CN105520930A - 一类黄烷化合物在预防或治疗黑色素瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类黄烷化合物在预防和/或治疗黑色素瘤方面的功能和用途，该类化合物是由黄烷聚合物经连接有不同功能基团的硫代试剂衍生化后得到的，发明人在对该类化合物药理活性评价过程中发现：该类化合物可明显激活细胞自噬活性；可明显增加黑色素瘤细胞内活性氧自由基水平，却不影响正常肝脏细胞内活性氧自由基水平；该类化合物在体内及体外均能够选择性抑制黑色素瘤生长。因此可以用于开发成抑制黑色素瘤方面的药物。

Description

一类黄烷化合物在预防或治疗黑色素瘤中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，一类黄烷化合物在预防或治疗黑色素瘤方面的药物和保健品方面的新用途。

背景技术

黑色素瘤是目前恶性肿瘤中发病率增长最快的一种，在我国，黑色素瘤的发病率也在不断增高，每年新发病例已超过10000例。目前，黑色素瘤的治疗方法主要包括手术、化疗、免疫治疗及靶向治疗。多数早期患者通过手术能够治愈，但对于进展期患者，化疗通常效果不佳，因此，寻找更为有效的化疗药物单独或辅助治疗具有一定意义。

自噬是目前涉及生物学、医学、植物学和微生物学等领域的一个快速发展的研究热点。尤其在生物医学界，许多研究人员正在积极探讨自噬在各种疾病中的作用，研究疾病中自噬水平调控的分子机制，以期利用自噬为临床疾病治疗寻找新的有效靶点。这些疾病包括感染性疾病、心脑血管疾病、癌症、代谢紊乱性疾病和神经退行性疾病等。

细胞自噬是细胞在饥饿、能量缺乏等代谢应激状态下的一种分解代谢过程，细胞内的蛋白等大分子、细胞器和胞质通过自噬作用被包裹、消化、降解成核苷、氨基酸和脂肪酸等可被重复循环利用的物质，用作合成新的大分子和能量来源ATP，从而维持细胞基本的生命活动。自噬参与维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定，其在清除细胞内废物、结构重建以及细胞生长发育中起着重要作用。自噬既是细胞的一种正常生理活动，也可在细胞遭受各种刺激(缺氧，缺营养，化学物质刺激，微生物入侵，细胞器损伤，异常蛋白堆积等)时作为应激反应而发生。自噬不仅具有维持细胞自我调节、促进细胞生存的作用，过度活跃的自噬活动也可以引起细胞死亡，即“自噬性细胞死亡(autophagiccelldeath)”。

肿瘤细胞的自噬是一把双刃剑：一方面，自噬可以清除肿瘤细胞内折叠异常的蛋白和功能异常的细胞器例如线粒体，抑制细胞应激反应，最终防止基因组损伤从而抑制癌症发生。另一方面，在肿瘤生长的后期，肿瘤细胞可利用自噬作用使自身在营养缺乏和低氧或缺氧的状况下得以存活。因此，在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬可能对肿瘤细胞有不同的影响。

机体内的活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies，ROS)通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡。随着自由基生物学研究的发展，研究者们逐渐认识到ROS可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖，并发现了自由基与细胞信号转导之间的内在关联。细胞内ROS堆积是肿瘤细胞与正常细胞的重要差异之一，鉴于肿瘤细胞这一特性，利用某些可增加细胞氧化应激的化合物可达到对肿瘤细胞与正常细胞的差异调节：一方面ROS水平的进一步增加可引起肿瘤细胞的凋亡或坏死；另一方面，正常细胞中ROS水平的增加仍在细胞生理承受范围内，不会引起细胞凋亡。

黄烷及其聚合物是广泛存在于传统药用植物中的一类化学成分，药理活性研究结果表明，黄烷类化合物具有抗肿瘤、降糖、神经保护、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等方面的活性，而黄烷聚合物近年来虽有活性方面的报道，但其研究尚未成熟，且其结构复杂，单体化合物不易提纯。文献报道，黄烷聚合物可以通过硫解的方法进行降解，得到4位被硫代的黄烷衍生物，但由于产物比较复杂，不易分离纯化，因此目前已报道的黄烷衍生物中4位被杂原子取代的衍生物较少。

课题组在对红景天的化学成分研究过程中发现，红景天中的黄烷聚合物要么以ECG为聚合单元，要么以EGCG为聚合单元，不同红景天中黄烷聚合单元不同。与其他植物如葡萄籽中的黄烷聚合单元不同的是，3-位羟基均被没食子酰化，因此，反应产物比较单一，后处理简单。利用此结构特点，我们对此类衍生物进行了进一步的衍生化合成，并对其药理活性进行深入研究，结果显示，该类化合物能够激活自噬，选择性增加肿瘤细胞ROS水平，抑制肿瘤生长。目前，国内尚未有报道此类黄烷衍生物激活自噬，选择性增加肿瘤细胞ROS水平，也未有此类黄烷衍生物在治疗或预防黑色素瘤方面的专利申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新的黄烷化合物。

本发明的另一目的在于提供一类黄烷化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种药物组合物，其包括至少一个上述黄烷化合物及药用载体和/或赋形剂。

本发明的又一目的在于提供一类黄烷化合物在制备用于预防和/或治疗黑色素瘤的产品中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一类黄烷化合物在其结构如下：

本发明第二方面提供了制备本发明黄烷化合物的方法。

该类衍生物是通过对天然药物中的黄烷聚合物进行衍生化反应后分离纯化得到的。具体通过以下几个步骤实现：

1)该部位的提取参照之前中国专利，专利申请号为201010587820.7的红景天有效部位的提取方法,将含有黄烷聚合物的中药材粉碎，用6-12倍量的有机溶剂提取2-5次；将提取液过滤后进行减压浓缩，除去溶剂，即得药材总提取物；

2)将药材总提取物进行大孔吸附树脂柱分离，洗脱液减压浓缩，经冷冻干燥后即得黄烷聚合物部位；

3)将黄烷聚合物部位通过加入硫代试剂进行硫解反应。

步骤1)中优选的有机溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮。甲醇、乙醇或丙酮的优选浓度为30-95％(和水的混合物的质量比)；

步骤1)中为加快提交效率，提取方式优选采用50-80℃；

步骤1)中优选的含有黄烷聚合物的中药材选自原料药材选自大花红景天、狭叶红景天、高山红景天、玫瑰红景天、德钦红景天、喜马红景天、帕里红景天、菱叶红景天、四裂红景天、云南红景天、大株红景天、长鞭红景天、唐古特红景天、圣地红景天、小丛红景天、库页红景天儿茶、虎杖、大黄、密花豆、桂皮、钩藤、金鸡纳皮。

步骤2)中大孔吸附树脂柱所选流动相优选为纯水-95％乙醇梯度系统；每个梯度的洗脱体积为2-4个柱体积。

步骤2)中优选的大孔树脂选自弱极性或中性大孔树脂。

步骤2)中更优选的大孔树脂选自DiaionHP-10、20、30、40、50、DM301、NKA-9、AB-8、D101、DM130、LSA-10、LSA-20、DM-18、D312。

步骤3)中选择硫解试剂为2,4,6-三甲基苄硫醇，其结构如下

本发明第三方面涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明第四方面涉及上述黄烷化合物制备用于预防和/或治疗黑色素瘤的产品中的应用。

所述的产品包括但不限定于药品、保健品。

有益技术效果：

1，本发明提供一类黄烷化合物在预防或治疗黑色素瘤方面的新用途。

2，实验证明本发明所述的化合物在药理上具有以下两方面显著活性：一，该类黄烷化合物可明显激活细胞自噬，是一类自噬激动剂；二，该类黄烷化合物可明显增加肿瘤细胞，如黑色素瘤细胞、肝癌细胞等的细胞内ROS水平，却不增加正常细胞，如肝细胞，肺上皮细胞等的细胞内ROS水平，从而选择性诱导肿瘤细胞凋亡。在小鼠黑色素瘤体内模型中也具有较好的疗效。

3，该类化合物的制备方法成熟，简单易得。

附图说明

图1为用流式细胞技术证明XY1，XY2具有自噬激动作用。

图2为用免疫印记方法证明XY1，XY2可激活自噬流。

图3为用活性氧自由基探针证明XY1可增加黑色素瘤细胞ROS水平，降低正常肝脏细胞ROS水平。

图4为用细胞增殖活力测定方法证明XY1对黑色素瘤细胞的生长抑制作用明显大于对正常肝细胞的生长抑制作用。

图5为用细胞凋亡检测方法证明XY1可显著诱导黑色素瘤细胞凋亡。

图6为用细胞凋亡检测方法证明XY1对正常肝细胞凋亡的影响较低。

图7为小鼠黑色素瘤模型中肿瘤生长曲线，给予三个不同剂量的XY1均可明显抑制肿瘤生长。

图8为小鼠黑色素瘤模型中各组别在体及离体肿瘤典型图。

图9为小鼠黑色素瘤模型中各组别瘤重的柱状统计图。

图10为用免疫荧光方法证明XY1可明显增加肿瘤组织中ROS水平，不增加肝脏组织中ROS水平。

具体实施方式

下面的实施例及药理活性实验用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：

DHE：二氢乙啶

BSA：牛血清白蛋白

DMEM：一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基

SDS：十二烷基硫酸钠

PVDF：聚偏氟乙烯

PBST：PhosphateBufferedSalinewithTween-20,pH7.5,10x，去污缓冲液

ECL：电化学发光

DAPI：聚偏二氟乙烯

PMSF：苯甲基磺酰氟

ROS：ReactiveOxygenSpecies，活性氧自由基

AnnexinV：膜联蛋白

PI：PropidiumIodide，碘化丙啶

1.黄烷衍生物的制备方法

制备例

制备例1黄烷聚合物部位的提取

该部位的提取参照之前中国专利，申请号为201010587820.7的红景天有效部位的提取方法，采集大花红景天及狭叶红景天各20kg，80％乙醇提取3次后浓缩，得到浸膏，然后向浸膏中加入质量比10倍量的蒸馏水于10℃左右静置96h，上清液浓缩后经依次经水、5％乙醇、50％乙醇、95％乙醇四个梯度进行大孔树脂分离，取50％水-乙醇部位，浓缩冷冻干燥，得到两种富含不同类型黄烷聚合物的部位。

制备例2黄烷衍生物的制备

取一定量大花或狭叶红景天黄烷聚合物部位，按照1:30的质量比，溶解在无水甲醇中，并按质量比1:0.5的比例加入2,4,6-三甲基苄硫醇，以及质量比1:0.5的比例加入48％的HBr水溶液，在60℃条件下反应4h，向反应液中加入与反应液质量比5:1的蒸馏水混悬后，以乙酸乙酯进行萃取3次，合并有机层，有机层干燥后减压浓缩依次进行200-300目的硅胶柱分离、LH-20柱色谱分离，以质量分数60-70％(MeOH/H₂O)的甲醇水溶液为流动相，高效制备液相制备得到化合物XY1和化合物XY2，化合物结构式如下(表1,)。

表1黄烷化合物的结构与名称

实施例14-(R)-(2,4,6-三甲基苄硫基)-表儿茶素没食子酸酯(XY1)的制备

制备方法同制备例2。所用黄烷聚合物原料为大花红景天50％部位，所用硫代试剂为2,4,6-三甲基苄硫醇，高效制备液相70％(MeOH/H₂O体积比)得到化合物JP-8，白色粉末，收率29.8％。

化合物结构：

化合物的波谱数据如下：

(c0.1MeOH)；

HR-ESI-MS(m/z607.1643[M+H]⁺,calcd,607.1646)；

¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:6.88(1H,d,J＝1.5,2′-H),6.86(2H,s,2″,6″-H),6.82(2H,s,3″′,5″′-H),6.79(1H,dd,J＝8.5,1.5,6′-H),6.72(1H,d,J＝1.5,5′-H),5.96(1H,d,J＝2.5,8-H),5.84(1H,d,J＝2.5,6-H),5.45(1H,s,3-H),5.33(1H,s,2-H),4.14(2H,s,4-H),4.05(1H,s,S-C-H),2.42(6H,s,2″′,6″′-CH₃),2.22(3H,s,4″′-CH₃)；

¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆)δ:165.2(O-C-O),158.0(C-5),157.4(C-7),155.2(C-9),145.5(C-3″,5″),145.0(C-3′,4′),138.9(C-4″),136.5(C-2″′,6″′),135.9(C-1″′),130.3(C-4″′),128.7(C-3″′,5″′),128.6(C-1′),118.6(C-1″),117.5(C-6′),115.3(C-5′),114.1(C-2′),108.7(C-2″,6″),97.3(C-10),96.0(C-6),94.1(C-8),73.1(C-2),71.7(C-3),40.6(C-4),31.1(S-C),20.6(C-4″′CH₃),19.1(C-2″′,6″′CH₃).

实施例24-(R)-(2,4,6-三甲基苄硫基)-表没食子儿茶素没食子酸酯(XY2)的制备

制备方法同制备例2。所用黄烷聚合物原料为狭叶红景天50％部位，所用硫代试剂为2,4,6-三甲氧基苄硫醇，高效制备液相65％(MeOH/H₂O体积比)得到化合物JP-21，白色粉末，收率27.8％。

化合物结构：

化合物的波谱数据如下：

(c0.1MeOH)；

HR-ESI-MS(m/z623.1583[M+H]⁺,calcd,623.1582)；

¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:6.85(2H,s,3″′,5″′-H),6.80(2H,s,2″,6″-H),6.43(2H,s,2′,6′-H),5.95(1H,d,J＝2.0,8-H),5.83(1H,d,J＝2.0,6-H),5.35(2H,s,3,2-H),4.11(1H,s,4-H),4.09(2H,s,S-CH₂),2.42(6H,s,2″′,6″′-CH₃),2.20(3H,s,4″′-CH₃)；

¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆)δ:165.2(O-C-O),158.0(C-5),157.3(C-7),155.2(C-9),145.8(C-3′,5′),145.4(C-3″,5″),138.9(C-4″),136.5(C-2″′,6″′),135.9(C-1″′),132.6(C-4″′),130.2(C-4′),128.7(C-3″′,5″′),127.9(C-1′),118.6(C-1″),108.7(C-2″,6″),105.3(C-2′,6′),97.3(C-10),96.0(C-6),94.0(C-8),73.0(C-2),71.6(C-3),40.7(C-4),31.0(S-C),20.5(4″′-CH₃),19.1(2″′,6″′-CH₃).

2.黄烷衍生物单体化合物的药理活性实验

通过药理学实验发现上述化合物具有明显的激活细胞自噬，选择性增加肿瘤细胞中ROS水平，促进肿瘤细胞凋亡，抑制小鼠黑色素瘤生长的活性。

实验例1利用自噬活性物质筛选系统对XY-1，XY-2自噬活性进行评价

本实验例中所用细胞系为稳定表达GFP-LC3荧光蛋白的CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞，该细胞中Ⅱ型GFP-LC3的量可反映自噬水平，因此自噬水平越高细胞荧光强度越高。具体操作步骤如下：

1.稳定表达GFP-LC3的CHO细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至指数生长期，以0.25％的胰酶消化细胞，传代至12孔板中继续培养24小时。

2.在12孔板中加入不同刺激：不加任何刺激的孔作为阴性对照，加入100nM雷帕霉素的孔作为阳性对照，分别加入10uMXY1，XY2作为受试物。继续培养12小时。

3.收取细胞，用0.1％皂素重悬细胞，500g离心后用PBS重悬，避光操作。

4.流式细胞仪测定FL1通道(488nm)荧光强度值，使用流式细胞分析软件FCSExpress4分析得出图1所示结果。

如图1所示，横坐标表示FL1通道荧光强度，纵坐标表示细胞个数，荧光峰越靠右代表荧光强度越高，相应的GFP-LC3表达量越高，自噬激活水平越高。图1的结果表明，XY1，XY2可明显激活自噬。

实验例2利用自噬抑制剂巴伐洛霉素证明XY1，XY2可激活自噬流

具体操作步骤如下：

1.小鼠肝细胞AML-12于6孔板中培养24h后，加入不同刺激，继续培养12小时。

2.收取细胞，每孔细胞加入150ul细胞裂解缓冲液(购自北京普利莱基因有限公司，C1053)，冰上裂解30分钟。

3.12000rpm离心30分钟，小心吸取上清，调整每孔蛋白至统一浓度，按体积比4：1加入5xloadingbuffer(购自北京普利莱基因有限公司，即5xSDS-PAGE非还原性蛋白上样缓冲液B1030)。

4.上样至SDS电泳凝胶，电泳后，取胶，使用电转仪将蛋白转至PVDF膜。

5.使用10％BSA封闭，按抗体说明书比例分别加入稀释特异性抗LC3II、GAPDH一抗(购自美国CST公司)，4℃孵育12h。

6.使用PBST在摇床中室温洗涤6x8min，按说明书比例稀释辣根酶标记的二抗，室温孵育2h。

7.使用PBST在摇床中室温洗涤6x8min。

8.使用ECL发光液曝光，使用ECL4000(购自北京普利莱基因有限公司，SuperECLPlus超敏发光液P1010)成像。以GAPDH(购自美国CST公司)作为内参，GAPDH斑块灰度一致表明细胞总蛋白数目一致。

结果如图2所示，XY1，XY2均可增加Ⅱ型LC3的表达，并且在同时加入巴伐洛霉素A1后，Ⅱ型LC3的量进一步增加，证明XY1，XY2均可激活自噬流。

实验例3用活性氧自由基探针测定XY1对肿瘤细胞和正常细胞ROS水平的影响

在本实验例及后续实验例中，鉴于XY1，XY2在结构上的相似性，发明人主要以XY1为代表探讨这类化合物进一步的分子机制。具体操作步骤如下：

1.12孔板分别培养小鼠黑色素瘤细胞B16-F10及小鼠正常肝细胞AML-12，分别加入0，10，25，50uMXY1，继续培养12小时。

2.收取细胞，每孔加入100uL1:1000比例稀释后的DHE探针染料(购自维格拉斯生物技术有限公司)，37℃避光孵育15分钟。

3.3000rpm离心，弃去上清，用PBS洗一遍，离心后用PBS重悬。

4.流式细胞仪分析FL2通道(480-535nm波长)荧光强度值，结果如图3所示，XY1可剂量依赖性明显增加肿瘤细胞B16-F10细胞内ROS水平，降低正常细胞AML-12细胞内ROS水平。

实验例4用CCK-8细胞增殖试剂盒测定XY1对肿瘤细胞与正常细胞增殖活力的影响

具体操作步骤如下：

1.将处于指数生长期的黑色素瘤细胞B16-F10及正常肝细胞AML-12用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数后用RPMI1640培养基稀释至2.5×10⁴个/ml，接种于96孔板中，每孔加入100ul细胞混悬液，置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时。

2.将XY1用RPMI1640培养基依次稀释成多个浓度梯度，同时设阴性对照(不加受试物)及空白对照(不加细胞及受试物)。取出96孔板，吸出培养基，每孔加入100μl含有不同浓度梯度受试物的培养基，每一浓度加6个复孔。置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养48小时。

3.取出96孔板，每孔中加入10μlCCK-8溶液，置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养1小时。酶标仪测定在450nm处的吸光度。

计算公式：

细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

细胞生长抑制率％(IR)＝100％-细胞存活率

As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、受试物质)

Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有受试物质)

Ab：空白孔(不含细胞和受试物质的培养基、CCK-8)

统计得回归方程曲线，求半数致死率％(IC₅₀)＝IR为50％的药物浓度。

如图4所示，XY1对肿瘤细胞(B16-F10)和正常细胞(AML-12)具有一定的选择毒性，其对正常细胞的IC₅₀值远大于肿瘤细胞的IC₅₀值。

实验例5用凋亡试剂盒测定XY1诱导肿瘤细胞及正常细胞凋亡的能力

具体操作步骤如下：

1.在12孔板中分别培养小鼠黑色素瘤细胞B16-F10及小鼠正常肝细胞AML-12。

2.待细胞在孔板中贴壁生长24小时后，加入不同浓度的XY1，同时设不加药空白对照组。

3.加药处理24小时后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，用500ulPBS重悬细胞。

4.加入5uLAnnexinV-FITC混匀后，加入5uLPropidiumIodide(PI)，混匀，37℃，避光反应15分钟。

5.3000rpm离心收集细胞，弃去上清，用1mLPBS重悬细胞。

6.流式细胞仪测定，用流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。

7.用流式细胞分析软件FCSExpress4分析结果，如图5，图6所示，XY1可剂量依赖性诱导细胞凋亡，但其诱导肿瘤细胞凋亡能力要高于正常细胞，说明其对肿瘤细胞和正常细胞具有一定的选择性。

实验例6小鼠黑色素瘤模型的制备

本实验例中用到的实验动物为清洁级近交系C57BL/6小鼠，雄性，6周龄，体重18-20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。B16-F10黑色素瘤细胞株购于上海细胞生物研究所。

具体操作步骤如下：

1.培养的B16-F10黑色素瘤细胞经0.25％胰酶消化，以PBS重悬，计数并调节细胞悬液浓度为1×10⁶个/mL。

2.用脱毛膏将小鼠右侧背部毛发去除，去毛面积约为4cm²。

3.用75％乙醇消毒小鼠背部脱毛部位皮肤，取上述B16-F10黑色素瘤细胞悬液0.1mL接种于小鼠背部皮下。

实验例7XY1腹腔给药治疗小鼠黑色素瘤

由于XY1水溶性较差，本实验例中采用含20％PEG400的PBS溶解XY1。具体操作步骤如下：

1.造模后第3天，将小鼠随机分为4组：①溶剂对照组，②XY110mg/Kg治疗组，③XY125mg/Kg治疗组，④XY150mg/Kg治疗组。

2.各组小鼠每天腹腔注射相应剂量XY1，溶剂对照组腹腔注射等体积的含20％PEG的PBS。

3.隔天用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤大小并记录。

XY1体内给药抑制黑色素瘤生长结果见图7，根据实验最后一天及第21天肿瘤体积的统计结果得出表1所示肿瘤生长抑制率,3个给药剂量均可抑制黑色素瘤生长，统计结果具有显著差异，10mg/Kg治疗组，25mg/Kg治疗组P值小于0.05，50mg/Kg组P值小于0.001。

表1肿瘤体积生长抑制率

实验例7XY1治疗小鼠黑色素瘤模型取材

给药3周后，脱颈处死小鼠，拍照。将黑色素瘤剥离，拍照并称重记录。各组选取一只小鼠作为典型图比较在体及剥离后肿瘤大小，见图8。各组瘤重比较结果见图9，根据各组瘤重的统计结果得出表2所示肿瘤生长抑制率，瘤重比较结果说明XY1可剂量依赖性地抑制小鼠黑色素瘤的体内生长。

表2

同时取小鼠肝脏，将瘤组织及肝脏组织送至北京雪邦科技有限公司，由该公司制作组织冰冻切片。

实验例8用激光共聚焦显微镜观察C57BL/6小鼠肝脏组织及黑色素瘤组织ROS水平

本实验例中用到的组织冰冻切片由北京雪邦科技有限公司制作。具体操作步骤如下：

1.将组织冰冻切片平衡至室温，用PBS洗3遍。

2.将DHE荧光探针染料(DHE荧光探针购自维格拉斯生物技术有限公司)1:1000稀释为工作液。

3.取上述染料工作液50uL滴于冰冻组织切片上，37℃避光反应15分钟。

4.PBS洗冰冻切片5遍。

5.用含有抗淬灭剂的DAPI(购自北京中衫金桥有限公司)封片。

6.待片子风干后用激光共聚焦显微镜扫描,采用480-535nm波长激发，测定590-610nm以上的发射光。

结果如图10所示，在肝组织中，XY125mg/Kg治疗组与对照组相比无明显差异，说明XY1给药对肝脏ROS水平影响不大。在肿瘤组织中，XY125mg/Kg治疗组ROS水平明显高于对照组，说明与体外细胞实验一致，XY1选择性增加肿瘤组织ROS水平。

Claims (6)

1.如式XY1和XY2所示的黄烷衍生化物在制备预防和/或治疗XY1的药物或保健品中的应用，

2.一种药物组合物，其特征在于：含有有效剂量权利要求1中任一种的黄烷衍生化物和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于：所述组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液和混悬剂。

4.权利要求1中任一种的黄烷衍生化物在制备预防或治疗黑色素瘤方面的产品中的应用。

5.权利要求4中任一项的应用，其特征在于，所述的产品选自药品、保健品。

6.权利要求1中任一种的黄烷衍生化物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将含有黄烷聚合物的中药材粉碎，用6-12倍量的有机溶剂提取2-5次；将提取液过滤后进行减压浓缩，除去溶剂，即得药材总提取物；

2)将药材总提取物进行大孔吸附树脂柱分离，洗脱液减压浓缩，经冷冻干燥后即得黄烷聚合物部位；

3)将黄烷聚合物部位通过加入硫代试剂进行硫解反应；

步骤1)中所述的原料药材选自大花红景天、狭叶红景天、高山红景天、玫瑰红景天、德钦红景天、喜马红景天、帕里红景天、菱叶红景天、四裂红景天、云南红景天、大株红景天、长鞭红景天、唐古特红景天、圣地红景天、小丛红景天、库页红景天儿茶、虎杖、大黄、密花豆、桂皮、钩藤、金鸡纳皮；

步骤3)中所述的硫解试剂选自2,4,6-三甲基苄硫醇，其结构如下