KR20130033466A - 프룩토실화 푸에라린 및 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오-약제학적 기술의 분야에서, 구체적으로는 푸에라린의 신규 유도체, 생물학적 전환 방법 및 이의 약제학적 적용과 관련되다. 본 발명은 하기 화학식 (I) 에서 보여지는 바와 같은 구조를 가진 신규한 유형의 프룩토실화 푸에라린을 개시하고, 이의 제조 방법은 생물변환 방법에 의해 수성상 또는 비수성상 시스템에서 푸에라린을 프룩토실 및 푸룩토오스 올리고사카릴 푸에라린으로 전환시키는 것이고, 107.5 g/L 의 푸에라린 농도에서 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 농도는 111.7 g/L 에 이를 수 있고, 프룩토실화 푸에라린의 전환율은 90 % 이다. AB-8 거대기공성 수지를 사용한 흡수 및 구배 용리에 의해 97 % 초과의 순도를 갖고 약물 세부사항에 따르는 생성물이 80 % 초과의 추출 속도로 수득될 수 있다. 시험은 프룩토실화 푸에라린이 급성 심근 허혈에 효과적이고, 시험관 내에서 인간 유방암 세포주 MDA-MB-23 및 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562 의 증식을 현저하게 억제할 수 있고, 이러한 올리고사카릴화된 푸에라린은 저독성을 가지고, 심장-뇌 혈관 질환 및/또는 종양 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 양호한 적용 특성을 가진다.
Description
본 발명은 특별하게는 신규한 푸에라린의 유도체와 관련된 바이오-약제학적 기술 분야에서의 생물학적 전환 방법 및 이의 약제학적 적용에 관한 것이다.
푸에라린은 푸에라리아로바타 (Willd.) 오아이 및 P. 토마오니 벤스로부터 추출되고, 화학명 7, 4'-디히드록시-8-β-D-글루코실 이소플라본을 가진 분리하여 얻어진 이소플라브노이드 C-글리코시드는 물에 용해될 수 있으나 낮은 용해도 (6.24 g/L) 를 갖는 백색 침상 형태의 결정이고, 이의 수용액은 무색이거나 옅은 황색이고, 이의 분자량은 416.37 이다. 푸에라린은 연장된 약리 작용을 가진 심장-뇌 혈관계 질환에 대한 천연 저독성이고 효과적인 의약인, 종래 한의학 푸레아리애 뿌리에서의 주요 활성 성분 중 하나이고, 이는 혈압을 감소시키고, 심장박동 속도를 늦추고, 심근 산소 소비를 낮추기 위해 치료적으로 사용되었고; 이는 관상동맥을 확장시키고 보통의 허혈성 심근의 신진대사를 향상시키고; 이는 혈관을 감싸는 회순환 및 미세-순환에 대한 효과를 가지고, 부가적으로 푸에라린은 혈당 수치를 조절하고, 산화 및 종양에 저항성인 기능을 가진다 (Yao Dan and Ding Xiansheng, China Clinical Pharmacology and Acology, 2008, 13, 468-474.).
현재, 푸에라린 제제는 푸에라린 주사 액체, 안약 및 동결건조 분말 주사 및 실제 적용을 포함하고, 이는 주로 주사로 임상적으로 사용된다 (Wu Yanhong, Su Ziren, Lai Xiaoping, et la. New Chinese Medicine and Clinical Pharmologogy, 2004, 15 (4):259-261). 물에서의 푸에라린의 용해도가 낮기 때문에, 임상적 적용에서 공용매는 용해도를 증가시킬 것이 요구된다. 임상 적용을 위한 본 푸에라린 주사에서, 보통 고농도의 프로필렌 글라이콜이 공용매로서 첨가되고, 이는 비용을 증가시키고 고점도로 인해 생산에 있어서 여과를 더욱 어렵게 하고, 또한 인간 신체에 대한 일부 독성 부작용을 가진 불용성 불순물이 증가되기 때문에 이는 약물의 안전성을 감소시킨다. 적용을 촉진하기 위해서, 이는 푸에라린의 용해도 및 생체이용 가능성을 향상시키기 위해 필요하다. 관련 문헌에 따라, 현재 사용되고 있는 주요 방법은 푸에라린의 글라이코실화 또는 푸에라린 용해도를 효과적으로 향상시킬 수 있는 특정 제형의 사용을 포함한다. 현재까지, 국내 및 해외에서의 푸에라린의 글라이코실화에 대한 보고는 2004, Li et al (Li D, Park S H, Shim J H, et al. Carbohyd Res, 2004, 339, 2789~2797.) 에서 시험관내 효소 방법에서 사용하는 푸에라린의 글라이코실화가 최초 보고 되었고, C-6" 히드록실기가 대체된 글라이코실의 글루코실-α (1, 6)-푸에라린 (CASRN: 824959-75-3) 및 말토실-α (1, 6)-푸에라린 (CASRN: 824959-76-4) 이 바실루스 서모필러스로부터 유래된 말토게닉 아밀라아제의 촉매 조성물에 의해 수득된다. 촉매 반응은 55 ℃ 에서 45 분 동안 글라이코실 공여체로서 1% (w/v) 푸에라린 및 3% (w/v) 가용성 전분을 사용하여 일어나고, 생성물 수율은 70 % 이다. 전환된 생성물이 분리되고 분취용 HPLC 방법에 의해 정제되고, 이의 수용성은 푸에라린과 비교하여 각각 14 배 및 168 배 증가하였다. Jiang Jierong et al (Jiang J R, Yuan S, Ding J F, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81, 647-657.) 는 푸에라린을 글라이코실화하는데 사용하기 위해 마이크로박테리아 옥시단을 사용하고, 7-O-글루코사이드 푸에라린 (CASRN: 1163249-06-6) 및 7-O-이소말토사이드 푸에라린 (CASRN: 1163249-07-7) 을 수득하였다. 촉매 반응은 30 ℃에서 48 시간 동안 글라이코실 공여체로서 4 g/L 푸에라린, 50 g/L 사탕수수당을 사용하여 일어났고, 7-O-글루코시드 푸에라린 몰 전환율은 40 % 이었고, 7-O-이소말토시드 푸에라린 몰 전환율은 5 % 있었다. 전환된 생성물을 분리하고 분취용 HPLC 방법을 정제하고, 이의 수용성은 푸에라린과 비교하여 각각 18 배 및 100 배 증가하였다. Huang et al (Huang W, Ochiai H, Zhang X Y, et al. Carbohyd Res, 2008, 343, 2903-2913.) 은 아세틸 갈락토시다아제를 글라이코실 공여체로서 트리만노스 아세트아미도 글루코오스 옥사졸린을 사용한 20% DMSO 에서의 글라이코실화에 의해 푸에라린을 전환시키기 위해 사용하고, 상응하는 글루코실화된 화합물 푸에라린-GlcNAcMan3 (CASRN: 1093135-90-0) 를 수득하였다. 촉매 반응은 23 ℃ 에서 2 시간 동안 4.16 g/L 푸에라린 및 글라이코실 공여체로서 13 g/L 트리만노스 아세트아미도 글루코오스 옥사졸린을 사용하였고, 푸에라린-GlcNAcMan3 몰 전환율은 60 % 이었으나, 글라이코실화 생성물의 제조 및 관련 특성은 보고되지 않았다. Choi et al (Choi C H, Kim S H, Jang J H, et al. J Sci Food Agric, 2010, 90:1179-1184.) 은 지방 바실루스 서모필러스로부터 유래된 말토-아밀라아제 (BSMA) 글라이코실화 푸에라린을 사용하였고, 10 g/L 푸에라린에서 56.7 % 의 생성물의 총수율로 각각 글루코실-α-(1,6)-푸에라린, 말토실-α-(1,6)-푸에라린 및 글루코실-α-(1, 3)-푸에라린 (CASRN: 1219937-73-1) 을 얻었다. Yu et al (Yu C G, Xu H D, Huang G D, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86:863-870.) 는 40 % 에탄올을 사용하여 마이크로박테리아 옥시단을 처리하고, 세포 침투성을 변화시켰고, 마이크로박테리아 옥시단은 7-O-글루코사이드 푸에라린을 7-O-프룩토사이드 푸에라린 (CASRN: 1223091-93-7) 으로 전환시킬 수 있다. Zhang Lianwen et al (China Invention Patent Application No.: 200910068855.7; Publication No.: CN 101575631A) 은 촉매 반응에서 갈락토오스 트랜스페라제를 사용하고, 9.12 g/L 푸에라린, 글라이코실 공여체로서 4 g/L UDP-갈락토오스를 사용하여 푸에라린을 글라이코실화하여, 반-에먼젼화된 글라이코실-α (1, 4)-푸에라린 (CASRN: 1196677-60-7) 을 얻었고, 이의 용해도는 푸에라린의 것의 12 배 이었다.
푸에라린이 글루코실화된 후, 이의 수용성이 실질적으로 증가되었고, 글루코실화 이후 분자 구조에서의 변화는 푸에라린의 효능에 영향을 주지 못하나 고농도 약물 투여를 위해 푸에라린 글루코실화된 화합물이 제공된다. 관련 보고는 하기와 같다: Chung et al (Chung M J, Sung N J, Park C S, et al. Eur J Pharmacol, 2008, 578, 159- 170.) 은 수용성 푸에라린 글루코실화 생성물로서 등몰 글루코실-α-(1,6)-푸에라린 (CASRN: 824959-75-3) 및 말토실-α-(1,6)-푸에라린 (CASRN: 824959-76-4) 의 혼합물을 사용하였고, HepG2 세포 및 C57 BL/6J 쥐에서의 약리적 실험은 하기를 나타내었다: 수용성 푸에라린 글루코실화 생성물은 산화 활성에 대해 저항성이고 LDL 산화를 낮추는 푸에라린으로서 동일한 효능을 유지하였다. 7-O-글루코사이드 푸에라린 (CASRN: 1163249-06-6) 을 사용하는 Jiang Jierong et al (Jiang J R, Yuan S, Ding J F, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81, 647-657.) 에 의해 수행되는 시험관내 약력학적 실험은 하기를 나타내었다: 푸에라린과 비교하여 7-O-글루코사이드 푸에라린은 더 나은 약력학적 성능을 나타내었고, 7-O-글루코사이드 푸에라린의 혈장 반감기 (t1/2) 및 평균 잔류 시간 (MRT) 은 각각 푸에라린의 것의 2 배 및 2.8 배이고, 상기 성능은 7-O-글루코사이드 푸에라린의 생체이용가능성을 향상시킬 수 있었다. Yuan Sheng et al (China Invention Patent Application No.: 200710021700.9) 은 7-O-글루코사이드 푸에라린 또는 7-O-이소말토사이드 푸에라린 및 이의 약물 조합을 사용하여 심장-뇌 혈관 질환을 치료하고 예방할 수 있는 약물을 제조하였다. Zhang Lianwen et al (China Invention Patent Application No.: 200910068855.7; Publication No.: CN 101575631A) 은 생리적 모델로서 대동맥 혈관 평활근과 함께 혈관 평활근에 대한 푸에라린 및 반-에먼젼화된 글라이코실-α- (1, 4)-푸에라린의 혈관확장 효과를 비교하고, 반-에먼젼화된 글라이코실-α- (1, 4)-푸에라린이 푸에라린보다 더 나은 혈관확장 효과를 생성할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
생물변환 방법을 사용하는 푸에라린의 글라이코실화에서의 비교적 낮은 푸에라린의 수용성으로 인해, 푸에라린 농도는 일반적으로 전환 이전보다 낮고 (모두 10 g/L 미만), 생성물의 몰 전환율 또한 낮다 (모두 70 % 미만). 이들 제한은 관련된 심장-뇌 혈관 및 종양 질환에 대한 약리적 실험을 위한 충분한 양의 생성물 및 그 후의 상업적 생산을 이루는 것을 어렵게 한다.
하기에서, 본 발명의 구현예는 첨부된 도면과 조합하여 상세하게 기술되고 이들은 하기와 같다:
도 1 은 이 도면에서 수성상 생물전환된 푸에라린의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다: 14.910 mm 의 체류 시간의 피크는 푸에라린의 것이고, 10.131 mm 의 체류 시간의 피크는 모노프룩토실-P (2,6)-푸에라린의 것이고, 6.130 분의 체류 시간의 피크는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고, 5.409 분의 체류 시간의 피크는 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고, 5.144 분의 체류 시간의 피크는 테트라프룩토실-13 (2,6)- 푸에라린의 것이고, 4.968 mm 의 체류 시간의 피크는 펜타프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고;
도 2 는 이 도면에서 비수성상 생물전환된 푸에라린의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다: 13.735 분의 체류 시간의 피크는 푸에라린의 것이고; 7.450 mm 의 체류 시간의 피크는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고, 4.603 분의 체류 시간의 피크는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고; 4.192 분의 체류 시간의 피크는 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고;
도 3 은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 1HNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 4 는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 13CNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 5 는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 H-H COSY 스펙트럼을 보여주고;
도 6 은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 C-H HSQC 스펙트럼을 보여주고;
도 7 은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 고해상 질량 스펙트럼을 보여주고;
도 8 은 푸에라린의 1HNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 9 는 푸에라린의 13CNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 10 은 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 1HNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 11 은 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 13CNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 12 는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 H-H COSY 스펙트럼을 보여주고;
도 13 은 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 C-H HSQC 스펙트럼을 보여주고;
도 14 는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 고해상 질량 스펙트럼을 보여주고;
도 15 는 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 질량 스펙트럼이고;
도 16 은 테트라프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 질량 스펙트럼이고;
도 17 은 펜타프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 질량 스펙트럼이다.
도 1 은 이 도면에서 수성상 생물전환된 푸에라린의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다: 14.910 mm 의 체류 시간의 피크는 푸에라린의 것이고, 10.131 mm 의 체류 시간의 피크는 모노프룩토실-P (2,6)-푸에라린의 것이고, 6.130 분의 체류 시간의 피크는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고, 5.409 분의 체류 시간의 피크는 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고, 5.144 분의 체류 시간의 피크는 테트라프룩토실-13 (2,6)- 푸에라린의 것이고, 4.968 mm 의 체류 시간의 피크는 펜타프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고;
도 2 는 이 도면에서 비수성상 생물전환된 푸에라린의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다: 13.735 분의 체류 시간의 피크는 푸에라린의 것이고; 7.450 mm 의 체류 시간의 피크는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고, 4.603 분의 체류 시간의 피크는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고; 4.192 분의 체류 시간의 피크는 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것이고;
도 3 은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 1HNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 4 는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 13CNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 5 는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 H-H COSY 스펙트럼을 보여주고;
도 6 은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 C-H HSQC 스펙트럼을 보여주고;
도 7 은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 고해상 질량 스펙트럼을 보여주고;
도 8 은 푸에라린의 1HNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 9 는 푸에라린의 13CNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 10 은 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 1HNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 11 은 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 13CNMR 스펙트럼을 보여주고;
도 12 는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 H-H COSY 스펙트럼을 보여주고;
도 13 은 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 C-H HSQC 스펙트럼을 보여주고;
도 14 는 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 고해상 질량 스펙트럼을 보여주고;
도 15 는 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 질량 스펙트럼이고;
도 16 은 테트라프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 질량 스펙트럼이고;
도 17 은 펜타프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 질량 스펙트럼이다.
본 발명의 내용
상기 언급된 기술 쟁점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적들 중 하나는 신규 유형의 프룩토실 푸에라린을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 기재된 프룩토실 푸에라린의 제조 방법이고, 구체적으로 이 방법은 아스로박터 니코티아나에를 사용한 수성상 또는 비수성상 생물변환을 가진 프룩토실 푸에라린을 제조하는 것이다 (Scientific name in Latin: Arthrobacter nicotianae XM6, classification nomenclature: Arthrobacter nicotianae XM6, collected at China Typical Culture Collection Center on June 29, 2010, address: Wuhan University, Wuhan China, Postal code: 430072, collection No.: CCTCC NO: M2010164).
본 발명의 다른 목적은 심장-뇌 혈관 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 기재된 프룩토실 푸에라린의 적용을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 기재된 프룩토실 푸에라린의 적용을 제공한다.
본 발명의 목적은 하기 기술 계획으로 실현된다.
한편, 본 발명은 프룩토실 푸에라린을 제공하고, 기재된 프룩토실 푸에라린 하기 화학식 (I) 에 보여진 구조를 가진다:
[식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 포르목실, 아세틸, 메틸아미노 및 설폰산으로부터 선택되고, R 은 하기 화학식 (II) 에 보여진 구조를 갖는 프룩토오스의 단일 글라이코실 또는 2 내지 5 개의 프룩토오스 분자에 결합된 올리고사카릴임:
식 중, n 은 0~4 임].
다른 한편으로, 본 발명은 상기 언급된 프룩토실 푸에라린의 제조 방법을 제공하고, 기재된 방법은 푸에라린을 함유하는 전환된 액체를 위한 생물변환 반응을 수행하여 푸에라린을 프룩토실 푸에라린으로 전환시키기 위해, 프룩토실화 효소 활성을 갖는 발효액 또는 발효 상청액 또는 정제된 프룩토실화 효소 또는 이의 재조합 발현 단백질을 사용하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 기재된 방법은 또한 전환의 완료, 이후 프룩토실 푸에라린 분말 또는 결정을 얻기 위해 수지 정제로 얻어진 표적 분획의 회전 증발 또는 동결 건조에 의해 전환된 액체로부터 박테리아 세포 또는 박테리아 단백질과 같은 불순물을 제거하는 것과 관련된다.
바람직하게는 기재된 발효액 또는 발효 상청액은 프룩토실화 푸에라린 활성을 갖는 미생물 발효로부터 얻어지고; 보다 바람직하게는 기재된 미생물은 아르틈 박터 니코티아나에 XM6 (CCTCC NO: M2010164) 이다.
바람직하게는, 미생물 발효에 사용되는 발효 매질은 하기를 함유한다: 사탕수수당 5-80 g/L, 펩톤 5-50 g/L, KH2PO4 0.4-4 g/L, CaCl2 0.5-5 g/L, MnSO4 0.1-2 g/L, pH 6-8 을 가짐; 발효 조건은 하기와 같이 최적화됨: 25~40 ℃, 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 환기 장치를 갖는 발효 탱크에서 교반함, 6~48 시간 동안 발효시키는 동안 속도 및 환기 성능은 1~6 vvm, 10~400 rpm 임; 추가로 바람직하게는, 발효 매질은 사탕수수당 15 g/L, 펩톤 25 g/L, KH2PO4 2 g/L, CaCl2 2 g/L, MnSO4 0.2 g/L (pH 7.5 임) 를 함유하고; 발효 조건은 하기와 같이 추가로 최적화된다: 30 ℃, 240 rpm 에서 16 시간 동안 진탕 플라스크에서 진동시키거나 환기 장치를 갖는 발효 탱크에서 교반함, 6 시간 동안 발효시키는 동안 속도 및 환기 성능은 4 vvm, 300 rpm 임.
바람직하게는, 기재된 생물변환 반응은 수성상 또는 비수성상에서 수행되고;
이에서 기재된 수성상 전환 조건은 하기를 포함한다: 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 발효 탱크에서 교반함, 푸에라린 농도는 0.1 g/L 초과 내지 포화까지이고, 글라이코실 공여체는 프룩토오스 또는 사탕수수당 또는 이 둘의 혼합물이고, 푸에라린 및 글라이코실 공여체는 1: 1~1: 200 의 몰비이고, 반응계의 10%~50% 를 차지하는 발효액 또는 발효 상청액 (프룩토실화 효소 10-100 U/mL 를 함유함) 을 6~96 시간 동안 25~40 ℃ 의 전환 온도에서 pH 4~8 을 갖는 임의의 버퍼 용액에서의 반응을 위해 첨가되고; 바람직한 조건은 하기와 같다: 10 g/L 푸에라린 및 글라이코실 공여체로서 100 g/L 사탕수수당, 20 % 발효 상청액 (프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유함) 은 30 ℃ 및 300 rpm 에서 12 시간 동안 교반 전환을 위해 1/15mol/L 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 을 갖는 5L 발효 탱크에 첨가된다.
기재된 비수성상 전환 조건은 하기를 포함한다: 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 발효 탱크에서 교반함, DMSO, DMF, 아세토니트릴, 메탄올 및 아세톤 또는 에탄올로부터 선택되는 하나 또는 복수개의 5~50 % 친수성 유기 용매, 5~200 g/L 에서의 푸에라린 농도, 바람직하게는 5~120 g/L 에서의 푸에라린 농도, 글라이코실 공여체는 프룩토오스 또는 사탕수수당 또는 이 둘의 혼합물이고, 1: 1~1: 200 로서의 푸에라린 및 글라이코실 공여체 몰비, 10%-50% 발효액 또는 발효 상청액 (프룩토코실라아제 10-100 U/mL 를 함유함) 은 6~96 시간 동안 25~40 ℃ 의 전환 온도에서 pH 4~8 을 갖는 임의의 버퍼 용액에서의 반응을 위해 첨가되고; 바람직한 조건은 하기와 같다: 20% DMSO, 107.5 g/L 푸에라린 및 글라이코실 공여체로서 350 g/L 사탕수수당을 선택함, 20 % 발효 상청액 (프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유함) 은 30 ℃ 및 300 rpm 에서 72 시간 동안 교반 전환을 위해 1/15mol/L 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 을 갖는 5L 발효 탱크에 첨가된다.
바람직하게는, 기재된 수지 정제는 AB-8 거대기공성 수지를 사용하여 프룩토실화 푸에라린을 함유하는 전환된 액체를 흡수하는 것이고, 대안적으로 비수성상 전환의 경우에 있어서, 전환된 액체에서의 유기 용매를 저온 증발에 의해 제거하거나 유기 용매를 2 % 의 부피비 미만으로 희석시킨 후 흡수를 실시하고; 흡수 후 잔여 글라이코실 공여체를 용리액으로 우선 제거하고 이후 수득된 프룩토실화 푸에라린을 용리액을 갖는 구배 또는 상에 의해 용리시켰고; 추가로 바람직하게는 잔여 글라이코실 공여체를 10 배 컬럼층 부피, pH 4~4.5 에서 증류수로 용리시키고, 이후 구배 또는 상 용리를 5~30 % 메탄올 또는 에탄올 용액으로 수행하여 각각 프룩토실화 푸에라린을 얻는다.
바람직하게는, 기재된 방법은 또한 용리액을 사용하여 용리하고 잔여 푸에라린을 회수하는 것과 관련되고; 추가로 바람직하게는, 100 % 메탄올 또는 에탄올이 용리하고 잔여 푸에라린을 회수하기 위해 사용된다.
바람직하게는, 기재된 프룩토실화 효소 또는 이의 재조합 발현 단백질은 β-D-푸란 프룩토시다제 또는 이의 재조합 발현 단백질이다.
추가로 바람직하게는, 기재된 β-D-푸란 프룩토시다제는 약 60 kDa의 분자량을 가진 아스로박터 박테리아로부터 유래되고, N 말단에서 제 1 의 5 아미노산 서열은 각각 ATEPV 이다.
다른 한편, 본 발명은 또한 심장-뇌 혈관 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 프룩토실화 푸에라린의 기재된 적용을 제공한다.
또 다른 한편, 본 발명은 또한 종양 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 프룩토실화 푸에라린의 기재된 적용을 제공한다.
바람직하게는, 기재된 약물은 주사 또는 경구 투여 제제이다.
하기는 본 발명의 상세한 설명이다:
본 발명의 목적을 충족시키기 위해, 본 출원은 하기 기술 계획을 적용한다:
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 본 발명은 화학식 (I) 에 보여진 바와 같은 신규한 유형의 프룩토실화 푸에라린을 제공한다:
[식 중, R1 및 R2 에 대해 각각 선택된 치환기는 수소기, 메틸, 에틸, 포르목실, 아세틸, 메틸아미노 및 설폰산임].
화학식 (I) 에서 R 은 화학식 (II) 에서 보여지는 바와 같다:
[식 중, n 은 0~4 임]. R 은 프룩토오스의 단일 클라이코실 또는 2 내지 5 개의 프룩토오스 분자에 의해 결합되는 올리고사카릴이다.
이 화합물은 효소 방법에 의해 제조되고, 다양한 통상 방법, 예컨대 크로마토그래피 분리, 액상 추출 및 재결정화 방법으로 정제될 수 있다. 이 화합물의 구조는 원소 분석, 적외선 스펙트럼, 가시선 및 자외선 스펙트럼, NMR 스펙트럼 및 단결정 X-선 회절에 의해 표현될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 구현예에 따라, 본 발명은 프룩토실화 푸에라린을 생물학적으로 전환시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 발효액, 또는 발효 상청액 (세포외효소), 또는 푸에라린의 프룩토실화 효소 활성을 가진 이 효소의 재조합 발현 단백질을 사용하고, 이는 푸에라린을 프룩토실화 푸에라린으로 전환시키기 위해 푸에라린을 함유하는 수성상 또는 비수성상의 전환된 액체로 첨가되고; 전환의 종료 후, 전환 액체에서의 박테리아 세포 또는 박테리아 효소 단백질을 가열, 침강 및 원심 분리에 의해 제거하고, 이후 전환된 액체를 AB-8 거대기공성 수지로 분리하고, 한편 표적 분획은 프룩토실화 푸에라린 분말 또는 결정을 수득하기 위해 회전 증발되거나 동결 건조된다.
푸에라린 프룩토실화 활성을 갖는 상기 언급된 미생물 균주는 임의의 프룩토실화 푸에라린, 특히 아트르박터 니코티아나에 XM6 (CCTCC NO: M2010164) 의 미생물 또는 글리코시다아제일 수 있다.
푸에라린 프룩토실화 활성을 갖는 상기 언급된 세포외효소, 또는 이 효소의 재조합 발현 단백질은 β-D-푸란 프룩토시다제 또는 β-D-푸란 프룩토시다제의 재조합 발현 단백질이다.
상기 언급된 β-D-푸란 프룩토시다제는 아스로박터 박테리아로부터 제조된다.
기재된 배양 배지의 영양 물질에 대한 특별한 제한은 없고, 이는 미생물의 성장에 적합한 임의의 영양 배지, 예컨대 탄소원으로서 전분, 글루코오스, 옥수수 전분 및 사탕수수당, 질소 공급원으로서 옥수수 침지액 및 땅콩박을 갖는 임의의 배양 배지이다. 발효 배양에 사용되는 상기 언급된 배양 배지는 하기와 같다: 사탕수수당 5-80 g/L, 펩톤 5-50 g/L, KH2PO4 0.4-4 g/L, CaCl2 0.5-5 g/L, MnSO4 0.1-2 g/L, pH 6-8 를 가짐.
발효 배양을 위한 상기 언급된 조건은 하기와 같다: 25~40 ℃, 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 환기 장치를 갖는 5L 발효 탱크에서 교반함, 6-48 시간 동안 발효하는 동안 속도 및 환기 성능은 1~6 vvm, 10~400 rpm 임.
상기 언급된 생물변환 방법 및 전환 반응은 수성상 또는 비수성상에서 수행될 수 있고, 전환 온도 범위는 25~40 ℃ 이고, 6~96 시간의 반응을 위해 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 환기 장치를 갖는 5L 발효 탱크에서 교반한다. (1) 수성상 전환 조건은 하기와 같다: 0.1 g/L 초과 내지 포화까지에 걸친 푸에라린 농도, 프룩토오스 또는 사탕수수당 또는 이 둘의 혼합물로서의 글라이코실 공여체, 푸에라린 대 글라이코실 공여체 몰비는 pH 4~8 를 가진 임의의 버퍼 용액에서 1: 1~1: 200 이고; (2) 비수성상 전환 조건은 하기와 같다: 5~50% 친수성 유기 용매 DMSO, DMF, 아세토니트릴, 메탄올, 아세톤 및 에탄올을 사용함, 푸에라린 농도는 5~200 g/L, 바람직하게는 5~120 g/L 이고, 글라이코실 공여체는 프룩토오스, 사탕수수당 또는 이 둘의 혼합물이고, 푸에라린 대 글라이코실 공여체 몰비는 pH 4~8 를 가진 임의의 버퍼 용액에서 1: 1~1: 200 이고,
프룩토실화 푸에라린을 함유하는 상기 언급된 전환된 액체는 AB-8 거대기공성 수지를 통해 흡수되고, 전환된 액체에서의 유기 용매가 저온 증발에 의해 제거되거나 유기 용매가 2 % 의 부피비 미만으로 희석시킨 후 흡착이 실시되고; 제 1 단계에서 잔여 글라이코실 공여체는 용리액으로서 10 배 컬럼층 부피에서 pH 4~4.5 (아세트산에 의해 pH 를 조절함) 에서 증류수를 사용하여 제거하였고; 제 2 단계에서 용리액은 프룩토실화 푸에라린을 수득하기 위한 구배 또는 상에 의한 5~30% 메탄올 또는 에탄올 용액이고, 제 3 단계에서 용리액은 잔여 푸에라린을 용리하기 위한 100 % 메탄올 또는 에탄올이다.
수지 정제를 통해 수득된 상기 언급된 프룩토실화 푸에라린 용액은 이후 프룩토실화 푸에라린 분말 또는 결정을 수득하기 위해 회전 증발 또는 동결 건조가 진행된다.
본 발명의 또 하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 심장-뇌 혈관 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 신규 유형의 푸에라린 글라이코실화 유도체를 제공한다.
본 발명의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 약제학적으로 기재된 형태의 임의의 약물을 제조하기 위해 사용될 수 있고; 기재된 약물 형태에 있어서, 주사 또는 구강 제제가 바람직할 것이다.
본 발명의 화합물 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린을 사용한 쥐 심근 허혈 T 파 진폭 변화에 대한 시험은 각각 12.5 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg 의 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 복용량을 사용한 경우 이는 피투이트린에 의해 야기되는 T 파 진폭을 상당하게 감소시킬 수 있다는 것을 보여주고, T 파 감소의 진폭은 푸에라린의 것보다 작고 이는 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 푸에라린보다 심근 허혈 저항성에 대해 더 나은 효과를 가진다는 것을 보여준다. 심근 허혈 쥐 심박수에 대한 본 발명의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 화합물을 사용한 시험 결과는 피투이트린 주사 2 분 후 모든 군의 쥐의 심박수는 이후 상당하게 느려지고, 심박수는 2~10 분 내에 모든 군에서 회복되기 시작한다는 것을 보여준다. 대조군 그룹과 비교하여, 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 상이한 복용량을 사용한 군에서의 심근 허혈 쥐 심박수의 회복은 모든 군에서 증가될 수 있고, 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 낮은 복용량을 사용한 군에서의 회복 시간은 푸에라린 군의 것보다 짧았다. 이는 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 심근 허혈에 의해 야기되는 심장 장애에 대한 특정 요법 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 기재된 프룩토실화 푸에라린은 심장-뇌 혈관 질환을 치료하기 위한 약물로 제조될 수 있다.
본 발명의 하나 초과의 구현예에 따라, 본 발명은 종양 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 신규한 유형의 푸에라린 글라이코실화 유도체의 적용을 제공한다.
본 발명의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 약제학적으로 기재된 형태의 임의의 약물을 제조하기 위해 사용될 수 있고; 기재된 약물 형태에 있어서, 주사 또는 경구 제조가 바람직할 것이다.
본 발명의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 화합물을 사용한 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562 의 시험관내 증식을 억제하기 위한 시험은 하기를 보여준다: 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 48 시간 동안 작용한 후 MDA-MB-231 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 동일한 기간 동안 대조군과 비교하는 경우 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 복용량이 50 μmol/L (P<0.05) 에 이르는 경우에서의 차이, 복용량이 100 μmol/L (P<0.01) 에 이르는 경우에서의 상당한 차이가 있고, 이 차이는 복용량이 150 및 200 μmol/L 에 이르는 경우 극히 분명하게 되고, MDA-MB-231 세포에 대한 억제율은 각각 44.04 % 및 59.42 % 이고, 이는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 현저하게 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 의 증식을 억제할 수 있음을 나타내고, 억제율은 복용량의 증가와 함께 증가한다. 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 48 시간 동안 작용한 후 K562 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 동일한 기간 동안 대조군과 비교하는 경우 1 μmol/L (P<0.05) 에서의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 낮은 복용량을 사용한 경우의 상당한 차이이 있고, 이 차이는 복용량이 100, 150 및 200 μmol/L 에 이르는 경우 매우 분명해지고 (P<0.01), K562 세포의 억제율을 각각 16.41 %, 29.84 % 및 46.41 % 를 나타내고, 이는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 현저하게 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562 의 증식을 억제할 수 있음을 나타내고, 억제율은 복용량의 증가와 함께 증가한다. 이는 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 암 세포에 대한 특정 시험관내 억제 효과를 가진다는 것을 보여준다. 본 발명에 기재된 프룩토실화 푸에라린은 종양 질환을 치료하기 위한 약물로 제조될 수 있다.
현존 기술과 비교하는 경우, 본 발명의 유익한 결과는 하기와 같다:
우선, 발명자는 신규한 프룩토실화 푸에라린을 개발하였고, 실험은 이러한 신규한 유형의 푸에라린 유도체가 심근 허혈에 의해 야기된 심장 장애에 대한 일부 요법 효과를 가지고, 이는 효과적으로 심장-뇌 혈관 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 실험은 또한 이러한 신규한 유형의 푸에라린 유도체는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562 에 대한 유의미한 시험관내 억제 효과를 가지고, 따라서 이는 종양 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 이는 약물로서 푸에라린 글라이코실화 유도체의 공급원을 풍부하게 하는 것을 입증하였고, 푸에라린 글루코실화된 유도체를 존재하게 하기 위한 이러한 양상에서의 어떠한 보고도 나타내지 않았다.
둘째로, 푸에라린과 비교하는 경우, 이러한 신규한 유형의 프룩토실화 푸에라린은 더 나은 용해도 및 더 높은 약리적 활성을 가지고, 이는 푸에라린 생산물의 결함을 이루며, 따라서 이는 약물의 안정성 성능 및 요법 효과를 증가시키고, 양호한 개발 전망을 가진 신규한 약물 생성물이 되도록 한다.
또한, 본 발명자는 또한 이 신규한 유형의 프룩토실화 푸에라린의 생물변환 방법을 제공한다. 현존하는 생물변환 방법을 사용하는 푸에라린의 글라이코실화 양상에 있어서, 푸에라린 농도는 푸에라린의 낮은 수용성으로 인해 일반적으로 낮고 (모두 10 g/L 미만), 생성물의 몰 전환율은 또한 본 발명의 생물변환 방법을 사용한 경우 낮고 (모두 70 % 미만), 수득한 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 90 % 초과의 기질 전환율과 함께 111.7 g/L 로 높은 농도를 갖고, 이는 현존하는 기술에서의 기술적 곤란성을 해결하고, 심장-뇌 혈관 및 종양 관련 질환 및 그 후의 생성물의 생산에 대한 약리적 시험을 촉진한다.
생물학적 재료의 수집 정보
라틴어 과학적 명칭: 아스로박터 니코티아나에 XM6, 분류 명명법: 아스로박 터 니코티아나에 XM6, 2010년 6 월 29일 China Typical Culture Collection Center 에서 수집됨, 주소: Wuhan University, Wuhan China, 우편번호: 430072, 수집 번호: CCTCC NO: M2010164.
본 발명의 최적의
구현예
본원에서 기재된 특정 구현예는 실시예에 의해 표현되나 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 본 발명의 주요 특징은 다양한 구현예에 적용될 수 있다. 본 기술분야에서의 당업자는 많은 등가물이 종래의 실험에 의한 것으로 기재된 특정 단계에서 적용될 수 있음을 인지하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되고 특허청구범위에 포함된다.
하기 구현예에 있어서, 상세하게 기재된 공정 및 방법은 일반적으로 본 분야에서의 공지된 종래 방법이다. 사용된 시약의 공급원 및 상표명 및 필수적으로 열거된 이의 성분들은 이의 최초 양태로 나타내어 지고, 이는 사용된 동일한 시약에 대한 특정 언급이 없는 경우 최초 나타낸 것과 동일한 것이다.
구현예
1:
푸에라린의
수성상
생물전환에 의한
프룩토실화
푸에라린의
수득
20 분 동안 121 ℃ HP 스팀을 사용하여 살균한 후, 40 mL 의 발효 배양 배지 2 (표 1 에서 보여지는 바와 같은 배양 배지 조성물) 을 250 mL 삼각 플라스크에 넣고, 아스로박터 니코티아나에 XM6 (CCTCCNO: M2010164) 를 접종하고, 발효 배양액을 30 ℃ 에서 5 % 의 부피의 양으로 5L 발효 탱크에 대해 시드 용액으로서 접종시키기 이전에 16 시간 동안 180 rpm 에서 진동시키고, 발효 탱크는 3 L 의 액체를 함유하고, 진탕 플라스크와 동일한 방법으로 살균시켰다. 이를 6 시간 동안 (OD 약 10) 3 vvm 의 환기 흐름으로, 30 ℃ 및 300 rpm 에서의 발효에 의해 배양하였고, 이후 20 분 동안 8000 rpm 에서 원심분리하여 효소 상청액을 수집하고, 프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유하는 효소 상청액을 측정하였다. 효소 활성을 측정하기 위해 하기 방법을 사용하였다:
기질액의 제조: 100 mL 의 1/15mol/L 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 에 0.4 g 푸에라린 및 10 g 사탕수수당을 용해시킨다. 반응 시스템: 2 mL 의 1/15mol/L 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 를 선택하고, 18 mL 기질액에 이를 첨가하고, 이를 30 ℃ 에서 10 분 동안 반응을 위해 넣었고, 이후 100 μL 를 즉시 꺼내고, 이를 900 μL 의 메탄올로 첨가하고 블랭크 대조군으로서 반응을 종결시켰다. 동시에 별개로 2 mL 효소액을 선택하고, 18 mL 기질액에 이를 첨가하고, 30 ℃ 에서 10 분 동안 반응을 위해 이를 넣었고, 그 다음 즉시 100 μL 를 꺼내고 이를 900 μL 의 메탄올에 첨가하고 시료로서 반응을 종결시켰다. 이후 HPLC 를 사용하여 측정하였다. 효소 활성 단위를 하기와 같이 정의하였다: 30 ℃ 에서 분 당 1 μmoL 의 푸에라린을 전환시키는데 필요한 효소의 양이 활성 단위이다 (1U 는 1 μmol/min 임). 비활성 (U/mL) 의 정의: 효소액의 단위 부피 (mL) 에서의 효소 활성 수 (U).
30 ℃ 및 300 rpm 으로 푸에라린 글라이코실화 반응을 위해 10 g/L 푸에라린 (Nanjing Zelang Medical Technology Co., Ltd. 사제) 및 100 g/L 사탕수수당을 함유하는 1/15mol/L 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 의 총부피를 함유하는 5L 발효 탱크에 600 mL 효소 상청액을 첨가하고, 12 시간 이후, 2 시간 동안 45 ℃ 에서 이를 가열하여 전환 반응을 종결시켰다. 전환된 액체를 HPLC 로 시험하였고, 프룩토실화 푸에라린의 전환율은 95 % 이고, 결과에 대해 도 1 에 나타내었다.
프룩토실화 푸에라린을 함유하는 상기 언급된 전환된 액체는 AB-8 거대기공성 수지 (크로마토그래피 컬럼 40 × 600 mm, 10 mL/min 의 유속) 에 의해 흡수되고, 이후 잔여 글라이코실 공여체를 10 배 컬럼층 부피, pH 4~4.5 (빙초산에 의해 pH 가 조절됨) 에서 증류수 및 이후 5%-30% 메탄올 용액을 사용한 구배 용리로 제거하여 각각 프룩토실화 푸에라린 (순도>97 %) 을 수득하였고, 마지막으로 100 % 메탄올을 안료 및 푸에라린을 세척하기 위해 사용하였다.
각각 순도>97 % 를 갖는 프룩토실화 푸에라린을 45 ℃ 에서 회전식 기화 또는 동결 건조하여 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 7.9 g, 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 16.8 g, 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 3.3 g, 테트라프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 3.2 g, 및 펜타프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 2.2 g 을 얻었다.
25 ℃ 에서의 측정은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 용해도가 26.0 g/L 이고, 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 것은 280.8 g/L 이고, 각각 동일한 조건 하에서 푸에라린 (5.2 g/L) 의 용해도 5 배 및 54 배임을 보여준다.
상기 언급된 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린: HR-MS: m/z 577.1563[M-H]-, 원소 조성 C27H29O14 (도 7), 및 M-H 계산된 값 577.1557; DMSO 에서,1H-NMR 및 13C-NMR 의 화학적 변위 특징은 각각 하기와 같다:
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 8.29(1H, s, H-2), 7.93(1H, d, J=8.7Hz, H-5), 6.98(1H, d, J=8.7 Hz, H-6), 7.40(2H, d, J=8.5 Hz, H-2'/H-6'), 6.80(2H, d, J=8.7 Hz, H-3'/H-5'), 9.48(1H, s, 4'-OH), 4.81(1H, d, J=9.1 Hz, H-1"), 3.93-3.96(2H, m, H-2"/H-4"'), 3.79-3.89 (2H, m, H-5"/H-6"'), 3.48-3.61 (3H, m, H-6"，H-5"'，H-6"'), 3.29-3.42 (6H, m, H-3", H-4", H-6"，2H-1"', H-3"') (도 3, 도 5, 도 6)
13C-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 174.9, 160.9, 157.1, 152.6, 130.0, 126.2, 123.0, 122.5, 114.9, 112.5, 116.8, 104.1(C-2"'), 82.1(C-5"'), 79.7, 78.4, 76.7, 75.1(C-5"), 73.4, 70.7, 70.3, 62.3(C-6"), 61.5(C-6"'), 61.1 (도 4).
푸에라린 1NMR 및 13C-NMR 의 화학적 변위 특징은 각각 하기와 같다:
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 8.33(1H, s, H-2), 7.97(1H, d, J=8.8Hz, H-5), 7.01(1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 7.41(2H, d, J=8.8 Hz, H-2'/H-6'), 6.83(2H, d, J=8.8 Hz, H-3'/H-5'), 9.52(1H, s, 4'-OH), 4.85(1H, d, J=9.0 Hz, H-1"), 4.05(1H, s, H-2"), 3.52, 3.75 (2H, m, 2H-6"), 3.26-3.36 (3H, m, H-3", H-4", H-5") (도 8)
13C-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 175.1, 161.2, 157.2, 152.7, 130.1, 126.4, 123.2, 122.6, 117.0, 115.19, 112.7, 81.8(C-5"), 78.8, 73.6, 71.0, 70.6, 61.5(C-6") (도 9).
바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린: HR-MS: m/z 739.2080[M-H]-, 원소 조성 C33H39O19 (도 14), M-H 계산된 값 739.2086; DMSO 에서, 1H-NMR 및 13C-NMR 의 화학적 변위 특징은 각각 하기와 같다:
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 8.29 (1H, s, H-2), 7.95 (1H, d, J=8.7Hz, H-5), 6.97 (1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 7.40 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2'/H-6'), 6.80 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3'/H-5'), 9.48 (1H, s, 4'-OH), 4.81(1H, d, J=9.2 Hz, H-1"), 3.92-3.99(3H, m, H-2"，H-4"', H-4""), 3.69-3.87 (4H, m, H-6"，H-5"，H-5"'，H-6""), 3.48-3.58 (5H, m, H-6"，H-3"'，H-6"'，H-5""，H-6"")，3.25-3.42 (8H, m, H-3", H-4", 2H-1"', H-6"'，2H-1""，H-3"") (도 10, 도 12, 도 13).
13C-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ: 174.7, 160.7, 156.9, 152.4, 129.8, 126.0, 122.9, 122.4, 116.6, 114.8, 112.3, 104.2, 104.0, 81.9(C-5""), 80.1, 79.6, 78.3, 76.3, 76.0, 75.5(C-5"'), 75.1(C-5"), 73.3, 70.6, 70.4, 62.7(C-6"), 62.4(C-6"'), 62.0(C-6"")，61.1, 60.8 (도 11).
트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린: ESI-MS: m/z 925.3[M+Na]+, 원소 조성 C39H50O24Na (도 15); 테트라프룩토실-β (2,6)-푸에라린: ESI-MS: m/z 1064.3[M-H]-, 원소 조성 C45H59O29 (도 16); 펜타프룩토실-β (2,6)-푸에라린: ESI-MS: m/z 1226.5[M-H]-, 원소 조성 C51H69O34 (도 17).
구현예
2:
푸에라린의
비수성상
생물전환에 의한
프룩토실화
푸에라린의
수득
20 분 동안 121 ℃ HP 스팀을 사용하여 살균한 후, 40 mL 의 발효 배양 배지 2 (표 1 에서 보여지는 바와 같은 배양 배지 조성물) 을 250 mL 삼각 플라스크에 넣고, 아스로박터 니코티아나에 XM6 (CCTCCNO: M2010164) 를 접종하고, 발효 배양액을 30 ℃ 에서 5 % 의 부피의 양으로 5L 발효 탱크에 대해 시드 용액으로서 접종시키기 이전에 16 시간 동안 180 rpm 에서 진동시키고, 발효 탱크는 3 L 의 액체를 함유하고, 진탕 플라스크와 동일한 방법으로 살균시켰다. 이를 6 시간 동안 (OD 약 10) 3 vvm 의 환기 흐름으로, 30 ℃ 및 300 rpm 에서의 발효에 의해 배양하였고, 이후 20 분 동안 8000 rpm 에서 원심분리하여 효소 상청액을 수집하고, 프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유하는 효소 상청액을 측정하였다.
30 ℃ 및 300 rpm 으로 진동 전환을 위해 107.5 g/L 푸에라린, 350 g/L 사탕수수당 및 20 % DMSO 를 함유하는 1/15mol/L 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 의 3000 mL 의 총부피를 갖는 5L 발효 탱크에 600 mL 효소 상청액을 첨가하고, 72 시간 이후, 2 시간 동안 45 ℃ 에서 이를 가열하여 전환 반응을 종결시켰다. 전환된 액체를 HPLC 로 시험하였다: 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 111.7 g/L 에 이르고, 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 28.3 g/L 에 이르고, 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 2.3 g/L 에 이르고, 프룩토실화 푸에라린 유도체의 전환율은 90 % 이고, 결과에 대해 도 2 에 나타내었다.
프룩토실화 푸에라린을 함유하는 상기 언급된 전환 액체를 10 배로 희석하고, AB-8 거대기공성 수지 (크로마토그래피 컬럼 40 × 600 mm, 10 mL/min 의 유속) 에 의해 흡수되고, 이후 잔여 글라이코실 공여체는 10 배 컬럼층 부피 pH 4~4.5 (빙초산에 의해 pH 를 조절함) 에서 희석된 물 및 이후 5%-30% 메탄올 용액을 갖는 구배 용리액으로 제거하여 각각 프룩토실화 푸에라린 (순도>97 %) 을 얻었고, 마지막으로 100 % 메탄올을 안료 및 푸에라린을 세척하기 위해 사용하였다.
순도>97 % 를 갖는 프룩토실화 푸에라린을 45 ℃ 에서 회전식 기화 또는 동결 건조하여 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 270 g, 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 68 g, 및 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 15 g 을 수득하였다.
구현예
3:
푸에라린의
비수성상
생물전환에 의한
프룩토실화
푸에라린의
수득
20 분 동안 121 ℃ HP 스팀을 사용하여 살균한 후, 40 mL 의 발효 배양 배지 2 (표 1 에서 보여지는 바와 같은 배양 배지 조성물) 을 250 mL 삼각 플라스크에 넣고, 아스로박터 니코티아나에 XM6 (CCTCCNO: M2010164) 를 접종하고, 발효 배양액을 30 ℃ 에서 16 시간 동안 (OD 약 10) 180 rpm 에서 진동시키고, 이후 20 분 동안 8000 rpm 에서 원심분리하여 프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유하는 효소 상청액을 수집하였다.
30 ℃ 및 180 rpm 으로 진동 전환을 위해 107.5 g/L 푸에라린, 350 g/L 사탕수수당 및 20 % DMSO 를 함유하는 포스페이트 버퍼 (pH 6.86) 의 20 mL 의 총부피를 갖는 프러그를 갖는 250 mL 삼각 플라스크에 4 mL 효소 상청액을 첨가하고, 72 시간 이후, 2 시간 동안 45 ℃ 에서 이를 가열하여 전환 반응을 종결시켰다. 전환된 액체를 HPLC 로 시험하였다: 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 111.7 g/L 에 이르고, 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 28.3 g/L 에 이르고, 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 2.3 g/L 에 이르고, 프룩토실화 푸에라린의 전환율은 90 % 이었다.
프룩토실화 푸에라린을 함유하는 상기 언급된 전환 액체를 10 배로 희석하고, AB-8 거대기공성 수지 (크로마토그래피 컬럼 20 × 600 mm, 10 mL/min 의 유속) 에 의해 흡수되고, 이후 잔여 글라이코실 공여체는 10 배 컬럼층 부피, pH 4~4.5 (빙초산에 의해 pH 를 조절함) 에서 증류수 및 이후 5%-30% 메탄올 용액을 갖는 구배 용리액으로 제거하여 각각 프룩토실화 푸에라린 (순도>97 %) 을 얻었고, 마지막으로 100 % 메탄올을 안료 및 푸에라린을 세척하기 위해 사용하였다. 순도>97 % 를 갖는 프룩토실화 푸에라린을 45 ℃ 에서 회전식 기화 또는 동결 건조하여 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 1.8 g, 바이프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 0.5 g, 및 트리프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말 또는 결정 0.03 g 을 수득하였다.
구현예
4: 상이한 발효의 효과 및 형성된 생성물에 대한 전환 조건
20 분 동안 121 ℃ HP 스팀을 사용하여 살균한 후, 40 mL 의 발효 배양 배지 2 (표 1 에서 보여지는 바와 같은 배양 배지 조성물) 을 250 mL 삼각 플라스크에 넣고, 아스로박터 니코티아나에 XM6 (CCTCCNO: M2010164) 를 접종하고, 진동된 발효 및 상이한 발효 조건 (표 2 에 보여지는 바와 같은 전환 조건) 하에서의 배양 후, 이를 20 분 동안 8000 rpm 에서 원심분리하여 프룩토실화 효소 10-100 U/mL 를 함유하는 효소 상청액을 수집하였다. 20 % 효소 상청액을 전환 시스템에 첨가하고, 상이한 전환 조건 (표 2 에 보여지는 바와 같은 발효 조건) 하에 진동하여 전환 후 45 ℃ 에서 2 시간 동안 가열하여 전환 반응을 종결시키고 전환된 액체를 HPLC 로 시험하였다.
상이한 균주 발효 및 전환 조건은 푸에라린 글라이코실화 생성물의 형성에 대해 상이한 효과를 가지고, 표 1 및 표 2 는 상이한 조건 하에서 푸에라린 글라이코실화 반응에서의 주요 생성물 모노프룩토실화 푸에라린 및 바이프룩토실화 푸에라린의 몰 전환율에 있어서의 변화를 보여준다.
비수성상 전환의 이점은 전환 시스템에서의 푸에라린 농도가 바람직한 비수성상 전환 조건 하에 120 g/L 로 증가될 수 있고, 비수성상의 전환율은 90 % 일 수 있고, 전환된 생성물의 농도는 현저하게 증가되고 (107.5 g/L 의 푸에라린에서 140 g/L 초과의 총 전환된 생성물) 또한 전환된 생성물은 용매 및 이의 함량을 선택함으로써 조절 및 제어될 수 있다는 것을 표 2 에서의 결과로부터 알 수 있다. 비수성상 전환의 이러한 이점은 산업적 생산에 대해 유익할 것이다.
구현예
5: 혈액에서의
모노프룩토실
-β (2,6)-
푸에라린의
대사동태 실험
1. 기기 및 크로마토그래피 조건
HPLC 분석에서, DIONEX 를 Discovery HS C18 (250 × 4.6 ㎛, 5 ㎛) 와 같은 크로마토그래피 컬럼, 공급 시편 속도 20 μL, 컬럼 온도 30 ℃ 로 사용하고, 검출기는 254 nm 의 검출 파장을 갖는 UVD170U 이었다, 유동상: A, 물, B, 크로마토그래피 분류 메탄올, A:B=80:20, (1 mL/min 의 유속에서임).
2. 실험 동물
스프래그-다우리 쥐 (SD 쥐), 180-220 g 의 중량, 반반의 수컷 및 암컷, Medical Experiment Center of Nantong University 로부터 제공받음, 생산 허가 번호 : SCXK (Su) 20080010.
3. 실험 방법
3.1 샘플 수집
SD 쥐를 무작위적으로 각각 5 개의 2 개의 그룹으로 나누고, 실험 전 12시간 동안 공복상태로 두었다. 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린을 각각 20% 1, 2-PG 정상 식염수에 용해시키고, 50 mg/kg 의 복용량으로 마우스 꼬리단부 정맥으로 주사하였다. 주사 후, t=0 분, 4 분, 7 분, 17 분, 40 분, 60 분, 120 분 및 180 분에서 0.5 mL 의 혈액을 안와로부터 취하여 리쿠아에민으로 처리된 원심 튜브로 주입하고, 이후 이를 3000 rpm 으로 15 분 동안 원심분리함으로써 즉시 분리하여 분석을 위한 혈장을 분리하였다.
3.2 시료의 처리
100 μL 의 혈장을 정확하게 취하여 시험용 튜브로 주입하고, 400 μL 의 메탄올 침전된 단백질을 첨가하고 5 분 동안 시험관 혼합기에서 이를 혼합하고, 이후 10 분 동안 10000 rpm 에서 원심분리하였고, 상청액을 HPLC 분석을 위해 사용하였다.
3.3 데이타 분석
3.2 각각에서 제조된 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 시료의 혈장 농도를 외부 참조 방법을 사용하여 계산함으로서 얻었다. 얻어진 데이타를 약동학 통계 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
4. 결과
모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 t1/2, MRT (0-t) 및 MRT (0-∞) 값이 푸에라린의 것보다 명백하게 더 높고, 푸에라린보다 혈액에서 푸에라린 유도체의 더 긴 체류 시간을 나타내고, 따라서 이는 신체에서 더 긴 작용 시간을 가질 수 있다는 것을 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 (표 3) 의 주요 대사동태 파라미터로부터 알 수 있었다. 또한, 푸에라린 유도체의 AUC (0-t) 및 AUC (0-∞) 값이 푸에라린의 것보다 명백하게 더 높고, 푸에라린보다 푸에라린 유도체의 더 높은 생체이용가능성을 나타낸다.
구현예
6:
모노프룩토실
-β (2,6)-
푸에라린
쥐 급성 심근 허혈의 보호 효과에 대한 실험
1. 실험 재료
피투이트린 주사를 Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd. 로부터, 정상 식염수 주사를 Nanjing Xiaoying Pharmaceutical Co., Ltd. 로부터 구입하고, DMSO, PG, 및 무수 에탄올은 크로마토그래피 분류의 것이었다. 푸에라린은 Nanjing Zelang Medical Technology Co., Ltd. 로부터 구입하였고, 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린은 본 발명의 방법을 사용하여 제조하였고, 99 % 초과의 순도에 대해 HPLC 로 시험하였다.
2. 실험 동물
스프래그-다우리쥐 (SD 쥐), 180-220 g 의 중량, 반반의 수컷 및 암컷, Medical Experiment Center of Nantong University 로부터 제공받음, 생산 허가 번호: SCXK (Su) 20080010.
3. 실험 방법
피투이트린에 민감한 50 마리의 SD 쥐를 3 일 동안의 적용을 위해 공급하고 용매 군, 푸에라린 군 및 낮은 배지 및 높은 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 군에 기초하여 무작위적으로 구분하였다. 약물을 10% PG 용액에 용해시키고, 투여량은 0.5 mL 이고, PG 정상 식염수 용액을 용매 군, 50 mg/kg 의 복용량에서의 푸에라린 군에 대한 PG 정상 식염수 용액을 위해 사용하였고, 각각 12.5 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg 의 복용량에서 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 군은 PG 정상 식염수 용액에 주어진다. 약물 주입 5 분 후, 모든 군의 쥐는 정맥 피트 0.5 U/kg 로 천천히 주입되어 급성 심근 허혈 모델이 재현되고, 모든 군에서의 쥐의 ECG 변화를 피트 주사 후 15 초, 30 초, 1 분, 5 분 및 10 분에서 관찰하였고, 상기 시점에서의 심박수 및 T-파 진폭 변화를 계산하였다.
4. 통계적 방법
t. P<0.05 로 나타내고 시험된 데이터는 상당한 차이를 나타내고, P<0.01 은 매우 상당한 차이를 나타내고; P<0.001 는 극히 상당한 차이를 나타낸다.
5. 결과
5.1 쥐 심근 허혈 T 파 진폭 변화에 대한 푸에라린 유도체의 효과
실험 결과는 12.5 mg/kg, 25 mg/kg 및 50 mg/kg 의 각각의 복용량에서의 시편 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 피투이트린에 의해 개시되는 T 파 진폭을 상당하게 모두 감소시키고, 푸에라린의 것보다 T 의 진폭을 감소시키고, 이는 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 푸에라린보다 심근 허혈에 보다 저항적일 수 있음을 보여준다.
5.2 심근 허혈 쥐 심박수에 대한 푸에라린 유도체의 효과
실험 결과는 피투이트린 주사 후 2 분 내에, 모든 군에서의 쥐의 심박수는 이후 낮아지고, 심박수는 2~10 분 내에 모든 군에서 회복된다. 대조군과 비교할 때, 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 상이한 복용량을 사용한 군에서 심근 허혈 쥐 심박수의 회복이 모든 군 내에서 증가될 수 있고, 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 낮은 복용량을 사용한 군의 회복 시간이 푸에라린 군의 것보다 더 단축된다. 이는 시험 시료 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 심근 허혈에 의해 야기되는 심장 장애에 대한 특정 요법 효과를 가지는 것을 나타낸다.
구현예
7: 암 세포 증식의 억제에 대한
모노프룩토실
-β (2,6)-
푸에라린의
실험
1. 세포주 및 약물
Shanghai Fument Gene Biotechnology Co., Ltd. 로부터 구입한 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231; cell bank of Chinese Academy of Sciences Shanghai Cell Research Institute 로부터 구입한 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562; Nanjing Zelang Medical Technology Co., Ltd. 로부터 구입한 푸에라린; 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린을 본 발명에서의 방법으로 제조하고, 99 % 초과의 순도를 갖도록 HPLC 를 사용하여 시험하였다.
2. 실험 약물 및 용액의 제조
약물 모액: 8.32 mg 의 푸에라린 분말을 취하고, 2 mL DMSO 에 이를 용해시켜 10 mmol/L 의 푸에라린 용액을 얻었고; 11.56 mg 의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 분말을 취하고, 2 mL DMSO 에 이를 용해시켜 10 mmol/L 의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 용액을 얻었고; 이를 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 1000 μL/doff 에서 이를 분리하고, 이를 -20 ℃ 에서 저장하고, 또한 고농도 DMSO 를 대조군에 의한 사용을 위해 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.
세포 배양 용액: 한 봉지의 RPM 1-1640 배양 배지 (분말) 을 취하고, 800 mL 의 3중 증류수에 이를 용해시키고 용해를 완료시키기 위해 자석 교반기로 적어도 30분 동안 교반하고, 2 g 의 NaHCO3 를 첨가하고, 완전 용해 후 1 L 의 일정한 부피로 이를 희석시켰다. 0.22 pm 의 여과막을 사용하여 여과하고, 10 % 의 최종 혈청 농도를 갖도록 혈청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 이를 저장하였다.
PBS 포스페이트 버퍼: 800 mL 의 증류수에 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2Pa 및 0.24g KH2PO4 를 용해시키고, HCl 을 사용하여 7.4 의 PH 값을 조정하고, 물을 l L 의 일정 부피로 첨가하고, HP 스팀을 사용하여 20 분 동안 살균시키고, 저온에서 이를 저장하였다.
MTT 응용 액체: 500 mg 의 MTT 분말을 칭량하여 취하고, 100 mL PBS 에 이를 용해시키고, 이를 용해시키기 위해 교반하고, 박테리아를 제거하기 위해 0.22 pm 의 여과 막으로 이를 여과하고, 이를 분리하고 4 ℃ 에서 차광하여 이를 저장하였다.
3중 액체: SDS 25 g, 이소프로판올 12.5 mL 및 농축 HCl 2.5 mL 를 취하고, l L 의 일정 부피로 3중 증류수를 첨가하고, 이를 저온에서 저장하였다.
3. 주요 시약 및 기기
HPLC 기기 (DIONEX Model: P600); ELISA 기기 (Molecular Devices Model: spectra MAX 190/GEMINIXS); CO2 인큐베이터 (Forma Company Model: 3111); 저속 원심분리기 (Thermostat Model: PICO-17); 도립 현미경 (Leica Company Model: DMIL); 수평 로커 (Nanjing University Instruments Company Model: TY-80S); 우태 혈청 (Hyclone Company); 송아지 혈청 (Gibaco BRL Company); RPMI1640 (US Gibco Company); 페니실린 G 나트륨 염 (AMRESCO Company); 스트렙토마이신 설페이트 (AMRESCO Company); 트립신 (AMRESCO Company); 및 MTT (AMRESCO Company).
4. 세포 배양
MDA-MB-231 세포를 37 ℃ 에서 5 % CO2 포화 습도를 갖는 인큐베이터에서 10% 부피 분율의 불활성화 우태 혈청, 100 U 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 완전 배양 배지에서 배양하였다.
K-562 세포를 37 ℃ 에서 5 % CO2 포화 습도를 갖는 인큐베이터에서 10% 부피 분율의 불활성화 우태 혈청, 100 U 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 완전 배양 배지에서 배양하였다.
5. 실험 방법
5.1 MDA-MB-231 세포 독성 시험
대수 증식기 (일차 배양병) 에서의 MDA-MB-231 세포를 취하고, 배양 용액을 폐기하였다. 이를 10 mL PBS 로 일회 세척하고, PBS 를 폐기한 후 3mL 의 0.25% 트립신-0.04% EDTA 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 분 동안 소화시킨 후 중화 반응을 위해 이에 5 mL 의 완전 배양 배지를 첨가하고, 송풍 및 비팅 후 세포를 15 mL 원심분리 튜브로 이송시켜 이를 1000 rpm 에서 3 분 동안 원심 분리시켰다. 세포의 현탁 용액을 제조하고, 세포 농도를 적절한 양의 완전 배양 배지를 사용하여 3 × 104/mL 로 조정하였다. 세포를 각 경우에서 180 ㎕ 의 세포 현탁액을 가진 조직 배양 플레이트 96 으로 공급하고, 배양 플레이트를 종래의 배양을 위한 세포 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO2) 에 넣었다. 세포가 50%-70% 로 성장하는 경우, 상이한 농도의 약물 액체를 첨가하였다. 10 mmol/L 의 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 모액을 취하고, 구배의 PBS 를 사용하여 액체를 각각 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1 및 0.1 μmol/L 로 희석시키고, 각 경우에서 20 μL 의 약물을 첨가하여 약물의 최종 농도가 각각 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1 및 0.01 μmol/L 이었다. DMSO 용매 대조군에 대해 20 μL 의 PBS 를 함유하는 상응하는 약물을 첨가하고, 블랭크 군에 대해 20 mL 의 PBS 를 첨가한다. 각각의 약물 농도에 대해 6 개의 복합 경우를 제공하였다. 배양판을 세포 인큐베이터에 다시 넣었고, 48 시간 후 20 μL MTT (5 mg/mL) 용액을 첨가하고, 4 시간 동안 인큐베이터에서 이의 배양을 지속하고, 이후 상청액을 제거하고 조직과 함께 이를 건조시키고, 각 경우로 200 μL DMSO 를 첨가하고, 15 분 동안 빛 없이 로커에서 이를 진동시켜, 결정이 완전히 용해되도록 하였다. 완전 자동 ELISA 기기를 사용하여 490 nm 에서의 광흡수를 측정하였고, 평균 억제율, 억제율 (%) = (대조군 그룹 A490- 시험 그룹 A490) /대조군 그룹 A490) 을 계산하였고, 실험을 3 회 반복하였다.
5.2 K562 세포 독성 시험
대수 증식기에서의 K-562 세포를 취하고, 농도를 1 × 105/mL 로 조절하고, 이를 각 경우에서 90 μL 의 세포 현탁액을 갖는 조직 배양 플레이트 96 에 접종하고, 실험군을 상이한 최종 농도 (1, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200 μmol/L) 의 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린을 사용하여 처리하였고, 각 경우에서 10 μL 의 약물을 첨가하고, DMSO 용매 대조군에 대해 20 μL 의 PBS 를 함유하는 해당하는 약물 용매를 첨가하고, 블랭크 군에 대해 20 μL 의 PBS 를 첨가한다. 각각의 약물 농도에 대해, 6 개의 복합 경우를 제공한다. 배양 플레이트를 세포 인큐베이터에 다시 넣고, 48 시간 후 20 μL 의 MTT (5 mg/mL) 용액을 첨가하고 48 시간 동안 인큐베이터에서 이를 배양하는 것을 지속하고, 이후 각 경우를 삼중 액체 100 μL 로 첨가하고, 이를 하룻밤 동안 정치하여 결정이 완전하게 용해되게 하였다. 이를 20 분 동안 진동자를 사용하여 진동시키고, 완전 자동 ELISA 기기를 사용하여 490 nm 에서 광흡수를 측정하고, 평균 억제율, 억제율 (%) = (대조군 그룹 A490- 시험 그룹 A490) /대조군 그룹 A490) 을 계산하고, 실험을 3 회 반복하였다.
6. 통계적 과정
Relevant analysis and Student t tests in Microsoft Excel 2003 을 사용하였고, 데이터는 X±SD 에 존재하였다.
7. 실험 결과
7.1 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 의 증식에 대한 푸에라린 유도체의 효과
MTT 방법을 사용한 분석 후의 통계적 결과는 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 모두는 48 시간 동안 작용 후 MDA-MB-231 세포의 수를 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다 (표 6 참조). 대조군과 비교할 때, 동일한 기간 동안, 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 50 μmol/L (P<0.05) 에 이르는 경우의 차이, 복용량이 100 μmol/L (P<0.01) 에 이르는 경우의 상당한 차이가 있고, 이러한 차이는 복용량이 150 및 200 μmol/L 에 이르는 경우 매우 분명하게 되고 (P<0.001), MDA-MB-231 세포에 대한 억제율이 각각 44.04 % 및 59.42 % 이고, 이는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 현저하게 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 의 증식을 억제할 수 있고, 억제율이 복용량의 증가와 함께 증가한다는 것을 나타낸다.
7.2 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562 의 증식에 대한 푸에라린 유도체의 효과
MTT 방법을 사용한 분석 후의 통계적 결과는 푸에라린 및 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린 모두는 48 시간 동안 작용 후 K562 세포의 수를 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다 (표 7 참조). 대조군과 비교할 때, 동일한 기간 동안, 1 μmol/L (P<0.05) 에서의 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린의 낮은 복용량을 사용한 경우 상당한 차이가 있고, 이러한 차이는 복용량이 100, 150 및 200 μmol/L 에 이르는 경우 매우 분명하게 되고 (P<0.001), K562 세포의 억제율은 각각 16.41 %, 29.84 % 및 46.41 % 이고, 이는 모노프룩토실-β (2,6)-푸에라린이 현저하게 인간 만성골수성 백혈병 세포주 K562 의 증식을 억제할 수 있고, 억제율이 복용량의 증가와 함께 증가한다는 것을 나타낸다.
Claims (10)
- 프룩토실화 푸에라린으로서, 기재된 프룩토실화 푸에라린은 하기 화학식 (I) 에 보여지는 구조를 갖는 프룩토실화 푸에라린:
[식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 포르목실, 아세틸, 메틸아미노 및 설폰산으로부터 선택되고, R 은 하기 화학식 (II) 에 보여지는 구조를 갖는 프룩토오스의 단일 글라이코실 또는 2 내지 5 개의 프룩토오스 분자에 결합된 올리고사카릴임:
식 중, n 은 0~4 임]. - 제 1 항에 따른 프룩토실화 푸에라린의 제조 방법으로서, 상기 기재된 방법이 푸에라린을 함유하는 전환된 액체를 위한 생물변환 반응을 수행하여 푸에라린을 프룩토실화 푸에라린으로 전환시키기 위해, 프룩토실화 효소 활성을 갖는 발효액 또는 발효 상청액 또는 정제된 프룩토실화 효소 또는 이의 재조합 발현 단백질을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 기재된 방법이 전환의 완료, 그 다음 수지 정제로 얻어진 표적 분획의 회전 증발 또는 동결 건조 후, 전환된 액체로부터 박테리아 세포 또는 박테리아 단백질과 같은 불순물을 제거하여 프룩토실화 푸에라린 분말 또는 결정을 수득하는 것과 관련되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 기재된 발효액 또는 발효 상청액은 프룩토실화 푸에라린 활성을 갖는 미생물 발효로부터 수득되고;
바람직하게는 상기 기재된 미생물은 아스로박체 니코티아나에 XM6 (CCTCC NO: M2010164) 인 것을 특징으로 하는 제조 방법. - 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재된 프룩토실화 효소 또는 이의 재조합 발현 단백질은 β-D-푸란 프룩토시다제 또는 이의 재조합 발현 단백질이고;
또한 바람직하게는, 상기 기재된 β-D-푸란 프룩토시다제는 약 60 kDa 의 분자량을 갖는 아스로박터 박테리아로부터 유래되고, N 말단에서의 제 1 의 5 아미노산 서열은 각각 ATEPV 인 것을 특징으로 하는 제조 방법. - 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 발효에 사용되는 발효 매질은 하기를 함유하고: 사탕수수당 5-80 g/L, 펩톤 5-50 g/L, KH2PO4 0.4-4 g/L, CaCl2 0.5-5 g/L, MnSO4 0.1-2 g/L, (pH 6-8 임);
바람직하게는, 발효 조건은 하기와 같고: 25~40 ℃, 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 환기 장치를 갖는 발효 탱크에서 교반함, 6~48 시간 동안 발효시키는 동안 속도 및 환기 성능은 1~6 vvm, 10~400 rpm 임;
또한 바람직하게는, 발효 매질은 사탕수수당 15 g/L, 펩톤 25 g/L, KH2PO4 2 g/L, CaCl2 2 g/L, MnSO4 0.2 g/L, (pH 7.5 임) 을 함유하고; 발효 조건은 하기와 같이 추가로 최적화되고: 30 ℃, 240 rpm 에서 16 시간 동안 진탕 플라스크에서 진동시키거나 환기 장치를 갖는 발효 탱크에서 교반함, 6 시간 동안 발효시키는 동안 속도 및 환기 성능은 4 vvm, 300 rpm 임을 특징으로 하는 제조 방법. - 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재된 생물전환 반응이 수성상 또는 비수성상에서 일어나고;
바람직하게는, 상기 기재된 수성상 전환 조건은 하기를 포함하고: 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 발효 탱크에서 교반함, 푸에라린 농도는 0.1 g/L 초과 내지 포화까지이고, 글라이코실 공여체는 프룩토오스 또는 사탕수수당 또는 이 둘의 혼합물이고, 푸에라린 및 글라이코실 공여체는 1: 1~1: 200 의 몰비이고, 반응계의 10%~50% 를 차지하는 발효액 또는 발효 상청액 (프룩토실화 효소 10-100 U/mL 를 함유함) 을 6~96 시간 동안 25~40 ℃ 의 전환 온도에서 pH 4~8 을 갖는 임의의 버퍼 용액에서의 반응을 위해 첨가되고; 바람직한 조건은 하기와 같고: 10 g/L 푸에라린 및 글라이코실 공여체로서 100 g/L 사탕수수당, 20 % 발효 상청액 (프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유함) 은 30 ℃ 및 300 rpm 에서 12 시간 동안 교반 전환을 위해 pH 6.86 에서의 1/15mol/L 포스페이트 버퍼를 갖는 5L 발효 탱크에 첨가하고;
바람직하게는, 기재된 비수성상 전환 조건은 하기를 포함하고: 진탕 플라스크에서 10~400 rpm 으로 진동시키거나 발효 탱크에서 교반함, DMSO, DMF, 아세토니트릴, 메탄올 및 아세톤 또는 에탄올로부터 선택되는 하나 또는 복수개의 5~50 % 친수성 유기 용매, 5~200 g/L 에서의 푸에라린 농도, 바람직하게는 5~120 g/L 에서의 푸에라린 농도, 글라이코실 공여체는 프룩토오스 또는 사탕수수당 또는 이 둘의 혼합물이고, 1: 1~1: 200 로서의 푸에라린 및 글라이코실 공여체 몰비, 10%-50% 발효액 또는 발효 상청액 (프룩토코실라아제 10-100 U/mL 를 함유함) 은 6~96 시간 동안 25~40 ℃ 의 전환 온도에서 pH 4~8 을 갖는 임의의 버퍼 용액에서의 반응을 위해 첨가되고; 바람직한 조건은 하기와 같고: 20% DMSO, 107.5 g/L 푸에라린 및 글라이코실 공여체로서 350 g/L 사탕수수당을 선택함, 20 % 발효 상청액 (프룩토실화 효소 30 U/mL 를 함유함) 을 30 ℃ 및 300 rpm 에서 72 시간 동안 교반 전환을 위해 pH 6.86 에서의 1/15mol/L 포스페이트 버퍼를 갖는 5L 발효 탱크에 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조 방법. - 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재된 수지 정제는 AB-8 거대기공성 수지를 사용하여 프룩토실화 푸에라린을 함유하는 전환된 액체를 흡수하는 것이고, 대안적으로 비수성상 전환의 경우에 있어서, 전환된 액체에서의 유기 용매를 저온 증발에 의해 제거하거나 유기 용매를 2 % 의 부피비 미만으로 희석시킨 후 흡수를 실시하고; 흡수 후 잔여 글라이코실 공여체를 용리액으로 우선 제거하고 이후 수득된 프룩토실화 푸에라린을 용리액을 사용하는 구배 또는 상에 의해 용리시키고;
바람직하게는 잔여 글라이코실 공여체를 10 배 컬럼층 부피, pH 4~4.5 에서 증류수로 용리시키고, 이후 구배 또는 상 용리를 5~30 % 메탄올 또는 에탄올 용액으로 수행하여 각각 프룩토실화 푸에라린을 수득하는 것을 특징으로 하는 제조 방법. - 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재된 방법은 또한 용리액을 사용하여 용리하고 잔여 푸에라린을 회수하는 것과 관련되고;
바람직하게는, 100 % 메탄올 또는 에탄올이 용리하고 잔여 푸에라린을 회수하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법. - 심장-뇌 혈관 관련 질환 및/또는 종양 관련 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하는 경우에서의 제 1 항에 따른 프룩토실화 푸에라린의 적용.
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