MXPA99009355A - Kodaistatinas a, b, c y d, un proceso su produccion y su uso - Google Patents

Abstract

Las kodaistatinas A y B, compuestos de la fórmula molecular C35H34O11, y kodaistatina C y D, compuesto de la fórmula molecular C35H34O12, tienen actividad antidiabética.

Description

KODAISTATINAS A, B, C Y D, UN PROCESO SU PRODUCCIÓN Y SU USO Esta invención se refiere a los compuestos novedosos conocidos como odaistatinas A, B, C Y D, un proceso para su producción y su uso. El incremento en la velocidad de eliminación de glucosa hepática es una característica general de diabetes mellitus. En particular, hay Una fuerte correlación entre el nivel de glucosa en plasma en ayuno en diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) y eliminación de glucosa hepática. Las dos vías mediante las cuales se produce glucosa en el hígado son gluconeogénesis y glucogenólisis. Los pasos terminales de ambas vías son catalizados por la glucosa-6-fosfatasa microsomal, una enzima clave en la regulación ho eostática de los niveles de glucosa en sangre. También se ha sabido que el nivel de esta enzima es elevado en condiciones experimentales y patológicas de diabetes. La interferencia con este sistema enzimático debe, por tanto, dar origen a una producción reducida de glucosa hepática. La glucosa-6-fosfatasa hepática es un sistema de múltiples componentes compuesto de cuando menos tres actividades funcionales: una glucosa-6-fosfato translocasa (TI) , una glucosa-6-fosfato fosfohidrolasa y una fosfato/pirofosfato translocasa (T2) . La glucosa-6-fosfato translocasa facilita el transporte de glucosa-6-fosfato hacia el lumen del retículo endoplásmico (RE) . La fosfohidrolasa, con su sitio activo situado en la superficie lumenal del RE, hidroliza la glucosa-6-fosfato y libera la glucosa y el fosfato en el lumen. Aµnque la emanación de fosfato se facilita por la fosfato/pirofosfato translocasa, todavía no es claro el mecanismo exacto de la emanación de glucosa. El alto grado de especificidad del sustrato de la glucosa-6-fosfato translocasa hace de esto un objetivo potencial para la intervención farmacológica en el tratamiento de diabetes mellitus. Así, entre los azúcar fosfatos fisiológicos, solo la glucosa-6-fosfato es transportada por la translocasa. Por el contrario, la fosfatasa no es específica y es conocida por hidrolizar una variedad de esteres fosfato orgánicos.

A) Una serie de inhibidores no específicos de glucosa-6-fosfatasa ha sido descrita en la literatura, por ejemplo phlorrhizina [J. Biol. Chem., 242, 1955-1960 (1967)], ácido 5, 5' -ditio-bis-2-nitrobenzóico [Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 694-699 (1972)], 2, 2 ' -diisotiocianatoestilbeno y 2-isotiocianato-2' -acetoxiestilbeno [J. Biol. Chem., 255, 1113-1119 (1980) ] . Los primeros inhibidores de uso terapéutico del sistema glucosa-6-fosfatasa han sido propuestos en la publicación de la Patente Europea Nos. 587087 (Solicitud No. 93 114 260.8) y 587088 (Solicitud No. 92 114 261.6) . Ahora se ha encontrado que las kodaistatinas A, B, C y D tienen una actividad inhibidora de enzimas, en particular con respecto a la glucosa-6-fosfato translocasa. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es: 1) Kodaistatina A y kodaistatina B, compuestos de la fórmula C35H34O11, y las sales farmacéuticamente aceptables, esteres, éteres y por supuesto los equivalentes químicos de los mismos. La kodaistatina B tiene una estructura novedosa hasta ahora no reportada, formada por una o-hidroquinona, fenol, ?-lactona insaturada, dihidroxi-ciclopentenona y porciones carbonilo a, ß, ? d-insaturadas y es un diasterómero de kodaistatina A. Las kodaistatinas A y B son compuestos de la fórmula I siguiente: La presente invención también se refiere a: 2) Kodaistatina C y kodaistatina D, compuestos de la fórmula molecular C35H34O12, y las sales farmacéuticamente aceptables, esteres, éteres y por supuesto los equivalentes guímicos de los mismos. La kodaistatina C tiene una estructura novedosa hasta ahora no reportada hasta ahora, formada por una o-hidroguinonas, ?-lactona insaturada, dihidroxi-ciclopentenona y porciones carbonilo a, ß, ? d-insaturadas. La kodaistatina D es un diasterómero de kodaistatina C. Las fórmulas estructurales de las kodaistatinas C y D difieren de la fórmula estructural I anterior por la adición de un grupo -OH, muy probablemente en el fenilo terminal A en la posición 6. Por consiguiente, la presente invención se refiere a todas las formas esteroisoméricas de kodaistatina, así como a sus mezclas. Las formas esteroisoméricas individuales pueden ser aisladas por los métodos conocidos, por ejemplo cromatografía en fase normal, cromatografía de intercambio aniónico, HPLC o cristalización selectiva. Las sales fisiológicamente tolerables (por ejemplo, las sales de Na, K, amonio) , los esteres (por ejemplo esteres con ácidos orgánicos) , así como los eguivalentes químicos (productos de oxidación, productos de adición como hidratos) pueden ser producidos en una forma conocida para un experto en la técnica. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para la producción de los compuestos novedosos kodaistatina A, B C y D a partir del cultivo No. HIL-051652, sus mutantes y variantes. El proceso consiste en cultivar el cultivo HIL-051652, sus mutantes y variantes, bajo condiciones aeróbicas en un medio nutriente que contenga fuentes de carbono y nitrógeno, sales inorgánicas nutrientes seguido por el aislamiento y purificación del compuesto a partir del filtrado del cultivo. El medio nutriente contiene fuentes de carbono, sales inorgánicas de nitrógeno y opcionalmente fuentes de elementos en trazas. Las fuentes de carbono pueden ser, por ejemplo, almidón, glucosa, sacarosa, dextrina, fructuosa, melasas, glicerol, lactosa o galactosa, de preferencia almidón. Las fuentes de nitrógeno son, por ejemplo, harina de soya, harina de cacahuate, extracto de levadura, extracto de res, peptona, triptona, extracto de malta, licor de maceración de maíz, gelatina o ácidos casamino, de preferencia triptona y extracto de levadura. Las sales inorgánicas nutrientes pueden ser, por ejemplo, fosfato ácido de sodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, carbonato de calcio, nitrato de potasio, sulfato de amonio o sulfato de magnesio, de preferencia cloruro de sodio y carbonato de calcio. Es posible realizar el cultivo del cultivo HIL-051652 a temperaturas entre 25 y 30°C y pH entre 6.0 y 8.0. De preferencia, el cultivo No. HIL-051652 se cultiva a 25°C (+ 1°C) y pH aproximado de 7.0. La fermentación de preferencia se realiza durante 40 a 90 horas cuando se obtiene un rendimiento óptimo de los compuestos de la presente invención. Se prefiere particularmente realizar la fermentación durante 45-70 horas bajo condiciones sumergidas por ejemplo en matraces en agitación, así como en fermentadores de laboratorio. Si se desea, en el proceso de fermentación es posible utilizar agentes antiespumantes como Desmophen® (óxido de polipropileno, Bayer AG, Leverkusen, Alemania) . El progreso de la fermentación y la formación de las kodaistatinas A, B, C y D puede ser detectada midiendo la actividad de la glucosa-6-fosfato en microsomas de hígado de rata no tratados y tratados con Tritón X-100® para el rompimiento en placas de microtitulación a temperatura ambiente utilizando un ensayo colorimétrico como se describe en los Methods Enzymology, 174, 58-67 (1989) con algunas modificaciones, y HPLC. En el caldo de cultivo resultante, las kodaistatinas B, C y D están presentes como compuesto menos, y kodaistatina A como un kodaistatina mayor. Así, el material crudo activo puede ser recuperado por extracción de micelios con solventes miscibles en agua como metanol, etanol y acetona, y la extracción del filtrado del cultivo con un solvente inmiscible en agua como acetato de etilo, diclorometano, cloroformo o butanol a pH 5-8 o por cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando resinas poliméricas como "Diaion HP-20®" (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japón), "Amberlite XAD®" (Rohm y Hass Industries E. U.) carbón activado o cromatografía de intercambio iónico a pH 5-8. El método preferido es absorción sobre "Diaion HP-20®" seguido por desorción del compuesto utilizando eluyentes como agua, metanol, acetona o acetonitrilo o combinaciones de los mismos. La concentración y liofilización de los eluídos activos da el compuesto crudo. El material crudo puede ser además purificado utilizando cualguiera de las siguientes técnicas: cromatografía en fase normal (utilizando alúmina o gel de sílice como fase estacionaria y eluyentes como acetato de etilo, cloroformo, metanol o combinaciones de estos) , cromatografía en fase inversa (utilizando gel de sílice fase inversa como gel de dimetiloctadecilsilil sílice, también conocido como RP-18 o gel de dimetiloctilsil-il sílice también conocido como RP-8 como fase estacionaría y eluyentes como agua, buffers" "como fosfato, acetato, citrato (pH 2-8) y solventes orgánicos como metanol, acetonitrilo o acetona, o combinaciones de estos disolventes) , la cromatografía de permeación en gel utilizando resinas como Sephadex LH-20®' (Pharmacia Chemical Industries Suecia) , TSKgel Toyopearl HW-40F®' (TosoHass, Tosoh Corporation, Japón) en solventes como metano1, cloroformo o acetato de etilo o sus combinaciones, o "Sephadex®" G-10" y G-25 en agua; o por "cromatografía de intercambio iónico, de preferencia por cromatografía de intercambio aniónico; o por cromatografía a contracorriente utilizando un sistema eluyente bifásico constituido por dos o más solventes como agua y cloroformo. Estas técnicas pueden ser utilizadas en forma repetida o es posible utilizar una combinación de diferentes técnicas. El método preferido es cromatografía sobre Toyopearl seguido por gel de sílice modificado en fase inversa (RP-18) . El microorganismo, cultivo número Y-93, 02839 (HIL-051652), en lo sucesivo mencionado como HIL-051652, utilizado para la producción de kodaistatinas A, B, C y D fue aislado de una muestra de suelo recolectada en Kodaicanal, Tamil Nadu, India. El microorganismo HIL-051652 ha sido identificado como Aspergillus terreus Thom.. El microorganismo fue depositado el 21 de octubre de 1996 con la Germán Colecction of Microorganisms and Cell Cultures, Braunsche eig, Alemania con un número de acceso DSM No. 11247. Las kodaistatinas A, B, C y D inhiben potencialmente la actividad de glucosa-6-fosfato translocasa microsomal de hígado de rata. Los valores IC50 aproximados se dan a continuación: Kodaistatina A: 0.2 µg/ml (aproximadamente 300 nM) Kodaistatina B: 0.3 µg/ml Kodaistatina C: 0.09 µg/ml Kodaistatina D: 0.5 µg/ml Por el contrario, la kodaistatina A inhibe la actividad de la fosfatasa en microsomas rotos con detergente con una IC5o de aproximadamente 200 µg/ml (aproximadamente 300 µM; ) indicando un alto grado de especificidad para la translocasa. Además, la kodaistatina A no afecto la actividad de fosfato/pirofosfato translocasa. La kodaistatina A es un inhibidor reversible y competitivo de glucosa-6-fosfato translocasa. La kodaistatina A además fue evaluada en hepatocitos aislados de rata para su efecto sobre la eliminación de glucosa. Esta inhibe la gluconeogénesis inducida por fructosa y la glucogenólisis inducida por glucagon con valores IC50 de aproximadamente 25 µg/ml y 50 µg/ml, respectivamente. Por consiguiente, otro aspecto de la presente solicitud es el uso de kodaistatinas A, B, C y D como farmacéuticos y el uso de las kodaistatinas A, B, C y D para la producción de farmacéuticos con acción antidiabética. Otro objeto de la presente solicitud es proporcionar los farmacéuticos que contengan una cantidad activa de kodaistatinas A, B, C y D, respectivamente . La formulación galénica, el método de administración, así como el rango de dosificación de las kodaistatinas depende de las especies que van a ser tratadas y del estado de la enfermedad/trastorno respectivo y pueden ser optimizadas utilizando los métodos conocidos en la técnica. En este sentido, se hace referencia a las citas mencionadas en el párrafo A) anterior. Las kodaistatinas A, B, C y D pueden ser administradas por vía oral, por vía intramuscular o intravenosa. Estas pueden ser preparadas mezclando los compuestos con uno o más auxiliares y/o excipientes farmacológicamente tolerados como materiales de carga, emulsificadores, lubricantes, sabores enmascarantes, colorantes, sustancias amortiguadoras, y pueden ser convertidos en una forma farmacéutica adecuada como tabletas, tabletas recubiertas, cápsulas o una suspensión o solución adecuada para la administración parenteral. Los ejemplos de los auxiliares y/o excipientes que pueden mencionarse son tragacanto, lactosa, talco, agar-agar, poliglicoles, etanol y agua. Convenientes y preferidos para la administración parenteral son las suspensiones y soluciones en agua. También es posible administrar las sustancias activas como, sin vehículos o diluyentes, en una forma adecuada, por ejemplo en cápsulas. Los compuestos pueden ser convertidos en sus derivados farmacéuticamente aceptables como esteres y éteres. Los esteres pueden ser preparados haciendo reaccionar los compuestos con ácidos carboxílicos en presencia de un catalizador o mediante el tratamiento de los compuestos con agentes acilantes como cloruros ácidos. Otros métodos de preparación de los esteres se dan en la literatura, por ejemplo, en Advanced Organic Synthesis 4a. Edición, J. marzo John Wiley & Sons, 1992. Los éteres pueden ser preparados a partir de los compuestos mediante la reacción con agentes de alquilación bajo condiciones básicas. Otros métodos de preparación de los éteres se proporcionan en la literatura, por ejemplo en Advanced Organic Synthesis 4a. Edición, J. marzo John Wiley & Sons, 1992. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la presente invención pero no limitativos del alcance de la misma: Ejemplo I Aislamiento de cultivo HIL-051652 a partir de muestra de suelo (a) composición de medio nutriente para el aislamiento (agar saburo) Peptona 10.0 g Glucosa 40.0 g Agar 13.0 g Agua demineralizada 1.0 litro pH 7.0 (b) Plaqueo y aislamiento de la muestra de suelo g de suelo recolectado de kodaicanal, tamil Nadu India, fue adicionado a 90 ml de agua demineralizada, esterilizada, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que fue luego agitado durante 2 horas en un agitador rotatorio (220 rpm) . La suspensión de suelo anterior fue luego diluida en serie en pasos de 10 hasta 10~5. De la última dilución se colocó 1 ml de suspensión en el centro de una placa de petri de vidrio, estéril, de diámetro 15 cm) en la cual luego fue vaciado aproximadamente 50 ml del medio para aislamiento, anterior, complementado con 50 µg/ml de cloranfenicol y 0.5% de propionato de sodio. El medio fue enfriado a 45°C y la placa fue mezclada perfectamente. La mezcla de la suspensión de suelo y medio fue dejada en reposo e incubada a 25°C (± 1°C) durante 7 días. La placa de petri fue observada periódicamente y el cultivo No. HIL-051652 fue aislado de entre los microorganismos en crecimiento.

Ejemplo II Mantenimiento del cultivo HIL-051652 El cultivo No. HIL-051652 se mantuvo en medio saburo agar mencionado en el Ejemplo I.

Después de disolver los ingredientes antes mencionados perfectamente por calentamiento, fueron distribuidos en tubos de prueba y luego esterilizados a 121°C durante 20 minutos. Los tubos de prueba fueron entonces enfriados y se permitió la solidificación en una posición inclinada. El agar inclinado fue sembrado con el crecimiento del cultivo HIL-051652 mediante una asa de alambre e incubados a 25°C (± 1°C) hasta que se observó buen crecimiento. Los cultivos con buen crecimiento fueron almacenados en el refrigerador a 8°C.

Ejemplo III Fermentación de cultivo HIL-051652 en matraces en agitación Composición del medio de semilla: Almidón 15.0 g Glucosa 5.0 g Harina de soya 15.0 Extracto de levadura 2.0 g Licor de maceración de maíz 1.0 g NaCl 5.0 g CaC03 2.0 g Agua demineralizada 1.0 litro pH 6.8 El medio simiente anterior fue distribuido en cantidades de 80 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y fueron sometidos a autoclave a 121°C durante 20 minutos. Los matraces fueron enfriados a temperatura ambiente y cada matraz fue entonces inoculado con una asa del cultivo con buen crecimiento antes mencionados del Ejemplo II y fueron agitados en un agitador rotatorio durante " 72 horas a 240 rpm a 25°C (± 1°C) para obtener el cultivo simiente.

Composición del medio de producción Almidón 20.0 g Glucosa 15.0 g Triptona 5.0 Extracto de levadura 5.0 g Extracto de carne de res 3.0 g CaC03 4.0 g Agua demineralizada 1.0 litro pH 6.5 El medio de producción fue distribuido en cantidades de 60 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y sometido a autoclave a 121°C durante 20 minutos. Los matraces fueron enfriados a temperatura ambiente y luego inoculados con el cultivo simiente antes mencionado (1% v/v) . La fermentación se realizó en un agitador rotatorio a 240 rpm y a una temperatura de 25°C (+ 1°C) durante 40-48 horas. La producción de los compuestos activos fue monitoreada midiendo la inhibición de la glucosa-6-fosfato translocasa. Después de cosechar, el caldo de cultivo fue centrifugado y las kodaistatinas A, B, C y/o D fueron aisladas del filtrado de cultivo y purificadas como se describe en el Ejemplo V.

Ej emplo IV Fermentación del cultivo No. HIL-051652 en fermentadores Etapa 1: Preparación del cultivo simiente en matraces en agitación El medio simiente del Ejemplo III fue distribuido en cantidades de 160 ml en matraces Erlenmeyer de 1 L y sometidos a autoclave durante 20 minutos. El cultivo simiente fue crecido en estos matraces como se describe en el Ejemplo III.

Etapa 2 : Preparación del cultivo simiente en fermentador 75 litros del medio simiente, como se describe en el Ejemplo III, en un fermentador Marubishi de 100 litros fue esterilizado in situ durante 45 minutos a 121°C, enfriado a 25 + 1°C y sembrado con 3 litros del cultivo simiente antes mencionados .

La fermentación se realizó con los siguientes parámetros : Temperatura 25°C (± 0.5°C) Agitación 80 rpm Aereación 50 1/min Tiempo de cosecha 50 h Etapa 3: Fermentación a gran escala 750 litros del medio de producción, como se describe en el Ejemplo III, en un fermentador Marubishi de 1000 litros junto con 175 ml _de Desmophen® (óxido de polipropileno) como a gente antiespumante, fue esterilizado in situ durante 45 minutos a 121°C, enfriado a 25°C ± 1°C y sembrado con 75 litros del cultivo simiente de la etapa 2.

La fermentación se realizó con los siguientes parámetros : Temperatura 25°C (+ 0.5°C) Agitación 50 rpm Aereación 350 1/min Tiempo de cosecha 40-44 h La producción del compuesto activo fue monitoreada midiendo la inhibición de glucosa-6-fosfato translocasa. Cuando la fermentación se descontinuó, el pH del caldo de cultivo fue 6.0-7.0. El caldo de cultivo fue centrifugado después de la cosecha y los inhibidores de glucosa-6-fosfato translocasa, kodaistatinas A, B, C y/o D fueron aislados del filtrado del cultivo como se describe a continuación en el Ejemplo V.

Ejemplo V Aislamiento y purificación de kodaistatinas A, B, C y/o D Aproximadamente 1000 litros del caldo de cultivo fueron cosechados y separados del micelio (110 kg) por centrifugación. Las kodaistatinas A, B, C y D estuvieron presentes en el micelio así como en el filtrado del cultivo. El filtrado del cultivo (830 litros) fue combinado con extracto de la masa celular con 30% de metanol en agua (330 litros) pasados a través de la columna de Diaion HP-20® (35 litros, 3% v/v) . La columna fue perfectamente lavada con agua demineralizada (50 litros) y luego eluida con un gradiente de CH3CN en agua. Así, la elusión se realizó con 10% de CH3CN (90 litros) y 30% de CH3CN (90 litros) . Las fracciones fueron recolectadas en medidas de 15 litros. Los eluidos activos (3 x 15 litros) , obtenidos con 30% de CH3CN fueron combinados, concentrados a presión reducida de 10-100 mm de Hg a 35°C y liofilizados para producir el material activo crudo (225 g) , kodaistatina A con una IC5o de 25 µg/ml. El material crudo así obtenido fue purificado en forma secuencial por 2 cromatografías de permeación en gel sucesivas sobre TSKgel Toyopearl HW-40F® variando las relaciones sustrato a gel. Así, el material crudo anterior fue separado en 15 lotes de 15 g cada uno y pasado a través de Toyopearl HW-40F® (1.5 litros) empacado en una columna de vidrio Latek-Sáulen M 6-48. La fase móvil fue 10% de CH3CN en agua y la velocidad de flujo se mantuvo a 10 ml/min a 3-5 bars. Las fracciones fueron recolectadas en tamaños de 250 ml . Los eluidos activos fueron combinados, concentrados a presión reducida de 10-100 de Hg a~ 35°C y liofilizados para obtener el material activo enriquecido (3.0 g) kodaistatina A con una IC50 de 1-1.5 µg/ml. El material enriquecido anterior fue además fraccionado en 10 lotes de 30 mg cada uno pasándolos a través de TSKgel Toyopearl HW-40F® (500 ml) empacado en una columna de vidrio Latek-Sáulen M 4-48. La fase móvil fue 10% CH3CN en agua y la velocidad de flujo se mantuvo a 1.5-2.0 ml/min. Las fracciones fueron recolectadas en medidas de 20 ml. Todas las fracciones activas fueron combinadas, concentradas bajo presión de 10-100 mm de Hg a 35°C y liofilizadas para obtener el material semi-puro con un contenido de las sustancias activas kodaistatina A con una IC50 de 0.375 µg/ml como el compuesto principal y kodaistatinas B, C y/o D como los compuestos menores (0.85 g) . Las kodaistatinas B, C y D finalmente fueron separadas de kodaistatina A como la fase móvil a una velocidad de flujo de 8 ml/min y detección a 294 nm para obtener kodaistatina B pura (0.004 g) , kodaistatina C (0.011 g) y kodaistatina D (0.004 g) .

La pureza de las kodaistatinas B, C y D fue verificada por HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) sobre una columna LiChrocart-250-4 RP Select B (5 µ) utilizando un gradiente de 0.1% de ácido ortofosfórico acuoso (pH 2.5) hasta CH3CN en 20 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/min y detección al UV a 294 nm a 40°C. La kodaistatina A semi-pura, así obtenida, finalmente fue purificada por HPLC preparativa sobre una columna de 16 x 250 mm Eurosphere C-18 (10 µ) utilizando 20% de CH3CN en agua como la fase móvil a una velocidad de flujo de 8 ml/min y detección a 294 nm para obtener kodaistatina A pura (0.14 g) con una IC50 de 0.2 µg/ml. Las propiedades físico-químicas y espectrales de kodaistatina A se resumen en las Tablas 1 y 1A, de kodaistatina C en la Tabla 2, de kodaistatina B en la Tabla 3 y de kodaistatina D en la Tabla 4.

Tabla 1 Kodaistatina A Naturaleza sólido amarillo Solubilidad MeOH, CH3CN y DMSO Punto de fusión > 200°C (descomposición) [ ]D -85.7°C (c 0.042, metanol) cromatografía líquida tiempo de retención: 7.3 min. columna de alta resolución ODS-hipersil (5 µ) [4 mm x (30 +- 250) mm] ; (HPLC) eluyente: CH3CN-H20 (20:80) velocidad de flujo: 1 ml/min; detección: 294 nm figura de los dibujos anexos peso molecular: 630 (ESI-MS) fórmula molecular: C35H3O11 [Observado: m/z 631.2174 (M + H)+ (HR FAB-MS, matriz: TEA/NBA, referencia interna: PEG 500) ; calculado para C35H35C11: 631.2179] UV: " Figura 2 de los dibujos anexos IR (Kbr) Figura 3 de los dibujos anexos 1HNMR (300 MHz, DMS0-d6) Figura 4 de los dibujos anexos XCNMR (150 MHz, DMSQ-d6) figura 5 de los dibujos anexos Tabla 1A - Datos de XH y 13C de kodaistatina A en metanol-D4, ppm reí. TMS, 278K Tabla ÍA (continuación) Tabla 2 Kodaistatina C Naturaleza sólido amarillo Solubilidad MeOH y DMSO Punto de fusión > 200°C (descomposición) [a]D -20.0° (c 0.04, metanol) HPLC RT 12.81 min. La figura 6 de los dibujos anexos Peso molecular 646 (ESI-MS) Análisis elemental Encontrado: C, 64 .52 ; H, 5.41 Calculado para C35H34O12 C, 65. 01 ; H, 5.26 Fórmula molecular : C35H3 0i2 UV Figura 7 de los dibujos anexos IR (KBr) Figura 8 de los dibujos anexos 41 NMR (300 MHz, DMSO-d6) Figura 9 de los dibujos anexos 13C NMR (d, 75 MHz, DMSO- 208.78, 201.38, 194.58, 176.28, 172.24, de) 166,94, 148.70, 146.83, 146.61, 145.49, 145.10, 144.99, 142.76, 134.56, 131.77, 126.03, 124.86, 122.69, 122.46, 121.60, 116.99, 116.32, 115.32, 112.48, 100.12, 90.36, 89.75, 84.70, 37.29, 34.34, 29.37, 28.17, 19.95, 12.17 y 11.75 Tabla 3 Kodaistatina B Naturaleza sólido amarillo Solubilidad MeOH y DMSO Punto de fusión > 200°C (descomposición) HPLC RT 13. 45 min Peso molecular 646 (ESI-MS) Fórmula molecular C35H34O11 UV (65:35 CH3CN-0.1% ácido 240, 300 y 375 nm ortofosfórico) 4í NMR (300 MHz, DMS0-d6) Figura 10 de los dibujos anexos, Tabla 4 Kodaistatina D Naturaleza sólido amarillo Solubilidad: MeOH y DMSO Punto de fusión: > 200°C (descomposición) HPLC RT. 12 . 67 min Peso molecular: 646 (ESI-MS ) Fórmula molecular: C35H34O12 UV ( 65 : 35 CH3CN-0. 1% ácido 285 y 380 nm ortofosfórico) : 4í NMR (300 MHz, DMá?-d6) . Figura 11 de los dibujos anexos.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Kodaistatina A/B, un compuesto de la fórmula I y las formas estereoisoméricas, las sales farmacéuticamente aceptables, esteres, éteres y por supuesto los equivalentes químicos de los mismos.

2. Kodaistatina A/B, un compuesto de la fórmula molecular C35H34O11 y sus sales, esteres y éteres farmacéuticamente aceptables .

3. Kodaistatina A/B, un compuesto de la fórmula molecular C35H34O11 que puede obtenerse cultivando el microorganismo Aspergillus terreus Thom HIL-051652 (DSM 11247) en un medio nutriente que contenga fuentes de carbono y nitrógeno, sales inorgánicas y elementos en trazas, y aislando y purificando el compuesto a partir del caldo de cultivo en una forma acostumbrada.

4. Kodaistatina C/D, un compuesto de la fórmula molecular C35H34O12 y sus sales, esteres y éteres farmacéuticamente aceptables .

5. Kodaistatina C/D, un compuesto de la fórmula molecular C35H34O12, obtenible cultivando el microorganismo Aspergillus terreus Thom HIL-051652 (DSM 11247) en un medio nutriente que contenga fuentes de carbono y nitrógeno, sales inorgánicas y elementos en trazas, y aislando y purificando el compuesto a partir del caldo de cultivo en una forma acostumbrada.

6. Kodaistatina A, B, C ó D con una o más de las propiedades físicas mencionadas en las Tablas 1, 3, 2 ó 4, respectivamente .

7. Un proceso para la preparación de kodaistatina A, B, C ó D, que consiste en cultivar un microorganismo Aspergillus terreus Thom HIL-051652 (DSM 11247) bajo condiciones aeróbicas en un medio nutriente gue contenga fuentes de carbono y nitrógeno, sales inorgánicas y elementos en trazas, y aislando y purificando el compuesto a partir del caldo de cultivo en una forma acostumbrada. 8. El proceso como se menciona en la reivindicación 7, en donde el cultivo se realiza a temperaturas entre aproximadamente 25 y 30°C y un pH entre 6 y

8.

9. El proceso como se menciona en la reivindicación 7 u 8, en donde el cultivo se realiza a 25°C (± 1°C) y un pH de aproximadamente 7.0.

10. El proceso como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 7 y 9, en donde el cultivo se realiza como fermentación sumergida.

11. Un farmacéutico que contiene un compuesto como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con auxiliares y/o _ excipientes acostumbrados para la preparación de los farmacéuticos.

12. El uso de un compuesto como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un farmacéutico con actividad inhibidora de la glucosa-6-fosfato translocasa.

13. El uso de un compuesto como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un farmacéutico con acción antidiabética.

14. Aspergillus terreus Thom HIL-051652 (DSM 11247).