CN105177090B - 一种酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法，属于生物催化与生物合成领域。以2‑甲基四氢呋喃‑水为溶剂，以葡萄糖为糖基供体，利用β‑葡萄糖糖苷酶催化穿心莲内酯的糖基化反应，合成得到19‑O‑葡萄糖基‑穿心莲内酯。本发明具有反应条件温和、环境友好、反应具有高度选择性和可控性、过程简单、产物易于分离等优点。

Description

一种酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法
技术领域
本发明属于生物催化与生物合成领域，涉及一种在非水介质中酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法。
背景技术
穿心莲内酯(andrographolide，附图)为爵床科植物穿心莲中提取得到的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一，具有清热解毒、凉血消肿等功能。由于穿心莲内酯几乎不溶于水，因而限制其应用。因此，通过对穿心莲内酯结构进行改造，寻找水溶性好、活性更强的穿心莲内酯衍生物研究倍受关注。穿心莲内酯糖苷化修饰后形成的糖苷衍生物水溶性增强，产物活性增加。此外，穿心莲内酯糖苷衍生物本身也是穿心莲的成分之一，但含量极低。目前，还未见生物法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的报道。若用化学方法合成葡穿心莲内酯糖苷衍生物，能耗大、选择性差、易产生副产物且产物难分离；并且由于反应过程中使用大量有毒有机溶剂和催化剂，一方面会带来较严重的环境污染问题，另一方面产物中常残留一些有毒的化学物质而存在安全隐患。因此，研究开发穿心莲内酯糖苷衍生物合成新工艺具有重大的实践意义。
2-甲基四氢呋喃是一种新型绿色有机溶剂，它可由农产品的副产物(如玉米芯等)制备。它沸点适中(80℃)，易于产物分离纯化。此外，在自然条件下2-甲基四氢呋喃可被降解成无毒的产物。
采用2-甲基四氢呋喃-水作为反映介质，既克服了底物的溶解问题又降低了酶的失活作用，该反应体系中酶催化穿心莲内酯糖苷化合物合成(附图)，具有反应条件温和、能耗少、产率高、选择性好、副产品少以及产物易分离等优点。同时由于采用生物酶为催化剂，反应过程环境友好，产品安全。
发明内容
本发明目的在于提供一种绿色有效的酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现：
以2-甲基四氢呋喃-水为反应介质，以葡萄糖为糖基供体，在反应温度30～45℃下，利用β-葡萄糖苷酶催化穿心莲内酯进行糖基化反应，合成得到19-O-葡萄糖-穿心莲内酯。所述的反应介质中2-甲基四氢呋喃与水的比例为80∶20～95∶5，最适比例为90∶10。所述的酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法优选把穿心莲内酯、葡萄糖和反应介质按质量(g)/质量(g)/体积(ml)比例1∶3∶25混合，按β-葡萄糖苷酶与穿心莲内酯的用量之比为250～1000U/g的比例加入糖苷酶，在30～45℃、振荡速度为100rpm的条件下反应24～72h。反应混合物经6000rpm离心后去除固定化糖苷酶，再减压蒸发去除溶剂，所得到的混合物用甲醇溶解，然后用C18柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝30∶20∶10，而后浓缩，真空干燥，得到白色粉末即为穿心莲内酯糖苷衍生物。
本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
1、采用高效生物催化剂β-葡萄糖苷酶来催化穿心莲内酯糖苷化合物合成，克服了传统化学方法的效率低的缺点。
2、酶催化反应具有高度选择性，因而产物穿心莲内酯糖苷衍生物纯度高；而传统的化学方法合成穿心莲内酯糖苷衍生物，由于选择性较差，副产物较多，产物纯度低。
3、由于采用生物酶作为催化剂，克服了传统化学方法使用大量有毒有害的金属盐作为催化剂的缺点，且产品不会引起健康方面的忧虑。
4、采用2-甲基四氢呋喃-水为反应体系，反应条件温和、环境友好、反应过程简单易控、产物易分离。
附图说明
附图为本发明涉及的穿心莲内酯及其糖苷衍生物酶法合成图。
具体实施方式
19-O-葡萄糖-穿心莲内酯糖苷衍生物的13C NMR(δ)如下：C1(38.2)，C2(29.0)，C3(80.9)，C4(40.6)，C5(56.4)，C6(25.2)，C7(38.9)，C8(148.8)，C9(57.4)，C10(39.9)，C11(25.7)，C12(149.4)，C13(129.8)，C14(66.7)，C(76.1)，C16(172.6)，C17(109.2)，C18(23.4)，C19(67.6)，C20(15.5)；C6′(60.69)，C4′(68.33)，C2′(70.28)，C3′(72.50)，C5′(74.91)，C1′(102.74)。
实施例1
把1g穿心莲内酯、3g葡萄糖、1g来源于杏仁的固定化β-葡萄糖苷酶(250U/g)和25ml 2-甲基四氢呋喃-水(80∶20)放入具塞三角瓶中，置于30℃、100rpm的恒温振荡器内振荡，反应24h后，过滤除去固定化糖苷酶，再减压蒸发去除溶剂，所得到的混合物用甲醇溶解，然后用C18柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝30∶20∶10，而后浓缩，真空干燥，得到白色粉末即为19-O-葡萄糖-穿心莲内酯糖苷衍生物(产率25.5％)。
实施例2
把1g穿心莲内酯、3g葡萄糖、2g来源于杏仁的固定化β-葡萄糖苷酶(250U/g)和25ml 2-甲基四氢呋喃-水(90∶10)放入具塞三角瓶中，置于35℃、100rpm的恒温振荡器内振荡，反应36h后，过滤除去固定化糖苷酶，再减压蒸发去除溶剂，所得到的混合物用甲醇溶解，然后用C18柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝30∶20∶10，而后浓缩，真空干燥，得到白色粉末即为19-O-葡萄糖-穿心莲内酯糖苷衍生物(产率37.3％)。
实施例3
把1g穿心莲内酯、3g葡萄糖、3g来源于杏仁的固定化β-葡萄糖苷酶(250U/g)和25ml 2-甲基四氢呋喃-水(90∶10)放入具塞三角瓶中，置于40℃、100rpm的恒温振荡器内振荡，反应72h后，过滤除去固定化糖苷酶，再减压蒸发去除溶剂，所得到的混合物用甲醇溶解，然后用C18柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝30∶20∶10，而后浓缩，真空干燥，得到白色粉末即为19-O-葡萄糖-穿心莲内酯糖苷衍生物(产率67.5％)。
实施例4
把1g穿心莲内酯、3g葡萄糖、4g来源于杏仁的固定化β-葡萄糖苷酶(250U/g)和25ml 2-甲基四氢呋喃-水(95∶5)放入具塞三角瓶中，置于45℃、100rpm的恒温振荡器内振荡，反应72h后，过滤除去固定化糖苷酶，再减压蒸发去除溶剂，所得到的混合物用甲醇溶解，然后用C18柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝30∶20∶10，而后浓缩，真空干燥，得到白色粉末即为19-O-葡萄糖-穿心莲内酯糖苷衍生物(产率45.5％)。

Claims (7)

1.一种酶法制备穿心莲内酯糖苷衍生物的方法，以2-甲基四氢呋喃-水为反应介质，以葡萄糖为糖基供体，在反应温度30～45℃下，利用β-葡萄糖糖苷酶催化穿心莲内酯进行糖基化反应，合成得到19-O-葡萄糖基-穿心莲内酯。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述反应介质中2-甲基四氢呋喃与水的比例为80∶20～95∶5。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于所述反应介质中2-甲基四氢呋喃与水的比例为90∶10。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
把穿心莲内酯、葡萄糖和反应介质按质量/质量/体积比例1∶3∶25混合，按β-葡萄糖苷酶与穿心莲内酯的用量之比为250～1000U/g的比例加入糖苷酶，而后加热至30～45℃、振荡速度为100rpm的条件下反应24～72h，而后分离纯化得到穿心莲内酯糖苷衍生物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于β-葡萄糖苷酶与穿心莲内酯的用量之比为750U/g。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶来源于杏仁，用海藻胶进行固定化，酶活为250U/g。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的分离纯化方法如下：反应混合物经6000rpm离心，去除糖苷酶，再减压蒸发去除溶剂，所得到的混合物用甲醇溶解，然后用C18柱纯化，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶水＝30∶20∶10，而后浓缩，真空干燥，得到白色粉末即为穿心莲内酯糖苷衍生物。
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