EUROTO INAS, Y DERIVADOS DE LAS MISMAS, PROCESOS PARA' PREPARARLAS, Y SU USO La presente invención se relaciona con; compuestos novedosos de la fórmula y ' .
en donde R(l), R(2), R(3)' y R(4) son, independientemente uno del otro, hidrógeno o un radical alquilo. Los compuestos de la fórmula I son inhibidores de la quinasa ..•'KDR y son apropiados, en vista de su efecto antiangiogénico, para prevenir y/o tratar enfermedades malignas. Los' compuestos de la fórmula I se pueden obtener fermentando el · microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872)" ó derivando químicamente los compuestos que se obtienen- después de fermentar el microorganismo. La invención, consecuentemente, también se relaciona con un proceso para preparar los compuestos de la fórmula I, al uso de los compuestos de la fórmula I para producir un producto farmacéutico ' para tratar enfermedades malignas y enfermedades que se -pueden tratar inhibiendo quinasa KDR, y con preparaciones farmacéuticas que comprenden un contenido de cuando menos un compuesto de la fórmula I. El cáncer es una enfermedad de seres humanos y animales que tiene en la mayor parte un resultado fatal y que se ocasiona por el . crecimiento no controlado ¦ de las propias células del cuerpo. El cáncer es el término para la formación de crecimientos malignos (malinomas) y neoplasmas (tumores o carcinomas) o para degeneración ;' maligna y perturbación de maduración en células blanca's de la sangre (leucemia, cáncer de sangre) . Las células de cáncer o células de tumor se presentan debido a la transformación de las propias células del cuerpo. La malignidad de' las células de cáncer se expresa en la autonomía de su crecimiento, que es en la capacidad de la célula para crecer de una manera infiltrante, sin ser inhibida, sin ser incorporado correctamente hacia el plano estructural del órgano, y con el tejido siendo destruido. Un signo confiable de malignidad es la formación de metástasis a una distancia de un tumor, siguiendo la dispersión hematogénica o linfogénica de células de tumor. El cáncer es una de las causas más frecuentes de muerte en seres humanos y, por lo tanto, existe una gran necesidad de métodos y medios para curar o ¦' tratar la degeneración maligna. Además de, .si es posible, remoción completa, operativa del tumor, las posibilidades de tratar tumores malignos incluyen terapia radiológica utilizando, rayos X, rayos alfa, rayos beta o rayos gamma, inmunoterapia o quimioterapia. En la actualidad, la inmunoterapia solamente se puede utilizar hasta un grado limitado. La quimioterapia de tumores se entiende como siendo la administración de venenos de célula (agentes citostáticos )¦ para tratar tumores y células de tumor que han permanecido después de' tratamiento quirúrgico local o irradiación. Estas ' substancias intervienen específicamente en eventos particulares en división de célula de modo que los tejidos que contienen una proporción elevada de células de división, tales como tejido de tumor que crece rápidamente, reaccionar más sensiblemente. Los compuestos utilizados son compuestos de alquilación, tales como ciclofosfamida (The Merck Index, 12a-' ed, página 463), antimetabolitos, tales como metotrexato . (The Merck Index, 12a ed, página 1025) , alcaloides, -tales como vincristina (The Merck Index, 23a ed., página 1704) y antibióticos, tales como daunomicína (The Merck' Index, 12a ed, página. 479), y adriamicina (The Merck Index, 12a ed., página 581-582). Debido a los efectos laterales masivos, todos estos agentes adolecen de severas desventajas tales que la muerte del paciente afectado solamente se retrasa pero no se evita. Además, las resistencias a los agentes empleados se desarrollan en las células degeneradas (cáncer) y los medicamentos que se están usando actualmente entonces ya no tienen un efecto citostático, sino que en su lugar,, un efecto tóxico como una consecuencia de los efectos laterales. Además, se ha encontrado que el uso combinado ó secuencial de agentes " citostáticos excede la ¦ actividad de . un solo agente citostático (monoterapia) y, como resultado, es posible que los efectos laterales substanciales asociados con poliquimioterapia no son simplemente aditivo. Debido a todas estas razones, se requieren' urgentemente agentes quimioterapéuticos novedosos y, .por lo tanto se están buscando a nivel mundial . El crecimiento de tumores presupone que el tumor se está suministrando adecuadamente con oxigeno,' algo que solamente se garantiza por el tumor que se proporciona con un suministro de sangre adecuado (vascularización) . Los tumores son incapaces de formar nuevos vasos , sanguíneos (=angiogenesis ) ; en su lugar, tienen que inducir el tejido conector circundante para realizar esta angiogenesis . La formación de nuevos vasos sanguíneos utilizando un sistema vascular ya existente como el punto de partida es de importancia central para el desarrollo embriónico y desarrollo de órgano. La angiogenesis anormalmente aumentada se observa, entre otros, en artritis reumatoide, · retinopatía diabética y crecimiento de tumor (Falkman,. 1995, at . Med., 1, 27-31) . La angiogenesis es un procesos dé múltiples pasos, complejo que incluye la activación, migración, proliferación y sobrevivencia de células endoteliales. En combinación con otros sistemas de señal . especifica de endotelio, lo que se denomina los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGFRs) transmiten señales para la migración, proliferación y sobrevivencia de las células endoteliales . La familia VEGFR incluye los subtipos VEGFR-1
(Flt-1), VEGFR-2 (KDR) y VEGFR-3 (Flt-4). Mientras que VEGRF-1 y VEGFR-2 funcionan como reguladores universales de células endoteliales, VEGFR-3 principalmente 'controla el crecimiento del sistema vascular linfático. Los VEGFRs juegan un papel clave en todas las etapas del proceso angiogénico . Los extensos estudios llevados a cabo en el campo de angiogenesis de tumor durante los últimos 20 años han descrito un gran número de metas terapéuticas potenciales, v.gr. , quinasas, proteasas e integrinas. Esto ha conducido al- descubrimiento de un gran número- de agentes antiangiogénicos novedosos, algunos de los cuales ya se han probado clínicamente (Jekunen y col., 1997, Cáncer Treatment Rev., 23, 263-286), con el contexto de un tratamiento quimioterapéutico de tumores, inhibidores de angiogenesis se podrían utilizar tanto para monoterapia como en una combinación de terapia junto con otros agentes citostáticos. Además de esto, es posible concebir utilizarlos para impedir que un tumor crezca nuevamente después de que ha completado una terapia. :
La inhibición o regulación de VEGFR-2 (KDR) es un mecanismo de reacción que ofrece un acercamiento novedoso para tratar un gran número de tumores sólidos. De esta manera, la activación de este receptor de quinasa de tirosina es crucial para crecimiento de célula endotelial y la formación de nuevos vasos sanguíneos en asociación con angiogenesis y consecuentemente tiene una influencia en el crecimiento de tumor y la formación de metástasis.- Además de esto, hay nueva evidencia para sugerir que la expresión de VEGF contribuye a la sobrevivencia de células de tumor después de la terapia de radiación o quimioterapia (Lee C. G., Heijn M. Y col., 2000, Cáncer Research 60 (19)', 5565-70). Esto subraya la importancia de inhibidores de KDR y los agentes citostáticos previamente conocidos que actúan posiblemente de manera sinergistica. Se ha encontrado, sorprendentemente, que el microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) es capaz de formar un compuesto activo que exhibe, un efecto inhibitorio pronunciado en quinasa de KDR y consecuentemente constituye un inhibidor efectivo de angiogenesis. El compuesto novedoso se denomina eurotinona abajo y es, junto con derivados de eurotinona, parte del asunto materia de la invención. La presente invención, por lo tanto,, se relaciona con compuestos de la fórmula I
en donde R(l), R(2), R(3) y R(4) son, independientemente uno del otro, en cada caso hidrógeno o un radical alquilo,, en' todas' las formas estereoquímicas del mismo, y mezclas de éstas formas en cualquier relación, y a las sales ' fisiológicamente toleradas de los mismos. Un radical alquilo de la fórmula I puede ser, por ejemplo, Alquilo (Ci-C6) , alquenilo (C2-C£) , alquinilo (C2-C6); cicloalquilo C3-C6 o alquilo- (Ci-C3) -cicloalquilo- (C3-C6) . Alquilo- (Ci-C6) puede ser un alquilo de cadena recta o ramificada que tiene 1 a 6 átomos de C, tales como metilo, etilo, i-propilo, butilo terciario y hexilo; Alquenilo- (C2-C6) puede ser alquenilo, de cadena recta o ramificada que tiene de 2 a 6 átomos de .C, tal como alilo, crotilo y pentenilo; Alquinilo- (C2-C6) puede ser alquinilo de. cadena recta o ramificada que tiene de 2 a 6 átomos de C, tal como propinilo, butinilo y penfinilo. Los ejemplos de cicloalquilo-C3-C6) son ciclopropilo, ciclobutilo, cxclopentxlo y ciclohexilo. Los radicales alquilo arriba mencionados se pueden substituir por una o más radicales. Estas pueden ser, por ejemplo, halógeno, tales como cloro, bromo ' o flúor; hidroxilo; alcoxi que tiene 1-4 átomos de C, en' particular metoxi, y/o trifluorometilo . De preferencia, R(l) - R(4) en la fórmula I son en cada caso, independientemente uno del otro, hidrógeno o alquilo- (Ci-C6) . Se da preferencia, en particular, a compuestos de la fórmula I en la que (a) R(l)-R(4) son hidrógeno (= eurotinona); (b) R(l)-R(3) son hidrógeno y R(4) es alquilo- {d-C6) , en particular metilo; o (c) R(l) y R{2) son hidrógeno y R(3) . y- R(4) son alquilo- (Ci-C6) , en particular metilo; en todas - las formas estereoquímicas de los mismos y mezclas de estas formas en cualquier relación, también las sales fisiológicamente toleradas de los mismos. La invención, consecuentemente, se relaciona en particular con eurotinona de la fórmula
con las sales fisiológicamente toleradas de las mismas. La invención se relaciona además con , 12Jdimetileurotinona de la fórmula
con 2-metileurotinona de la fórmula
y con las sales fisiológicamente toleradas de las mismas. De conformidad con la invención, los- compuestos de la fórmula I se pueden obtener fermentando el microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872), o sus variantes o imitantes, bajo condiciones apropiadas. Las eurotinonas se obtienen aislando subsecuentemente los. compuestos', y, cuando sea apropiado, convirtiéndolos en derivados químicos y en sus sales fisiológicamente toleradas. La invención, por lo tanto, se relaciona además con un proceso para preparar un compuesto de la fórmula' I, cuyo proceso comprende fermentar el microorganismo' Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872}, o sus variantes o imitantes, bajo condiciones apropiadas, en un medio .de cultivo hasta .que la eurotinona se acumula en el medio de cultivo o en el microorganismo y subsecuentemente aislar la eurotinona del medio de cultivo o microorganismo, y cuando sea apropiado, convertirlo en derivados químicos ' y/o sales fisiológicamente toleradas. Un gran número de reacciones de fenoles de alquilación se ha descrito en la literatura. . La alquilación de los grupos fenólicos OH de los presentes compuestos, por lo tanto, se puede llevar a cabo utilizando reacciones químicas que son conocidas en sí. Una derivación para proporcionar los derivados alquilados de eurotinona. se puede efectuar, por ejemplo, haciendo reaccionar la eurotinona con haluros de alquilo, tales como bromuros de alquilo o yoduros de alquilo, esteres alquilsulfónicos, tales como mesilatos, tosilatos o triflatos, y también diazoalcanos, tales como diazometileno o trimetilsilildiazometano. En lo que sigue, la invención se describirá con detalle, en particular en sus modalidades preferidas. Las eurotinonas de conformidad con la invención se producen mediante el hongo Eurotium echinulatum, de preferencia por Eurotium echinulatum Delacroix DSM- 13872. El hongo Eurotium posee un micelio de substrato amarillo/pardo y poco micelio aéreo. En el cultivo forma los cuerpos de producción de frutos, es decir, la clestotecia, que son característicos para Eurotium. Las ascoesporas son esferas aplanadas, esféricas. Poseen una cresta ecuatorial típica. El hongo es ubicuito y prefiere hábitats secos. La designación Aspergillus echinulatos también se usa todavía como un sinónimo. Un aislado de Eurotium echinulatum Delacroix se depositó en la Deutsche Sammlung von Midroorganismen und Zellkulturen [Colección alemana de microorganismos, y cultivos de célula] GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg IB, 38124 Brunswick,
Alemania, de conformidad con las reglas del Tratado de Budapest, el 15.11.2000 bajo el siguiente número: . DSM 13872. El Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 produce la eurotinona de conformidad con la invención en ün medio de cultivo sólido o liquido que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y las sales 'inorgánicas acostumbradas . En lugar de la cepa Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872, también es posible usar sus imitantes y variantes que asimismo sintetizan las eurotinonas de conformidad con la invención . Estos mutantes se pueden generar de .una manera conocida, utilizando medios físicos, -por ejemplo, irradiación, tal como utilizar rayos ultravioleta, o rayos X, o utilizar mutagenesis química, tal como metansulfonato de etilo (EMS), 2-hidr xi-4-metoxi-benzofenona · (MOB) o N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , o 'usar métodos recombinantes . Las condiciones de fermentación que se describen son válidas para Eurotium echinulatum, el Eurotium .
echinulatum Delacroix DSM 13872 aislado despositado, y también mutantes y variantes de estos organismos. El proceso de conformidad con la invención se puede emplear para fermentar a una escala de laboratorio (escala de mililitro a litro) y a escala industrial (escala de metro cúbico) . A menos que se indique de otra manera, todos los valores de porcentaje se refieren al peso. A menos que se indique de otra manera, las relaciones de mezclado en el caso de líquidos se refieren al volumen. El proceso de conformidad con la- invención comprende cultivar Eurotium echinulatum Delacroix,. DSM 13872, sus mutantes y/o variantes, bajo condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y, cuando sea apropiado, elementos vestigiales. La cepa Eurotium echinulatum Delacroix,' DSM 13872, forma eurotinona en soluciones nutrientes que contienen glucosa, almidón, avenas laminadas o glicerol. Las fuentes de carbono que se prefieren y son apropiadas para fermentación son carbohidratos asimilables y alcoholes de azúcar, tales como glucosa, lactosa, sucrosa o D-manitol, y también productos naturales que contienen carbohidrato, tales como extracto de malta o extracto de levadura. Los nutrientes que contienen nitrógeno apropiados -son: aminoácidos, péptidos y proteínas- y también sus productos de descomposición, tales corno caseína, peptonas o triptonas, y, además, extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por ejemplo de maíz, trigo, frijoles, soya o la planta de algodón, residuos de destilación de producción de alcohol, alimentos de carne o extracto de levadura, y también sales y nitratos de amonio, y asimismo, en particular, péptidos que se obtienen sintética o biosintéticamente . Los ejemplos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en la solución nutriente -son cloruros, carbonates, sulfatos o fosfatos de los metales -alcalinos o metales alcalino térreos, hierro, zinc, cobalto y manganeso. La eurotinona de conformidad con la invención se forma particularmente bien, por ejemplo, en una solución nutriente que contiene de alrededor de 0.05 a 5%, de preferencia de 1 a 2%, de extracto de malta, de aproximadamente 0.05 a 3%, de preferencia de 0.05 a 1%, de extracto de levadura, de 0.2 a 5%, de preferencia de 0.5 a 2%, de glucosa, y de 0.5 a 3%, de preferencia de -1.5 a 3% de avenas laminadas. Los valores en por ciento están en cada caso basados en el peso de la solución nutriente total. El microorganismo se cultiva aeróbicamente, es decir, por ejemplo, sumergido mientras que se agita o mueve en matraces de agitación o termentadores, o en medio sólido, en donde sea apropiado mientras que se introduce aire u oxígeno. El cultivo se puede llevar a cabo en una escala de temperatura de alrededor de 15 a 35°C, de preferencia a de aproximadamente 20 a 35°C, en particular a de -25.a 30°C. La escala de pH debe ser entre 3 y 10, de preferencia entre 6.5 y 7.5. El microorganismo generalmente se cultiva bajo estas condiciones durante un periodo de 48 a 720 horas, de preferencia de 72 a 720 horas. Venta osamente, se. cultiva en varios pasos, es decir, uno o más precultivos primero se preparan todos en un medio nutriente liquido, cuyos precultivos luego se inoculan hacia el medio de producción real, es decir, el cultivo principal, por ejemplo en una relación en volumen de 1:10-1:100. El precultivo : se obtiene, por ejemplo,, inoculando el micelio hacia una solución nutriente y dejándolo crecer de aproximadamente 20 a 120 horas, de preferencia de 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener, por ejemplo, dejando que la cepa crezca durante aproximadamente 1 a 40 días, de preferencia durante 15 a 20 días, en un medio nutriente sólido o liquido, por ejemplo agar de levadura-malta, agar de avenas laminadas o agar de dextrosa de patata. El hongo eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, puede formar el compuesto eurotinona en' un cultivo superficial o cultivo en pie en medio nutriente sólido. Los medios nutrientes sólidos se preparan añadiendo, por ejemplo, agar o gelatina, a medios nutrientes acuosos. ¦ También es posible, sin embargo, obtener la eurotinona fermentando el hongo Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, en el método sumergido, es decir, en suspensión acuosa. La, eurotinona puede estar presente tanto en el micelio como en el filtrado de cultivo; la cantidad mayor normalmente está ubicada en el filtrado de cultivo. Si el cultivo es un cultivo- liquido, los métodos acostumbrados primeramente empleados para separar el micelio del caldo de cultivo y la eurotinona luego se extrae de la masa de célula utilizando un solvente orgánico, que puede, si es necesario, ser miscible con agua. La fase de solvente orgánico contiene el producto, natural de conformidad con la invención; esta fase se concentra, cuando sea apropiado, al vacio y se purifica adicionalmente como se describe abajo. El filtrado de cultivo, cuando sea apropiado, se combina con el concentrado del extracto de micelio y se extrae con un solvente orgánico apropiado que no- es miscible con agua, por ejemplo con n-butanol. La fase orgánica, que se separa subsecuentemente, se concentra en vacio, cuando sea apropiado. Se da preferencia al filtrado de cultivo que se fracciona directamente mediante cromatografía, como se describe abajo. El cultivo superficial primeramente se seca por congelación de manera expediente y luego se .extrae con metanol o 2-propanol; sin embargo, también .es posible utilizar otros solventes. El extracto resultante luego se liofiliza. La purificación adicional de la eurotinona de conformidad con la invención se efectúa mediante cromatografía en materiales apropiados, v.gr., en tamices moleculares, en soportes de fase normal, tales como gel de sílice u óxido de aluminio, o en intercambiadore's de iones, de preferencia, sin embargo, en resinas adsorbedoras , o en fases invertidas (Rps) . Esta cromatografía se utiliza para aislar la eurotinona. La cromatografía se ' lleva a cabo usando soluciones acuosas tamponadas o mezclas de soluciones acuosas y orgánicas. Mezclas de soluciones acuosas u orgánicas se entiende que significan todos los solventes orgánicos que son miscibles con agua, de preferencia metanol, 2-rpropanol y acetonitrilo, a una concentración de 10 a 80% de solvente, de preferencia de 15 a 55% de solvente, o bien, todas las soluciones acuosas tamponadas que son miscibles con solventes orgánicos . Las soluciones acuosas tamponadas o acidificadas se entiende que significan, por ejemplo, agua, ' tampón dé fosfato, acetato de amonio o tampón de citrato a una concentración de 1 mM a 0.5 , y también ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético o todos los ácidos comercialmente disponibles conocidos por la persona experta, de preferencia a una concentración de 0.01 a 3%, en particular 0.1%. La cromatografía se lleva a cabo utilizando un gradiente que empieza con 100% de tampón acuoso y .termina con 100% de solvente, de preferencia 2-propanol o acetonitrilo. Un gradiente lineal de 10 a 60% de acetonitrilo en solución acuosa tamponada de preferencia se efectúa para purificar las eurotinonas de conformidad con la invención. Los métodos conocidos por la persona ' experta se pueden utilizar para convertir la eurotinona y derivados químicos derivados de la fórmula G en las sales fisiológicamente toleradas correspondientes. Las sales fisiológicamente toleradas de compuestos de la fórmula I y II se entiende que significan tanto sus sales orgánicas como sus sales inorgánicas, como se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences (17a edición, página
1418 (1985) ) . Debido a su estabilidad y solubilidad física y química, las sales de sodio, potasio, calcio y amonio, entre otras, se prefieren para grupos ácidos; sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o de ácidos carboxílieos o ácidos sulfónicos, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico y ácido p-toluensulfónico, se prefieren para grupos básicos. La presente invención abarca todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la fórmula I. Los centros de asimetría que están presentes en los compuestos de la fórmula I todos, independientemente uno del otro, pueden tener la configuración S o la configuración R. Ea invención incluye todos los enanciómeros y diastereomeros posibles , asi como mezclas de dos o más formas estereoisoméricas, por ejemplo mezclas de enanciómeros y/o diastereomeros, en todas relaciones. Consecuentemente, los enanciómeros en forma enancioméricamente pura, tanto como antipodos levogiratorios asi como dextrogiratorios , las configuraciones R .'y S, en la forma de racematos y en la forma de mezclas de los dos enanciómeros, en todas las relaciones, son parte, del asunto materia de la invención. Cuando está presente un isomerismo cis/trans, ambas, la forma cis y la forma trans, y mezclas de estas formas, en todas las relaciones, son parte del asunto materia de la invención. Pruebas para determinar las actividades biológicas de las eurotinonas: El receptor de tirosina quinasa KDR es la meta de prueba. El KDR juega un papel clave en el crecimiento de endotelio y en angiogenesis y consecuentemente también está involucrado en el desarrollo de tumores. El KDR consecuentemente es una molécula de meta . ¦ terapéutica importante para enfermedades de cáncer y otras enfermedades proliferantes. En la prueba, la actividad de la "quinasa KDR se mide sobre la base de la fosforilación de un" substrato de péptido específico. Además de su actividad inhibitoria en las quinasas, las eurotinonas también exhiben otras quinasas que están asimismo involucradas en el desarrollo de cáncer o en la cascada de inflación. Debido a sus valiosas propiedades farmacológicas, los compuestos de conformidad con la invención son apropiados para usarse específicamente como farmacéuticos en medicina humana y/o veterinaria. Los compuestos de conformidad con la invención se pueden utilizar en asociación con enfermedades de cáncer, en particular como agentes quimioterapéuticas. Debido a sus propiedades antiangiogénicas, y la actividad antitumor que está asociada con las mismas, en particular, se pueden emplear como remedios para degeneración maligna en animales y en seres humanos. Además de esto, es posible concebir -utilizarlas para impedir que un tumor crezca nuevamente después de que se ha completado una terapia'. Dentro del contexto de un tratamiento de tumor quimioterapéutico, las eurotinonas de la fórmula I de conformidad con la invención se pueden utilizar para monoterapia y en una terapia de combinación junto con otros agentes citostáticos . Debido a que los agentes citostáticos e inhibidores de angiogenesis tienen diferentes puntos de ataque, la terapia de combinación puede conducir a inhibidores de KDR y los agentes citostáticos previamente conócidos que tienen un efecto sinergístico.
La invención- también se relaciona con preparaciones farmacéuticas que comprenden una o más de las eurotinonas de la fórmula I de conformidad con la invención -y también, cuando sea apropiado, un agente citostático como un compuesto activo adicional. Se da preferencia a utilizar las eurotinonas en una mezcla con substancias ' auxiliares apropiadas o materiales portadores. Todos los materiales portadores farmacológicamente tolerados y/o substancias auxiliares se pueden utilizar como materiales portadores en seres humanos. La invención también se relaciona con un proceso para producir un producto farmacéutico de conformidad con la invención, cuyo proceso comprende cuando menos uno . de los compuestos de conformidad con la invención que- se. lleva, junto con un portador farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente tolerado y, en donde sea apropiado, otros compuestos activos apropiados, aditivos o 'substancias auxiliares, hacia una forma de administración apropiada. En general, los farmácéuticos de conformidad con la invención se administran oralmente, localmente o parenteralmente; sin embargo, un uso rectal .también es posible en principio. Los ejemplos de formas- de preparación galénica sólida o liquida apropiadas son gránülos, polvos, tabletas, tabletas revestidas 'con azúcar, (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas y soluciones inyectables en forma de ampolleta, y también preparaciones que tienen una liberación trazada del compuesto activo, en conexión con la producción ' de cuyo uso se hace de manera acostumbrada de substancias portadoras y aditivos y/o substancias ' auxiliares, . tales como desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchado, deslizantes o lubricantes, sáborizantes, edulcorantes y solubilizadores . Los ejemplos de · substancias portadoras o substancias auxiliares frecuentemente empleadas que se pueden mencionar son carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteina de leche, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales, polietilenglicoles y solventes, tales como agua estéril, alcoholes, glicerol y alcoholes polihidricos . Cuando sea apropiado, las unidades de dosificación pueden estar microencapsuladas para administración oral, a fin de retrasar la liberación o prolongarla- . durante un periodo relativamente largo, por ejemplo revistiendo o incrustando el compuesto activo, en forma de partícula, en polímeros, ceras o lo semejante apropiados. Se da preferencia a producir y administrar las preparaciones farmacéuticas en unidades de dosificación, con cada unidad conteniendo, como el constituyente activo, una dosis 'particular de uno o más compuestos de las eurotinonas de la fórmula I de conformidad con la invención. En los casos de unidades de dosificación sólidas, tal como tabletas, cápsulas y supositorios, esta dosis puede . ser hasta aproximadamente 500 mg, de preferencia, sin embargo, de alrededor de 0.1 a 200 mg, y, en el caso de soluciones de inyección en forma de ampolleta, puede' ser hasta aproximadamente 500 mg, de preferencia, sin embargo, de alrededor de 0.1 a 100 mg, por día. La dosis diaria que se va a administrar . depende del peso corporal, edad, sexo y condición del .paciente. Sin embargo, dosis diarias superior o inferior posiblemente también pueden ser apropiadas. La dosis diaria se puede administrar tanto por medio de una administración de solamente una vez en la forma de una sola" unidad de dosificación, o bien en varias unidades de dosificación menores, y por medio de la administración repetida de dosis subdivididas a intervalos predeterminados. La invención se aclara en los ejemplos que siguen. Los valores de porcentaje se refieren al peso. A menos que se indique de otra manera, las relaciones de mezclado en el caso de líquidos se refieren l volumen Ejemplos Ejemplo 1 Preparar un cultivo de glicerol de Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 - · 30 mi de solución nutriente (extracto de malta 2.0%, extracto de levadura 0.2%, glucosa 1.0%, (N¾)2HP04 0.05%, pH 6.0) en un matraz Erlenmeyer de 100 mi' estéril se inoculan con la cepa Eurotium echinulatum .Delacroix, DSM 13872, y se incuban, a 25°C y 140 rpm, durante 6 días en un agitador giratorio. 1.5 mi de este cultivo se diluyen subsecuentemente con 2.5 mi de 805 de glicerol y se almacenan a -135°C. Ejemplo 2 Preparar un precultivo de Eurotium echinulatum .Delacroix, DSM
13872, en un matraz Erlenmeyer 100 mi de solución nutriente (extracto · de ' malta 2.0%, extracto de levadura 0.2%, glucosa 1.0%> (N¾)2HP04 0.05%, pH 6.0) en un matraz Erlenmeyer estéril de- 300 mi se inoculan con la cepa Eurotium echinulatum Delacroix, DSM
13872, y se incuban, a 25 °C y 140 rpm, durante 7 dias en un agitador giratorio. 2 mi de este precultivo se utilizan subsecuentemente para preparar los cultivos principales. E emplo 3 Preparar un cultivo principal de Eurotium -echinulatum
Delacroix, DSM 13872, en placas de medio sólido 30 placas estériles de 25 x 25 cm ¦ se vierten utilizando 200 mi de la siguiente solución nutriente: 20 g de extracto de malta/1, 20 g de avenas íaminadás/1, 2% de agar y pH 7.0. Estas placas se inoculan con 2 mi de un precultivo y se incuban a 25°C. La producción máxima de la eurotinona de conformidad con la invención se alcanza después de aproximadamente 360 horas. Ejemplo 4 Preparar un cultivo principal liquido de Eurotiurrr echinulatum
Delacroix, . DSM 13872. Un matraz Erlenmeyer de 300 mi, estéril, que contiene 100 mi de la siguiente solución nutriente: extracto de malta 2.0%, extracto de levadura 0.2%, glucosa 1.05%, ( H^zHPO, 0.05%, pH 6, s inocula con un cultivo que se ha desarrollado en un tubo inclinado (misma solución nutriente pero conteniendo 2% de agar) o con 2 mi de un precultivo (ver el Ejemplo 2 } y se incuban, a 25°C y 140 rpm, en un agitador. La producción máxima de la eurotinona de conformidad con la invención se logra después de aproximadamente 360 horas. Un cultivo sumergido de 96 a 144 horas de edad (cantidad de inoculación aprox. 10%) de la misma solución nutriente es suficiente para inocular termentadores de 10 ' a 200 1 de volumen. Las condiciones de estos fermentadores son: Temperatura 25°C Velocidad de agitación: 200 rpm Aereación 15 1 min"1 La formación de espuma se puede suprimir añadiendo repetidamente solución de poliol etanólico. La producción máxima se alcanza después de aproximadamente 96 a 144. horas.
E emplo 5 Aislar la eurotinona de una fermentación en medio ' sólido 150 placas de medio sólido, que se incubaron como se describió en el Ejemplo 3, se liofilizaron y el liofilizado se extrajo subsecuentemente con metanol (20-30
1). El extracto de metanol se redujo a, 10 1 bajo' vacio y se diluyó con agua a un contenido de metanol de 10%. El extracto diluido se cargó subsecuentemente hacia .una columna de vidrio preparada (BPG 100, 4 1 de volumen interno, de Pharmacia Biotech) , que se llenó con aproximadamente 2 litros de MCl-Gelw CHP-20P Material -(resina adso'rbedora de Mitsubishi Chemicals, Japón) . La columna se eíuyó con un gradiente de 1005 de agua y 100% de alcohol de isopropilo. El flujo pasante de columna (1 1/6 min) se .recogió en fracciones (1 1 en cada caso) . Todas las fracciones se probaron en el ensayo de KDR y las fracciones activas (fracciones 6-14) se agruparon. Estas fracciones se redujeron bajo vacio a aproximadamente 10 1 y esta solución se diluyó nuevamente con agua de modo que el Contenido de solución de partida fuera 10%. La solución resultante se cargó nuevamente hacia una columna (ver arriba) que se llenó con aproximadamente 1.5 litros de mCl-GelÍR! CHP-20P material. La columna se eluyó con un gradiente de 100% de agua a 100% de acetonitrilo . El flujo pasante de columna. (? 1/6 min) se recogió en fracciones (1 1 en cada caso) y las fracciones (fracciones 4-11) que fueron activas en . la prueba se agruparon nuevamente. Concentrando estas fracciones bajo vacio, y liofilizando subsecuentemente,. proporcionó aproximadamente 16 g de polvo pardo. Ejemplo 6 Utilizar cromatografía para purificar la eurotinona Aproximadamente 2 g del polvo obtenido como se describió en el Ejemplo 5 se cargaron en una columna LUNA(R) 10 u C18 (2) columna (tamaño: 50 raí x 250 mm, de Phenomenex, Alemania) equipada con una precolumna LUNAÍR1 .10 u C18 (2)
(tamaño 21.2 mm x 60 mm) y cromatografiado usando un gradiente de 10% a 40% de acetonitrilo en 0.1% de' acetato de amonio/agua durante 40 minutos. El régimen de- flujo del eluyente fue 125 ml/min y el tamaño de fracción .fue 125 mi. La eurotinona estaba en fracciones 14 y 15. Liofilizando estas fracciones se proporcionaron aproximadamente 320 mg de eurotinona enriquecida. Un paso de purificación adicional, por medio de HPLC realizado en la misma columna RP-18 que arriba, se llevó a cabo utilizando un gradiente de 20% a 30% en 30 minutos. Las fracciones que contienen eurotinona se combinaron, desalaron y secaron por congelación. Esto resultó en 210 mg de eurotinona (compuesto 1)' (pureza >35%). En- este caso, también, todas las fracciones de los pasos de separación individuales se investigaron en la bioprueba. E emplo 7 :
Metilacion de eurotinona 35 mg (= 0.12 mmol} de la eurotinona obtenida como se describió en el Ejemplo 6 se disolvieron en MeOH (5 mi), después de lo cual se añadió trimetilsilildiazometano en exceso molar de 6 veces. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se concentró hasta sequedad. La mezcla resultante ' se. fraccionó cromatográficamente en una columna LÜNAÍR> 5 u C18 (-2) (tamaño: 10 mm x 250 mm) . La elución se llevó a cabo utilizando un gradiente de 20% a 60% de acetonitrilo en agua, en la presencia añadida de 0.1% de acetato de amonio', durante 50 minutos, a un régimen de flujo de 6.5 ml/minuto. El flujo pasante de columna se recogió en fracciones (en cada caso fracciones de 5.5 mi). Las fracciones 19-22 contenían 7.5 mg del derivado de dimetilo 2 , 12-dimetileurotinona (compuesto
2), mientras que las fracciones 23-25 contienen 6 mg del derivado de monometilo 2-metileurotinona (compuesto 3) . Ejemplo 8 Caracterizar eurotinona (compuesto 1) ' Las propiedades fisicoquímicas y espectroscópicas de eurotinona se pueden resumir como sigue: Fórmula empírica: Fórmula estructural:
Peso molecular: 288 UV máxima: 200, 262 y 330 nm XH MR y 1:<C NMR: ver Cuadro 1 Cuadro 1: Desplazamientos de N R-quimicos de eurotinona, c
4.5 mg/ml; DMS0-D6 a 300 K Posición d (13C) m (13C) d (XH) nJCH ·· 1 131.45 s - 6.203, 6.148
2 148.16 s - 6.203 2-OH - - 9.1 br - 3 101.85 d 6.203 6.145 4 154.66 s - 6.203, (6.148) 4-OH - - 9.1 br - 5 104.83 d 6.148 6.203 6 135.13 s br - - .·' 7 28.37 · t 3.79 br .· (6.148) 8 132.81 s - 2.147 9 142.49 s - 6:576, 2.147 9-OH - - 8.1 br 10 130.34 s - {6.578 ) (2.147
-Me 17.24 q 2 .147 6.576. 11 116.47 d 6 .576 2.147- 12 151.53 s - 6.576" 12-OH - - 9 .1 br - 13 112.19 s - 6.567, (2.147)
14 164.95 s - 6.5.67 Ejemplo 9 Caracterizar 2,12-dimetileurotinona (compuesto 2) ' Las ¦ propiedades fisicoquímicas y éspéctroscópicas de 1, 12-dimetileurotinona se pueden resumir como sigue: Fórmula empírica: Ci7Hi606 . Fórmula estructural:
Peso molecular: 316 UV máxima: 200, 262 y 330 nm . aH NMR y 3¾MR: ver Cuadro 2 Cuadro 2: Desplazamientos de MR-químicos de i, 12-dimetileurotinona, c =.2.5 mg/ml, DMS0-D6 a 300 K Posición d (13C) m (13C) d (¾) nJCH ' NOE 1 131.84 s - 6.311, 6.269 - ' 2 150.16 . s - 6.311, (6.269), - 3.728 ·2-??? 55.47 q 3.728 - '6.311 3 98.57 d 6.311 9.446, 6.269, 9.446, 3.728 3.728 4 154.81 s - 9.446, 6.311, -. .6.269 4-OH - - 9.446 - 6-311, 6.269
105.56 d 6.269 9.446, 6.311 9.446, 3.78
6 135.85 s br - ' - 7 28.19 t 3.78br 6.269 6.269, 8.385
8 131.35 s - 8.385, (6.765) - (2.205) 9 143.32 s - 8.385, 6.765," -. 2.205 9-OH - - 8.385 - 3.78, 2.205
130.91 s - 8,385, 6.765, - 2.205 10- e 17.37 q 2.205 6.765 .8.385, 6.765
11 112.95 d 6.765 3.691, 2.205 3:.691, 2.205
12 151.69 s - 6.765, 3.691 12-OMe 56.05 q 3.691 - " 6.765 13 114.67 s - 6.765, (2.205) -14 162.41 s - 6.765 Ejemplo 10 Caracterización de 2-metileurotinona (compuesto 3). Las propiedades fisicoquímicas y espectroscópicas de 2-metileurotinona se pueden resumir como sigue.:- Fórmula empírica: CisHi406 Fórmula estructural:
Peso molecular: 302 UV máxima: 200, 262 y 330 nm lE NMR y L3C NMR: ver Cuadro 3 Cuadro 3: Desplazamientos de NMR-químicos
2-metileurotinona, c = 2.5 mg/ml, DMSO-D6 a 300 K
Posición d (13C) m (13C) d (¾) nJCH NOE 1 132.16 s - 3.864, 6.249, - 6.292 2 150.21 s - 3.716, 6.249 - 2-Me 55.36 q 3.716 - 6.249 3 98.41 d 6.249 (3.716), 6,292,' 3.716, 9.207 9.207 4 155.27 s - 9.207, 6,929, . - 6.249 4-OH - - 9.207 - 6.292, 6.249
105.54 d 6.292 9.207, 6.249, 9.207, 3.864 3.864 6 134.64 s br - 3.684 - . 7 28.19 t 3.864 6.292 6.292 8 134.62 s - 7.994, 2.144, - ¦ (9.344) 9 142.78 s 7.994, 6.534, - ; 2.144, (3.864) 9-OH - - 7.994 - "2.1.44 10 129.16 s - 7.994, (6.53), - 2.144,- (3.864) 0-Me 17.34 q 2.144 6.534 7.994, 6.534
11 116.59 d 6.534 9.344, 2.144' 9.344, 2.144
12 153.30 s - 9.344, 6.534 12-OH - - 9.344 - 6.534 13 110.38 s - 9.344, 6.534, - : (2.144) 14 166.90 s - 6.534 - · Ejemplo 11 Investigación de la actividad de quinasa KDR La quinasa KDR se determina utilizando enzima purificada en placas de microtitulo de 384 pozos (Coated FlashPlates, NEN Life Science) . Las actividades de enzima se determinan por medio de fosforilación de un substrato de péptido especifico. Una serie previamente preparada de diluciones de las eurotinonas que tienen concentraciones de 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.7813, 0.3907, 0.195, 0.094, 0.047 y 0 uM se introdujeron con tubo, en el orden correspondiente, hacia los ensayos experimentales. La mezcla de reacción (etiquetada radioactivamente AtP, solución de tampón a pH 7.4 y soluciones de enzima) luego se añade y la totalidad se incuba a RT durante 1 h. Descripción del ensayo de KDR: Material y métodos Placas: FlashPlates de 384 pozos de N] EN Life Science Lector: Contador Wallac MicroBeta Trilux Reactivos: . · Substrato de pétido: PLCvl Enzima: quinasa KDR (receptor VEGF) Tampón de quinasa: 50 mM MOPS, ??7.4, 10 mM MgCl2, 2p? DTT, 2.5 mM EDTA, 10 mM ß-glicerofosfato, 1 mM ortovanadato y 1 mM ' fluoruro de sodio. Solución para revestimiento: 20 ug de substrato de péptido/ml en tampón PBS (sin Mg+ sin
Ca++ ) - ¦ ' Solución de ATP: 25 u Ci de- 33?-?-???/??1 y 12.5 uM ATP fria Solución de enzima de KDR: 3.5 ug/ml en tampón. de quinasa Solución de lavado: PBS (sin Mg++, sin Ca++) FlashPlates de 384 pozos se revisten, a 4°C y durante la noche, con 60 ul (1.2 ug/pozo) del substrato de péptido y luego se lavaron 3 x con, en cada caso, 80 ul de PBS. Las placas que se habían revestido de esta manera se pueden almacenar durante un tiempo relativamente' corto a 4°C y durante un período más. largo a -20° C. Reacción: en un volumen final de 50 ul, el ensayo contiene 10 ul de solución de eurotinona diluida 20 ul de solución de enzima a una concentración de 3.5 ug/ml (70 ng/pozo) 20 ul de solución de ATP (concentración final de 0.5 uCi de
ATP caliente y 5 uM de ATP frío/pozo) La mezcla de reacción se deja reposar a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavan subsecuentemente tres veces con 75 ul de solución de lavado en cada caso y la radioactividad se mide durante 30 segundos en un contador MicroBeta ( allac) . Todas las muestras se prueban en duplicado a una concentración final de 1:30. 16 pozos se utilizan en cada placa para probar la actividad de enzima total (= control de enzima) . 16 pozos adicionales se revisten con 4 ug de caseina/pozo, sin substrato, a fin de probar la inhibición no específica. La actividad de la quinasa de KDR se mide a través de la incorporación de fosfato radioactivo de ATP hacia el substrato, y el efecto inhibitorio de la eurotinona (IC50) se calcula de esta incorporación. La inhibición se calcula como: [1- (muestra CPM-CPM no específico) /enzima con'tr.-' CPM-CPM no específico)] x 100 (%). I valores C5o [uM] : eurotinona (compuesto 1) : 22 2, 12-dimetileurotinona (compuesto 2). 155 2-metileurotinona (compuesto 3) 18