CN105924484B - 从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法。方法：对油茶叶进行浸提；以D101为色谱柱填料，用75‑85％乙醇溶液对粗提液进行洗脱；将最后的洗脱液进行硅胶层析分离，合并含有槲皮素‑3‑鼠李糖苷、槲皮素葡萄糖苷(或半乳糖苷)的流份段，采用DAC色谱柱分离，收集槲皮素‑3‑鼠李糖苷流份；同时合并含有槲皮素葡萄糖苷(或半乳糖苷)的流份段，命名为第二顺序组分；对第二顺序组分进行硅胶层析，合并含有槲皮素葡萄糖苷(或半乳糖苷)的流份段，再进行半制备液相色谱分离，收集槲皮素葡萄糖苷(或半乳糖苷)的流份。本发明首次同时从油茶叶中成功提取出了三种槲皮素的衍生物，收率高、产品纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及药物提取技术领域，尤其是涉及一种从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法。
背景技术
油茶叶为山茶科植物油茶的叶，其富含多种药效成分，尤其是黄酮类化合物、苷类化合物。黄酮类化合物具有多种生物活性，例如心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性、镇痛活性、保肝活性等。苷类化合物具有祛痰止咳、抗肿瘤、抗真菌、抑菌及降胆固醇等生物活性。
如何从油茶叶中提取出槲皮素等生物活性成分，对深度开发油茶作物极其重要。
发明内容
本发明的目的在于提供从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，所述的提取方法首次同时从油茶叶中成功提取出了三种槲皮素的衍生物，即槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷，并且该提取方法具有收率高、产品纯度高等优点。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，包括以下步骤：
A：以乙醇溶液为溶剂，对油茶叶进行浸提，得到粗提液；
B：以D101大孔吸附树脂为填料，依次用水、15-25％乙醇溶液、75-85％乙醇溶液对所述粗提液进行恒定洗脱；
C：将所述75-85％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，用9-11∶1至1∶2.5-3.5梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段，命名为第一顺序组分；
D：采用DAC色谱柱，用55-65％甲醇-水为流动相对所述第一顺序组分进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，收集槲皮素-3-鼠李糖苷流份；同时合并含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段，命名为第二顺序组分；
E：对所述第二顺序组分进行硅胶层析，用90-110:10-14:1的二氯甲烷-甲醇-水进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段，命名为第三顺序组分；
F：对所述第三顺序组分进行半制备液相色谱分离，以20-30％乙腈-水进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，收集槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份。
上述提取方法由粗至精的方式从油茶叶中逐步分离出槲皮素-3-鼠李糖苷(简称为CO-1)的纯净物，以及槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(简称为CO-8a)、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(简称为CO-8b)这两种非对映异构体的混合物。
以干油茶叶为基准，本发明对CO-1的提取率在96.4mg/kg以上，在对CO-8a、CO-8b混合物的提取率在30.3mg/kg以上，并且前后两个产品的纯度均在90％以上。
本发明所述的流动相(即洗脱所用的液体)的比例均指体积比，流动相中的“％”指非水物质所占的体积百分数，乙醇溶液均指乙醇的水溶液，例如，15-25％乙醇溶液指乙醇体积百分比为15-25％水溶液。
本发明所述的恒定洗脱是指流动相的组成比例固定。
本发明所述的梯度洗脱是指在洗脱过程中不断改变流动相的浓度配比，但起始浓度和终点浓度是固定的，例如步骤C中的梯度洗脱是指：二氯甲烷-甲醇按照起始浓度为9-11∶1、洗脱终点浓度为1∶2.5-3.5的方式进行梯度洗脱。
本发明所述的提取方法适用于不同种属的油茶叶，尤其适合普通油茶(Camelliaoleifera Abel)，其提取率高。
本发明所述的DAC色谱柱指轴向动态压缩工业色谱柱。
本发明所述的提取方法的各个步骤可以进一步改进，例如：
步骤A中，浸提所用的溶剂、料液比、温度对粗提液中的杂质含量以及有效成分的提取率都有影响。溶剂优选用40-60％的乙醇-水溶液，更优选50％的乙醇-水溶液。料液比优选为1：2.5-3.5(1g固体：2.5-3.5mL溶剂)，更优选1：2.5-3。浸提温度优选为70-80℃，并且以回流浸提为最佳。采用以上浸提条件能降低粗提液中的杂质含量，提高槲皮素衍生物的提取率。
另外，为了降低后期分离的难度，在浸提之后可以浓缩干燥粗提液，除去乙醇。
步骤B中，每个梯度洗脱所用流动相的体积优选为柱体积的3.5-4.5倍，更优选为4-4.5倍，保证待提取成分能够被充分洗脱出来。所用流动相的浓度优选水、15-20％乙醇溶液和75-80％乙醇溶液。
步骤C中，硅胶层析分离为分离手段，色谱分析为评价分离结果的手段，两者互相配合，筛选出含有CO-1、CO-8a、CO-8b三个目标提取物的洗脱液。筛选通常为粗筛选，一般是经色谱分析，先将色谱图相似的洗脱液合并，然后与目标提取物的标准品色谱图对比，从中筛选出含有三个目标提取物之一的洗脱液，将其合并。
所述步骤C中，所用的硅胶的粒径优选为200-300目，所述梯度洗脱优选为：用9-10∶1至1∶2.5-3梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，采用以上进一步优化的条件，可以提高分离度和柱效。
在所述步骤C中，所述硅胶层析分离之前还包括：将所述75-85％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩干燥，可以避免乙醇对后续硅胶层析的干扰。
另外，所述步骤C中的色谱分析可以是薄层色谱(TLC)、高效液相色谱等任意能用于定性的方法，其中后者更准确。
同样，所述步骤D中，经色谱分析可以为：高效液相色谱分析，和/或薄层分析等。
所述步骤D中，流动相的浓度优选55-60％甲醇-水时，具有更高的分离度。在该步骤中即可获得CO-1的纯净物，只要在色谱分析后，将仅含有CO-1的流份段合并即可。此处的“仅含”是指CO-1的含量只要达到提取物的一般纯度即可，在此基础上，可根据生产需求选择进一步提纯。
另外，在进行硅胶层析时，为了保证待分离物均匀分散在硅胶之中，优选将二氯甲烷-甲醇稀释待分离物，同时拌入硅胶，之后再水浴蒸干。经过以上处理后的物质再装入硅胶柱中进行层析。
所述步骤E中，所用的硅胶的粒径优选为200-300目，所述二氯甲烷-甲醇-水的比例优选为90-100:10-12:1，以提高分离度和柱效。所采用的色谱分析可以为高效液相色谱分析、薄层分析等。
所述步骤F中，所述半制备液相色谱分离的色谱柱优选为C18，分离度高。所述乙腈-水优选为：20-25％乙腈-水，提高柱效。
与现有技术相比，本发明能达到以下技术效果：
(1)首次同时从油茶叶中提取了出高纯度的槲皮素衍生物——槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷；
(2)由粗到精的提取方式利于提取方法的规模化推广；
(3)提取收率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的80％乙醇洗脱后收集的样品的液相色谱图；
图2为CO-1的质谱图；
图3为CO-8的质谱图；
图4为CO-1的1H-NMR谱图；
图5为CO-1的13C-NMR谱图；
图6为CO-8的1H-NMR谱图；
图7为CO-8的13C-NMR谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中所述的流动相的比例均指体积比。
实施例1
第一步：
将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用50％乙醇按料液比1∶3在70-80℃加热回流，重复提取2次，每次提取2h，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。
第二步：
用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的提取液分两次上样，依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。
80％乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g，其HPLC谱图如图1所示，洗脱程序：0-10min 50％甲醇水溶液，10-20min 80％甲醇水溶液，20-21min 100％甲醇；检测波长254nm，进样量10μL)，溶解于10∶1的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200～300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g。
流动相系统为二氯甲烷-甲醇(10∶1～1∶3梯度洗脱)，每500mL收集为一次，经过TLC检测合并为1-2+2’(表示：将第一次硅胶柱的第一个流份、第二个流份以及第二次硅胶柱的第二个流份合并)，3-7+3’-7’，8-10+8’-10’，11-13+11’，14-16+12’-13’，17-19+14’，20-22+15’-18’，19’-21’，23-26+22’-27’，27-40，28’-34’，35’-44’，41-47，48-64，65，66-67，68-70，71，72-78，45’-51’，52’-63’，64’-67’，68’-71’，72’-84’共计24个组分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号“’”加以区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接(同一次硅胶柱的流份用-衔接)，例如，第一次装柱的提取液经洗脱后，收集的液体编号分别为1、2……78，第二次装柱的提取液经洗脱后，收集的液体编号分别为1’、2’……84’)。
第三步：
27-40利用DAC制备色谱分离，60％甲醇-水恒定洗脱，得到化合物CO-1(56.4mg)，以及一个含多个化合物的复杂组分fr.A(865mg)。经高效液相色谱分析，CO-1即为槲皮素-3-鼠李糖苷。
第四步：
将fr.A流份溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇-水(100:12:1恒定洗脱)，每40mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为1，2，3，4-12(编号方法同第二步)。
第五步：
利用半制备液相色谱对流份3进行分离，25％乙腈-水恒定洗脱，得到化合物CO-8(含CO-8a和CO-8b,10.3mg)。
第六步：表征提取物
将CO-1、CO-8进行质谱检测，如图2和3所示。
将CO-1、CO-8进行核磁共振图谱检测，CO-1的1H-NMR、13C-NMR分别如图4和5所示，CO-8的1H-NMR、13C-NMR分别如图6和7所示。
结合上述表征结果可以确定CO-1的分子式如下式(一)。
CO-8a和CO-8b是一对非对映异构体，对CO-8检测发现：在1H-NMR中，可见两组糖端基质子信号，δ5.24(1H,d,J＝7.5Hz)为葡萄糖基的端基质子信号，δ5.14(1H,d,J＝7.6Hz)为半乳糖基的端基质子信号，两组信号的峰面积比约为3:2。两组重叠的苯环间位质子信号δ6.37(2H,s)和δ6.17(2H,s)分别归属于A环的H-6和H-8；另有两组ABX偶合系统的芳香质子信号δ6.83(1H,d,J＝8.4Hz)，δ7.57(1H,d,J＝8.4Hz)和δ7.69(1H,s)归属于CO-8a的H-2’，H-3’和H-5’，而δ6.83(1H,d,J＝8.4Hz)，δ7.57(1H,d,J＝8.4Hz)和δ7.83(1H,s)归属于CO-8b的H-2’，H-3’和H-5’；在13C-NMR中，可见不饱和区的碳信号均成对出现，且每一对信号的化学位移值非常接近，谱峰高度比约为3:2，另有一组葡萄糖基的碳信号δ102.80，74.2，76.6，69.7，76.9，61.0和一组半乳糖基的碳信号δ103.9，71.7，73.6，68.5，75.7，60.4。因此，可以鉴定CO-8为CO-8a与CO-8b的混合物，CO-8a为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(结构式如式(二))CO-8b鉴定为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(结构式如式(三))。
经检测，CO-1、CO-8的纯度分别为96.4％、95.6％。
实施例2
第一步：
将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用40％乙醇按料液比1∶2.5在70-80℃加热回流，重复提取2次，每次提取2h，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。
第二步：
用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的提取液分两次上样，依次用水、15％乙醇、75％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4.5倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。
80％乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g)，溶解于10∶1的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200～300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g。
流动相系统为二氯甲烷-甲醇(9∶1～1∶2.5梯度洗脱)，每500mL收集为一次，经过TLC检测合并含有槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷中至少一种的流份段，命名为第一顺序组分。
第三步：
第一顺序组分利用DAC制备色谱分离，55％甲醇-水恒定洗脱，经色谱分析，合并得到化合物CO-1(57.1mg)，以及一个含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的复杂组分，命名为第二顺序组分。经高效液相色谱分析，CO-1即为槲皮素-3-鼠李糖苷。
第四步：
将第二顺序组分溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇-水(90:10:1恒定洗脱)，每40mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为四个组分，其中一个组分中是将含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段合并，命名为第三顺序组分。
第五步：
利用半制备液相色谱对第三顺序组分进行分离，20％乙腈-水恒定洗脱，得到化合物CO-8(含CO-8a和CO-8b,10.5mg)。
第六步：表征提取物
同样，采用质谱和1H-NMR、13C-NMR进行表征，结果与实施例1相同，CO-1为槲皮素-3-鼠李糖苷，CO-8为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的混合物。
实施例3
第一步：
将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用60％乙醇按料液比1∶3.5在70-80℃加热回流，重复提取2次，每次提取2h，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。
第二步：
用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的提取液分两次上样，依次用水、25％乙醇、85％乙醇洗脱，每个梯度洗脱3.5倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。
80％乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g)，溶解于10∶1的二氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200～300目)，水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约800g。
流动相系统为二氯甲烷-甲醇(11∶1～1∶3.5梯度洗脱)，每500mL收集为一次，经过TLC检测合并含有槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷中至少一种的流份段，命名为第一顺序组分。
第三步：
第一顺序组分利用DAC制备色谱分离，65％甲醇-水恒定洗脱，经色谱分析，合并得到化合物CO-1(57.1mg)，以及一个含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的复杂组分，命名为第二顺序组分。经高效液相色谱分析，CO-1即为槲皮素-3-鼠李糖苷。
第四步：
将第二顺序组分溶解于一定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200-300目)，水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇-水(110:14:1恒定洗脱)，每40mL收集为一个流份，经过TLC检测合并为四个组分，其中一个组分中是将含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段合并，命名为第三顺序组分。
第五步：
利用半制备液相色谱对第三顺序组分进行分离，30％乙腈-水恒定洗脱，得到化合物CO-8(含CO-8a和CO-8b,11.4mg)。
第六步：表征提取物
同样，采用质谱和1H-NMR、13C-NMR进行表征，结果与实施例1相同，CO-1为槲皮素-3-鼠李糖苷，CO-8为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的混合物。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A：以乙醇溶液为溶剂，对油茶叶进行浸提，得到粗提液；
B：以D101大孔吸附树脂为填料，依次用水、15-25％乙醇溶液和75-85％乙醇溶液对所述粗提液进行恒定洗脱；
C：将所述75-85％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，用9-11∶1至1∶2.5-3.5梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段，命名为第一顺序组分；
D：采用DAC色谱柱，用55-65％甲醇-水为流动相对所述第一顺序组分进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，收集仅含有槲皮素-3-鼠李糖苷的流份；同时合并含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段，命名为第二顺序组分；
E：对所述第二顺序组分进行硅胶层析，用90-110:10-14:1的二氯甲烷-甲醇-水进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份段，命名为第三顺序组分；
F：对所述第三顺序组分进行半制备液相色谱分离，以20-30％乙腈-水进行恒定洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，收集仅含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷的流份。
2.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤A中，浸提的方法为：料液比为1：2.5-3.5，在70-80℃下回流提取，乙醇溶液优选为40-60％的乙醇-水溶液。
3.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤B中，每个梯度洗脱所用流动相的体积为柱体积的3.5-4.5倍。
4.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤C中，所用的硅胶的粒径为200-300目，所述梯度洗脱优选为：用9-10∶1至1∶2.5-3梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。
5.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤D中，经色谱分析为：经高效液相色谱分析，和/或薄层分析。
6.根据权利要求1或5所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤D中，所述55-65％甲醇-水为55-60％甲醇-水。
7.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤E中，所用的硅胶的粒径为200-300目，所述二氯甲烷-甲醇-水的比例优选为90-100:10-12:1。
8.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤F中，所述半制备液相色谱分离的色谱柱为C18。
9.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，所述步骤F中，所述乙腈-水为：20-25％乙腈-水。
10.根据权利要求1所述的从油茶叶中提取槲皮素衍生物的方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述硅胶层析分离之前还包括：将所述75-85％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩干燥。
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