CZ20032426A3

CZ20032426A3 - Deriváty caloporosidu, léčiva s jejich obsahem, způsob přípravy těchto látek pomocí mikroorganismu a tento mikroorganismus

Info

Publication number: CZ20032426A3
Application number: CZ20032426A
Authority: CZ
Inventors: Claudia Eder; Michael Kurz; Mark BRÖNSTRUP; Luigi Toti
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-23
Publication date: 2003-12-17
Also published as: NZ528070A; EE05184B1; MY127289A; NO20033965D0; KR20030084973A; RU2003129888A; BR0207953A; YU67203A; EE200300433A; RS50275B; MEP56208A; HRP20030712B1; IL157793A; BG108151A; NO20033965L; DE50203198D1; MXPA03007550A; PT1372670E; PL363320A1; EP1372670A1

Description

Deriváty caloporosidu, léčiva s jejich obsahem, způsob přípravy těchto látek pomocí mikroorganismu a tento mikroorganismus

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových účinných látek (derivátů caloporosidu), které jsou tvořeny během fermentace pomocí mikroorganismu Gleoporus dichrous Bres. ST001714, DSM 13784, způsob jejich přípravy, jejich použití jako léčiv, léčiva s obsahem derivátů caloporosidu, a rovněž mikroorganismus Gleoporus dichrous Bres. ST001714, DSM 13784.

Dosavadní stav techniky

Caloporosid byl poprvé popsán v roce 1994 jako inhibitor fosfolipázy C (W. Weber a kol., J. Antibiotics, 47, 1188 až

1194). Ve stejném roce byly izolovány dva další podobné sekundární metabolity (R. Shan a kol., Nat. Prod. Lett., 4, 171 až 178). Sloučeniny obecného vzorce I (níže) podle předkládaného vynálezu se od těchto popsaných látek liší svojí strukturou.

Rakovina je většinou smrtelně probíhající onemocnění člověka a zvířat, které je zapříčiněno nekontrolovaným růstem tělu vlastních buněk. Rakovina je označení pro tvorbu zhoubných nádorů (malignomů), neoplasmat (nádorů, respektive karcinomů) nebo pro maligní zvrhnutí, jakož i poruchy zrání bílých krvinek (leukémii, rakovinu krve). Rakovinné nebo nádorové buňky vznikají přeměnou buněk tělu vlastních. Zhoubnost rakovinné buňky se vyznačuje autonomií růstu, tj . schopností infiltrovatelně, nespoutané a bez začlenění do stavebního plánu orgánu růst za porušování tkání. Jistým příznakem malignity je tvorba nádoru vzdálených kolonií (metastáz) hematogenním nebo lymfogenním rozšířením nádorových buněk. Rakovina patří k nejčastějším příčinám úmrtí lidí, a proto existuje velká potřeba způsobů a prostředků k léčení či ·

I 44

4 « «4

4 «

4 4

I 4»

4444 ošetřování maligních zvrhnutí.

Možnosti terapie maligních nádorů zahrnuje kromě, pokud možno radikálních, operativních odstranění nádorů, radiologickou terapii rentgenovými paprsky, paprsky α, β, γ, imunoterapii a chemoterapii. Imunoterapie je v současné době použitelná pouze v omezené míře. Pod chemoterapií nádorů se rozumí podávání buněčných jedů (cytostatik) k ošetřování nádorů a nádorových buněk zbylých po lokálním chirurgickém ošetření nebo ozáření. Tyto látky specificky zasahují určité procesy buněčného dělení, takže tkáně s vysokým podílem dělících se buněk, jako je rychle rostoucí nádorová tkáň, reagují citlivěji. Použít lze alkylované sloučeniny, jako např. cyklofosfamid (The Merck Index, 12. vydání, str. 463), antimetabolity, jako methotrexát (The Merck Index, 12. vydání, str. 1025), alkaloidy, jako vincristin (The Merck Index, 12. vydání, str. 1704) a antibiotika, jako daunomycin (The Merck Index, 12. vydání, str. 479), jakož i adriamycin (The Merck Index, 12. vydání, str. 581 až 582). Všechna tato činidla však mají kvůli masivním vedlejším účinkům velkou nevýhodu, takže smrt pacientů je pouze oddalována, avšak nikoli odvrácena. Kromě toho se u zvrhlých (rakovinných) buněk vyskytuje resistence vůči použitému prostředku. Pak současná léčiva již nepůsobí cytostaticky, avšak díky vedlejším účinkům toxicky. Navíc se ukázalo, že účinnost kombinovaného, respektive postupného, použití cytostatik je vyšší než u jediného cytostatika (monoterapie), a je proto možné, že se významné vedlejší účinky při polychemoterapii nesčítají. Z těchto všech důvodů jsou nová chemoterapeutika nutně potřebná, a proto celosvětově hledána.

Cyklin-dependentní kinázy (CDK = kinázy závislé na cyklinu) hrají ústřední roli při regulaci buněčného cyklu. Katalyzují fosforylační reakce a uvádějí tak do chodu reakční kaskádu, která v buněčném cyklu podněcuje přechod z Gl fáze (růstová fáze 1) do S fáze (syntetická fáze). Cyklin- 3

ΦΦ φφ φ* φφφφ φ φ φ φφ φ φ φ φ φ φφφ · φφφφ φ φ φφ φ· φφ ·· φφφφ · φ · φ φ •ΦΦΦΦ φ φ φ φφφφ φφ φφφφ dependentní kinázy proto představují dobrý terapeutický cíl pro ošetřování rakoviny a jiných onemocnění s patologickou poruchou buněčné proliferace. Užitečnými léčivy pro ošetřování pacientů s rakovinou by byly nízkomolekulární inhibitory regulující buněčný cyklus a zabraňující nekontrolovanému buněčnému dělení.

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST dokáže produkovat vysoce účinná nová inhibují cyklin-dependentní kinázy koncentracích.

kmen mikroorganismu

001714, DSM 13784, cytostatika, která ve velmi nízkých

Podstatou vynálezu proto caloporosidu) produkované kmenem Bres. ST 001714, DSM 13784, přijatelné soli, estery a zřejmé jsou účinné látky (deriváty Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) jakož i jejich fyziologicky chemické ekvivalenty.

Předkládaný vynález se v souladu s tím týká sloučenin obecného vzorce I

ve kterém

Ri, R₂ a R₃ nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo acylovou skupinu obsahující 2 až 10 uhlíkových atomů, výhodně 2 až 6 atomů, obzvláště 2 atomy; a »9 ·♦*· «· ♦* <» 4 9 9 • 9 44

4 4 4 • 4 4 4

4· ··

4*44 4 · ·

4*44 44 t

4 4« 444 4 4

4 4 4 * 4 4 «4 44 44

R₄ znamená atom vodíku nebo skupinu -C(0) (CH₂)_nCOOH, kde n znamená 1 až 7, výhodně 1 až 3, obzvláště výhodně 1 nebo 2;

s tou výhradou, že Ri, R₂, R3 a R₄ neznamenají všechny atom vodíku;

jakož i jejich fyziologicky přijatelných solí.

Acylové skupiny sloučenin obecného vzorce I mohou být přímé nebo rozvětvené, nasycené nebo jednou či dvakrát nenasycené.

Acylovou skupinou obsahující 2 uhlíkové atomy se míní například acetylová skupina.

Příklady nasycených nerozvětvených acylových skupin jsou zbytky kyseliny octové (C = 2), kyseliny propionové (C = 3), kyseliny máselné (C = 4), kyseliny valerové (C = 5), kyseliny kapronové (C = 6), kyseliny enantové (C = 7), kyseliny kaprylové (C = 8), kyseliny pelargonové (C = 9) a kyseliny kaprinové (C = 10).

Příklady jednou nenasycených nerozvětvených acylových skupiny jsou zbytky kyseliny akrylové (C = 3), kyseliny krotonové (C = 4) nebo kyseliny vinyloctové (C = 4).

Příkladem dvojnásobně nenasycené nerozvětvené acylové skupiny je zbytek kyseliny sorbové (C = 6).

Caloporosidy jsou slabě účinná antibiotika, které sestávají z kyseliny salicylové a disacharidu. Obě strukturní jednotky jsou svázány prostřednictvím alkylového řetězce. Cukernou částí sloučeniny obecného vzorce může být disacharid • · • · sestávající vždy z D-pyranózy aldohexózy (jako např. D-glukopyranózy nebo D-galaktopyranózy) a -onové kyseliny aldohexózy (např. kyseliny D-glukonové). Výhodnou cukernou částí je kyselina D-mannopyranosyl-D-mannonová, která je nesubstituovaná nebo je substituovaná substituenty R₂, R3 nebo/a R₄, jak jsou definovány výše.

Vynález se dále týká

a) sloučeninu obecného vzorce I, ve kterém Ri znamená acetylovou skupinu; R₂ = R₃ - R₄ = atom vodíku (= caloporosid B: sumární vzorec: C₃₈H ₆20i6, molekulová hmotnost 774,9), jakož i její fyziologicky přijatelné soli;

b) sloučeninu obecného vzorce I, ve kterém R_x = R₃ = acetylová skupina; R₂ = atom vodíku; R₄ = malonylová skupina (= caloporosid C: sumární vzorec: C₄₃H₆60₂o, molekulová hmotnost 902,99), jakož i její fyziologicky přijatelné soli;

c) sloučeninu obecného vzorce I, ve kterém Ri = R₂ = atom vodíku; R₃ = acetylová skupina; R₄ = malonylová skupina (= caloporosid D: sumární vzorec: Ο₄ιΗ6₄Ο_Χ9, molekulová hmotnost 806,96), jakož i její fyziologicky přijatelné soli;

d) sloučeninu obecného vzorce I, ve kterém Ri = R₃ = atom vodíku; R₂ = acetylová skupina; R₄ = malonylová skupina (= caloporosid E: sumární vzorec: C₄iH6₄0i₉, molekulová hmotnost 806,96), jakož i její fyziologicky přijatelné soli;

e) sloučeninu obecného vzorce I, ve kterém R_x = R₂ = R₄ = atom vodíku; R₃ = acetylová skupina (= caloporosid F: sumární vzorec: C₃₈H₆₂0i6, molekulová hmotnost 774,9), jakož i její fyziologicky přijatelné soli.

Centra chirality mohou být ve sloučeninách obecného vzorce I, pokud není uvedeno jinak, v konfiguraci R- nebo S-. Vynález se týká jak opticky čistých sloučenin, tak směsí stereoisomerů, jako směsí enanciomerů a směsí diastereomerů.

Sloučeniny obecného vzorce I lze podle vynálezu získat fermentací pomocí mikroorganismu Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, nebo jednou z jeho variant či mutací za vhodných podmínek v kultivačním mediu, dokud se v kultivačním mediu nehromadí jeden či více derivátů caloporosidu obecného vzorce I. Následnou izolací sloučenin a případně konverzí na chemické ekvivalenty, jakož i jejich fyziologicky přijatelné soli, se získají deriváty caloporosidu.

Předkládaný vynález se v souladu s tím dále týká způsobu přípravy sloučeniny obecného vzorce I, který se vyznačuje tím, že se fermentuje mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, nebo jedna z jeho variant či mutací za vhodných podmínek v kultivačním mediu, dokud se v kultivačním mediu nehromadí jedna nebo více cílových sloučenin a následně se sloučeniny izolují a popřípadě se převedou na chemické ekvivalenty nebo/a fyziologicky přijatelné soli.

Výhodně se kmen ST 001714, DSM 13784, jeho mutace nebo/a varianty fermentuje v živném roztoku nebo pevném mediu (označovaném též jako kultivační medium) se zdroji uhlíku a dusíku, jakož i obvyklými anorganickými solemi, dokud se mediu nehromadí sloučeniny podle vynálezu, sloučeniny izolují z kultivačního media a v kultivačním následně se popřípadě se rozdělí na jednotlivé aktivní složky.

Způsob podle vynálezu lze použít pro fermentaci v laboratorním měřítku (v rozsahu mililitrů až litrů) a v průmyslovém měřítku (v měřítku krychlových metrů).

· · · · 99 9 • 9 · · · · 9 999

9 9 9 9 9 « •9 99 99 99

Kmen Gloeoporus dichrous (Fr.cFr.) Bres. ST 001714 byl rozmnožen v předkultuře. Izolát byl uložen dne 14. prosince 1999 za podmínek budapešťské smlouvy u Deutsche Sammlung von Mikroorganismen u Zellkulturen GmbH (Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur), Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig, Německo, pod číslem DSM 13784.

Mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784 má bílé mycelium a purpurově zbarvené spory. Vyskytuje se na organismu Betula, může však napadat také jiné hostitele, například Alnus, Salix, Populus, Ulmus, Prunus.

Namísto kmene Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, lze rovněž použít jeho mutace a varianty, které syntetizují jednu či více sloučenin podle vynálezu. Tyto mutace lze vytvářet způsoby o sobě známými, pomocí fyzikálních prostředků, například ozařování, jako například pomocí ultrafialového či rentgenového záření, nebo chemických mutagenů, jako je například ethylmethansulfonát (EMS); 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon (MOD) nebo N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG).

Vyhledávání mutací a variant, které syntetizují sloučeniny podle vynálezu, probíhá dle následujícího schématu:

lyofilizace deskových kultur;

extrakce lyofilizátů organickým rozpouštědlem;

extrakce sloučeniny z kultivačního filtrátu s pevnými fázemi;

analýza pomocí HPLC, DC nebo pomocí testů biologické účinnosti.

Níže popisované podmínky fermentace platí pro mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, uložený izolát DSM 13784, jakož i jeho mutace a varianty.

V živném roztoku, který obsahuje zdroj uhlíku a zdroj dusíku, jakož i obvyklé anorganické soli, produkuje mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, deriváty caloporosidu.

Jako výhodné zdroje uhlíku jsou pro fermentaci vhodné asimilovatelné uhlovodany a cukerné alkoholy, jako je glukóza, laktóza, sacharóza či D-mannitol, jakož i přirozené produkty obsahující uhlovodany, jako je například sladový výtažek. Jako živiny obsahující dusík přicházejí v úvahu: aminokyseliny, peptidy a proteiny, jakož i jejich degradační produkty, jako jsou kasein, peptony či tryptony, dále masové extrakty, mletá semena, například kukuřice, nebo bavlníku, destilační rezidua z produkce alkoholu, masné moučky nebo kvasnicové extrakty, rovněž však ammoniové soli a nitráty, zejména však také synteticky, respektive biosynteticky, získané peptidy. Anorganickými solemi, které může živný roztok obsahovat, jsou například chloridy, uhličitany, sírany nebo fosforečnany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, železa, zinku, kobaltu a manganu.

kvasnicové extrakty, pšenice, bobů, sojy

Tvorby sloučenin podle vynálezu probíhá obzvláště dobře v živném roztoku, který obsahuje přibližně 0,05 až 5 %, výhodně 1 až 2 % sladového výtažku, 0,05 až 3 %, výhodně 0,05 až 1 % kvasnicového extraktu a 0,2 až 5 %, výhodně 0,5 až 2 % glukózy, 0,5 až 3 %, výhodně 0,5 až 3 % práškové celulózy a stopy síranu amonného. Údaje v procentech jsou vždy vztaženy ke hmotnosti celého živného roztoku.

V tomto živném roztoku mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, vytváří směs derivátů caloporosidu. Podle složení živného roztoku se může kvantitativní podíl jednoho či více derivátů caloporosidu podle vynálezu liší. Kromě toho se může pomocí složení media řídit syntézu jednotlivých derivátů caloporosidu, takže jeden • · • · · · · · · ····· · • · · ·· · · · · derivát caloporosidu není mikroorganismem vytvářen vůbec, respektive je vytvářen v množství pod hranicí detekovatelnosti.

Kultivace mikroorganismu probíhá aerobně, tj . například ponořená za protřepávání nebo míchání v protřepávacích baňkách či fermenterech, popřípadě za zavádění vzduchu nebo kyslíku, nebo na pevném mediu. Lze ji provádět v teplotním rozmezí přibližně od 18 do 35 °C, výhodně přibližně při 20 až 30 °C, zejména při 25 až 30 °C. Hodnota pH by se měla pohybovat mezi 5 a 8, výhodně mezi 5,5 a 6,5. Mikroorganismus se za těchto podmínek obecně kultivuje po dobu pohybující se od 24 do 720 hodin, výhodně 288 až 576 hodin.

Kultivace se výhodně provádí v několika stupních, tj. z počátku se v kapalném živném mediu vytvoří jedna či více předkultur, ty se poté přeočkují do vlastního produkčního media, tj. hlavní kultivace, například v objemovém poměru 1:10. Předkultura se například získá přeočkováním mycelia do živného roztoku a jeho ponecháním růst po dobu přibližně 36 až 120 hodin, výhodně 48 až 72 hodin. Mycelium lze například získat ponecháním kmene růst po dobu 3 až 40 dní, výhodně 10 až 30 dní, na pevné či kapalné živné půdě, například sladokvasnicovém agaru nebo bramborodextrózovém agaru.

Průběh fermentace lze sledovat podle hodnot pH kultury nebo objemu mycelia, jakož i pomocí chromatografických metod, jako je např. kapalinová chromatografie s vysokou rozlišovací schopností (HPLC), nebo testováním biologické aktivity.

Níže popisovaný způsob izolace slouží k vyčištění derivátů caloporosidu podle vynálezu.

Izolace, respektive vynálezu z kultivačního s ohledem na chemické, čištění, derivátu caloporosidu podle media se provádí známými způsoby fyzikální a biologické vlastnosti • · ·· přirozené látky. K testování koncentrace příslušného derivátu caloporosidu v kultivačním mediu nebo v jednotlivých stupních izolace lze použít HPLC, přičemž se množství vytvořené látky vhodně porovnává s kalibračním roztokem.

K izolaci sloučenin podle vynálezu se kultivační bujón nebo kultura s pevným mediem lyofilizuje, následně se deriváty caloporosidu mísitelným, rozpouštědla extrahuj i organickým obsahuje z lyofilizátu rozpouštědlem, přirozené látky popřípadě se koncentruje ve vakuu a dále čistí.

vhodným, s vodou Fáze organického podle vynálezu,

Další čištění jedné nebo více sloučenin podle vynálezu se provádí pomocí chromatografie na vhodných materiálech, výhodně např. na molekulových sítech, na silikagelu, oxidu hlinitého, iontoměničích nebo adsorbčních pryskyřicích, respektive na reverzních fázích (RP). S pomocí této chromatografie se deriváty caloporosidu rozdělí. Chromatografie derivátů caloporosidu probíhá s pufrovanými vodnými roztoky nebo směsí vodných a organických roztoků.

Směsmi vodných nebo organických roztoků se rozumí všechna s vodou mísitelná rozpouštědla, výhodně methanol, propanol a acetonitril, v koncentraci 5 až 80 % rozpouštědla, výhodně 20 až 50 % rozpouštědla nebo též všechny pufrované vodné roztoky, které jsou mísitelné s organickými rozpouštědly.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou vyskytovat jak v myceliu, tak v kultivačním filtrátu, avšak hlavní množství se obvykle nachází v biomase (myceliu). Proto je vhodné separovat posledně jmenované od předešle jmenovaného pomocí filtrace nebo odstřeďování. Filtrát se extrahuje rozpouštědlem nemísícím se s vodou, jako je 1-butanol, ethylacetát, chloroform či podobně. Mycelium se vhodně extrahuje methanolem nebo acetonem, avšak lze také použít výše uvedená rozpouštědla •4 ·· ·· • · · · · · · · ·· 44·· 4··· 44 4 η 4 44 444 4 44444 4 ~~ 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4 nemísící se s vodou. Použitelnými pufry jsou stejné pufry, jako jsou uvedeny výše.

Rozdělení derivátů caloporosidu na základě jejich rozdílné polarity se provádí pomocí chromatografie s reverzní fází, například na MCI® (adsorbční pryskyřice od Mitsubishi, Japonsko) nebo Amberlite XAD® (TOSOHAAS), na dalších hydrofobních materiálech, jako např. na fázích RP-8 či RP-18. Kromě toho lze rozdělení provádět pomocí chromatografie s normální fází, například na silikagelu, oxidu hlinitém apod.

Chromatografie derivátů caloporosidu se provádí pomocí pufrovaných nebo okyselených vodných roztoků nebo směsí vodných roztoků s alkoholy či jinými, s vodou mísitelnými, organickými rozpouštědly. Jako organická rozpouštědla se výhodně používají propanol a acetonitril.

Pufrovanými nebo okyselenými vodnými roztoky se rozumí např. voda, fosfátový pufr, ammoniumacetát, citrátový pufr v koncentraci od 0 do 0,5M, jakož i kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina trifluoroctová nebo všechny obchodně dostupné, odborníkovi známé kyseliny, výhodně v koncentraci od 0 do 1 %. Jako pufrovaný vodný roztok je obzvláště výhodný 0,1% ammoniumacetát.

Chromatografie probíhá s gradientem, který začíná 100 % vody a končí 100 % rozpouštědla, výhodný je lineární gradient od 20 do 100 % propanolu nebo acetonitrilu.

Alternativně lze provádět též gelovou chromatografií nebo chromatografií na hydrofobních fázích.

Gelová chromatografie se provádí na polyakrylamidových nebo směsných polymerních gelech, jako např. Biogel-P 2® (Biorad) nebo Fractogel TSK HW 40® (Merck, Německo, nebo Toso Haas, USA).

• · · • ·· · ··

Pořadí výše uvedených chromatografií je zaměnitelné.

Sloučeniny podle vynálezu jsou v pevném stavu a v roztocích o hodnotách pH mezi 3 a 8, obzvláště 5 a 7, stabilní a lze je proto zpracovat do podoby běžných galenických přípravků.

Jedna či více sloučenin ze sloučenin podle vynálezu je vhodná, díky svým cenným farmakologickým vlastnostem, pro použití v lidském či veterinárním lékařství jako léčivo.

Předkládaný vynález se tak týká použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelné soli k přípravě cytostatika k ošetřování nádorových onemocnění.

Předkládaný vynález se dále týká všech zřejmých chemických ekvivalentů sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu. Těmito ekvivalenty jsou sloučeniny, které vykazují nepatrný chemický rozdíl, tedy mají stejné účinky nebo se za mírných podmínek přeměňují na sloučeniny podle vynálezu. K uvedeným ekvivalentům patří např. také soli, redukční produkty, estery, ethery, acetaly nebo amidy sloučenin podle vynálezu, jakož i ekvivalenty, které může odborník připravit standardními způsoby, kromě toho všechny optické antipody, diastereomery a všechny stereomerní formy.

Fyziologicky přijatelnými solemi sloučenin obecného vzorce I se míní jak organické, tak anorganické soli, jak jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydání, str. 1418 (1985)). Díky fyzikální a chemické stabilitě a rozpustnosti jsou u kyselých skupin výhodné, mimo jiné, sodné, draselné, vápenaté a amonné soli; u bazických skupin jsou výhodné, mimo jiné, soli kyseliny chlorovodíkové, kyseliny sírové, kyseliny fosforečné nebo karboxylových kyselin či sulfonových kyselin, jako např. kyseliny octové, kyseliny ·

·♦· 9 · citrónové, kyseliny benzoové, kyseliny maleinové, kyseliny fumarové, kyseliny vinné a kyseliny p-toluensulfonové.

Estery, ethery a acetaly lze připravit způsoby popsanými v literatuře, např. v Advanced Organic Synthesis, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons, 1992 nebo Protective Groups in Organic Synthesis, 3. vydání, T. W. Greene & P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, 1999.

Karboxylovou skupinu lze redukovat na alkohol například pomocí LíA1H₄.

Ze sloučenin obecného vzorce I lze především odštěpit glykosidovou část pomocí alkalické hydrolýzy (W. Weber a kol., J. Antibiotics, 47, 1188 až 1194). Následně lze pomocí glykosylace (např. Kónigs-Knorrova reakce) zavést libovolný cukerný zbytek. Příslušné metody jsou popsány v literatuře, např. v Carbohydrate Chemistry, J. F. Kennedy, Oxford University Press, 1988.

Mechanismus účinku derivátů caloporosidu je neznámý, avšak významný účinek lze prokázat.

K průkazu inhibitorů CDK se používají testy, při nichž se stanovuje míra fosforylace specifického peptidového substrátu pomocí cyklin-dependentních kináz. Cyklin-dependentní kinázy se aktivují pomocí vazby na příslušný cyklin. [γ-Ρ]-fosfát se pomocí enzymu přenese z [γ-Ρ]-ATP na peptidový substrát. Test se provádí na devadesátišestijamkových mikrotitračních deskách. Stanovuje se radioaktivita [γ-Ρ]-fosfátů přenesených na substrát.

Hodnoty IC₅₀ pro deriváty caloporosidu udává tabulka 1; jsou to koncentrace, které inaktivují CDK-4 na 50 %.

«· ·*· · ·· ·« ·· ·· «··· · · · · · · · • · «· · · · * · · 9 • · · · « · « ··· · · · · » · · · ·· · · · · · • · ·· ·· · · ·· * ·

Tabulka 1

caloporosid B	1,5 μπιοί
caloporosid C	3,1 μπιοί
caloporosid D	1,8 μπιοί
caloporosid E	1,8 μπιοί
caloporosid F	1,5 μπιοί

Předkládaný vynález se dále týká léčiva s obsahem alespoň jedné sloučeniny podle vynálezu.

Jednu či více sloučenin z derivátů caloporosidu podle vynálezu lze v zásadě podávat jako takové. Výhodné je použití ve směsi s vhodnými pomocnými látkami či nosnými materiály. Jako nosný materiál lze u léčiv použít běžné a farmakologicky přijatelné nosné materiály nebo/a pomocné látky.

Léčiva podle vynálezu lze obecně podávat orálně či parenterálně, avšak rektální aplikace je v zásadě též možná. Vhodnými pevnými či kapalnými galenickými přípravky jsou například granulát, prášek, tablety, dražé, (mikro)kapsle, čípky, sirup, emulze, suspenze, aerosol, kapky nebo injikovatelné roztoky v podobě ampule, jakož i preparáty s protrahovaným uvolňováním účinné látky, při jejichž přípravě nacházejí využití běžné nosné látky a přísady nebo/a pomocné látky, jako jsou bubřidlo, pojivo, potahové činidlo, bobtnací činidlo, glidant nebo lubrikant, ochucovadla, sladidlo nebo solubilizační činidlo. Jako často používané nosné nebo pomocné látky lze jmenovat například uhličitan hořečnatý, oxid titaničitý, laktózu, mannitol a další cukry, talek, mléčný protein, želatina, škroby, vitaminy, celulóza a její deriváty, živočišné a rostlinné oleje, polyethylenglykol a rozpouštědla, jako sterilní voda, alkoholy, glycerin a vícesytné alkoholy.

Popřípadě mohou být dávkové jednotky pro orální podávání mikroenkapsulovány k oddálení nebo prodloužení uvolňování po ·· ···· • C »9 ·· ·· • · · 9 9 99 9

9 9 · 9 9· · • 99 999 9 999

9 9 9 9 9 9

99 99 99

99 delší období, jako například potažením nebo vložením účinné látky v podobě částic do vhodného polymeru, vosku apod.

Výhodně se farmaceutické preparáty připravují a podávají v podobě dávkových jednotek, přičemž každá jednotka obsahuje jako účinnou složku určitou dávku jedné či více sloučenin z derivátů caloporosidu podle vynálezu. Při použití pevných dávkových forem, jako jsou tablety, kapsle a čípky, může tato dávka činit až přibližně 500 mg, výhodně však přibližně 0,1 až 200 mg, a u injekčních roztoků v podobě ampulí až přibližně 200 mg, výhodně však přibližně 0,5 až 100 mg, na den.

Podávané denní dávky závisejí na tělesné hmotnosti, stáří, pohlaví a stavu savce. Podle podmínek lze však použít též vyšší či nižší denní dávky. Podávání denní dávky lze provádět prostřednictvím jednoho podání v podobě jediné dávkové jednotky nebo více menších dávkových jednotek, avšak též prostřednictvím vícenásobného podání rozdělených dávek v určitých intervalech.

Léčiva podle vynálezu lze připravovat tak, že se jedna či více sloučenin podle vynálezu s běžnými nosnými látkami, jakož i popřípadě přísadami nebo/a pomocnými látkami, vpraví do vhodné dávkové formy.

Následující příklady provedení vynálezu mají sloužit pro další dokreslení předkládaného vynálezu. Procentuální údaje se vztahují ke hmotnosti. Směsné poměry u kapalin se vztahují k objemu, pokud není uvedeno jinak.

• 999 • 9 99 99 ·· ·· • 9 9 · 9999 99

9999 9 9 9 9 ·· • ·· 9 9 9 9 999 9 9 9 9 • 999 99 9 99··

99 ·· 99 99 99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava glycerinové kultury Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784

100 ml živného roztoku (sladový výtažek 2,0 %, kvasnicový extrakt 0,2 %, glukóza 1,0 %, (NH₄)₂HPO₄ 0, 05 %, pH 6,0) ve sterilní Erlenmeyerově baňce o objemu 300 ml se naočkuje kmenem Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784 a inkubuje se při 25 °C a 140 rpm (otáčkách za minutu) na rotační třepačce po dobu 7 dní. Následně se 1,5 ml této kultury zředí 2,5 ml 80% glycerinu a uchovává při -135 °C.

Příklad 2

Příprava předkultury Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784 v Erlenmeyerově baňce ml živného roztoku (sladový výtažek 2,0 %, kvasnicový extrakt 0,2 %, glukóza 1,0 %, (NH₄)₂HPO₄ 0,05 %, pH 6,0) ve sterilní Erlenmeyerově baňce o objemu 100 ml se naočkuje kmenem Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784 a inkubuje se při 25 °C a 140 rpm (otáčkách za minutu) na rotační třepačce po dobu 4 dní. Právě 2 ml této předkultury se následně naočkují desky při přípravě hlavní kultury.

Příklad 3

Příprava hlavní kultury Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784 na deskách s pevným mediem

Sterilní desky o rozměrech 25 x 25 cm (Nunc) se zalijí 200 ml následujícího živného roztoku: 20 g/1 sladového výtažku, 2 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 glukózy a 0,5 g/1

99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • « · 9 ♦ W · 9 9 9 9 • 9 · · * · · 999 999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 99 (ΝΗ₄)₂ΗΡΟ₄, pH 6,0. Tyto desky se vždy naočkují 2 ml předkultury. Maximální produkce jedné nebo více sloučenin podle vynálezu se dosáhne přibližně po 480 hodinách.

Příklad 4

Produkce derivátů caloporosidu

Připraví se 50 kusů desek o rozměrech 25 x 25 cm a naočkují se předkulturou:

Živné medium:

g/1 sladového výtažku g/1 kvasnicového extraktu g/1 glukózy

0,5 g/1 (NH₄)₂HPO₄ pH 6,0 (před sterilizací)

Inkubační doba: 480 hodin

Inkubační teplota: 25 °C

Příklad 5

Izolace caloporosidové směsi z deskových kultivací Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784

Po dokončení

001714, fermentace DSM 13784

Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) se deskové kultivace získané 1 se

Bres. ST v příkladu methanolu.

lyofilizují a lyofilizát se extrahuje 5 Účinnou látku obsahující methanolový roztok filtrací zbaví rezidua a koncentruje ve vakuu. Koncentrát se zředí vodou a nanese se na připravený 1,01 sloupec MCI GEL, CHP20P. Eluce se provádí s gradientem od vody po 100% acetonitril. Průtok sloupcem (25 ml/min) se jímá po frakcích (každá 25 ml) a frakce obsahující deriváty

	- 18 - : • *	·· · «·· «9·· ♦ ·«· Φ * · · · · • · · < > A · · Φ ··· · Φ · 9 9 ΦΦ · ·
caloporosidu	(od 40%	do 100% acetonitrilu)	se shromažďují.
Koncentrací	ve vakuu	a následnou lyofilizací	se získá 8,5 g
žlutohnědého	prášku.
Příklad 6
Předběžné	dělení	derivátů caloporosidu	pomocí RP18

·· «··· chromatografie

0,5 g produktu získaného v příkladu 4 se nanese na sloupec Nucleosil® 100-7 C18 HD (velikost: 40 mm x 250 mm). Eluuje se gradientem od 20 % acetonitrilu (+ voda s 0,1% přídavkem ammoniumacetátu) po 100% acetonitril za rychlosti průtoku 35 ml/min. Výtok ze sloupce se jímá po frakcích (35 ml). Deriváty caloporosidu se převážně nacházejí ve frakcích 39 až 68. Shromažďují se, ve vakuu se odstraní rozpouštědlo a následně se lyofilizují. Přitom se získá caloporosid B (22,4 mg) a F (10,5 mg) již s čistotou > 95 %. Caloporosid C (frakce 41; 4 3,4 mg), D (frakce 43 až 45; 76,2 mg) a E (frakce 43 až 45; 76,2 mg) se získají s čistotou přibližně 70 %, a proto se ještě dále chromatograficky čistí.

Příklad 7

Čištění caloporosidu C, D a E mg v příkladu 5 izolovaného a upraveného caloporosidu C se nanese na sloupec LUNA® 5μ C18(2) (velikost: 10 mm x 250 mm) a chromatografuje se gradientem od 25 do 35 % acetonitrilu v 0,1% ammoniumacetát/voda. Rychlost průtoku elučního media činí 6,5 ml/min, velikost frakcí 6,5 ml. Ve frakcích 35 až 42 se nachází caloporosid C. Lyofilizací uvedených frakcí se získá caloporosid C (7,5 mg) s čistotou > 95 %.

mg v příkladu 5 izolované a upravené směsi caloporosidu D a E se nanese na sloupec LUNA® 5μ C18(2) (velikost: 10 mm x

4

44 444 444444 4 4

4444 44 4 4444

250 mm) a chromatografuje se gradientem od 30 do 40 % acetonitrilu v 0,1% ammoniumacetát/voda. Rychlost průtoku elučního media činí 6,5 ml/min, velikost frakcí 6,5 ml. Ve frakcích 18 a 19 se nachází caloporosid D, ve frakcích 20 až 21 caloporosid E. Lyofilizací uvedených frakcí se získá caloporosid D (7,0 mg) a caloporosid E (6,0 mg) s čistotou > 95 %.

Fyziálně-chemické, jakož i spektroskopické vlastnosti sloučenin podle vynálezu lze následovně shrnout:

caloporosid B:

Sumární vzorec: Molekulová hmotnost: UV maxima:

X- a ¹³C-NMR:

C38H62O16

774,9

208, 244, 310 viz tabulka 2

FAB hmotové spektrum s vysokou rozlišovací schopností ukazuje intenzívní MH⁺ při m/z 775,4120, v dobré shodě s vypočtenou hmotou (pro C3₈H 620i6, monoisotop) 775,4116.

caloporosid C:

Sumární vzorec: Molekulová hmotnost UV maxima:

X- a ¹³C-NMR:

C43H66O20

902,99

208, 244, 310 viz tabulka 3

FAB hmotové spektrum s vysokou rozlišovací schopností ukazuje intenzívní M+H⁺ při m/z 903,4264, v dobré shodě s vypočtenou hmotou (pro C₃₆H7iO25, monoisotop) 903, 4284.

	•« · Φ · ·	• · ·
	• · ·· · · _ 9 fi _ ······· ······ ·· ·· ··	0 · · • · · · · • · • · v
caloporosid D:
Sumární vzorec:	C41H64O19
Molekulová hmotnost	: 890,96
UV maxima:	208, 244, 310
a ¹³C-NMR:	viz tabulka 4
FAB hmotové	spektrum s vysokou rozlišovací schopností
ukazuje intenzívní	M+Na⁺ při m/z 883,3942, v dobré	shodě
s vypočtenou hmotou	(pro C4iH₆₄0i₉Na, monoisotop) 883, 3939.

caloporosid E:

Sumární vzorec: C41H64O19

Molekulová hmotnost: 890,96

UV maxima: ¹H- a ¹³C-NMR:	208, 244, 310 viz tabulka 4
FAB hmotové	spektrum s vysokou rozlišovací schopností
ukazuje intenzívní	M+Na⁺ při m/z 883,3942, v dobré shodě
s vypočtenou hmotou	(pro C4iH640i₉Na, monoisotop) 883, 3939.
caloporosid F:
Sumární vzorec:	C38H62O16
Molekulová hmotnost	: 774,9
UV maxima:	208, 244, 310
¹H- a ¹³C-NMR:	viz tabulka 5
FAB hmotové	spektrum s vysokou rozlišovací schopností
ukazuje intenzívní	M+H⁺ při m/z 775,4128, v dobré shodě
s vypočtenou hmotou	(pro C38H62O16, monoisotop) 775, 4116.

• · ·· • · ·

Tabulka 2 ¹H- a ¹³C-chemické posuny caloporosidu B v methanolu-d₄ a DMSO-dg při 300K


	DMSO	MeOD	DMSO	MeOD
1	-	-	171,24	a)
2	-	-	a)	a)
3	-	-	162,22	163,57
4	6, 68	6,77	115,28	116,81
5	7,17	7,25	-131,6	b
6	6,57	6,67	121,02	-123,0
7	-	-	137,90	139,57
8	a)	a)	a)	a)
9	a)	a)	a)	a)
10-20	1,30-1,20	1,32-1,27	29,01-28,69	30,76-30,47
21	1,30	1,38/1,32	24,81	26, 52
22	1,54/1,45	1,65/1,52	35, 31	37,00
23	4,81	4,95	70,04	73, 09
24	1,15	1,24	19, 69	20,22
1'	-	-	173,43	175,35
2'	3,95	4,13	70,89	72, 97
3'	3, 95	4,17	70, 04	71,59
4'	3,54	3, 82	67,96	69, 80
5'	3, 65	3, 86	78,94	80,12
6'	3,74/3,44	3,90/3,69	62,11	63, 25
1	4,53	4,71	100,27	101,34
2	3, 74	3, 95	70,37	72, 46
3	3, 22	3,44	73, 67	75,30
4	3,21	3,49	67,54	69, 00
5	3, 04	3,22	77,15	78,23
6	3,72/3,31	3,88/3,63	61, 80	63,25
Ac-C'	-	a)	-	a)
Ac-Me	a)	a}	a)	a)

a) Pro tyto protony/atomy uhlíku nebyl v MeOD, respektive DMSO, pozorován žádný signál (agregace) ♦· A · AA AA

A AAAA AA A

AA AAAA AAA

AAA A AAAAA A A

A Aa a AAAA

AA AA AA A»A

AAAA

Tabulka 3 ¹H- a ¹³C-chemické posuny caloporosidu C v methanolu-d₄ při 300K

	^ΧΗ	13_C
1	-	175,90
2	-	116,73
3	-	163,67
3-Ac-Me	a)	a)
3-Ac-C'	-	a)
4	6,73	116,73
5	7,16	-132,6 ^{a) b)}
6	6,55	123,53
7	-	139,51
8	2,49	43, 06
9	1,53	24,75
10-20	1,36-1,26	30,78-30,62
21	1,38/1,33	26,54
22	1,65/1,52	37,02
23	4,95	73,04
24 ·	1,24	20,22
1'	-	175,17
2'	4,17	72,82
3'	4,08	71, 60
4'	3,71	69, 79
5'	4,07	76, 38
6'	4,60/4,14	66, 43
7'	-	170,55
8'	3,27^(c	-44,8
9'	-	173,12
1	4,93	99, 40
2	5,33	73,40
3	3,72	73,40
4	3,42	69,34
5	3,34	78,19
6	3,89/3,62	63,11
2-Ac-Me	2,11	21, 17
2-Ac-C'	-	172,56

a) Pro tato jádra nebyl pozorován žádný signál (silné rozšíření signálu).

b) Rozšíření signálu • · ·»· ······ · · ·«· ·· * · · · ·

c) Signál pro protony v poloze 8' byl pozorován pouze v čerstvém roztoku (rychlejší výměna oproti deuteriu).

Tabulka 4 ¹H- a ¹³C-chemické posuny caloporosidu D a E v methanolu-d₄ při 300K

	caloporosid D	¹³c caloporosid D	³η caloporosid E	¹³c caloporosid E
1	-	-	176,28	176,28
2	-	-	120,37	120,37
3	-	-	162,12	162,12
4	6, 61	6, 61	114,91	114,91
5	7,06	7,06	131,53	131,53
6	6,58	6,58	122,23	122,23
7	-	-	147,22	147,22
8	3, 04	3, 04	36, 31	36, 31
9	1, 55	1, 55	33,35	33, 35
10-20	1,36-1,25	1,36-1,25	31,07-30,61	31,07-30,61
21	1,38/1,32	1,38/1,32	26,53	26, 53
22	1,65/1,53	1,65/1,53	37,01	37,01
23	4,95	4,95	73,13^a)	73, 07^a)
24	1, 24	1,24	20,23	20,23
1'	-	-	175,18	175,40
2'	4,17	4,15	72,80	72,80
3'	4,08	4,15	71,61	71,53
4'	3, 71	3, 85	69,78	69, 27
5'	4,07	4,08	76,40	77,07
6'	4,58/4,14	4,59/4,24	66,35	65, 43
7'	-	-	-170,4	-170,4
8'	3,28	3,28	-45, 0	-45,0
9'	-	-	-173,0	-173,0
1	4,93	4,84	99, 40	100,20
2	5,33	4,03	73,41	70,27
3	3,72	4,78	73,39	77,44
4	3,42	3,71	69, 32	66, 35
5	3,34	3,38	78,35	78,00
6	3,91/3,62	3,89/3,65	63, 09	62,96
2/3-Ac-Me	2,11	2,00	21,18	20, 98
2/3-Ac-C'	-	-	172,59	172,36

·· «· · · • · • · · · · • · • *

a) Tyto signály nebylo možné jednoznačně přiřadit.

Tabulka 5 ^XH- a ¹³C-chemické posuny caloporosidu F v methanolu-d₄ při 300K

	^XH	¹³c
1	-	174,95
2	-	117,32
3	-	162,18
4	6,68	115,42
5	7,17	133,17
6	6,67	122,65
7	-	146,91
8	2, 93	36, 57
9	1,56	33,27
10-20	1,36-1,25	30,93-30,62
21	1,35	26, 53
22	1,65/1,53	37,02
23	4,95	73, 05
24	1,24	20,23
1'	-	175,15
2'	4,17	72,98
3'	4,09	71,73
4'	3,71	69, 88
5'	3,85	79, 59
6'	3,90/3,61	63,57
1	4,88	99, 76
2	5, 37	73, 52
3	3,63	73,56
4	3,46	69,27
5	3,28	78,33
6	3, 91/3,63	63,06
Ac-C'	-	173,03
Ac-Me	2,13	21,21

• · 9 · · · 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 · · 9 9 9

Přiklad 8

Bioanalýza CDK-4 inhibitorů

Za účelem stanovení hodnot IC₅₀ byly z přirozených látek podle vynálezu připraveny zásobní roztoky o koncentraci 10 mmol. Na 384-jamkové desky FlashPlates bylo při pokojové teplotě během 2 hodin naneseno 50 μΐ (50 μg/jamka) biotinylovaného peptidového substrátu a následně byly 3x promyty PBS pufrem. Pro reakci bylo na desky napipetováno 30 μΐ pufrem zředěného roztoku derivátu caloporosidu a 20 μΐ předem namíchaného roztoku ATP/cyklinDl/CDK4 (konečná koncentrace: 1 μθί 33Ρ-γ-ΑΤΡ, 2 μπιοί ATP a 1 μς enzymové směsi) . Po 2 hodinách reakční doby při 37 °C byly desky 3x promyty 80 μΐ 3% kyseliny fosforečné a následně 30 sekund měřeny v počítači MicroBeta. Stanovení procentuální inhibice bylo provedeno za pomoci matematických rovnic. Pro stanovení hodnot IC₅₀ bylo testováno 10 koncentrací čerstvě zředěného DMSO roztoku sloučenin podle vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučeniny obecného vzorce I ve kterém

Ri, R₂ a R3 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo acylovou skupinu obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů; a

R₄ znamená atom vodíku nebo skupinu -C(O) (CH₂)_nCOOH, kde n znamená 1 až 7;

s tou výhradou, že Ri, R₂, R3 a R₄ neznamenají všechny atom vodíku;

jakož i jejich fyziologicky přijatelné soli.
2. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde

Ri, R₂ a R3 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo acetylovou skupinu; a

R₄ znamená atom vodíku nebo malonylovou skupinu, tj. n = 1;

jakož i její fyziologicky přijatelné soli.

• ··
3. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde

Ri znamená acetylovou skupinu; a

R₂, R₃ a R₄ znamenají atom vodíku;

jakož i její fyziologicky přijatelné soli.
4. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde

Ri a R₃ znamenají acetylovou skupinu;

R₂ znamená atom vodíku; a

R₄ znamená malonylovou skupinu;

jakož i její fyziologicky přijatelné soli.
5. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde

R_x a R₂ znamenají atom vodíku;

R₃ znamená acetylovou skupinu; a

R₄ znamená malonylovou skupinu;

jakož i její fyziologicky přijatelné soli.
6. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde

Ri a R₃ znamenají atom vodíku;

R₂ znamená acetylovou skupinu; a

R₄ znamená malonylovou skupinu;

• *

I·· jakož i její fyziologicky přijatelné soli.
7. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2, kde

Ri, R₂ a R₄ znamenají atom vodíku; a

R₃ znamená acetylovou skupinu;

jakož i její fyziologicky přijatelné soli.
8. Sloučenina obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl podle jednoho či více z nároků 1 až 7 připravitelná tak, že se fermentuje mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, respektive jedna z jeho variant či mutací, za vhodných podmínek, izoluje se jeden či více derivátů caloporosidu a popřípadě se tyto převedou na fyziologicky přijatelné soli.
9. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelné soli podle jednoho či více z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že se fermentuje mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, respektive jedna z jeho variant či mutací, za vhodných podmínek, izoluje se jeden či více derivátů caloporosidu a popřípadě se tyto převedou na fyziologicky přijatelné soli.
10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že se fermentace provádí za aerobních podmínek, při teplotě mezi 18 a 35 °C a při pH mezi 5 a 8.
11. Sloučenina obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl podle jednoho či více z nároků 1 až 8 pro použití jako léčivo.

4 · • * • •44 • 4. 4 4 4· • · 4 4 4 4 4 4 4 4

4 44 4 4 · 4 4 4 4 • 4 ·«« 4 4 4 4 4 · 4 · » 4 4 4 » 4 4444 «4 44 ·· ·· 4 · 4 4
12. Sloučenina obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl podle jednoho či více z nároků 1 až 8 pro použití jako inhibitor cyklin-dependentní kinázy.
13. Použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelné soli podle jednoho či více z nároků 1 až 8 pro přípravu léčiv k ošetřování rakoviny nebo jiných onemocnění s patologickou poruchou buněčné proliferace.

14. Léčivo vyznačuj i c i se tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl podle jednoho či více z nároků 1 až 8. 15. Způsob přípravy léčiva podle nároku 14 vy z n a č u - jící se tím, že se alespoň jedna sloučenina

obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl podle jednoho či více z nároků 1 až 8 s vhodnými pomocnými nebo/a nosnými látkami vpraví do formy vhodné k podávání.
16. Mikroorganismus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.)