KR20030084973A - 칼로포로사이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

칼로포로사이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효 동안에 미생물 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)에 의해 형성되는 신규한 활성 물질(칼로포로사이드 유도체)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 활성 물질의 제조방법, 의약으로서 이의 용도, 칼로포로사이드 유도체를 포함하는 의약 및 미생물 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784) 그 자체에 관한 것이다.

Description

칼로포로사이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Caloporoside derivatives, methods for the production thereof and their use}
본 발명은 발효 동안에 미생물 글로에오포러스 디크로우스 브레스.(Gloeoporus dichrous Bres.) ST 001714(DSM 13784)에 의해 생성되는 신규한 활성 물질(칼로포로사이드 유도체), 이의 제조방법, 의약으로서 이의 용도, 칼로포로사이드 유도체를 함유하는 의약 및 미생물 글로에오포러스 디크로우스 브레스. ST 001714(DSM 13784)에 관한 것이다.
칼로포로사이드는 1994년에 포스포리파제 C 억제제로서 최초로 기술되었다[참조: W. Weber et al. J. Antibiotics, 47, 1188-1194]. 같은 해에, 2종의 또 다른 유사한 2차 대사물이 분리되었다[참조: R. Shan et al. Nat. Prod. Lett., 4, 171-178]. 본 발명의 (하기) 화학식 I의 화합물은 이의 구조가 상기 문헌들에 기술된 물질과 상이하다.
암은 보통 치명적 결과를 초래하며 신체 자체의 세포 성장이 조절되지 않음으로써 유발되는 사람과 동물의 질환이다. 암은 악성 증식물 또는 신생물(종양 또는 육종)의 형성 또는 악성 변성 및 백혈구 세포의 성숙 저해(백혈병)을 칭하는 명칭이다. 암 세포 또는 종양 세포는 신체 자체의 세포의 형질전환을 통해 발생한다. 암 세포의 악성은 증식의 자율성, 즉 기관의 구조안에 적합하지 않으며 조직을파괴시키는 억제되지 않은 침윤성 증식능으로 표현된다. 악성의 확실한 신호는 종양 세포의 혈행 또는 림프행 파종 후에 종양으로부터 멀리 떨어진 전이의 형성이다. 암은 사람에서 가장 흔한 사망 원인 중 하나이기 때문에 악성 변성을 치유 또는 치료하는 방법 및 수단이 절실히 필요하다.
악성 종양의 가능한 치료요법으로는, 가능한 경우에 기본적인 종양의 외과적 제거 - X-선, α, β 및 γ선을 사용한 방사선 요법, 면역요법 및 화학요법이 포함된다. 면역요법은 현재 한정된 범위로만 적용시킬 수 있다. 종양의 화학요법은 국소 외과 치료 또는 방사선조사 후에 잔류하는 종양 및 종양 세포의 치료를 위한세포 독소(세포증식억제제)의 투여를 의미한다. 이러한 물질은 특히 세포 분열의 특정한 과정을 방해하여, 빠르게 증식하는 종양 조직과 같은 대다수의 분열 세포를 갖는 조직이 보다 민감하게 반응하게 만든다. 사용되는 물질은 알킬화 화합물(예: 사이클로포스파미드)[참조: The Merck Index, 12th Ed. page 463], 항대사물(예: 메토트렉세이트)[참조: The Merck Index, 12th Ed. page 1025], 알칼로이드(예: 빈크리스틴)[참조: The Merck Index, 12th Ed. page 1704] 및 항생제(예: 다우노마이신[참조: The Merck Index, 12th Ed. page 479] 및 아드리아마이신[참조: The Merck Index, 12th Ed. page 581-582]이다. 그러나, 광범위한 부작용으로 인해 이러한 모든 제제는 환자의 사망이 단지 지연만 되고 피하지 못한다는 큰 단점이 있다. 또한, 사용되는 제제들에 대한 내성이 퇴행성(암성) 세포에서 유발된다. 현재의 의약은 더이상 세포증식억제 효과를 갖지 않지만 부작용으로 인해 독성이다. 또한, 세포증식억제제를 배합하여 사용하거나 순차적으로 사용하는 것이 단일 세포증식억제제(단일요법)의 효능을 초과하는 것으로 판명되었기 때문에 상당한 부작용과 함께 복합화학요법이 추가되지 않을 수 있다. 상기한 모든 이유로 인해, 신규한 화학요법제에 대한 절실한 필요성과 이로 인한 전세계적 조사가 있다.
사이클린 의존적 키나제(=CDK)는 세포 주기의 조절에서 중요한 역할을 한다. 사이클린 의존적 키나제는 인산화 반응을 촉매함으로써, 세포 주기에서 G1기(성장기 1)로부터 S기(합성기)로의 전이를 개시하는 반응 캐스케이드를 시작하게 한다. 따라서, 사이클린-의존적 키나제는 암 및 세포 증식이 병리학적으로 저해된 기타 장애의 치료를 위한 우수한 치료 표적이다. 세포 주기를 조절하고 조절되지 않은 세포 분열을 방지하는 저분자량 억제제는 암 환자를 치료하는데 유용한 물질일 수 있다.
놀랍게도, 미생물 균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)가 사이클릭 의존적 키나제를 매우 저농도에서 억제하는 매우 효과적인 신규한 세포증식억제제를 생산할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)에 의해 생산되는 활성 물질(칼로포로사이드 유도체) 및 이의 생리학적으로 허용되는 염, 에스테르 및 명백한 화학적 등가물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명 하기 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다.
상기 화학식에서,
R1, R2및 R3은 서로 독립적으로, H 또는 탄소수 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 6, 특히 바람직하게는 2의 아실 라디칼이고,
R4는 H 또는 -C(O)(CH2)nCOOH(여기서, n은 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 3, 특히 바람직하게는 1 또는 2이다)이며, 단 R1, R2, R3및 R4모두가 H는 아니다.
화학식 I의 화합물의 아실 라디칼은 직쇄 또는 측쇄이며 포화 또는 단일불포화 또는 이불포화될 수 있다.
탄소수 2의 아실 라디칼은 예를 들어, 아세틸 라디칼을 의미한다.
포화 직쇄 아실 라디칼의 예로는 아세트산 잔기(C=2), 프로피온산 잔기(C=3), 부티르산 잔기(C=4), 발레르산 잔기(C=5), 카프로산 잔기(C=6), 에난트산 잔기(C=7), 카프릴산 잔기(C=8), 펠라르곤산 잔기(C=9) 및 카프르산 잔기(C=10)가 있다.
단일불포화 직쇄 아실 라디칼의 예로는 아크릴산 잔기(C=3), 크로톤산 잔기(C=4) 또는 비닐아세트산 잔기(C=4)가 있다.
이불포화 직쇄 아실 라디칼의 예로는 소르브산 잔기(C=6)가 있다.
칼로포로사이드는 활성이 약한 항생제이며 살리실산과 디사카라이드로 이루어진다. 2개의 구조 단위가 알킬 쇄에 의해 연결되어 있다. 화학식 I의 화합물 내의 당 잔기는 각 경우에 알도헥소즈의 D-피라노즈(예: D-글루코피라노즈 또는 D-갈락토피라노즈)와 알도헥소즈의 온산(예: D-글루콘산)으로 이루어진 디사카라이드일 수 있다. 당 잔기는 바람직하게는 비치환되거나 상기 정의한 R2, R3및/또는 R4에 의해 치환된 D-만노피라노실-D-만논산이다.
본 발명은 추가로,
(a) R1이 아세틸이고 R2, R3및 R4가 H인 화학식 I의 화합물(=칼로포로사이드 B: 분자식: C38H62O16, MW 774.9) 및 생리학적으로 허용되는 이의 염;
(b) R1및 R2가 H이고 R3이 아세틸이며 R4가 말로닐인 화학식 I의 화합물(=칼로포로사이드 C: 분자식: C43H66O20, MW 902.99) 및 생리학적으로 허용되는 이의 염;
(c) R1및 R2가 H이고 R3이 아세틸이며 R4가 말로닐인 화학식 I의 화합물(=칼로포로사이드 D: 분자식: C41H64O19, MW 806.96) 및 생리학적으로 허용되는 이의 염;
(d) R1및 R3이 H이고 R2가 아세틸이며 R4가 말로닐인 화학식 I의 화합물(=칼로포로사이드 E: 분자식: C41H64O19, MW 806.96) 및 생리학적으로 허용되는 이의 염;
(e) R1, R2및 R4가 H이고 R3이 아세틸인 화학식 I의 화합물(=칼로포로사이드F: 분자식: C38H62O16, MW 774.9) 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
화학식 I의 화합물내의 키랄 중심은 달리 명시하지 않는 한 R 또는 S 배위로 존재할 수 있다. 본 발명은 광학적으로 순수한 화합물 및 입체이성체의 혼합물( 예: 에난티오머의 혼합물 및 부분입체이성체의 혼합물) 둘다에 관한 것이다.
화학식 I의 화합물은 본 발명에 따라서 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784) 또는 이의 변이체나 돌연변이체 중 하나를, 적합한 조건하에 배양 배지내에서 하나 이상의 화학식 I의 칼로포로사이드 유도체가 상기 배양 배지 내에 축적될 때가지 발효시켜 수득할 수 있다. 칼로포로사이드 유도체는 후속적으로 상기 화합물을 분리시키고 경우에 따라 이의 화학적 등가물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염으로 전환시켜 수득한다.
따라서, 본 발명은 미생물 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784) 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체를 적합한 조건하에 배양 배지내에서 하나 이상의 표적 화합물이 상기 배지내에 축적될 때까지 배양시키고 이어서 배양 배지로부터 분리시키고, 경우에 따라 화학적 등가물 및/또는 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시킴을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
균주 ST 001714(DSM 13784), 이의 돌연변이체 및/또는 변이체를, 바람직하게는 탄소원 및 질소원과 함께 통상의 무기염을 함유하는 영약액 또는 고체 배지(배양 배지로도 지칭됨)내에서 본 발명의 화합물이 상기 배양 배지내에 축적될 때까지발효시킨 다음, 당해 화합물을 배양 배지로부터 분리시키고, 경우에 따라 개개의 활성 화합물로 분별한다.
본 발명의 방법은 실험실 규모(밀리리터 내지 리터 범위) 및 산업상 규모(입방 미터 규모)의 발효용으로 사용할 수 있다.
균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr:Fr.) 브레스. ST 001714는 예비배양물로서 증식시킨다. 분리체는 부다페스트 조약에 따라서 1999년 12월 14일자로 번호 DSM 13784하에 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 독일 3300 브룬스윅 마쉐로더 벡 1베 소재)에 기탁하였다.
균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)는 백색 균사체와 자주색 포자를 지니고 있다. 이는 바람직하게는 자작나무과에서 발생하나 기타 숙주, 예를 들어, 오리나무과, 버드나무과, 느릅나무과, 장미과에서도 만연할 수 있다.
균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784) 대신에, 하나 이상의 본 발명의 화합물 합성하는 이의 돌연변이체 및 변이체를 사용할 수도 있다. 이러한 돌연변이체는 물리적 수단, 예를 들어, 자외선 또는 X-선의 조사, 또는 화학적 돌연변이유발원, 예를 들어, 에틸 메탄설포네이트(EMS), 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG)를 사용하여 자체 공지된 방식으로 생성시킬 수 있다.
하나 이상의 본 발명의 화합물을 합성하는 돌연변이체 및 변이체는 다음 단계에 따라서 스크리닝한다:
플레이트 배양물을 동결건조시키는 단계;
동결건조물을 유기 용매로 추출하는 단계;
고체 상을 사용하여 배양 여액으로부터 당해 화합물을 추출하는 단계;
HPLC, TLC에 의해 분석하거나 생물학적 활성을 검정하는 단계.
하기에서 기술하는 발효 조건이 기탁된 분리체 DSM 13784인 글로에오포러스 디크로우스(Fr:Fr.) 브레스. ST 001714 및 이의 돌연변이체와 변이체에 적용된다. 탄소원과 질소원 및 통상의 무기 염을 함유하는 영약액 내에서, 글로에오포러스 디크로우스(Fr:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)는 칼로포로사이드 유도체를 생산한다.
발효에 적합하고 바람직한 탄소원으로는 동화 탄수화물 및 당 알콜, 예를 들어, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈 또는 D-만니톨 및 탄수화물 함유 천연 산물, 예를 들어, 맥아 추출물이 있다. 적합한 질소 함유 영양소로는 아미노산, 펩타이드 및 단백질 및 이들의 분해 산물, 예를 들어, 카세인, 펩톤 또는 트립톤, 또한 고기 추출물, 효모 추출물, 예를 들어, 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 면 식물의 분쇄된 종자, 알콜, 알콜 생성으로부터의 증류 잔사, 고기 가루 또는 효모 추출물 뿐만 아니라, 암모늄 염 및 질산염, 그러나 특히 합성 또는 생합성에 의해 수득한 펩타이드가 있다. 영양액에 함유될 수 있는 무기 염으로는 예를 들어, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 철, 아연, 코발트 및 망간의 염산염, 탄산염, 황산염 또는 인산염이 있다.
본 발명의 화합물은 맥아 추출물 약 0.05 내지 5%, 바람직하게는 1 내지 2%, 효모 추출물 0.05 내지 3%, 바람직하게는 0.05 내지 1%, 글루코즈 0.2 내지 5%, 바람직하게는 0.5 내지 2%, 셀룰로즈 분말 0.5 내지 3%, 바람직하게는 0.5 내지 3% 및 미량의 황산암모늄을 함유하는 영양액 내에서 특히 잘 생성된다. % 데이터는 각 경우에 완전 영약액의 중량을 기준으로 한다.
상기 영양액 내에서, 글로에오포러스 디크로우스(Fr:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)는 칼로포로사이드 유도체의 혼합물을 생산한다. 다량의 하나 이상의 본 발명의 칼로포로사이드 유도체의 측면에서 양은 영양액의 조성에 따라 다를 수 있다. 또한, 배지의 조성을 통해 개개의 칼로포로사이드 유도체의 합성을 조절하여 칼로포로사이드 유도체가 미생물에 의해 전혀 생산되지 않도록 하거나 검출 한계치 이하의 양으로 생산되도록 할 수 있다.
미생물은 호기적으로, 즉 예를 들어, 진탕기 플라스크 또는 발효조에서 진탕 또는 교반하고 경우에 따라 공기 또는 산소를 도입하면서 침지시킴으로써 배양하거나 고체 배지 상에서 배양할 수 있다. 배양은 약 18 내지 37℃, 바람직하게는 약 20 내지 32℃, 특히 25 내지 30℃의 온도 범위의 수행할 수 있다. pH 범위는 5 내지 8, 바람직하게는, 5.5 내지 6.5이어야 한다. 일반적으로, 미생물은 24시간 내지 720시간, 바람직하게는 288시간 내지 576 시간 동안 상기한 조건에서 배양한다.
배양은 유리하게는 여러 단계로 수행할 수 있으며, 즉 하나 이상의 예비 배양물을 액체 배지내에서 제조한 다음, 실제 생산 배지인 주 배양물에 예를 들어 1:10의 용적비로 옮길 수 있다. 상기 예비배양물은, 예를 들어, 균사체를 영양액으로 옮기고 이를 약 36시간 내지 120시간, 예를 들어, 48시간 내지 72시간 동안 생장시킴으로써 수득할 수 있다. 상기 균사체는, 예를 들어, 균주를 약 3일 내지 40일, 바람직하게는 10일 내지 30일 동안 고체 또는 액체 영양 배지, 예를 들어, 맥아/효모 아가 또는 감자 덱스트로스 아가에서 생장시킴으로써 수득할 수 있다.
발효 과정은 배양물의 pH 또는 균사체 용적에 기초하여, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 크로마토그래피 방법을 사용하거나 생물학적 활성을 시험함으로써 모니터링할 수 있다.
하기에서 기술하는 분리 방법을 사용하여 본 발명의 칼로포로사이드 유도체를 정제한다.
본 발명의 칼로포로사이드 유도체는 천연 물질의 화학적, 물리학적 및 생물학적 특성을 고려하여 공지된 방식으로 배양 배지로부터 분리 또는 정제한다. 배양 배지 또는 개개의 분리 단계에서 각각의 칼로포로사이드 유도체의 농도를 편의상, 생성된 물질의 양과 보정액을 비교함으로써 검정하는데 HPLC를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합을 분리하기 위해서는, 배양 브로쓰 또는 배양물과 함께 고체 배지를 동결건조시킨 다음, 임의로 물과 혼화성인 유기 용매를 사용하여 동결건조물로부터 칼로포로사이드 유도체를 추출한다. 유기 용매 상은 본 발명의 천연 물질을 함유하고, 이는 경우에 따라 진공에서 농축시키고, 추가로 정제할 수 있다.
하나 이상의 본 발명의 화합물은 적합한 물질, 바람직하게는 예를 들어, 분자 체, 실리카겔, 알루미나, 이온 교환기 또는 흡착 수지 또는 역상(역상, RP)에서크로마토그래피시켜 추가로 정제한다. 칼로포로사이드 유도체는 이러한 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있다. 칼로포로사이드 유도체의 크로마토그래피는 완충된 수용액 또는 수용액과 유기 용액의 혼합물을 사용하여 수행한다.
수용액 또는 유기 용액의 혼합물은 용매의 5 내지 80%, 바람직하게는 용매의 20 내지 50% 농도의 모든 수혼화성 유기 용매, 예를 들어, 메탄올, 프로판올 및 아세토니트릴이거나, 또는 유기 용매와 혼화성인 모든 완충된 수용액을 의미하는 것으로 이해한다. 사용될 완충액은 상기 명시한 바와 동일할 수 있다.
칼로포로사이드 유도체는 이의 극성 차이에 기초하여, 예를 들어, MCIR(흡착 수지, 제조원: Mitsubishi, Japan) 또는 Amberlite XADR(공급원: TOSOHAAS) 또는 기타 소수성 물질(예: RP-8 또는 RP-18 상)에서의 역상 크로마토그래피를 보조로하여 분리시킨다. 또한, 예를 들어, 실리카 겔 및 알루미나 등에서의 표준상 크로마토그래피를 보조로하여 분리시킬 수도 있다.
칼로포로사이드 유도체의 크로마토그래피는 완충되거나 산성화된 수용액 또는 수용액과 알콜 또는 기타 수혼화성 유기 용매와의 혼합물을 사용하여 수행한다. 바람직하게는, 프로판올 및 아세토니트릴을 유기 용매로서 사용한다.
완충되거나 산성화된 수용액은 예를 들어, 0 내지 0.5M 농도의 물, 포스페이트 완충액, 암모늄 아세테이트, 시트레이트 완충액, 및 0 내지 1% 농도의 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 또는 바람직하게는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 모든 시판되는 산을 의미한다. 완충된 수용액의 경우, 0.1% 암모늄 아세테이트가 특히 바람직하다.
크로마토그래피는 100%의 물로 시작하여 100%의 용매로 종결되는 구배, 바람직하게는 20 내지 100%의 프로판올 또는 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 수행한다.
또한, 대안적 가능성은 겔 크로마토그래피 또는 소수성 상에서의 크로마토그래피를 수행하는 것이다.
겔 크로마토그래피는 폴리아크릴아미드 또는 공중합체 겔, 예를 들어, Biogel-P 2R(제조원: Biorad) 또는 Fractogel TSK HW 40R(공급원: Merck, Germany 또는 Toso Hass, USA)에서 수행한다.
상기한 크로마토그래피의 순서는 반대로 할 수 있다.
본 발명의 화합물은 고체 상태에서 안정하며 3 내지 8, 특히 5 내지 7의 pH 범위인 용액 속에서 안정하므로, 통상의 약제학적 제제내로 혼입시킬 수 있다.
하나 이상의 본 발명의 화합물은 이의 유용한 약리학적 특성으로 인해 사람 의학 또는 수의학에서 약제로서 사용하기에 적합하다.
따라서, 본 발명은 종양증 치료용 세포증식억제제를 제조하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 화학식 I의 화합물의 모든 명백한 화학적 등가물에 관한 것이다. 이러한 등가물은 약간의 화학적 차이를 나타내는, 즉 동일한 효과를 갖거나 온화한 조건하에 본 발명의 화합물로 전환되는 화합물이다. 상기등가물로는 또한 예를 들어, 본 발명의 화합물의 염, 환원 산물, 에스테르, 에테르, 아세탈 또는 아미드 및 당해 분야의 숙련가가 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있는 등가물 및 또한, 모든 광학 대상체, 부분입체이성체 및 모든 입체이성체 형태가 포함된다.
화학식 I의 화합물의 생리학적으로 허용되는 염은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences(17th edition, page 1418 (1985)]에 기술되어 있는 이의 유기 염 및 무기 염 둘다를 의미한다. 물리적 및 화학적 안정성 및 가용화도로 인해, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 암모늄 염이 산성 그룹용으로 특히 바람직하며, 염기성 그룹용으로는 염산, 황산, 인산 또는 카복실산 또는 설폰산, 예를 들어, 아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산 및 p-톨루엔설폰산의 염이 특히 바람직하다.
에스테르, 에테르 및 아세탈은 예를 들어, 문헌[참조: Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992 or Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, John Wiley & Sons, 1999]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
카복실 그룹은 예를 들어, LiAlH4를 사용하여 알콜로 환원시킬 수 있다.
먼저, 알칼리성 가수분해에 의해 화학식 I의 화합물의 글로코시드 잔기를 제거할 수 있다[참조: W. Weber et al. J. Antibiotics, 47, 1188-1194]. 이어서 글리코실화(예: 쾨니히스-크노르(Konigs-Knorr) 반응)에 의해 임의 목적하는 당 잔기를 도입시킬 수 있다. 상응하는 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Carbohydrate Chemistry, J.F. Kennedy, Oxford University Press, 1988]에 기재되어 있다.
칼로포로사이드 유도체의 작용 기작은 공지되어 있지 않지만, 현저한 효과를 검출할 수 있다.
CDK의 억제제는 사이클린-의존적 키나제에 의한 특이적 펩타이드 기질의 인산화 속도를 측정하는 검정을 사용하여 검출한다. 사이클린 의존적 키나제는 특정 사이클린에 결합함으로써 활성화된다. [γ-P]-포스페이트는 상기 효소에 의해 [γ-P]-ATP로부터 펩타이드 기질로 전달된다. 검정은 96-웰 미세역가 플레이트에에서 수행하며, 기질로 전달된 [γ-P]-포스페이트의 방사능을 측정한다.
칼로포로사이드 유도체에 대한 IC50값은 하기 표 1에 명시한다; IC50은 CDK-4를 50% 불활성화시키는 농도이다.
칼로포로사이드 B 1.5μM
칼로포로사이드 C 3.1μM
칼로포로사이드 D 1.8μM
칼로포로사이드 E 1.8μM
칼로포로사이드 F 1.5μM
본 발명은 추가로 하나 이상의 본 발명의 화합물을 함유하는 의약에 관한 것이다.
하나 이상의 본 발명의 칼로포로사이드 유도체의 화합물은 원칙적으로 희석시키지 않고 그 자체로 투여할 수 있다. 바람직한 용법은 적합한 부형제 또는 담체 물질과 혼합하는 것이다. 사용할 수 있는 담체 물질은 약제학적으로 적합하며 의약에서 통상적인 담체 물질 및/또는 부형제이다.
본 발명의 의약은 일반적으로 경구 또는 비경구 투여하나, 원칙적으로는 직장내 사용도 가능하다. 적합한 고체 또는 액체 약제학적 제형은, 예를 들어, 입제, 산제, (제피) 정제, (미세)캡슐제, 좌제, 시럽제, 유제, 현탁제, 에어로졸, 점적제 또는 앰풀 형태의 주사액 및 활성 물질의 서방성을 갖는 생성물이며, 이 생성물의 제조시에는 일반적으로 담체 및 첨가제 및/또는 보조제, 예를 들어, 붕해제 또는 결합제, 피복제, 팽윤제, 활주제 또는 윤활제, 풍미제, 감미제 또는 가용화제가 사용된다. 흔히 사용되는 담체 또는 부형제로는 예를 들어, 탄산마그네슘, 이산화티탄, 락토즈, 만니톨 및 기타 당류, 활석, 유단백질, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로즈 및 이들의 유도체, 동물성 또는 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 용매(예: 멸균수, 알콜, 글리세롤 및 다가 알콜)을 언급할 수 있다.
경우에 따라, 장시간에 걸쳐 방출을 지연 또는 연장시키기 위해, 예를 들어 활성 물질을 적합한 중합체 또는 왁스 등의 입자 형태로 피복 또는 매봉시킴으로써 경구 투여용 투여량 단위를 미세캡슐화시킬 수 있다.
약제학적 생성물은 바람직하게는 각각의 단위가 활성 성분으로서 특정 투여량의 본 발명의 칼로포로사이드 유도체의 화합물 하나 이상을 함유하는 투여량 단위로서 제조하고 투여한다. 정제, 캡슐제 및 좌제와 같은 고체 투여량 단위인 경우, 이러한 투여량은 1일당 약 500mg 이하, 바람직하게는 약 0.1 내지 200mg일 수 있으며, 앰풀 형태의 주사액의 경우 1일당 약 200mg 이하, 바람직하게는 약 0.5 내지 100mg일 수 있다.
투여될 1일 투여량은 포유동물의 체중, 연령, 성별 및 상태에 따라 좌우된다. 그러나, 일부 상황에서는 보다 높거나 낮은 1일 투여량이 적절할 수도 있다. 1일 투여량의 투여는 1회 투여량 단위 형태 또는 여러개의 보다 작은 투여량 단위로서 1회 투여하는 것을 통해 및 세분된 투여량을 일정 간격으로 여러번 투여하는 것을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 의약은 하나 이상의 본 발명의 화합물을 통상의 담체 및, 경우에 따라 경우에 따라 첨가제 및/또는 부형제와 함께 적합한 투여형태로 전환시킴으로써 제조한다.
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 설명된다. 백분율은 데이터는 중량을 기준으로 한다. 액체의 혼합비는 달리 명시하지 않는 한 용적을 기준으로 한다.
실시예 1: 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)의 글리세롤 배양물의 제조
300㎖들이 멸균 에를렌마이어 플라스크내의 영양액(맥아 추출물 2.0%, 효모 추출물 0.2%, 글루코스 1.0%, (NH4)2HPO40.05%, pH 6.0) 100㎖를 균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)과 함께, 회전 진탕기에서 25℃ 및 140rpm로 7일 동안 배양한다. 이어서 당해 배양물 1.5㎖를 80%의 글리세롤 2.5㎖로 희석시키고, -135℃에서 저장한다.
실시예 2: 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)의 에를렌마이어 플라스크내 예비배양물의 제조
100㎖들이 멸균 에를렌마이어 플라스크내의 영양액(맥아 추출물 2.0%, 효모 추출물 0.2%, 글루코스 1.0%, (NH4)2HPO40.05%, pH 6.0) 30㎖를 균주 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)로 접종시키고, 회전 진탕기에서 25℃ 및 140rpm로 4일 동안 배양한다. 이어서 당해 배양물 2㎖를 사용하여 주 배양물 제조용 플레이트를 접종시킨다.
실시예 3: 고체 배지 플레이트 상에서 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784) 주배양물의 제조
멸균 25×25cm 플레이트(제조원: Nunc)를 20g/ℓ맥아 추출물, 2g/ℓ효모 추출물, 10g/ℓ 글루코즈 및 0.5g/ℓ(NH4)2HPO4로 이루어진 영양액(pH 6.0) 200㎖로 주조한다. 상기 플레이트를 각각 예비배양물 2㎖로 접종시킨다. 하나 이상의 본 발명의 화합물의 최대 생산량은 약 480시간 후에 달성된다.
실시예 4: 칼로포로사이드 유도체의 제조
50개의 25×25cm 플레이트를 준비하고 예비배양물로 접종시킨다:
영양 배지:
20g/ℓ맥아 추출물
2g/ℓ효모 추출물
10g/ℓ 글루코즈
0.5g/ℓ(NH4)2HPO4
pH 6(멸균시키기 전)
배양 시간: 480시간
배양 온도: 25℃
실시예 5: 글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)의 플레이트 배양물로부터 칼로포로사이드 혼합물의 분리
글로에오포러스 디크로우스(Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)의 발효를 완료한 후, 실시예 3에서 수득된 플레이트 배양물을 동결건조시키고, 동결건조물을 메탄올 5ℓ로 추출한다. 활성 물질 함유 메탄올 용액을 여과하여 잔사를 제거하고 진공하에 농축시킨다. 농축물을 물로 희석시키고, 준비된 1.0ℓMCI GEL, CHP20P 컬럼에 충전시킨다. 물 내지 100% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 용출시킨다. 컬럼 유동물(분당 25㎖)를 분획(각각 25㎖)으로서 수집하고, 칼로포로사이드 유도체 함유 분획(40% 내지 100% 아세토니트릴)을 합한다. 진공하에 농축시킨 다음, 동결건조시켜 황갈색 생성물 8.5g을 수득한다.
실시예 6: RP18 크로마토그래피에 의한 칼로포로사이드 유도체의 예비 분리
실시예 4에서 수득한 생성물 0.5g을 NucleosilR100-7 C18 HD 컬럼(크기:40mm×250mm)에 충전시킨다. 20% 아세토니트릴(+ 0.1% 암모늄 아세테이트가 첨가된 물) 내지 100% 아세토니트릴의 구배를 사용하고 유속을 분당 35㎖으로 하여 용출시킨다. 컬럼 유출물을 분획(35㎖)으로서 수집한다. 칼로포로사이드 유도체는 주로 분획 39 내지 68 속에 존재한다. 이들 분획을 합하고 진공하에 용매를 제거한 다음, 동결건조시킨다. 이로써, 이미 순도 95%를 초과하는 칼로포로사이드 B(22.4mg) 및 F(10.5mg)가 수득된다. 칼로포로사이드 C(분획 41; 43.4mg), D(분획 43 내지 45; 76.2mg) 및 E(분획 43 내지 45; 76.2mg)은 약 70%의 순도로 수득되므로 크로마토그래피시켜 추가로 정제한다.
실시예 7: 칼로포로사이드 C, D 및 E의 정제
실시예 5에서 분리하고 농축시킨 칼로포로사이드 20mg을 LUNAR5μC18(2) 컬럼(크기:10mm×250mm)에 충전시키고, 0.1% 암모늄 아세테이트/물 중의 25 내지 35% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 크로마토그래피시킨다. 용출액의 유속은 분당 6.5㎖이고, 분획 크기는 6.5㎖이다. 칼로포로사이드 C는 분획 35 내지 42 속에 존재한다. 상기 분획들을 동결건조시켜 95% 순도를 초과하는 칼로포로사이드 C(7.5mg)를 수득한다.
실시예 5에서 분리하고 농축시킨 칼로포로사이드 D와 E의 혼합물 25mg을 LUNAR5μC18(2) 컬럼(크기:10mm×250mm)에 충전시키고, 0.1% 암모늄 아세테이트/물 중의 30 내지 40% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 크로마토그래피시킨다. 용출액의 유속은 분당 6.5㎖이고, 분획 크기는 6.5㎖이다. 칼로포로사이드 D는 분획 18 및 19 속에 존재하며, 칼로포로사이드 E는 분획 20 내지 21 속에 존재한다. 상기 분획들을 동결건조시켜 95% 순도를 초과하는 칼로포로사이드 D(7.0mg) 및 칼로포로사이드 E(6.0mg)을 수득한다.
본 발명의 물질의 물리화학적 및 분광학적 특성은 다음과 같이 요약할 수 있다:
칼로포로사이드 B:
분자식: C38H62O16
분자량:774.9
UV 최대치: 208, 244, 310
1H- 및13C-NMR: 표 2 참조
고분해능 FAB 질량 스펙트럼은 계산된 질량(C38H62O16의 경우, 단일동위원소) 775.4116 Da와 양호하게 일치하는 m/z 775.4120 Da에서 집중적 MH+를 나타낸다.
칼로포로사이드 C:
분자식 : C43H66O20
분자량: 902.99
UV 최대치: 208, 244, 310
1H- 및13C-NMR: 표 3 참조
고분해능 FAB 질량 스펙트럼은 계산된 질량(C36H71O25의 경우, 단일동위원소) 903.4284 Da와 양호하게 일치하는 m/z 903.4264 Da에서 집중적 M+H+를 나타낸다.
칼로포로사이드 D:
분자식 : C41H64O19
분자량: 860.96
UV 최대치: 208, 244, 310
1H- 및13C-NMR: 표 4 참조
고분해능 FAB 질량 스펙트럼은 계산된 질량(C41H64O19Na의 경우, 단일동위원소) 883.3939 Da와 양호하게 일치하는 m/z 883.3942 Da에서 집중적 M+Na+를 나타낸다.
칼로포로사이드 E:
분자식: C41H64O19
분자량: 860.96
UV 최대치: 208, 244, 310
1H- 및13C-NMR: 표 4 참조
고분해능 FAB 질량 스펙트럼은 계산된 질량(C41H64O19Na의 경우, 단일동위원소) 833.3939 Da와 양호하게 일치하는 m/z 833.3942 Da에서 집중적 M+Na+를 나타낸다.
칼로포로사이드 F:
분자식: C38H62O16
분자량: MW 774.9
UV 최대치: 208, 244, 310
1H- 및13C-NMR: 표 5 참조
고분해능 FAB 질량 스펙트럼은 계산된 질량(C38H63O16의 경우, 단일동위원소) 775.4116 Da와 양호하게 일치하는 m/z 775.4128 Da에서 집중적 M+H+를 나타낸다.
실시예 8: CDK-4 억제제의 생검
IC50을 측정하기 위해, 본 발명의 천연 물질의 모액을 10mM의 농도로 제조한다. 384-웰 플레시 플레이트를 비오티닐화된 펩타이드 기질 50㎕(50㎍/웰)로 실온에서 2시간 동안 피복시킨 다음, PBS 완충액으로 3회 세척한다. 반응 동안, 칼로포로사이드 유도체의 완충액으로 희석된 용액 30㎕ 및 미리 혼합된 ATP/사이클린D1/CDK4 용액 20㎕(최종 농도: 1μCi33P-γ-ATP, 2μM ATP 및 1㎍ 효모 혼합물)을 피펫으로 상기 플레이트에 첨가한다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 매회 3% 인산 80㎕으로 3회 세척한 다음, 마이크로베타 계수기로 30초 동안 측정한다. 억제%를 수학식을 보조로 하여 측정한다. IC50값을 측정하기 위해, 본 발명의 물질의 갓 희석된 DMSO 용액의 10가지 농도를 검정한다.

Claims (16)

  1. 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
    상기 화학식에서,
    R1, R2및 R3은 서로 독립적으로, H 또는 탄소수 2 내지 10의 아실 라디칼이고,
    R4는 H 또는 -C(O)(CH2)nCOOH(여기서, n은 1 내지 7이다)이며, 단 R1, R2, R3및 R4모두가 H는 아니다.
  2. 제1항에 있어서, R1, R2및 R3이 서로 독립적으로 H 또는 아세틸이고 R4가 H 또는 말로닐(n=1)인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 아세틸이고 R2, R3및 R4가 H인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1및 R3이 아세틸이고 R2가 H이며 R4가 말로닐인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1및 R2가 H이고 R3이 아세틸이며 R4가 말로닐인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1및 R3이 H이고 R2가 아세틸이며 R4가 말로닐인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1, R2및 R4가 H이고 R3이 아세틸인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 미생물 글로에오포러스 디크로우스 (Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784) 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체 중 하나를 적합한 조건하에 발효시키고, 하나 이상의 칼로포로사이드 유도체를 분리시키고, 경우에 따라 이를 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시킴으로써 제조할 수 있는 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  9. 미생물 글로에오포러스 디크로우스 (Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784)또는 이의 변이체 또는 돌연변이체 중 하나를 적합한 조건하에 발효시키고, 하나 이상의 칼로포로사이드 유도체를 분리시키고, 경우에 따라 이를 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시킴을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 발효가 호기성 조건하에 18℃ 내지 35℃의 온도 및 5 내지 8의 pH에서 수행되는 방법.
  11. 의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  12. CDK 억제제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.
  13. 암 또는 세포 증식의 병리학적 장애를 갖는 기타 질환의 치료용 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 용도.
  14. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 하나 이상의 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 의약.
  15. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 하나 이상의 화학식 I의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 적합한 부형제 및/또는 담체를 사용하여 적합한 투여 형태로 전환시킴을 포함하는, 제14항에 따르는 의약의 제조방법.
  16. 미생물 글로에오포러스 디크로우스 (Fr.:Fr.) 브레스. ST 001714(DSM 13784).
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