瘤细胞的数据显示AZ28能够有效的抑制EGFR酪氨酸激酶自动磷酸化作用。该位点不是一种直接的Src磷酸化作用位点。图9中显示的肿瘤细胞数据还显示了化合物(I)对于EGFRTK的酶切自动磷酸化作用具有较少的活性。
自动磷酸化作用的抑制作用与本发明化合物的GI50值有关。图10A和图10B显示了与Az28在c-Src527F/NIH-3T3细胞和在HT-29细胞中相比，化合物(I)对Src自动磷酸化作用(Y416)的抑制作用。转磷酸作用的抑制作用也与本发明化合物(I)的GI50值有关。图10D和10E显示了与Az28在c-Src527F/NIH-3T3细胞和在HT-29细胞中相比，化合物(I)对Src转磷酸作用的抑制作用。
在全细胞试验中，本发明化合物(I)显示了非常高的蛋白质酪氨酸激酶选择性。例如，图11显示了与达沙替尼相比，化合物(I)对于酪氨酸激酶的选择性。
实施例10：对噪音导致的听力丧失的保护措施
使用灰鼠(N＝6)来研究噪音导致的听力丧失。在实验操作之前，使用标准电物理方法测量动物的“听觉灵敏度”。尤其是，按照标准实验方法通过将诱发性电位从引导电极慢慢的嵌入下丘处来测定听觉阈值。将动物麻醉，打开其耳道(auditory bullae)观察左边和右边的耳蜗。耳蜗处圆窗导致的鼓阶可以作为药物的给药点。使用化合物(I)或者KX2-328(来自AstraZeneca的非腺苷三磷酸竞争性抑制剂，KX2-238)在二甲亚砜中乳化后的1000mM盐溶液处理动物，将药物给药在一个耳朵的圆窗上。
将3mM二甲亚砜在1000mM盐溶液中形成的参照溶液放置于另一个耳朵的圆窗中。将所述溶液放置于圆窗中30分钟，然后关闭耳道。随后，对动物在105分贝SPL下进行四个小时4千赫兹频带噪音处理。在暴露于噪音环境下之后，在第1天、第7天和第21天时检测动物的听力，从而确定诱发性电位的阈值位移。在第21天估定永久性阈值位移。
实施例11：使用PTK抑制剂对顺铂导致的听力丧失的保护措施
高水平噪音和耳毒性药物在耳朵内部起到几乎相同的作用，其中，所述耳毒性药物例如顺铂或者氨基糖苷类药物。首先，噪音和/或药物能够改变耳蜗(内耳)中自由基/抗氧化剂水平。自由基的增加被证明是感觉细胞凋亡的致病因素。在顺铂导致的听力丧失的研究中使用豚鼠(N＝7)。在实验操作之前，使用标准电物理方法测量动物的“听觉灵敏度”。尤其是，按照标准实验方法通过将诱发性电位从引导电极慢慢的嵌入下丘处来测定听觉阈值。将动物麻醉并用顺铂处理，随后，测定动物的听力从而确定诱发性电位阈值位移。
实施例12：化合物对破骨细胞形成的影响
为了确定化合物(I)对破骨细胞形成的影响，向衍生自脾细胞的破骨细胞前体加入所述化合物。为了产生脾衍生出的破骨细胞，在核因子-κB配位体(RANfKL)和巨噬细胞菌落-刺激因子(M-CSF)存在的条件下，用雷帕霉素、化合物(I)、KX2-328(AstraZeneca化合物)处理包括破骨细胞前体的脾细胞5天。在老鼠或者人类破骨细胞体外模型中，可溶解的RANKL能够在M-CSF存在的条件下区别出破骨细胞前体(Quinn，et al：，1998，Endocrinology，139，4424-4427；Jimi，et al.；1999，J.Immunol.，163，434-442)。将未处理的参照细胞在RANKL和M-CSF单独存在的情况下进行培养。使用雷帕霉素作为破骨细胞形成抑制作用的阳性对照。
实施例13：化合物对成骨细胞存活的作用
为了确定化合物对破骨细胞存活的作用，在核因子-κB配位体(RANfKL)和巨噬细胞菌落-刺激因子(M-CSF)存在的条件下，用雷帕霉素、化合物(I)、KX2-328处理破骨细胞48小时。将未处理的参照细胞在RANKL和M-CSF单独存在的情况下进行培养。使用雷帕霉素作为破骨细胞存活抑制作用的阳性对照。
实施例14：化合物对体外骨吸收的作用
为了确定骨切片上化合物(I)对破骨细胞形成的作用，使用增加浓度的雷帕霉素、化合物(I)、KX2-328处理骨切片，例如，浓度为0.1纳摩，1纳摩，或者10纳摩。计数骨切片上破骨细胞的数目。
在骨吸收过程中，成骨细胞形成吸收池。为了确定骨切片上化合物(I)对吸收池形成的作用，按照如上所述方法使用雷帕霉素、化合物(I)、KX2-328处理骨切片。计数骨切片上吸收池的数目。
按照上述方法处理骨切片，然后使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)对骨切片染色。确定抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性成骨细胞的数目。
按照上述方法处理骨切片，然后使用甲苯胺蓝对泄露的吸收池染色，所述甲苯胺蓝是破骨细胞调节的骨吸收的指示剂。
实施例15：化合物对成骨细胞的作用
由于涉及在骨质钙化值得磷酸盐的过程中，碱性磷酸酶可以被用作成骨细胞活性的指示剂。为了确定化合物(I)对成骨细胞活性的作用，用增加浓度的化合物(I)、KX2-328处理成骨细胞并确定碱性磷酸酶的表达(nM碱性磷酸酶/μg蛋白质/分钟。作为对照物，用单独的培养基、二甲基亚砜(DMSO)或者骨促骨生成蛋白-2(BMP2)处理成骨细胞。BMPs的定义是通过其能力进行骨诱导从而导致在嵌入额外的骨位点时导致骨生成，通常认为BMPs能够调节未分化的间充质细胞转化成为生产骨的成骨细胞。
为了决定化合物(I)在成骨细胞活性和蛋白质表达方面的作用，用培养基、二甲亚砜、BMP2、化合物(I)、KX2-328按照如上所述的方法处理成骨细胞。确定细胞溶解产物中的蛋白质浓度。
实施例16：对肥胖症的作用
下列实施例说明本发明化合物(I)可用于治疗肥胖症。使用先前描述的方法对化合物(I)进行试验(Minet-Ringuet，et al.，2006，Psychopharmacology(精神药理学)，Epub出版，通过引证在这里并入本文)。将三十个最初体重在175-200克的雄性Sprague-Dawley鼠分别放置在胶质玻璃笼中，所述胶质玻璃笼带有仿真12：12-白天-黑夜循环(在08:00开始照明)系统，并且房间中温度维持在24±1℃，将湿度维持在55±5％。在整个过程中，食物和水无限制的供应。用中等脂肪食品(代谢能17.50千焦耳/克)喂养所有的小鼠，所述中等脂肪食品由140克/公斤全乳蛋白质、538.1克/公斤玉米淀粉、87.6克/公斤蔗糖和137克/公斤豆油组成，并在日常饮食中补充以矿物和维生素(无机盐35克/公斤、维生素10克/公斤、纤维素50克/公斤和胆碱2.3克/公斤)。这些食物也叫做P14-L，与人类日常饮食相似(14％蛋白质、31％脂质和54％碳水化合物)，该食物在实验室中以粉末形式被制备。
除了参照溶液之外，还对若干剂量的本发明化合物(I)进行检测：0.01、0.1、0.5和2毫克/公斤。将化合物溶解于水中，然后结合进日常饮食中，在适应期内记录基本的食物摄入并由此确定每日结合近食物中的本发明化合物的量。将所述化合物混合入实验室制备的食物中。在经过一星期，适应了实验室的情况之后，将这些小鼠分为5组(每组n＝6)，每组的重量相同并喂给加入本发明化合物的食物6星期。每周记录重量三次。在研究结束后通过解剖测定身体组织的重量并对主要的器官和组织称重。通过腹膜内注射过量的麻醉剂(戊巴比妥钠48毫克/公斤)并进行肝素化(100U肝素/100克体重)使小鼠快速的被深度麻醉。在移去并称重主要新鲜器官(肝、脾、肾脏和胰腺)和组织(肾周脂肪组织和肩胛粗脂肪组织、附睾脂肪组织、腹膜后脂肪组织、内脏脂肪组织和皮下白色脂肪组织(WATs)，和由肌肉和骨骼组成的尸体)以前，通过切断大静脉和腹主动脉对小鼠放血(为了避免凝结在组织中)。
实施例17：化合物对3T3-L1脂肪细胞中胰岛素导致的GLUT4移位作用的影响
下列实施例说明本发明化合物(I)可用于治疗糖尿病。使用先前描述的方法对本发明化合物(I)进行试验(Nakashima，et al；2000，J.Biol.Chem.，275，12889-12895)。将对照物IgG(免疫免疫球蛋白G)或者本发明化合物注入培养片上辨别出的3T3-L1脂肪细胞细胞核中。为了进行检测，将谷胱甘肽5-转移酶融合蛋白质与5毫克/毫升羊免疫免疫球蛋白G一起注射。再染色之前，允许细胞恢复1个小时。将细胞在无血清的培养基中培养2小时，用或者不用胰岛素刺激(0.5纳摩或者17纳摩)20分钟，然后固定。
使用兔多克隆抗GLUT4(F349)(1微克/毫升)进行免疫染色。在质膜-有关的GLUT4着色存在的情况下，对每个异硫氰酸荧光素-阳性微注射的细胞进行评价。使用预免疫的羊免疫免疫球蛋白G对参照细胞进行注射，然后按照进行试验注射的细胞相同的方法进行处理。通过萤光免疫检验法的GLUT4染色进行测定，胰岛素导致向质膜的GLUT4移位作用增加。本发明化合物能够刺激胰岛素导致的GLUT4移位作用，这表明给药本发明化合物能够抑制激酶活性，例如，PTEN功能，从而导致胞内磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸盐水平的增加，刺激GLUT4移位作用。
实施例18：化合物对视网膜新血管生成的影响
下列实施例说明本发明化合物(I)可用于治疗眼部疾病，例如，黄斑变性、视网膜病和黄斑浮肿。化合物对视网膜新血管生成的影响可以使用之前描述的视网膜新血管生成模型确定(Aiello，et al.；1995，Proc.Natl.Acad.Sd.，92，10457-10461)。C57B1/6J鼠在出生后第7天(P7)到第12天暴露于75％氧气条件下，并精心照顾。在第12天，将小鼠放回室内空气中，在第12天和第14天的某些时候进行如下所述的眼球内注射。在17天，通过心脏灌注4％的多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水中的溶液致死小鼠，并剜出眼睛，在包入石蜡中之前，在4℃条件下，固定在4％多聚甲醛中过夜。
在所有步骤中，使用三溴代乙醇将小鼠深深的麻醉。打开眼睑(例如，使用11号解剖刀)将眼睛提升(proptosed)。首先使用Ethicon TG 140-8缝合针进入左眼到达后部的异组织边缘，进行眼球内注射，使用32-定径的汉弥尔顿针和注射器通过已经存在的入口位点传递用Alcon平衡盐液稀释后的本发明化合物。然后将眼睛复位并将眼睑大致盖住角膜。2天后通过先前未处理的断口进行重复注射。作为参照，对右眼注射等量的盐水。
从视觉神经头部开始，制造超过50个6微米石蜡包埋的轴向截面。在用高碘酸/Schiff试剂和苏木精染色之后(Pierce，et al；1995，Proc.Natl.Acad.ScL USA.，92，905-909；Smith et al；1994，Invest.Ophthal.Vis.Set.，35，101-111)，对具有相同长度、间隔30微米的10个完整的截面进行评估，所述断面跨度为300微米。显示视网膜剥离或者眼内炎的眼睛从评价试验中除去。在完全遮盖的试验中，在每个截面内计算在内界膜之前的所有视网膜血管细胞核。所有10个计数的截面的平均值产生平均新生视网膜细胞核每6-微米截面每眼。在正常的、未处理的动物中，不会观察到在内界膜之前的血管细胞核(Smith et al；1994，Invest.Ophthal.Vis.ScL，35，101-111)。与盐水对照组的眼睛相比，用本发明化合物处理的眼睛可以观察到减少的新血管生成。
实施例19：与中风有关的激酶信号级联的调节
已经发展并定性了很多中风的动物模型，参见，例如，Andaluz，et al.，Neurosurg.Clin.North Am.，vol.13：385-393(2002)；Ashwal，S.and W.J.Pearce.，Curr.Opin.Pediatr.，vol13：506-516(2001)；De Lecinana，et al，Cerebrovasc.Dis.，vol.11(Suppl.1)：20-30(2001)；Ginsberg and Busto，Stroke，vol.20：1627-1642(1989)；Lin，et al.，J.Neurosci.Methods，vol.123：89-97(2003)；Macrae，I.M.，Br.J.Clin.Pharmacol.，vol.34：302-308(1992)；McAuley，M.A.，Cerebrovasc.BrainMetab.Rev.，vol.7：153-180(1995)；Megyesi，et al，Neurosurgery，vol.46：448-460(2000)；Stefanovich，V.(ed.).，Stroke：animal models.Pergamon Press，Oxford(1983)；和Traystman，R.J.，ILAR J.44：85-95(2003)，这些文献通过引证在此全部并入本文。作为用于局部(中风)和整体(心脏骤停)脑缺血动物模型的参考，参见，例如，Traystman，ILARJ.，vol.44(2)：85-95(2003)和Carmichael，The Journal of the AmericanSociety for Experimental NeuroTherapeutics，vol.2：396-409(2005)(实验性神经治疗的美国社会期刊)，这些文献通过引证在此全部并入本文。
在中风中，使用本领域已知的用于中风的模型识别能够调控细胞死亡的化合物。在这里所描述的研究中，使用动脉内缝合闭塞大脑中动脉(MCA)通过颈内动脉作为用作在中风中细胞死亡模型，该方法也叫做MCAo。在小鼠的控制组和检测组，横切颈外动脉，将颈总动脉结扎，然后将颈外动脉用作一种途径，允许通过颈内动脉的缝线经过，其中，将所述缝合固定在前面和中间脑动脉接合处。为了减少蛛网膜下出血和早发再灌注。优选的在缝合处涂布一种试剂，例如，硅树脂。将缝合处用于阻塞MCA并持续一段时间，例如，持续60分钟、90分钟或者120分钟，或者永久的阻塞MCA。
在检测组，在使用缝合方法MCA闭塞之前、期间或之后不同的时间对小鼠给药本发明化合物(I)。将检测组中本发明化合物的影响与在参照组中观察到的影响相比，例如，通过测量每个MCAo基团细胞死亡的程度进行比较。一般地，在对照组，细胞死亡按照从纹状体的早期梗死开始到覆盖所述纹状体的背外侧皮层的延迟梗塞死为止，以这一过程为特征。纹状体通常先坏死并且此坏死发生的非常迅速。将检测组细胞死亡方式与控制组的细胞死亡方式相比，从而识别能够调控中风过程中细胞死亡的化合物。
实施例20：与动脉粥样硬化症有关的激酶信号级联的调节
已经发展并定性了很多用于动脉粥样硬化症的动物模型。作为动脉粥样硬化症、再狭窄和血管内移植研究动物模型的回顾，请参见，例如，Narayanaswamy et al.，JVIR，vol.11(1)：5-17(2000)，所述文献通过引证在此全部并入本文。使用高脂肪/高胆固醇(HFHC)日常饮食可以在适当的动物模型中诱发动脉粥样硬化症。所述试验动物是包含胆固醇酯转移酶的动物，例如兔子或者猪。通过例如商业可购得的补充有脂肪的食物制备HFHC日常饮食。胆固醇摄取量在日常饮食的0.5-2.0％之间。对实验组的动物，例如兔或者猪给药本发明化合物(I)。将检测化合物的作用与未处理的对照组动物中对动脉粥样硬化症的作用相比。被比较的作用包括，例如，动脉粥样斑形成的程度、在每组动物中观察到的心肌梗塞的数量和/或频率，以及冠状组织中显示的从属于心肌梗塞二发生的组织损伤程度。
使用多种动物模型研究心肌梗塞，所述动物模型例如鼠和老鼠。大多数心肌梗塞能够引起已经存在的冠状动脉粥样斑快速血栓闭塞，在动物模型中通过结扎鼠和老鼠左侧冠状动脉来模仿所述冠状动脉的动脉粥样斑。心肌梗塞导致心室结构的整体变化，这个过程叫做心室重新塑造。血管梗塞的心脏逐渐膨胀并加速心室功能紊乱的恶化，最终导致心力衰竭。
通过结扎左前部下行的冠状动脉在检测组和对照组动物，例如老鼠或者鼠体内导致心肌缺血。在出现局部缺血感应现象之后，将受影响的心脏组织给药本发明化合物(I)，例如通过腹膜内(i.p.)注射给药。在手术后24小时，测定高分辨率磁共振成象(MRI)、干重测量值、梗塞面积、心脏容积、和受风险的面积。对受到本发明化合物(I)注射的小鼠在手术后各个时间测定存活率和超声波心动描记。将检测化合物的其他作用与对照组小鼠进行对比。例如，使用超声波心动描记法对左心室几何和功能方面的改变进行定性，从而对比末端-心脏舒张直径、相对胞壁厚度和缩短分数百分比。在离体心室中，计算梗塞面积并表示为占左心室表面面积的百分比。
实施例21：与神经性疼痛有关的激酶信号级联的调节
用于神经性疼痛，例如慢性神经性疼痛的许多动物模型已经被发展并定性，参见，例如，Bennett&Xie，Pain，vol.33，87-107(1988)；Seltzer et al.，Pain，vol.43，205-18(1990)；Kim&Chung，Pain，vol.50，355-63(1992)；Malmberg&Basbaum，Pain，vol.76，215-22(1998)；Sung et al.，Neurosci Lett.，vol.246，117-9(1998)；Lee et al.，Neuroreport，vol.11，657-61(2000)；Decosterd&Woolf，Pain，vol.87，149-58(2000)；Vadakkan et al.，J Pain，vol.6，747-56(2005)，这些文献的全部内容通过引证在此全部并入本文。作为用于神经性疼痛的动物模型的回顾，参见，例如，Eaton，J.Rehabilitation Research andDevelopment，(复原研究和发展)vol.40(4Supplement)：41-54(2003)，该文献的全部内容通过引证在此全部并入本文。
使用任意本领域内已知的用于神经性疼痛的模型来识别能够调控神经性疼痛的化合物。例如，用于神经性疼痛的模型通常包括坐骨神经伤害，尽管该方法常常会导致伤害变化。例如，通过部分收缩、完全横切、神经冷冻和对神经进行新陈代谢损伤、化学损伤或者免疫损伤使坐骨神经受伤。经过这种神经伤害的动物已经表现出发展成非正常的疼痛，这种疼痛类似于患有神经性疼痛的病人所报道的疼痛。在这里描述的研究中，检测组和对照组主体，例如，老鼠的坐骨神经被损害。在检测组中，在坐骨神经受到损伤之前、期间或者之后对主体给药本发明化合物。将本发明化合物(I)对检测组的影响与对照组观察到的影响相比较，例如，通过对主体进行物理观察和检验。例如，在老鼠体内，使用老鼠的后爪检测对非有害刺激物，例如触觉刺激的反应，或者检测老鼠对在正常状态下有可能有害的刺激的反应，所述刺激例如，将后爪加热。在患者体内，异痛症、通常无痛的刺激导致的疼痛或者痛觉过敏、对疼痛过度敏感或者易感的迹象表明检测化合物在调控测试主体内神经性疼痛方面是无效的。
实施例22：与乙型肝炎有关的激酶信号级联的调节
用于乙型肝炎的许多动物模型已经被发展并定性。作为用于乙型肝炎的动物模型的回顾，参见，例如，Guha et al.，Lab Animal，vol.33(7)：37-46(2004)，所述文献通过引证在此全部并入本文。适当的动物模型包括，例如，黑猩猩、树鼯(非啮齿小动物，在动物种类史上接近于灵长类，参见Walter et al，Hepatology(肝脏病学)，vol.24(1)：1-5(1996)，所述文献通过引证在此全部并入本文)，以及代位模型例如旱獭、鸭子和黄鼠(参见例如，Tennant and Gerin，ILAR Journal，vol.42(2)：89-102(2001)，所述文献通过引证在此全部并入本文。
例如，从树鼯种树鼯属belangeri的肝脏中分离出初始肝细胞，并用HBV感染。体外传染导致病毒DNA和RNA在肝细胞中合成并向培养基中分泌乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎抗原(HBeAg)。还可以用HBV在体内感染树鼯属，导致病毒DNA复制和树鼯属肝脏中的基因表达，与人类急性自我限制型乙型肝炎相似，乙型肝炎表面抗原能够快速的从血清中清除，随后血清转变成抗HBe和抗HBs。
使用任意本领域内已知的用于乙型肝炎的模型来识别能够调控神经性疼痛的化合物。在这里描述的研究中，用HBV病毒感染检测组和对照组的动物，例如，黑猩猩或者树鼯。在检测组中，在暴露于HBV病毒之前、期间和之后的不同时间内，对主体给药本发明化合物(I)。将本发明化合物(I)对检测组的影响与对照组观察到的影响相比较，例如，通过对主体进行物理观察和检验或者通过血液或者血清分析从而确定传染从主体清除的时间。例如，运行试验从而检测乙型肝炎病毒要求的表面抗原和其片段的存在和/或量。做为选择或者另外，分析主体的肝脏。使用肝功能试验分析某些蛋白质和酶的水平，所述蛋白质和酶例如，天冬氨酸转氨酶(AST，从前的血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(SGOT))和丙氨酸转氨酶(ALT，从前的血清谷氨酸-丙酮酸盐转氨酶(SGPT))。
实施例23：化合物对酪氨酸激酶抑制作用的影响
下列实施例说明本发明化合物(I)可用于治疗自身免疫疾病。使用先前描述的方法检验所述化合物(I)(Goldberg，et al.；2003，J.Med.Chem.，46，1337-1349)。使用DELFIA(离解作用提高的镧系元素氟代免疫试验)测量激酶活性，所述试验利用铕螯合-标记的抗磷酸化酪氨酸抗体检测转入无规聚合物聚Glu4-Tyrl(PGTYR)中的磷酸盐。在处于激酶测定缓冲剂(50毫摩尔HEPES，pH值为7.0，25毫摩尔MgCl2，5毫摩尔MnCl2，50毫摩尔KCl，100微摩Na3VO4，0.2％BSA，0.01％CHAPS)中的中性链亲和素涂布的96孔白板上进行激酶测定试验。将试验样品(本发明化合物(I))首先以1毫克/毫升的浓度溶解于二甲亚砜中，用测定缓冲剂进行预稀释，用于剂量反应(10剂量，起始终浓度为1微克/毫升，1-3.5连续稀释)。将25微升等份的稀释样品和25微升的稀释酶(lck)(0.8纳摩终浓度)相继添加到每个小孔中。在50微升/孔的底物混合物中起始反应，所述底物混合物包含2微摩腺苷三磷酸(最终腺苷三磷酸浓度是1微摩)和在激酶缓冲剂中浓度为7.2毫微克/微升PGTYR-生物素。对照孔只用缓冲液和底物培养。在室温下培养45分钟之后，用300微升/孔DELFIA洗涤缓冲剂洗涤测定孔板三次。向每个小孔中加入100微升/孔等分的用DELFIA测定缓冲剂稀释后的铕-标记的抗磷酸化酪氨酸(Eu3+-PT66，1纳摩，Wallac CR04-100)，并在室温下培养30分钟。培养完成之后，所述孔板用300微升/孔的洗涤缓冲剂和100微升/孔的DELFIA洗涤缓冲剂洗涤孔板四次。向每个小孔中加入增强作用溶液(Wallac)。十五分钟之后，测量LJL分析(在360纳摩下激发，在620nm下传播，EU 400分色镜)在延迟250微秒后的时间分辨荧光色谱图。本发明化合物可以抑制lck的激酶活性，这一结果表明所述化合物可能用来治疗患者的自身免疫性疾病。
实施例24：化合物(I)和达沙替尼在达沙替尼-抗药性细胞系中的IC 50 值；在各自细胞 株中十二种抑制剂的浓度。
根据最新资料的报道，癌细胞株是具有达沙替尼抗药性的(Le.，COLO-320DM，H460，H226，and HCT-116)，将此达沙替尼-抗药性癌细胞系在有KXO1/化合物(I)Src抑制剂或者达沙替尼参照物存在的情况下培养，从而确定KXO1/化合物(I)对细胞生长抑制作用的影响。使用MTT比色定量试验评价细胞增殖/生长抑制作用。另外，确定KXO1/KX2-391和达沙替尼对照物的IC50。下表提供了在生长抑制作用研究中使用的一系列细胞系。
名称 ATCC No. 类型
H460 HTB-177 NSCLC
H226 CRL-5826 NSCLC
COLO-320DM CCL-220 结肠直肠腺癌
HCT 116 CCL-247 结肠直肠癌
按照常规方法培养COLO-320DM、H460、H226和HCT-116人类癌细胞系，并在37℃下，5％二氧化碳环境中，将所述细胞系保存在包含2％FBS的基础培养基中。为了进行试验，将细胞接种96孔板中，所述细胞处于基础培养基/1.5％FBS中，接种量为4.0x103/190微升和8.0x103/190微升/孔。在37℃下，在适当的二氧化碳环境中，在加入化合物(I)和达沙替尼之前，在96孔板中将细胞培养过夜(16小时)。
为了稀释化合物(I)和达沙替尼(BMS354825)，将20毫摩尔储备溶液样品在基础培养基/1.5％FBS中按照1∶3的稀释法进行逐级稀释，产生20x浓度在131微摩到0.74纳摩范围内。10微升20x稀释液被添加到包含190微升癌细胞系的适当的孔中(n＝3)，产生的最终浓度在6561纳摩到0.037纳摩范围内。使用下列对照物：细胞的载体参照且无样品；细胞的培养基对照物、无样品，和0.03％二甲亚砜(存在于样品中的最高浓度的二甲亚砜；没有报道结果)。
在37℃下，在适当的二氧化碳环境中，将处理后的癌细胞培养3天(78小时)。在第3天，向每个小孔中加入10微升的MTT(5毫克/毫升)。然后在37℃下，在适当的二氧化碳环境中，在MTT存在的条件下培养细胞4小时。培养之后，向每个小孔中加入90微升10％十二烷基磺酸钠(+HCl)从而裂解细胞并溶解三苯基甲脂。然后，在37℃下，在适当的二氧化碳环境中，将细胞培养整夜。
使用微板阅读器测量OD570。使用GraphPad Prism 4统计软件确定生长抑制作用曲线和EC50/IC50值。整理数据从而表示最大反应百分比。
下表显示了在78小时，化合物(I)和达沙替尼在癌细胞系中的IC50值(8.0x103细胞/孔，1.5％FBS)(是标准化反应数据的结果)。
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实施例25：化合物(I)对达沙替尼和甲磺酸伊马替尼抗药性白血病细胞的作用。
在96孔板中，使用完全培养基+IL-3培养Ba/F3细胞(参见例如，Palacios et al.，Nature 309：126-131(1984)；Palacios et al.，Cell 41：727-734(1985))对Ba/F3细胞进行培养，并将培养后的Ba/F3细胞进行转染，从而表达野生型(WT)Bcr-Abl，Bcr-Abl的E255K突变体，或者Bcr-Abl的T315I突变体，并在96孔板中，使用不含有IL-3的完全培养基培养。当发生Bcr/Abl酪氨酸激酶E225K突变时，对Ba/F3细胞株赋予格列卫(Gleevec)抗药性。当发生Bcr/Abl酪氨酸激酶T3151突变时，对Ba/F3细胞株赋予格列卫(Gleevec)抗药性和达沙替尼抗药性。然后分别用无药物、0.1-10,000纳摩达沙替尼或者0.1-10,000纳摩化合物(I)的10倍稀释液中处理各组细胞96小时。进行MTT试验(在570纳摩时进行孔板读数)。将所有试验重复3遍。
图12-13和下表概括了所述研究的结果，结果显示，在GI50＝35处，化合物(I)能够抑制BCR-AbI的T315I突变株，而达沙替尼在10,000纳摩时仍不能抑制。此外，达沙替尼不能够抑制IL-3-导致的Ba/F3细胞增殖，而化合物(I)是一种有效的抑制剂(GI50＝3.5纳摩)。
实施例26：使用化合物(I)和BMS354825对五个细胞系进行GI 50 /5-溴脱氧尿核苷试验
使用化合物(I)估价五个细胞系(SKOV-3、K562、HT-29、A549和MDA-MB 231)的GI50值，并使用5-溴脱氧尿核苷在T＝0和T＝72时进行BMS354825试验。
为了进行这些试验，将细胞接种到两个96孔板中，每个细胞株按照下面所示的细胞编号，每个96孔板的小孔中含有200微升包含1.5％FBS的生长培养基。被评价的细胞系是：SKOV-2、K562、HT-29、A549和MDA231。除了HT-29和MDA MB 231细胞外，在每个小孔中接种1000个其他的试验细胞，HT-29接种2000个细胞，MDA MB 231接种5000个细胞。除了MDA231，其他的细胞在37℃下，5％二氧化碳环境中接种之后，将孔板培养24小时。对于MDA231，该细胞株在37℃下，0％二氧化碳环境中生长。
在接种24小时之后，向一个孔板的细胞株(n＝3)中加入KX2-391和BMS354825浓度为128纳摩、64纳摩、32纳摩、16纳摩、8纳摩、4纳摩、2纳摩和1纳摩。经过入KX2-391和BMS354825处理的细胞株孔板在37℃下，5％二氧化碳环境中培养72小时。除了MDA231，MDA231在37℃下，0％二氧化碳环境中生长。在T＝0和T＝72时进行5-溴脱氧尿核苷试验。
生长抑制：使用公式GI＝[(T1-T0)/(Con-To)]x100，和5-溴脱氧尿核苷试验数据确定每个样品浓度的生长抑制百分比。其中，T0＝细胞在0时的荧光度；Ti＝表示在第x小时的处理后细胞荧光度；Con＝在x时参照细胞的荧光度。≤T0值的Ti值被叫做T细胞毒性。使用XLFit估计GI50，除了≤T0值的Ti(细胞毒性)值之外。图14-18和下表概括了研究结果。
实施例27：5-溴脱氧尿核苷试验测定Gemzar和化合物(I)在L3.6pl细胞株中的联合 GI 50 。
该试验包括使用5-溴脱氧尿核苷试验(罗氏化学：商品分类号：11647229001)在T＝0和T＝72时进行试验，评价L3.6pl细胞株中Gemzar±化合物(I)的GI50值。将L3.6pl细胞接种到3个96孔板中，所述L3.6pl细胞是一种胰腺癌细胞株，向每个孔板中接种2000细胞/孔，所述细胞是位于190微升包含1.5％FBS的生长培养基中的L3.6pl。Trevino et al.Am JPathol.2006Mar；168(3)：962-72的文献中已经描述了L3.6pl细胞，该文献的全部内容通过在此引用全部并入本文。在接种之后，在37℃下，5％二氧化碳环境中培养细胞18-24小时.24小时之后，向L3.6pl细胞(n＝3)中加入Gemzar+化合物(I)、Gemzar、和化合物(I)。在浓度为8纳摩、4纳摩、2纳摩、I纳摩、0.5纳摩、0.25纳摩、0.125纳摩、0.063纳摩时评价Gemzar。在浓度为10O纳摩、50纳摩、25纳摩、12.5纳摩、6.25纳摩、3.125纳摩、1.56纳摩、和0.78纳摩条件下对化合物(I)进行评价。在37℃下，5％二氧化碳环境中将各个用样品处理过的孔板培养72小时。在T＝0时进行5-溴脱氧尿核苷试验，然后在培养72小时之后，在进行一次试验，T＝72。图19和20中提供了所述研究的结果。下表概括了计算所得的Gemzar±化合物(I)的GI50结果。
实施例28：用于研究体内转移的正位前列腺模型
用PC3-MM2前列腺癌细胞对Nu/Nu老鼠(8-12星期大的)的前列腺进行注射，如Pettawayet al，Clin Cancer Res 1996，2：1627-1636之前的描述，该文献的全部内容通过引证在此全部并入本文。正位注射PC3-MM2细胞十四天后，将老鼠随机分为4组：分别用达沙替尼(15毫克/公斤/天)处理；化合物(I)(5毫克/公斤/天)处理；化合物(I)(10毫克/公斤/天)处理和作为对照物(煤介物)。达沙替尼、化合物(I)和煤介物通过口服给药方式给药。在大约42天后，通过颈脱位致死所有老鼠。记录肿瘤体积(通过圆规测定)、重量和区域发病率(腹腔或者主动脉)淋巴结次生肿瘤。下表、图21和图27中记录了试验结果。
实施例29：HBV初步试验
按照Korba(Antiviral Res.15：217-228(1991)和Antiviral Res.19：55-70(1992))等人描述的方式进行HBV初步试验的发展，但是其中的病毒DNA的检测和量化已经被改善和简化了(Korba et al.，Antiviral Res.19：55-70(1992))。
在标准化HepG2-2.2.15抗病毒试验中使用单个高试验浓度的化合物来评价化合物(I)的潜在的抗HBV活性。所述HepG2-2.2.15是一种稳定的细胞株，能够产生高水平的野生型HBVaywl菌株。简单的讲，将HepG2-2.2.15细胞放入96孔板中。只使用所述孔板的内部小孔，从而减少在细胞培养期间观察到的“边缘效应”；将外部小孔中充满完全培养基从而最小化样品蒸发。在第二天，洗涤HepG2-2.2.15细胞融合的单层细胞，并将所述培养基替换为包含三倍检验浓度试验物品的完全培养基。使用3TC作为阳性参照物，当单独加入培养基时，将此细胞用作未处理的参照物。三天之后，将所述培养基替换为包含适当稀释药物的新鲜培养基。在最初给药测试化合物之后六天，收集细胞培养物悬浮液，用链霉蛋白酶和脱氧核糖核酸酶(DNAse)处理，然后用于实时定量TaqMan PCR试验中，使用ABI Prism 7900顺序检测系统(Applied Biosystems公司，Foster City，CA)，直接测量HBV DNA拷贝。
通过将其HBV DNA拷贝与未处理的参照细胞(100％)的拷贝相比较，计算各个检验化合物的抗病毒活性，从而得到抑制作用水平百分比。之后除去上清液，将剩余细胞进行CellTiter 96Aqueous One(购自Promega公司，Madison，WI)溶液细胞增殖试验(MTS-基础的)，从而检测细胞存活期。通过将化合物处理后的细胞活性与未处理的细胞参照物的细胞活性相比较，来确定化合物的细胞毒性，从而得到细胞参照物的百分比。下表和图23中显示了所述研究的结果。
实施例30：全细胞中Src激酶活性的抑制作用
在全细胞中本发明化合物(I)能够抑制Src激酶活性，如图10A、10B、10C、和10D所示。图10A是一种描绘c-Src/NIH-3T3细胞中化合物(1)对Src自动磷酸化作用影响的图表；图10B是一种描绘HT-29细胞中化合物(I)对Src自动磷酸化作用影响的图表；图10C是一种描绘c-Src/NIH-3T3细胞中化合物(I)对Src转磷酸化作用影响的图表；且图10D是一种描绘HT-29细胞中化合物(I)对Src转磷酸化作用影响的图表。在全细胞中，化合物(I)是一种有效的Src激酶活性抑制剂。如图10A-10D所示，在全细胞中，化合物(I)是一种有效的Src激酶活性抑制剂。具体的讲，在多种细胞系中，化合物(I)是一种有效的Src自动磷酸化作用的抑制剂(图10A和10B)且是一种Src转磷酸作用的有效的抑制剂(图10C和10D)。对于附加的转磷酸作用底物可以得到类似于全细胞的抑制作用，所述附加的转磷酸作用底物也叫做黏着斑激酶Y925和桩蛋白Y31。在全细胞中，PDGF Y572/574、表皮生长因子Y845、JAK1Y1022/1023和JAK2Y1007/1008、Lck Y405和ZAP70Y319的磷酸化作用没有被抑制。Lyn Y416和Bcr/Abl&245的磷酸化作用的抑制作用比较小。
实施例31：蛋白质酪氨酸激酶在全细胞中的选择性
本发明化合物(I)对于蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)具有选择性。图11是一种描绘全细胞中同达沙替尼相比化合物(I)对蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)选择性的附图。所述达沙替尼是目前在临床试验中广泛使用的腺苷三磷酸-竞争性的Src抑制剂。SYF细胞是一种缺少Src激酶族成员Src、Yes和Fyn的老鼠成纤维细胞。与达沙替尼相比，化合物(I)在全细胞中显示了相当高的PTK选择性。
实施例32：口服效力
本发明化合物(I)显示了很好的口服效力。例如，图24显示了与达沙替尼相比化合物(I)的口腔效力。使用阶段性的HT29(人类结肠癌)老鼠异种移植物，在28天时间内用kxol处理，并在2.0和4毫克/公斤时检测来确定口服效力。对于达沙替尼在25毫克/公斤时检测。在第5天，由于重量损失，将达沙替尼剂量减少为15毫克/公斤。
实施例33：HCV初步试验
本发明化合物(I)可用于治疗HCV。使用Pietschmann，T.，et al.J.Virol.76：4008-4021描述的方法检测本化合物。ET细胞株是人类肝癌细胞株，Huh-7含有带有稳定的荧光素酶(Luc)指针的HCV RNA复制子(基因型Ib)和三个细胞培养物适应性突变。在37℃下，5％二氧化碳环境中，在Dulbecco′s改进的基础培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(pen-strep)、1％谷氨酰胺、5毫克/毫升G418中培养细胞。所有的细胞培养基试剂来自例如，Mediatech(Herndon，VA)。
实施例34：向血浆和脑的暴露
化合物(I)显示了很好的血浆和脑的暴露。例如，下面描述了化合物(I)向血浆和脑的暴露。在口服给药之后，测量老鼠体内的血浆浓度。在纯净水中配制AU制剂。在服药后4小时进行密集的培养，随后对雄性CD-1鼠给药。剂量如下所述：
*注意：给药的剂量是毫克自由碱/千克
用0.25毫升乙腈沉淀血浆中的蛋白质，用0.25毫升乙腈沉淀脑中蛋白质。进行离心之后，将上清液直接注入到LC/MS系统中。使用50微升等份的血浆和50微升等份的脑，数量限制为1纳克/毫升。脑和血浆的标准曲线是1到1000纳克/毫升。高效液相色谱条件如下所述：
高效液相色谱系统：Shimadzu SCL-10系统
分析柱：Aquasil C1 85微米100x2毫米柱。
柱温：环境温度
自动取样器温度：环境温度
流动相A)10mM甲酸铵在水中的溶液(pH值为4)
B)乙腈。
流速：0.6毫升/分
注射体积：2微升
梯度：
时间(分钟) 1.0 1.6 2.6 3.8 3.9 4.1 4.4 4.6 4.65 7.0
％B 20 20 65 65 20 20 95 95 20 停止
质谱条件如下所述：
工具：ABI Sciex API 4000
模式：ESI+
实验：MRM(多重反应监测)
转换：化合物(I)：m/z 432.4→114.2(Rt＝3.11分钟)
下面的四个表分别显示了化合物(I)以10毫克/千克和50毫克/千克的剂量进行单一给药剂量后的血浆和脑浓度
以10毫克/千克的剂量对雄性CD-I鼠进行单一PO给药后的化合物(I)的血浆浓度(第一组)
NA：不适用。
BLQ：低于定量限制(1毫微克/毫升)
BLQ＝当计算平均数、标准差和％CV时为0
以10毫克/千克的剂量对雄性CD-I鼠进行单一PO给药后的化合物(I)的脑浓度(第一组)
以50毫克/千克的剂量对雄性CD-I鼠进行单一PO给药后的化合物(I)的血浆浓度(第二组)
以50毫克/千克的剂量对雄性CD-I鼠进行单一PO给药后的化合物(I)的脑浓度(第二组)
以10毫克/千克的剂量(第一组)对鼠进行单一剂量给药之后化合物(I)在老鼠脑部和血浆中的药代动力学参数
注意：脑Cmax和AUClast的单位分别为毫微克/毫升和毫微克·小时/毫升。
脑AUClast/血浆AUClast的比率是0.42。
以50毫克/千克的剂量(第二组)对鼠进行单一剂量给药之后化合物(I)在老鼠脑部和血浆中的药代动力学参数
注意：脑Cmax和AUClast的单位分别为毫微克/毫升和毫微克·小时/毫升。
脑AUClast/血浆AUClast的比率是0.39。
实施例35：神经胶质瘤存活者研究
进行脑肿瘤鼠异种移植研究来比较化合物(I)和(替莫唑胺)。在C57BL/6鼠中进行研究。将GL261神经胶质瘤细胞(在5微升DMEM中1x105个)植入颅内对等位置：前囟点、侧部2.0mm、前部1.2mm、硬脑脊膜3.0mm深度。在移植3天之后开始治疗。治疗组如下所示(所有剂量都在100微升的水中)：
下表显示了结果的概括。存活范围中值和对数轶(log-rank)(mantel-cox)统计学检测试验能够获得样品存活分布的比较结果。
图24和图25A-D显示了不同的治疗组中每只CD57BL/6鼠体重的增量。下表显示了每个治疗组末端时的平均体重。图26的图表显示了每个治疗组经过40天时间之后的平均体重。
在末端的平均体重
实施例36.使用一种结合物对细胞生长的协同抑制作用
体外检测化合物(I)和他莫西酚的结合物，从而确定该结合物在MCF-7乳腺癌细胞中抑制细胞生长的能力。如下所示，通过MTT试验检测了一种浓度范围。第一栏是指化合物(I)的浓度。
使用CalcuSyn软件(Biosoft公司)来分析MTT细胞生长数据。该程序使用中值作用原则(77)来描述两种药物之间的相互作用。对于结合物的每种剂量，该程序产生一种结合指数(Cl)。这种结合指数(Cl)小于1、等于1或者大于1分别表示协同效应、加成作用或者结抗作用。图27显示了100nM他莫昔芬(tamoxifen)与75nM化合物(I)相结合所获得的协同的生长抑制效果。计算得到所述结合物的结合指数(Cl)是0.505。
其它实施方案
尽管本发明已经结合其详细的说明进行了描述，但是之前的描述只是起到说明作用，并不能作为本发明范围的限制，而本发明的范围由所述权利要求书来定义。本发明其他的方面、优点和改良也包括在随后的权利要求书的范围内。本发明所述领域普通技术人员应该理解的是，在不背离由所附权利要求书定义的本发明范围的情况下，可以进行多种形式和细节方面的改变。

Claims (10)

1.化合物(I)或其药学上可接受的盐在制备用于口服给药、静脉内给药、肌肉给药或者皮下给药的药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症，其中所述药物包含一定量化合物(I)以及药学上可接受的载体，每剂量中包含20毫克到250毫克化合物(I)，每日给药2次或3次或者每剂量中包含40毫克到500毫克化合物(I)，每日给药一次，且所述药物与他莫昔芬、吉西他滨或奥沙利铂结合给药，
优选所述一定量是指每剂量中包含40毫克到200毫克，每日给药2次或3次，
优选所述一定量是指40、80或120毫克每剂量，每日给药一次，更优选所述一定量是指约40毫克每剂量，每日给药一次，或更优选所述一定量是指约80毫克每剂量，每日给药一次，或更优选所述一定量是指约120毫克每剂量，每日给药一次，
优选所述药物包括化合物(I)的甲磺酸盐，
优选所述药物每日给药一次。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述药物与吉西他滨结合给药。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物与他莫昔芬结合给药。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是结肠癌。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物与奥沙利铂结合给药。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的用途，其中所述药物用于口服给药。
10.根据权利要求1-8中任意一项所述的用途，其中所述药物用于静脉内给药。
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