ES2240774T3 - Eurotinona y sus derivados, procedimiento para su fabricacion y uso de los mismos. - Google Patents
Eurotinona y sus derivados, procedimiento para su fabricacion y uso de los mismos.Info
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Abstract
Compuesto de la fórmula general I en la que R(1), R(2), R(3) y R(4) significan, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo (C1-C6), alquenilo (C2-C6), alquinilo (C2-C6); cicloalquilo C3-C6 o alquil (C1-C3)-cicloalquilo (C3-C6), restos alquilo que eventualmente pueden estar sustituidos con uno o varios restos, en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.
Description
Eurotinona y sus derivados, procedimiento para su
fabricación y uso de los mismos.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos de la fórmula general I
en la que R(1), R(2),
R(3) y R(4) representan, independientemente entre sí,
hidrógeno o un resto alquilo. Los compuestos de fórmula I son
inhibidores de la KDR-quinasa y, a causa de su
acción antiangiogenética, son adecuados para la prevención y/o el
tratamiento de enfermedades malignas. Los compuestos de fórmula I
son obtenibles mediante fermentación del microorganismo Eurotium
echinulatum Delacroix (DSM 13872) o por derivatización química
de los compuestos obtenidos por la fermentación del microorganismo
citado. La invención se refiere por tanto también a un procedimiento
para la preparación de los compuestos de fórmula I, a la utilización
de los compuestos de fórmula I para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades malignas y de enfermedades que
se pueden tratar inhibiendo la KDR-quinasa, así como
a preparados farmacéuticos que contienen como mínimo un compuesto de
la fórmula
I.
El cáncer es una enfermedad del hombre y de los
animales, con desenlace mortal en la mayoría de los casos, que está
causada por el crecimiento descontrolado de células del cuerpo.
Cáncer es la expresión de la formación de nódulos malignos
(malignomas), de neoplasmas (tumores o carcinomas) o de la
degeneración maligna así como de la perturbación de la maduración de
células blancas (leucemia, cáncer de la sangre). Las células
cancerosas o tumorales se forman por transformación de células del
cuerpo. La malignidad de las células cancerosas se expresa en la
autonomía del crecimiento, esto es, en su capacidad de crecer sin
impedimento y desordenadamente fuera del plan de desarrollo de los
órganos, infiltrándose. Una señal segura de la malignidad es la
formación de colonias (metástasis) alejadas del tumor después de una
invasión hematógena o linfógena de células tumorales. El cáncer es
una de las causas más frecuentes de la muerte del hombre y, por
tanto, existe una gran necesidad de métodos y medios para la
curación o el tratamiento de degeneraciones malignas.
La posibilidad de una terapia de tumores malignos
comprende, junto a la extirpación -si es posible, radical- del
tumor, la terapia radiológica con rayos X, radiación \alpha,
\beta, \gamma, la inmunoterapia y la quimioterapia. La
inmunoterapia es por ahora sólo aplicable de forma limitada. Por
quimioterapia de tumores se entiende la administración de venenos de
las células (citostáticos) para el tratamiento de tumores y de
células tumorales que quedan después de un tratamiento quirúrgico o
radiológico tópico. Estas sustancias atacan específicamente
determinados procesos de la división celular, de manera que
reaccionan más sensiblemente los tejidos con una proporción alta de
células que se dividen, como los tejidos tumorales que crecen
rápidamente. Se usan al efecto compuestos de alquilación como, por
ejemplo, ciclofosfamida (The Merck Index, 12ª edic., pág. 463),
antimetabolitos como el metotrexato (The Merck Index, 12ª ed.,
página 1025), alcaloides como vincristina (The Merck Index, 12ª ed.,
página 1704) y antibióticos como daunomicina (The Merck Index, 12ª
ed., página 479) sí como adriamicina (The Merck Index, 12ª ed.,
páginas 581-582). Todos estos agentes tienen grandes
inconvenientes debido a sus masivos efectos secundarios, por lo que
con ellos se demora la muerte del enfermo, pero no se evita. Además,
en células degeneradas (cancerosas) se presentan resistencias frente
a los agentes aplicados, por lo que los medicamentos actuales no
actúan citostáticamente, sino como tóxicos a causa de los efectos
secundarios. Ha de decirse al respecto, que se ha visto que una
aplicación combinada o secuencial de citostáticos supera la eficacia
de un citostático individual (monoterapia) y por ello es posible en
la poliquimioterapia no sumar los considerables efectos secundarios.
Por esta razón, se necesitan urgentemente nuevos agentes
quimioterapéuticos, cuya búsqueda es universal.
El crecimiento de tumores supone un suministro
suficiente de oxígeno al tumor, que sólo está garantizado por un
riego sanguíneo suficiente (vascularización) del tumor. Los tumores
no son capaces de formar nuevos vasos sanguíneos (=angiogénesis),
sino que deben ocasionar la angiogénesis del tejido conjuntivo del
entorno.
La formación de nuevos vasos sanguíneos a partir
de un sistema vascular ya existente tiene una importancia central
para el desarrollo embrionario y el desarrollo de órganos. Una
angiogénesis anormal incrementada se observa, entre otras dolencias,
en la artritis reumatoide, la retinopatía diabética y el crecimiento
de tumores (Folkman 1995, Nat. Med., 1, 27-31). La
angiogénesis es un proceso complejo de etapas múltiples que incluye
activación, migración, proliferación y supervivencia de células
endoteliales.
En combinación con otros sistemas de señalización
específicos del endotelio, los denominados factores del crecimiento
endotelial vascular (VEGFRs) presentan señales para la migración
celular endotelial, proliferación y supervivencia de las células. La
familia de VEGFR comprende los subtipos VEGFR-1
(Flt-1), VEGFR-2 (KDR) y
VEGFR-3 (Flt-4). Mientras que
VEGFR-1 y VEGFR-2 actúan como
reguladores universales de células endoteliales, el
VEGFR-3 controla principalmente el crecimiento del
sistema vascular linfático. Los VEGFR juegan un papel clave en tales
etapas del proceso angiogenético.
Estudios extensivos en el campo de la
angiogénesis tumoral durante los últimos 20 años han descrito un
gran número de potenciales dianas terapéuticas, por ejemplo
quinasas, proteasas e integrina. Esto condujo al descubrimiento de
nuevos agentes antiangiogenéticos, de los que algunos están ya en
fase de ensayos clínicos (Jekunen y otros, 1997, Cancer Treatment
Rev., 23, 263-286). Los inhibidores de la
angiogénesis podrían utilizarse tanto para la monoterapia como
también la terapia de combinación con otros citostáticos en el marco
de un tratamiento quimioterapéutico de tumores. Además, puede
pensarse en el uso para la prevención de un renovado crecimiento de
un tumor después de haber realizado la terapia.
La inhibición, o la regulación, de
VEGFR-2 (KDR) es un mecanismo de reacción que ofrece
un nuevo enfoque para el tratamiento de una multiplicidad de tumores
sólidos. Así, la activación de este receptor de tirosinaquinasa es
decisiva para el crecimiento celular endotelial y la nueva formación
de vasos en la angiogénesis y, por ello, tiene influencia sobre el
crecimiento tumoral y la formación de matástasis. Además, hay nuevos
datos en cuanto a que la expresión de VEGF contribuye a la
supervivencia de células tumorales después de terapia radiactiva o
quimioterapia (Lee, C.G., Heijn, M. y otros, 2000, Cancer Research,
60 (19), 5565-70). Esto subraya la importancia de un
posible efecto sinérgico de inhibidores de KDR con los citostáticos
conocidos hasta ahora.
Se ha encontrado, sorprendentemente, que el
microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) es
capaz de formar una sustancia activa que presenta una acusada acción
inhibidora sobre la KDR-quinasa y, por ello,
representa un eficaz inhibidor de la angiogénesis. El nuevo
compuesto se denominará eurotinona en lo que sigue, y es, junto con
derivados de eurotinona, objeto de la invención.
La presente invención se refiere, por tanto, a
compuestos de la fórmula general I
en la
que
R(1), R(2), R(3) y
R(4) representan, independientemente entre sí, en cada caso,
hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{6}), alquenilo
(C_{2}-C_{6}), alquinilo
(C_{2}-C_{6}), cicloalquilo
(C_{3}-C_{6}) o alquil
(C_{1}-C_{3})-cicloalquilo
(C_{3}-C_{6}), en todas sus formas
estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción,
así como sus sales fisiológicamente tolerables.
Alquilo C_{1}-C_{6} puede
significar alquilo de cadena lineal o ramificada con 1 a 6 átomos de
C como, por ejemplo, metilo, etilo, i-propilo,
t-butilo y hexilo;
alquenilo C_{2}-C_{6} puede
significar alquenilo de cadena lineal o ramificada con 2 a 6 átomos
de C como, por ejemplo, alilo, crotilo o pentenilo;
alquinilo C_{2}-C_{6} puede
significar alquinilo de cadena lineal o ramificada con 2 a 6 átomos
de C como, por ejemplo, propinilo, butinilo y pentinilo.
Son ejemplos de cicloalquilo
(C_{3}-C_{6}) ciclopropilo, ciclobutilo,
ciclopentilo o ciclohexilo.
Los mencionados restos alquilo pueden estar
sustituidos con uno o más restos. Éstos pueden ser, por ejemplo,
halógeno como cloro, bromo, flúor; hidroxi; alcoxi con 1 a 4 átomos
de C, en especial metoxi, y/o trifluoro-metilo.
Preferiblemente, en la fórmula I, R(1) a
R(4) representan, cada uno de ellos independientemente,
hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{6}).
Son especialmente preferidos compuestos de la
fórmula I en los que
(a) R(1) a R(4) son hidrógeno
(=eurotinona);
(b) R(1) a R(3) son hidrógeno y
R(4) es alquilo (C_{1}-C_{6}), en
especial, metilo;
(c) R(1), R(2) son hidrógeno y
R(3), R(4) son alquilo
(C_{1}-C_{6}), en especial metilo; en todas sus
formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier
proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.
La invención concierne, por tanto, en especial a
la eurotinona de fórmula
así como a sus sales
fisiológicamente
tolerables.
La invención concierne también a la
2,12-dimetileurotinona de la fórmula
y la
2-metileurotinona de
fórmula
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
De acuerdo con la invención, los compuestos de la
fórmula I son obtenibles por fermentación del microorganismo
Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) o sus variantes o
mutantes en condiciones adecuadas. Por aislamiento posterior de los
compuestos y eventual conversión en derivados químicos, así como sus
sales fisiológicamente tolerables, se obtienen las eurotinonas.
La invención se refiere, además, a un
procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I,
caracterizado porque se hace fermentar el microorganismo Eurotium
echinulatum Delacroix (DSM 13872) o sus variantes o mutantes en
condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que la
eurotinona se acumula en el medio de cultivo o en el microorganismo,
y seguidamente se aísla del medio de cultivo o el microorganismo y,
eventualmente, se convierte en derivados químicos y/ sales
fisiológicamente tolerables.
En la bibliografía se describen muchas reacciones
para la alquilación de fenoles. La alquilación de los grupos OH
fenólicos de los presentes compuestos puede, por tanto, realizarse
conforme a reacciones químicas en sí conocidas. Por ejemplo, una
derivatización a los derivados alquilados de la eurotinona puede
realizarse, por ejemplo, por reacción con halogenuros alquílicos
tales como bromuros de alquilo o yoduros de alquilo, ésteres de
ácidos alquilsulfónicos tales como mesilatos, tosilatos o triflatos,
así como diazoalcanos como diazometileno o
trimetilsilil-diazometano.
En lo que sigue se describirá detalladamente la
invención, en especial en sus formas de realización preferentes.
Las eurotinonas de acuerdo con la invención se
producen mediante el hongo Eurotium echinulatum, preferentemente
mediante Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872.
El hongo Eurotium posee un micelio sustrato
amarillo/pardo y poco micelio aéreo. Forma en cultivo los cuerpos
fructíferos característicos de Eurotium, los peritecios. Las
ascosporas son bolas esféricas aplanadas. Tienen una típica armila
ecuatorial. El hongo es ubicuo y prefiere ambientes secos. Como
sinónimo se usa también la designación Aspergillus
echinulatus.
Se depositó en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) (Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos de Células), Mascheroder Weg 1B, 38124
Braunschweig, Alemania, de conformidad con las reglas del Tratado de
Budapest de 15.11.2000, un aislado de Eurotium echinulatus
Delacroix, bajo el siguiente número: DSM 13872.
En un medio de cultivo sólido o líquido que
contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno así como
las sales inorgánicas corrientes, Eurotium echinulatum
Delacroix DSM 13872 produce la eurotinona conforme a la
invención.
En vez de la cepa Eurotium echinulatum
Delacroix DSM 13872 pueden emplearse también sus mutantes y
variantes, que sintetizan igualmente la eurotinona de acuerdo con la
invención.
Tales mutantes pueden generarse de forma en sí
conocida por medios físicos, por ejemplo irradiación con rayos
ultravioleta o rayos X, o por mutágenos químicos como, por ejemplo,
metanosulfonato de etilo (EMS),
2-hidroxi-4-metoxi-benzo-fenona
(MOB) o
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), o por aplicación de métodos de ingeniería genética.
Las condiciones de fermentación que se describen
seguidamente son válidas para Eurotium echinulatum, el aislado de
Eurotium echinulatium Delacroix DSM 13872 depositado, así
como para sus mutantes y variantes.
El procedimiento de acuerdo con la invención
puede utilizarse para la fermentación a escala de laboratorio (en el
intervalo de mililitros a litros) y a escala industrial (escala de
metros cúbicos). Todos los porcentajes son en peso a no ser que se
indique lo contrario. Las proporciones de mezcla en líquidos se
refieren al volumen si no se hace cualquier indicación
diferente.
El procedimiento conforme a la invención abarca
el cultivo de Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, sus
mutantes y/o variantes en condiciones aeróbicas en un medio de
cultivo que contiene una fuente de carbono y una fuente de
nitrógeno, sales inorgánicas y, eventualmente, oligoelementos. La
cepa Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 forma la
eurotinona en soluciones nutrientes que contienen glucosa, almidón,
copos de avena o glicerina.
Como fuentes preferentes de carbono para la
fermentación son adecuados hidratos de carbono y alcoholes de
azúcares asimilables, como glucosa, lactosa, sacarosa o
d-manitol, así como productos naturales que
contienen hidratos de carbono como, por ejemplo, extracto de malta o
extracto de levadura. Como sustancias nutrientes que contienen
nitrógeno se consideran: aminoácidos, péptidos y proteínas, así como
sus productos de degradación, como caseína, peptona o triptona,
además de extractos de carne, extractos de levadura, semillas
molidas, por ejemplo de maíz, trigo, habas, soja o del algodón,
residuos de destilación de la obtención de alcoholes, harinas de
carne o extractos de levaduras, pero también sales amónicas y
nitratos, pero en especial también péptidos obtenidos por vía
sintética o biosintética. Como sales inorgánicas, la solución
nutriente puede contener, por ejemplo, cloruros, carbonatos,
sulfatos o fosfatos de metales alcalinos o alcalinotérreos, hierro,
zinc, cobalto y manganeso.
La formación de la eurotinona de acuerdo con la
invención se desarrolla especialmente bien, por ejemplo, en una
solución nutriente que contiene aproximadamente 0,05 a 5%,
preferiblemente 1 a 2% de extracto de malta, aproximadamente 0,05 a
3%, preferiblemente 0,05 a 1% de extracto de levadura y 0,2 a 5%,
preferiblemente 0,5 a 2% de glucosa, 0,5 a 3%, preferiblemente 1,5 a
3% de copos de avena. Los porcentajes se refieren en cada caso al
peso de la totalidad de la solución nutriente.
El cultivo del microorganismo se efectúa
aeróbicamente, por ejemplo sumergido, con sacudidas o agitación en
matraces de sacudida, o en fermentadores o sobre un medio sólido,
eventualmente con aportación de aire u oxígeno. Se puede efectuar en
un intervalo de temperaturas de aproximadamente 15 a 35ºC,
preferentemente a aproximadamente 20 hasta 35ºC, en especial a
25-30ºC. El intervalo de pH debería estar entre 3 y
10, preferiblemente entre 6,5 y 7,5. Por lo general, en estas
condiciones se cultiva el microorganismo en un período de tiempo de
48 a 720 horas, preferiblemente de 72 a 720 horas. Es ventajoso el
cultivo en varias etapas, esto es, se producen primeramente uno o
varios precultivos en un medio nutriente líquido, que luego se
inocula en el medio de producción propiamente dicho, el cultivo
principal, por ejemplo en una proporción en volumen de
1:10-1:100. El cultivo previo se obtiene, por
ejemplo, sobreinoculando el micelio en una solución nutriente y
dejando crecer durante aproximadamente 20 a 120 horas,
preferiblemente 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener, por
ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 1 a 40 días,
preferiblemente durante 15 a 20 días, en un medio nutriente sólido o
líquido, por ejemplo
levadura-malta-agar, copos de
avena-agar o dextrosa de
patata-agar.
El hongo Eurotium echinulatum Delacroix
DSM 13782 puede formar el compuesto eurotinona en un cultivo
superficial o fijo sobre medios nutrientes sólidos. Los medios
nutrientes sólidos se obtienen añadiendo, por ejemplo, agar o
gelatina a medios nutrientes acuosos. Sin embargo, también es
posible obtener la eurotinona por fermentación del hongo Eurotium
echinulatum Delacroix, DSM 13872, por el procedimiento de inmersión,
esto es, en suspensión acuosa. La eurotinona puede presentarse tanto
en el micelio como en el filtrado del cultivo, usualmente la mayor
cantidad se encuentra en el filtrado del cultivo. Si se trata de un
cultivo en medio líquido, entonces primeramente se separa el micelio
del caldo de cultivo por el procedimiento habitual y, seguidamente,
se extrae la eurotinona de la masa celular con un disolvente
orgánico, eventualmente miscible con agua. La fase del disolvente
orgánico contiene el producto natural de acuerdo con la invención,
eventualmente, se concentra en vacío y se purifica como se describe
más adelante.
El filtrado del cultivo se combina en algunos
casos con el concentrado del extracto de micelio y se somete a
extracción con un disolvente orgánico adecuado, no miscible con
agua, por ejemplo, con n-butanol. La fase orgánica
separada se concentra a continuación eventualmente en vacío. Se
prefiere separar directamente por cromatografía el filtrado del
cultivo, como se describe posteriormente.
De manera conveniente se liofiliza primeramente
el cultivo superficial y, seguidamente, se somete a extracción con
metanol o 2-propanol, pero pueden utilizarse también
otros disolventes. Posteriormente se liofiliza el extracto
obtenido.
La posterior purificación de la eurotinona de
acuerdo con la invención se realiza por cromatografía en materiales
adecuados, por ejemplo en tamices moleculares, en soportes de fase
normales como, por ejemplo, gel de sílice, óxido de aluminio, en
intercambiadores de iones, pero preferentemente en resinas
adsorbentes y en fases invertidas (RP). La eurotinona se aísla con
ayuda de esta cromatografía. La cromatografía se realiza con
soluciones acuosas tamponadas o mezclas de soluciones acuosas y
orgánicas.
Por mezclas de soluciones acuosas u orgánicas se
entienden todos los disolventes orgánicos mezclables con agua,
preferentemente metanol, 2-propanol y acetonitrilo,
en una concentración de 10 a 80% de disolvente, preferiblemente de
15 a 55% de disolvente, y también todas las soluciones acuosas
tamponadas que son mezclables con los disolventes orgánicos.
Por soluciones acuosas tamponadas o acidificadas
se entiende, por ejemplo, agua, tampón de fosfato, acetato amónico,
tampón de citrato en una concentración de 1 mM a 0,5 M, así como
ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los
ácidos comercialmente corrientes, conocidos por los expertos,
preferiblemente en una concentración de 0,01 a 3%, en especial de
0,1%.
Se cromatografía con un gradiente que comienza
con 100% de tampón acuoso y finaliza con 100% de disolvente,
preferiblemente 2-propanol o acetonitrilo. Para
purificar la eurotinona de acuerdo con la invención, preferiblemente
se trabaja con un gradiente lineal de 10 a 60% de acetonitrilo en
solución acuosa tamponada.
La eurotinona y sus derivados químicos de fórmula
I pueden convertirse en las correspondientes sales fisiológicamente
tolerables por métodos conocidos por los expertos.
Por sales fisiológicamente tolerables de los
compuestos de las fórmulas I y II se entienden tanto sus sales
orgánicas como inorgánicas según se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418 (1985)). A causa
de su estabilidad física y química y de su solubilidad, para grupos
ácidos se prefieren, entre otras, sales sódicas, potásicas, cálcicas
y amónicas; para grupos de caráceter básico, se prefieren, entre
otras, sales de los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, o los
ácidos carboxílicos o sulfónicos como, por ejemplo, ácido acético,
ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido
tartárico y ácido p-toluenosulfónico.
La presente invención abarca todas las formas
estereoisómeras de los compuestos de fórmula I. Los centros de
asimetría contenidos en los compuestos de la fórmula I pueden
presentar, todos independientemente entre sí, la configuración S o
la configuración R. A la invención pertenecen todos los posibles
enantiómeros o diastereómeros, así como mezclas de dos o más formas
estereoisómeras, por ejemplo mezclas de enantiómeros y/o
diastereómeros, en todas las proporciones. Son objeto de la
invención, por tanto, los enantiómeros en forma enantioméricamente
pura, antípodas tanto levógiros como dextrógiros, con
configuraciones R y S, en forma de modificación racémica y en forma
de mezclas de los dos enantiómeros en todas las proporciones. Cuando
se presenta una isomería cis/trans, son objeto de la invención tanto
la forma cis como también la forma trans y mezclas de estas formas
en todas proporciones.
El receptor KDR de la
tirosina-quinasa representa la diana de ensayo. El
KDR juega un papel clave en el crecimiento del endotelio y en la
angiogénesis y, por ello, participa también en la formación de
tumores. Así, el KDR es una molécula diana terapéuticamente
importante para las enfermedades cancerosas y otras enfermedades
proliferativas. En el ensayo se mide la actividad de la
KDR-quinasa basándose en la fosforilación de un
sustrato peptídico específico. Junto a la actividad inhibidora sobre
las quinasas citadas, la eurotinona inhibe también otras quinasas
que participan asimismo en la generación de cáncer o en la cascada
de inflamación.
En razón a sus valiosas propiedades
farmacológicas, los compuestos de acuerdo con la invención son
apropiados para su aplicación específica como medicamentos en
medicina humana y veterinaria. Los compuestos de acuerdo con la
invención pueden utilizarse en enfermedades cancerosas, en especial
como agentes quimioterapéuticos. A causa de sus propiedades
antiangiogenéticas y de la actividad antitumoral ligada a ellas,
pueden emplearse especialmente como agentes frente a la degeneración
maligna tanto en el hombre como en animales.
Además, es previsible una utilización preventiva
para impedir un crecimiento renovado de un tumor después de
efectuada la terapia. Las eurotinonas de fórmula I de acuerdo con la
invención pueden usarse tanto en monoterapia como en terapia de
combinación con otros citostáticos en el marco de un tratamiento
quimioterapéutico de tumores. A causa de los diferentes puntos de
ataque de los citostáticos e inhibidores de la angiogénesis, la
terapia de combinación puede conducir a un efecto sinérgico de los
inhibidores de KDR con los citostáticos conocidos hasta ahora.
La invención concierne también a preparados
farmacéuticos que contienen una o varias de las eurotinonas de
fórmula I de acuerdo con la invención, así como, eventualmente,
eventualmente, también un citostático como sustancia activa
adicional. Se prefiere la utilización en mezclas con adecuados
coadyuvantes o vehículos. Como vehículos pueden utilizarse en el
hombre todos los vehículos y/o coadyuvantes fisiológicamente
tolerables.
La invención se refiera también a un
procedimiento para la preparación de un medicamento de acuerdo con
la invención, caracterizado porque contiene en una forma de
administración adecuada como mínimo uno de los compuestos de acuerdo
con la invención con un vehículo farmacéutica y fisiológicamente
adecuado y, en su caso, otras sustancias activas, aditivos o
coadyuvantes.
Por lo general, los medicamentos de acuerdo con
la invención se administran por vía oral, local o parenteral, aunque
en principio también es posible una administración rectal. Son
formas sólidas o líquidas adecuadas de preparados galénicos, por
ejemplo, granulados, polvos, comprimidos, grageas,
(micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones,
suspensiones, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en ampollas,
así como preparados con liberación retardada del principio activo,
en cuya preparación se emplean habitualmente vehículos y aditivos
y/o coadyuvantes tales como dispersivos, aglomerantes, agentes de
revestimiento, agentes de expansión, agentes de deslizamiento o
lubricantes, saboreadores, edulcorantes o agentes solubilizantes.
Como vehículos o coadyuvantes frecuentemente utilizados se citan,
por ejemplo, carbonato magnésico, dióxido de titanio, lactosa,
manitol y otros azúcares, talco, albúmina, gelatina, almidón,
vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales,
poletilenglicoles y disolventes tales como, por ejemplo, agua
esterilizada, alcoholes, glicerina y alcoholes polivalentes.
Eventualmente pueden microencapsularse las
unidades de dosificación para administración oral, con el fin de
demorar el suministro o alargar la liberación en el tiempo como, por
ejemplo, revistiendo la sustancia activa, o incrustándola en forma
de partículas en polímeros adecuados, ceras o similares.
Preferentemente, los preparados farmacéuticos se
producen y administran en unidades de dosificación, conteniendo cada
unidad, como componente activo, una dosis determinada de uno o
varios compuestos de las eurotinonas de fórmula I de acuerdo con la
invención. En el caso de unidades de dosificación sólidas tales como
comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de hasta
aproximadamente 500 mg, pero con preferencia aproximadamente 0,1 a
200 mg, y para soluciones inyectables en forma de ampollas, la dosis
puede ser de hasta aproximadamente 500 mg, pero preferiblemente de
aproximadamente 0,1 a 100 mg, por día.
La dosis a administrar diariamente depende del
peso corporal, la edad, el sexo y el estado del paciente. En ciertas
circunstancias, sin embargo, pueden administrarse también dosis más
altas o más bajas. La administración de la dosis diaria puede
hacerse tanto en forma de una sola toma de la unidad de dosificación
como de varias unidades de dosis más pequeñas, pero también en
varias tomas de dosis divididas a determinados intervalos.
La invención se ilustra con los Ejemplos que
siguen. Los porcentajes son en peso. Las proporciones de las
mezclas, cuando se trata de líquidos, se refieren a volúmenes si no
se indica lo contrario.
30 ml de una solución nutriente (extracto de
malta 2,0%, extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0%,
(NH_{4})_{2}HPO_{4} 0,05%, pH 6,0) en un matraz
erlenmeyer estéril de 100 ml se inoculan con la cepa Eurotium
echinulatum Delacroix, DSM 13872, y se incuba durante 6 días a
25ºC y 140 rpm en una máquina de sacudidas rotatoria. Seguidamente
se diluyen 1,5 ml de este cultivo con 2,5 ml de glicerina al 80% y
se almacenan a -135ºC.
100 ml de una solución nutriente (extracto de
malta 2,0%, extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0%,
(NH_{4})_{2}HPO_{4} 0,05%, pH 6,0) en un matraz
erlenmeyer estéril de 300 ml se inoculan con la cepa Eurotium
echinulatum Delacroix DSM 13872 y se incuba durante 7 días a
25ºC y 140 rpm en una máquina de sacudidas rotatoria. Se utilizan 2
ml de este precultivo para la preparación de los cultivos
principales.
Sobre 30 placas estériles de 25 x 25 cm se
vierten 200 ml de la siguiente solución nutriente: 20 g/l de
extracto de malta, 20 g/l de copos de avena, 2% de agar, pH 7,0.
Estas placas se inoculan con 2 ml de un precultivo y se incuban a
25ºC. La producción máxima de la eurotinona de acuerdo con la
invención se alcanza después de aproximadamente 360 horas.
Un matraz erlenmeyer estéril de 300 ml con 100 ml
de la siguiente solución nutriente, extracto de malta 2,0%, extracto
de levadura 0,2%, glucosa 1,0%, (NH_{4})_{2}PO_{4}
0,05%, pH 6, se inocula con un cultivo crecido en un tubito
inclinado (con igual solución nutriente, pero con 2% de agar) o con
2 ml de un precultivo (véase el Ejemplo 2) y se incuba en una
máquina de sacudidas a 140 rpm y 25ºC. La producción máxima de la
eurotinona de acuerdo con la invención se alcanza después de
aproximadamente 360 horas. Para inocular de 10 a 200 l de
fermentadores basta un cultivo sumergido con una vida de 96 a 144
horas (cantidad para inocular aproximadamente 10%) de la misma
solución nutriente. Las condiciones para estos fermentadores
son:
Temperatura: 25ºC
Velocidad de agitación: 200 rpm
Aireación: 15 l min^{-1}.
La formación de espuma puede deprimirse añadiendo
repetidamente solución etanólica de poliol. El máximo de producción
se alcanza después de aproximadamente 96 a 144 horas.
Se liofilizaron 150 placas con medio sólido
incubadas según el Ejemplo 3 y seguidamente el liofilizado se
sometió a extracción con metanol (20-30 l). El
extracto metanólico se redujo a un volumen de 10 l en vacío y se
diluyó con agua a un contenido de metanol de 10%. El extracto
diluido se llevó seguidamente a una columna de vidrio preparada (BPG
100, volumen interior de 4 l, de la firma Pharmacia Biotech) que
estaba llena con aproximadamente 2 litros del material
MCl-Gel® CHP-20 P (resina adsorbente
de la firma Mitsubishi Chemicals, Japón). Se eluyó con un gradiente
de 100% de agua a 100% de alcohol isopropílico. El caudal de paso de
la columna (1 litro/6 min) se recogió fraccionadamente (cada
fracción, 1 l). Todas las fracciones se ensayaron según las pruebas
de KDR y se combinaron las fracciones activas (fracciones
6-14). Éstas se redujeron en vacío a un volumen de
aproximadamente 10 l y esta solución se diluyó de nuevo con agua
hasta un contenido de 10% de la solución de partida. La solución
resultante se llevó nuevamente a una columna (véase lo indicado
antes) que estaba llena con aproximadamente 1,5 litros del material
MCl-Gel® CHP-20P. Se eluyó con un
gradiente de 100% de agua a 100% de acetonitrilo. El caudal de paso
de la columna (1 l/6 min) se recogió fraccionadamente (cada
fracción, 1 l) y se combinaron nuevamente las fracciones activas en
el ensayo (fracciones 4-11). Por concentración en
vacío y posterior liofilización se obtuvieron aproximadamente 16 g
de un polvo pardo.
Se cargaron aproximadamente 2 g del polvo
obtenido según el Ejemplo 5 en una columna LUNA® 10\mu C18 (2)
(tamaño: 50 mm x 250 mm, de la firma Phenomenex, Alemania) con una
columna previa LUNA® 10\mu C18 (2) (tamaño: 21,2 mm x 60 mm) y se
cromatografió con un gradiente de 10% hasta 40% de acetonitrilo en
agua con 0,1% de acetato amónico durante 40 minutos. El caudal del
eluyente era de 125 ml/min, el tamaño de la fracción 125 ml. La
eurotinona se encontraba en las fracciones 14 y 15. La liofilización
de las fracciones mencionadas dió aproximadamente 320 mg de
eurotinona enriquecida. Una etapa posterior de purificación mediante
HPLC en la misma columna RP-18 se realizó con un
gradiente de 20% a 30% en 30 minutos. Se combinaron las fracciones
que contenían eurotinona, se eliminaron las sales y se liofilizaron.
Se obtuvieron así 210 mg de eurotinona (Compuesto 1) (pureza >
95%). También aquí se sometieron al ensayo de actividad biológica
todas las fracciones de cada una de las etapas de separación.
Se disolvieron en MeOH (5 ml) 35 mg (=0,12 mmol)
de la eurotinona obtenida de conformidad con el Ejemplo 6 y se
mezclaron con trimetilsilildiazometano en un exceso 6 veces molar.
La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura
ambiente y seguidamente se concentró a sequedad. La mezcla obtenida
se separó cromatográficamente en una columna LUNA® 5 \mu C18 (2)
(tamaño: 10 mm x 250 mm). Se eluyó con un gradiente de 20% hacia 60%
de acetonitrilo en agua, al que se había añadido 0,1% de acetato
amónico, durante 50 min a un caudal de 6,5 ml/min. El caudal de paso
de la columna se recogió fraccionadamente (cada fracción, 6,5 ml).
Las fracciones 19-22 contenían 7,5 mg del derivado
dimetílico, 2,12-dimetileurotinona (Compuesto 2) y
las fracciones 23-25 contenían 6 mg del derivado
monometílico, 2-metileurotinona (Compuesto 3).
Las propiedades físicoquímicas así como
espectroscópicas de la eurotinona pueden compendiarse como
sigue:
Fórmula elemental: C_{15}H_{12}O_{6}
Fórmula estructural:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Peso molecular: 288
Máximos en UV: 200, 262, 330 nm
RMN ^{1}H y RMN ^{13}C: véase la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Las propiedades fisicoquímicas así como
espectroscópicas de la 2,12-dimetileurotinona pueden
compendiarse como sigue:
Fórmula elemental: C_{17}H_{16}O_{6}
Fórmula estructural:
Peso molecular: 316
Máximos de UV: 200, 262, 330 nm
RMN ^{1}H y RMN ^{13}C: véase la Tabla 2.
Las propiedades fisicoquímicas así como
espectroscópicas de la 2,12-dimetileurotinona pueden
compendiarse como sigue:
Fórmula elemental: C_{16}H_{14}O_{6}
Fórmula estructural:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Peso molecular: 302
Máximos de UV: 200, 262, 330 nm
RMN ^{1}H y RMN ^{13}C: véase la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a páginma
siguiente)
Para la determinación de la
KDR-quinasa se trata una enzima purificada en placas
de microtitulación, de 384 pocillos (placas rápidas revestidas NEN
Life Science). Los actividades de las enzimas se determinaron
mediante la fosforilación de un sustrato peptídico específico. Se
aporta a las tandas de ensayo con pipeta una serie de dilución
previamente preparada de las eurotinonas con concentraciones de 100,
50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094,
0,047 y 0 \muM, secuencialmente en el orden de la serie.
Seguidamente se añade la mezcla de reacción (ATP marcado
radiactivamente, solución tampón de pH 7,4 y soluciones de enzimas)
y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente.
Placas: placas rápidas de 384 pocillos de NEN
Life Science.
Lector: Contador Wallac MicroBeta Trilux
Reactivos:
Sustrato peptídico: PLC\gamma1
Enzima: KDR-quinasa (receptor
VEGF)
Tampón quinasa:
MOPS 50 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2 mM,
EDTA 2,5 mM, \beta-glicerolfosfato 10 mM,
ortovanadato 1 mM y fluoruro de sodio 1 mM.
Solución para revestimientos:
20 \mug/ml de sustrato peptídico en tampón PBS
(exento de Mg^{2+}, exento de Ca^{2+}).
Solución de ATP: 25\muCi/ml de
^{33}P-\gamma-ATP y ATP 12,5
\muM frío
Solución de enzima KDR: 3,5 \mug/ml en tampón
quinasa.
Solución de lavado: PBS (exento de Mg^{2+},
exento de Ca^{2+}).
Placas rápidas de 384 pocillos se revistieron a
4ºC durante la noche con 60 \mul (1,2 \mug/pocillo) del sustrato
peptídico y se lavaron 3 veces, en cada caso con 80 \mul de PBS.
Las placas revestidas de esta manera pueden almacenarse durante un
tiempo corto a 4ºC y durante un período de tiempo más prolongado a
-20ºC.
Reacción: en un volumen final de 50 \mul, la
prueba contiene 10 \mul de solución diluida de eurotinona, 20
\mul de solución de enzima de una concentración de 3,5 \mug/ml
(70 ng/pocillo), 20 \mul de solución de ATP (concentración final
0,5 \muCi de ATP caliente/pocillo y 5 \muM de ATP frío/pocillo).
La mezcla de reacción se deja en reposo durante 1 hora a temperatura
ambiente. Seguidamente se lavan las placas 3 veces, en cada caso con
75 \mul de solución de lavado y se mide la radiactividad con un
contador MicroBeta (Wallac) durante 30 segundos.
Todas las muestras se ensayan por duplicado a una
concentración final de 1:30. En cada placa se emplean 16 pocillos
para comprobar la actividad enzimática total (=controles
enzimáticos). Otros 16 pocillos se revisten con 4 \mug/pocillo de
caseína sin sustrato para ensayar la inhibición no específica.
La actividad de la KDR-quinasa se
mide mediante la incorporación de fosfato radiactivo en el sustrato
de ATP y a partir de ella se calcula el efecto inhibidor de la
eurotinona (IC_{50}).
La inhibición se calcula como:
[1-(prueba
CPM-CPM no específica)/(enzima
CPM-control-CPM no específica)] x
100
(%)
Valores IC_{50} [\muM]: | |
Eurotinona (Compuesto 1): | 22 |
2,12-dimetileurotinona (Compuesto 2) | 155 |
2-metileurotinona (Compuesto 3) | 18 |
Claims (18)
1. Compuesto de la fórmula general I
en la que R(1), R(2),
R(3) y R(4) significan, independientemente entre sí,
hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{6}), alquenilo
(C_{2}-C_{6}), alquinilo
(C_{2}-C_{6});
cicloalquilo C_{3}-C_{6} o
alquil
(C_{1}-C_{3})-cicloalquilo
(C_{3}-C_{6}), restos alquilo que eventualmente
pueden estar sustituidos con uno o varios restos,
en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de
estas formas en cualquier proporción, así como sus sales
fisiológicamente tolerables.
2. Compuesto de la fórmula I de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que R(1), R(2), R(3) y
R(4) significan, independientemente entre sí, hidrógeno o
alquilo (C_{1}-C_{6}),
en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de
estas formas en cualquier proporción, así como sus sales
fisiológicamente tolerables.
3. Compuesto de la fórmula I de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 2, en la que R(1), R(2),
R(3) y R(4), significan, independientemente entre sí,
hidrógeno o metilo, así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
4. Compuesto de la fórmula I de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 3, en la que R(1), R(2),
R(3) y R(4) significan hidrógeno,
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
5. Compuesto de la fórmula
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
6. Compuesto de la fórmula
así como sus sales fisiológicamente
tolerables.
7. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales
fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de la
reivindicaciones 1 - 6, que se puede preparar mediante fermentación
del microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13782)
o una de sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas en un
medio de cultivo, hasta que se acumulen uno o varios compuestos de
la fórmula I y, seguidamente, éstos se aíslan del medio de cultivo
y, eventualmente, se convierten en un derivado de la fórmula I o en
sales fisiológicamente tolerables.
8. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente
tolerables de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 -
6, caracterizado porque se fermenta el microorganismo
Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) o una de sus
variantes o mutantes en condiciones adecuadas en un medio de cultivo
hasta que se acumulen uno o varios compuestos de la fórmula I en el
medio de cultivo y, eventualmente, se aíslan del medio de cultivo y,
en algunos casos, se convierten en un derivado de la fórmula I o en
sales fisiológicamente tolerables.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
8, caracterizado porque la fermentación se realiza en
condiciones aeróbicas a una temperatura entre 20 y 35ºC y a un pH
entre 6,5 y 7,5.
10. Eurotium echinulatum Delacroix (DSM
13872).
11. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales
fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1 - 6 para su utilización como medicamento.
12. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales
fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1 - 6 para su utilización como medicamento para la
inhibición de la KDR-quinasa.
13. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales
fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1 - 6 para su utilización como medicamento para la
inhibición de la angiogénesis.
14. Preparado farmacéutico con un contenido de al
menos un compuesto de la fórmula I o una de sus sales
fisiológicamente tolerable de acuerdo con una o varias de las
reivindicaciones 1 - 6.
15. Preparado farmacéutico de acuerdo con la
reivindicación 14, que además contiene un citostático.
16. Procedimiento para la producción de
preparados farmacéuticos de acuerdo con la reivindicación 14,
caracterizado porque se incorpora al menos un compuesto de la
fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo
con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6, junto con
coadyuvantes y/o vehículos, en una forma de administración
adecuada.
17. Preparado farmacéutico de acuerdo con las
reivindicaciones 14 y 15 para su aplicación para el tratamiento de
enfermedades malignas.
18. Uso de Eurotium echinulatum Delacroix
(DSM 13782) para la obtención de inhibidores de
KDR-quinasa.
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