ES2320894T3 - Derivados de bengamida y su uso para el tratamiento de enfermedades cancerosas. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de la fórmula (I). ** ver fórmula** en la que R1 significa H o alquilo-(C1-C6), R2 significa H u OH, y R3 significa H o -C(=O)-alquilo-(C1-C6) o una sal fisiológicamente aceptable del mismo.
Description
Derivados de bengamida y su uso para el
tratamiento de enfermedades cancerosas.
El cáncer es una enfermedad que afecta a seres
humanos y animales que, en su mayor parte, es mortal y que está
causada por el crecimiento incontrolado de células endógenas. Cáncer
es el término que designa la formación de tumores malignos
(malignomas) y de neoplasias (tumores o carcinomas), o la
degeneración maligna y la maduración alterada de leucocitos
(leucemia, cáncer de la sangre). Las células cancerosas o las
células tumorales surgen como consecuencia de la transformación de
células endógenas. El carácter maligno de la célula cancerosa se
expresa por la autonomía de su crecimiento, es decir la capacidad de
la célula para crecer de manera no inhibida y sin ajustarse a la
estructura de los órganos, así como para crecer a modo de
infiltración, destruyendo el tejido. La formación de diseminaciones
(metástasis) a distancia del tumor, después de que se hayan
diseminado células tumorales a través de la sangre o la linfa, es
un signo seguro de malignidad. El cáncer es una de las causas más
frecuentes de muerte en el ser humano y
existe, por consiguiente, una elevada necesidad de métodos y medios para curar o tratar las degeneraciones malignas.
existe, por consiguiente, una elevada necesidad de métodos y medios para curar o tratar las degeneraciones malignas.
Aparte de la eliminación quirúrgica, a ser
posible, radical, del tumor, las posibilidades para tratar tumores
malignos incluyen radioterapia, utilizando rayos X, rayos \alpha,
rayos \beta y rayos \gamma, inmunoterapia y quimioterapia. En
la actualidad, la inmunoterapia sólo se puede emplear en un grado
limitado. Por quimioterapia de tumores se entiende la
administración de venenos celulares (agentes citostáticos) para
tratar tumores y las células tumorales que permanecen habitualmente
después del tratamiento quirúrgico local o la irradiación. Estas
sustancias interfieren de manera específica con ciertos procesos de
división celular, lo que significa que los tejidos que contienen
una elevada proporción de células en división, tales como los
tejidos tumorales de rápido crecimiento, reaccionan de forma más
sensible. Los agentes citostáticos que se utilizan son compuestos
alquilantes tales como ciclofosfamida, antimetabolitos tales como
metotrexatos, alcaloides tales como vincristina, y antibióticos
tales como daunomicina o adriamicina. Sin embargo, debido a los
masivos efectos secundarios, todos estos agentes presentan graves
inconvenientes, de modo que sólo se retrasa, pero no se evita la
muerte del paciente afectado. Además, las células degeneradas
(cancerosas) desarrollan resistencias a los agentes que se
utilizan; aunque los medicamentos que se emplean en ese momento ya
no exhiben efecto citostático, siguen siendo tóxicos como
consecuencia de los efectos secundarios. Adicionalmente, se ha
observado que la eficacia alcanzada mediante el uso de agentes
citostáticos en combinación o de forma secuencial es superior a la
que se logra con el uso de un único agente citostático
(monoterapia) y, por lo tanto, es posible que los efectos
secundarios sustanciales no sean aditivos en relación con la
poliquimioterapia. Por todas estas razones, se necesitan
urgentemente nuevos agentes quimioterapéuticos y se les investiga,
por consiguiente, en todo el mundo.
Los primeros ejemplos de bengamidas fueron las
bengamidas A y B, que están sustituidas con dodecanoílo en el
anillo de caprolactama, y que se aíslan de la esponja marina
Jaspis cf. Coriacea (familia Coppatiidae,
orden Choristida B Astrophorida) (Adamczewski et
al., J. Org. Chem. 1986, 51, 4497-4498), y que
se ha comunicado que resultan biotóxicas para células eucariotas,
nematodos y bacterias.
Ejemplos de derivados de bengamida, en los que
se detectó una actividad antitumoral, son la bengamida E
y su derivado
N-metilado, bengamida F. Bengamida E inhibe la
proliferación celular al detener la división celular en el punto de
restricción G1/S y en la fase G2/M del ciclo celular. Los derivados
de bengamida B inhiben la proliferación de células de cáncer de
mama MDA-MB-435 (Kinder et
al., J. Med. Chem. 2001, 44,
3692-3699).
Una característica común de los derivados de
bengamida conocidos es que se les ha aislado de esponjas marinas
del género Jaspis sp. o Pachastrissa sp. (Thale et
al., J. Org. Chem. 2001, 66, 1733-1741).
Se ha encontrado ahora que la cepa de
microorganismos Myxococcus virescens ST200611 (DSM
15898) es capaz de formar nuevos derivados de bengamida que inhiben
la proliferación celular a bajas concentraciones y que, por lo
tanto, son adecuados para ser utilizados en el tratamiento y/o la
profilaxis de enfermedades oncológicas. La presente invención se
refiere a un compuesto de la fórmula (I),
en la
que
- R_{1}
- significa H o alquilo-(C_{1}-C_{6}),
- R_{2}
- significa H u OH, y
- R_{3}
- significa H o -C(=O)-alquilo-(C_{1}-C_{6}),
o a una sal fisiológicamente
aceptable de un compuesto de la fórmula
(I).
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De forma independiente entre sí, R_{1} es,
preferentemente, H o metilo, y R_{3} es, preferentemente, H.
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La invención se refiere, preferentemente, a un
compuesto de la fórmula (I) en la que
- R_{1}
- significa H o metilo,
- R_{2}
- significa H u OH, y
- R_{3}
- significa H.
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Alquilo-(C_{1}-C_{6})
significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene
hasta 6 átomos de carbono, por ejemplo metilo (Me), etilo,
n-propilo, isopropilo, terc-butilo o
n-hexilo, preferentemente metilo.
Adicionalmente, la invención se refiere a un
compuesto de la fórmula (I) que se distingue por un compuesto de la
fórmula (II)
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un compuesto de la fórmula
(III)
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y un compuesto de la fórmula
(IV)
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\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere, además, a
sales fisiológicamente compatibles de los compuestos de la fórmula
(I) según la invención.
A menos que se indique lo contrario, los centros
quirales en los compuestos de las fórmulas (I) pueden encontrarse
presentes en configuración R o en configuración S. La invención se
refiere tanto a los compuestos ópticamente puros como a las mezclas
estereoisómeras tales como mezclas enantiómeras y mezclas
diastereoisómeras.
Por sales fisiológicamente aceptables de los
compuestos de la fórmula (I) se entienden tanto sus sales orgánicas
como sus sales inorgánicas, como se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418 (1985)). Debido a
su estabilidad física y química y a su solubilidad, se prefieren las
sales de sodio, potasio, calcio y amonio, entre otras, para grupos
ácidos; se prefieren las sales del ácido clorhídrico, ácido
sulfúrico o ácido fosfórico, o de ácidos carboxílicos o ácidos
sulfónicos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico,
ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico y ácido
p-toluenosulfónico, entre otras, para grupos
básicos.
Compuestos de la fórmula (I) pueden prepararse
mediante
- 1.
- la fermentación de la cepa Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), o una de sus variantes y/o mutantes, bajo condiciones adecuadas en un medio de cultivo hasta que se acumule uno o más de los compuestos de la fórmula (I) en el medio de cultivo,
- 2.
- aislamiento de un compuesto de la fórmula (I) desde el medio de cultivo, y
- 3.
- derivatización del compuesto de la fórmula (I), cuando sea apropiada, y/o, cuando resulte adecuado, conversión en una sal fisiológicamente aceptable.
El medio de cultivo es una solución de
nutrientes o un medio sólido que contiene al menos una fuente
habitual de carbono y una fuente de nitrógeno, así como sales
inorgánicas habituales. Si se agrega hidroxilisina al medio de
cultivo, la cepa de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898)
produce un compuesto de la fórmula (I) en el que R_{2} es OH como
consecuencia de la digestión de hidroxilisina.
El procedimiento se puede utilizar para
fermentar a escala de laboratorio (escala de mililitro a litro), y
para fermentar a escala industrial (escala de metro cúbico).
Como fuentes de carbono para la fermentación son
adecuados hidratos de carbono y alcoholes sacáricos asimilables
tales como glucosa, lactosa, sacarosa o D-manitol,
así como productos naturales que contienen hidratos de carbono
tales como extracto de malta o extracto de levadura. Ejemplos de
nutrientes que contienen nitrógeno son aminoácidos, péptidos y
proteínas, así como sus productos de degradación, por ejemplo
caseína, peptonas o triptonas; extractos de carne; extractos de
levadura; gluten; semillas trituradas, por ejemplo de maíz, trigo,
habas, soja o de la planta del algodón; residuos de destilación de
la producción de alcohol; harinas de carne; extractos de levadura;
sales de amonio; nitratos. Se prefiere que la fuente de nitrógeno
sea uno o múltiples péptidos obtenidos por síntesis o biosíntesis.
Ejemplos de sales inorgánicas son cloruros, carbonatos, sulfatos o
fosfatos de metales alcalinos, metales
alcalino-térreos, hierro, cinc, cobalto y manganeso.
Ejemplos de elementos traza son cobalto y manganeso.
Condiciones adecuadas para formar bengamidas
según la invención son las siguientes: las bengamidas según la
invención se forman, preferentemente, en un medio de cultivo que
contiene 0,05 a 5%, preferentemente 0,1 a 2,5% de extracto de
levadura; 0,2 a 5,0%, preferentemente 0,1 a 2% de casitona; 0,02 a
1,0%, preferentemente 0,05 a 0,5% de CaCl_{2} x 2 H_{2}O; 0,02
a 1,5%, preferentemente 0,05 a 0,7% de MgSO_{4} x 7 H_{2}O, así
como 0,00001% a 0,001% de cianocobalamina. Los valores porcentuales
indicados están basados, en todos los casos, en el peso de la
solución de nutrientes total.
El microorganismo se cultiva bajo condiciones
aeróbicas, es decir, por ejemplo sumergido, mientras se agita o
remueve en frascos de agitación o fermentadores, o en medio sólido,
cuando resulte apropiado, mientras se hace pasar aire u oxígeno.
Los microorganismos se pueden cultivar en un intervalo de
temperaturas de aproximadamente 18 a 35ºC, preferentemente de
aproximadamente 20 a 32ºC y, en particular, de 27 a 30ºC. El
intervalo de pH debe estar comprendido entre 4 y 10,
preferentemente entre 6,5 y 7,5. Por lo general, el microorganismo
se cultiva bajo estas condiciones durante un período de 2 a 10
días, preferentemente de 72 a 168 horas. De manera ventajosa, el
microorganismo se cultiva en varias etapas, es decir, se preparan
inicialmente uno o múltiples cultivos preliminares en un medio de
nutrientes líquido, inoculando entonces estos cultivos preliminares
en el medio de producción real, es decir, el cultivo principal, por
ejemplo, en una relación por volumen de 1:10 hasta 1:100. El
cultivo preliminar se obtiene, por ejemplo, inoculando la cepa, en
forma de células vegetativas o cuerpos fructíferos, en una solución
nutriente y dejándola crecer durante aproximadamente 20 a 120 horas,
preferentemente desde 48 a 96 horas. Se pueden obtener células
vegetativas y/o cuerpos fructíferos dejando crecer la cepa, por
ejemplo, durante 1 a 15 días, preferentemente 4 a 10 días, sobre un
sustrato nutriente sólido o líquido, por ejemplo, agar de
levadura.
levadura.
Se aísla o purifica un derivado de bengamida de
la fórmula (I) a partir del medio de cultivo, usando métodos
conocidos y teniendo en consideración las propiedades químicas,
físicas y biológicas de las sustancias naturales. Se empleó HPLC
para analizar las concentraciones de los respectivos derivados de
bengamida en el medio de cultivo o en las etapas individuales de
aislamiento, comparando convenientemente la cantidad de sustancia
formada con una solución de calibración.
Para el aislamiento, el caldo de cultivo, o el
cultivo junto con el medio sólido, se liofilizan, tras lo cual se
extraen los derivados de bengamida del liofilizado usando un
disolvente orgánico, por ejemplo metanol ó
2-propanol. La fase de disolvente orgánico contiene
las sustancias naturales según la invención; cuando es adecuado, se
concentra al vacío y se somete a una purificación adicional.
La purificación adicional de uno o múltiples
compuestos según la invención se realiza por cromatografía sobre
materiales adecuados, preferentemente, por ejemplo, sobre tamices
moleculares, sobre gel de sílice, sobre óxido de aluminio, sobre
intercambiadores de iones, o sobre resinas adsorbentes o sobre fases
inversas (RP). Con ayuda de esta cromatografía se separan los
derivados de bengamida. Los derivados de bengamida se cromatografían
usando soluciones acuosas tamponadas o mezclas de soluciones
acuosas y orgánicas.
Como mezclas de soluciones acuosas u orgánicas
se entienden todos los disolventes orgánicos miscibles con agua,
preferentemente metanol, 2-propanol o acetonitrilo,
en una concentración de 5 a 95% de disolvente, preferentemente 5 a
40% de disolvente, o también todas las soluciones acuosas tamponadas
que son miscibles con disolventes orgánicos. Los tampones que se
deben utilizar son los mismos que se han especificado
anteriormente.
Los derivados de bengamida se separan, sobre la
base de sus diferentes polaridades, con ayuda de cromatografía de
fase inversa, por ejemplo sobre MCI® (resina adsorbente de
Mitsubishi, Japón), o Amberlite XAD® (TOSO-HAAS), o
sobre otros materiales hidrófobos, por ejemplo sobre fases
RP-8 o RP-18. Adicionalmente, la
separación se puede efectuar mediante cromatografía de fase normal,
por ejemplo sobre gel de sílice, óxido de aluminio, y
similares.
Los derivados de bengamida se cromatografían
usando soluciones acuosas tamponadas, básicas o acidificadas, o
mezclas de soluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes
orgánicos miscibles con agua. Se utilizan, preferentemente,
acetonitrilo y metanol como disolvente orgánico.
Como soluciones acuosas tamponadas, básicas o
acidificadas se entienden, por ejemplo, agua, tampón fosfato,
acetato de amonio y tampón citrato, a una concentración de hasta 0,5
M, así como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético,
amoniaco y trietilamina, o todos los ácidos y bases disponibles en
el comercio y conocidos por los expertos, preferentemente a una
concentración de hasta 1%. En el caso de soluciones acuosas
tamponadas, se prefiere de manera especial acetato de amonio al
0,1%.
La cromatografía se llevó a cabo usando un
gradiente que comenzó con agua al 100% y finalizó con disolvente al
100%; la cromatografía se efectuó, preferentemente, con un gradiente
lineal de acetonitrilo al 5 a 95%.
De forma alternativa, también es posible llevar
a cabo una cromatografía sobre gel o cromatografía sobre fases
hidrófobas. La cromatografía sobre gel se lleva a cabo sobre geles
de poliacrilamida o geles copolímeros tales como
Biogel-P 2® (Biorad), o Fractogel TSK HW 40® (Merck,
Alemania). Es posible invertir la secuencia de las etapas
cromatográficas anteriormente mencionadas.
En el caso en que las bengamidas estén presentes
como diastereoisómeros, se les puede separar usando métodos
conocidos, por ejemplo mediante separación usando una columna
quiral.
La derivatización de los grupos OH en la cadena
lateral de los compuestos de la fórmula (I) (R_{3} es, en cada
caso, H), para dar un grupo acilo (R_{4} es, en cada caso,
-C(=O)-alquilo-(C_{1}-C_{6})) se
efectúa empleando métodos que son conocidos en sí mismos (J. March,
Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4ª edición,
1992), por ejemplo por medio de una reacción con un anhídrido ácido.
Por ejemplo, Adamczeski et al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,
647-654, describen la reacción con anhídrido acético
para dar un compuesto de la fórmula (I), en la que R_{3}
significa -C(=O)-CH_{3}.
Del mismo modo, la alquilación del grupo NH en
el anillo de caprolactama de un compuesto de la fórmula (I)
(R_{1} es, en cada caso, H) se lleva a cabo usando métodos
conocidos en sí mismos (J. March, Advanced Organic Chemistry, John
Wiley & Sons, 4ª edición, 1982), por ejemplo por reacción con
Me_{2}CO_{3} o Me_{2}SO_{4}, para preparar los
correspondientes derivados N-metilados, o por
reacción con bromuro de alquilo-(C_{1}-C_{6})
en presencia de una base.
Con el número DSM 15898, se depositó con fecha
11.09.2003 un aislado de la cepa de microorganismo Myxococcus
virescens ST200611 en la Colección Alemana de Microorganismos y
Cultivos Celulares GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, 38124
Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las normas del Tratado de
Budapest.
Las células vegetativas de la cepa DSM 15898
tienen forma de bacilo característica de Myxococcus
virescens. Sobre sustratos nutrientes sólidos, Myxococcus
virescens ST200611 (DSM 15898) forma cuerpos fructíferos
naranja-amarillentos que contienen mixosporas
redondas.
En lugar de la cepa Myxococcus virescens
ST200611 (DSM 15898), también es posible usar sus mutantes y/o
variantes que sintetizan uno o múltiples compuestos según la
invención.
Un mutante es un microorganismo en el que uno o
múltiples genes del genoma se han modificado con el gen o los genes
responsables de la capacidad del organismo para producir el
compuesto según la invención, conservándose éstos últimos en forma
funcional y hereditaria.
Estos mutantes se pueden producir, de manera
conocida en sí misma, usando medios físicos, por ejemplo irradiación
tal como, por ejemplo, con rayos ultravioletas o rayos X, o
mutágenos químicos tales como metanosulfonato etílico (EMS);
2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona
(MOB) o
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), o del modo descrito por Brock et al. en "Biology
of Microorganisms", Prentice Hall, páginas
238-247 (1984).
Una variante es un fenotipo del microorganismo.
Los microorganismos tienen la capacidad de adaptarse a su ambiente
y, por consiguiente, exhiben una flexibilidad fisiológica altamente
desarrollada. En la adaptación fenotípica intervienen todas las
células del microorganismo, sin que la naturaleza de la variación
esté genéticamente condicionada y siendo reversible con la
alteración de las condiciones (H. Stolp, Microbial ecology:
organism, habitats, activities. Cambridge University Press,
Cambridge, GB, página 180, 1988).
El análisis de mutantes y/o variantes que
sintetizan uno o más de los compuestos según la invención tiene
lugar de acuerdo con el siguiente esquema:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Las condiciones de fermentación que se han
descrito son aplicables a Myxococcus virescens ST200611 (DSM
15898) y a sus mutantes y/o variantes.
Se emplea un ensayo basado en la determinación
de la concentración intracelular de ATP para detectar la inhibición
de la proliferación celular. Resulta posible utilizar líneas
celulares tumorales tales como Hep-G2 y Colo205. En
este ensayo, el contenido en ATP de células metabólicamente activas
sirve, en una reacción con luciferasa, como medición del número de
células vivas.
Los compuestos de las fórmulas (II)-(VI) se
utilizaron en el ensayo en una concentración única de 0,3 - 40
\muM y una dependencia de dosis indicada como valor de CT_{50},
indicando en cada caso (IIA) y (IIB) una diastereoisómero del
compuesto de la fórmula (II):
Por lo tanto, objeto de la invención es, además,
el uso del compuesto de la fórmula (I) o de una sal fisiológicamente
aceptable del mismo para la preparación de un medicamento en
medicina humana o veterinaria, en particular para el tratamiento
y/o la profilaxis de enfermedades oncológicas. La invención se
refiere, preferentemente, al uso de un compuesto de la fórmula (I),
o de una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para preparar un
medicamento para tratar el cáncer de mama, cáncer intestinal, cáncer
de estómago, cáncer de hígado, tumores cerebrales, tumores
ováricos, cáncer de esófago, cáncer renal y carcinoma de células
musculares, en especial carcinoma de los músculos de cabeza y
cuello.
Además, la presente invención se refiere a un
medicamento que contiene al menos un compuesto de la fórmula (I) o
una sal fisiológicamente aceptable del mismo, existiendo la
posibilidad de administrar el o los compuestos de la fórmula (I)
como tales o, preferentemente, estando presentes en una mezcla con
uno o más de las sustancias de vehículo o sustancias auxiliares
habituales, farmacéuticamente adecuadas.
Los compuestos según la invención son estables
en estado sólido y en soluciones, en un intervalo de pH entre 2 y
9, en particular entre 5 y 7 y, en consecuencia, se pueden
incorporar en preparaciones galénicas habituales.
Aun cuando los medicamentos según la invención
se pueden administrar por vía oral o parenteral, también resulta
posible, en principio, su uso por vía rectal. Ejemplos de formas de
preparaciones galénicas sólidas o líquidas adecuadas son gránulos,
polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos,
(micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones,
suspensiones, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en forma de
ampolla, así como preparaciones que proporcionan una liberación
prolongada del compuesto activo; en su preparación se utilizan
habitualmente sustancias de vehículo o sustancias auxiliares
farmacológicamente adecuadas tales como desintegrantes,
aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchamiento,
deslizantes, lubricantes, sustancias saborizantes, edulcorantes o
solubilizantes, por ejemplo carbonato de magnesio, dióxido de
titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteína de la
leche, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados,
aceites animales o vegetales, polietilenglicoles y disolventes
tales como, por ejemplo, agua esterilizada, alcoholes, glicerol y
alcoholes polihídricos.
Eventualmente, las unidades de dosificación para
administración oral pueden estar micro-encapsuladas
para retrasar la liberación o prolongarla durante un período
relativamente largo de tiempo, por ejemplo mediante recubrimiento o
inclusión del compuesto activo en forma de partículas en polímeros o
ceras adecuados, y similares.
Es preferible producir y administrar las
preparaciones farmacéuticas en unidades de dosificación, conteniendo
cada unidad, como componente activo, una dosis definida de uno o
múltiples compuestos de los derivados de bengamida de la fórmula
(I). En el caso de unidades de dosificación sólidas tales como
comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de hasta
aproximadamente 500 mg, pero, preferentemente, es de aproximadamente
0,1 hasta 200 mg y, en el caso de soluciones inyectables en forma
de ampolla, hasta aproximadamente 200 mg, pero, preferentemente, de
aproximadamente 0,5 hasta 100 mg al día.
La dosis diaria a administrar depende del peso
corporal, edad, sexo y estado del mamífero. Sin embargo, también
dosis diarias mayores o menores pueden ser apropiadas. La dosis
diaria se puede administrar tanto por medio de una administración
única al día, en forma de una unidad de dosificación única, o en
varias unidades de dosificación menores, y por medio de la
administración múltiple de dosis subdivididas, a intervalos
definidos.
Los medicamentos según la invención se fabrican
dando forma adecuada para la administración a uno o múltiples
compuestos de la fórmula (I) según la invención, opcionalmente junto
con una o múltiples sustancias de vehículo y sustancias auxiliares
habituales.
Los siguientes Ejemplos pretenden explicar la
invención de forma más detallada, sin limitar su alcance en
absoluto.
A menos que se indique lo contrario, los valores
porcentuales se refieren al peso y las relaciones de mezcla, en el
caso de líquidos, se refieren al volumen.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se inocula una placa de agar (levadura de
panadería fresca al 1%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM,
cianocobalamina al 0,00005%, agar al 1,5%, pH 7,2) con la cepa de
Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) y se incuba a 30ºC
durante aproximadamente 7 días. De la superficie de agar se retiran
por rascado las células en este cultivo superficial usando una
espátula estéril, se resuspenden en 0,5 ml de medio de casitona
(casitona al 1% (Difco), MgSO_{4} x 7 H_{2}O al 0,15%, pH 7,0) y
se almacenan a -135ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Un matraz Erlenmayer de 300 ml con 100 ml de
solución nutriente (levadura de panadería fresca al 1%, CaCl_{2}
x 2 H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM, cianocobalamina al 0,00005%, pH
7,2) se inocula con la cepa de Myxococcus virescens ST200611
(DSM 15898), y el cultivo se incuba durante 4 días a 30ºC y 180 rpm
en un agitador rotatorio. Se utilizan, entonces, 5 ml de este
cultivo preliminar para preparar los cultivos principales.
\newpage
Ejemplo
3
Un matraz Erlenmayer estéril de 300 ml, que
contiene 100 ml de la siguiente solución nutriente (extracto de
levadura al 0,5%, casitona al 0,5%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 0,1%,
MgSO_{4} x 7 H_{2}O al 0,2%, cianocobalamina al 0,00005%, pH
7,4) se inocula con 5 ml del cultivo preliminar (véase el Ejemplo
2), o un cultivo realizado en un placa de agar fresco (levadura de
panadería fresca al 1%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM,
cianocobalamina al 0,00005%, pH 7,2, más agar al 1,5%), y se incuba
a 30ºC y 180 rpm en una agitadora. La producción máxima de
bengamidas según la invención se alcanza después de
72-96 horas. Un cultivo sumergido de
72-96 horas de antigüedad (cantidad de inoculación
aprox. 5-10%) de la misma solución nutriente
descrita en el Ejemplo 2, es suficiente para inocular fermentadores
de 10 a 200 L.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Un matraz Erlenmayer estéril, de 300 ml, que
contiene 100 ml de la siguiente solución de nutrientes (extracto de
levadura al 0,5%, casitona al 0,5%, CaCl_{2} x 2H_{2}O al 0,1%,
MgSO_{4} x 7H_{2}O al 0,2%, cianocobalamina al 0,00005% e
hidroxilisina 1 mM, pH 7,4) se inocula con 5 ml de un cultivo
preliminar del Ejemplo 2, o un cultivo que se ha hecho crecer sobre
una placa de agar fresco (levadura de panadería fresca al 1%,
CaCl_{2} x 2H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM, cianocobalamina al
0,00005%, pH 7,2, más agar al 1,5%), y se incuba a 30ºC y 180 rpm
en una agitadora. La producción máxima del derivado de bengamida
(IV) se alcanza después de 72-96 horas. Se utilizó
HPLC-MS para el análisis. Un cultivo sumergido de
72-96 horas de antigüedad (cantidad de inoculación,
aprox. 5-10%) de la misma solución de nutrientes
descrita en el Ejemplo 2, es suficiente para inocular fermentadores
de 10 a 200 L.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Los fermentadores de 10 L y 30 L se hicieron
funcionar bajo las siguientes condiciones:
El pH se reguló siempre utilizando KOH al 10% o,
respectivamente, H_{2}SO_{4} al 10%. La formación de espuma se
puede suprimir agregando repetidamente Clerol FBA 265 (Cognis
Alemania GmbH). La producción máxima se alcanza después de aprox.
72 a 96 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Después de finalizar la fermentación de
Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), se liofilizó el
caldo de cultivo del Ejemplo 3 (30 L de caldo de cultivo), junto
con la biomasa, y el liofilizado se extrajo con metanol (2 x 5 L).
El extracto de metanol se redujo a 1,2 L al vacío y se cargó,
seguidamente, en una columna preparada empaquetada con aprox. 1,5
litros de material CHP-20P (gel MCI®,
75-150 \mu, Mitsubishi Chemical Corporation). Se
eluyó con metanol al 95%. Se recogió el caudal de la columna (120
ml/min) y se redujo a un volumen de 1,5 L al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se cargaron 1,5 L de la solución obtenida de la
forma descrita en el Ejemplo 6 en una columna Phenomenex Luna® 10
\mu C18 (2) (tamaño: 50 mm x 250 mm), dotada con una
pre-columna Luna® 10 \mu C18 (2) (dimensiones:
21,2 mm x 60 mm), y se eluyó (acetato de amonio al 0,1%, pH 4,6,
ajustado con ácido acético) durante 60 min, usando un gradiente de
acetonitrilo en agua al 5% hasta 95%. El caudal fue de 150 ml/min y
el tamaño de fracción fue de 200 ml. Las bengamidas estuvieron
presentes en las fracciones 5-9,
10-11 y 12-14.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se liofilizaron las fracciones individuales del
Ejemplo 7 y se purificaron una vez más por HPLC sobre una columna
Phenomenex Luna® 10 \mum C18 (2) (dimensiones: 21 mm x 250 mm),
dotada con una pre-columna XTerra® Prep MS C18 10
\mum (Waters, dimensiones: 19 x 10 mm). Se eluyó usando un
gradiente de acetonitrilo en agua al 5% hasta 40% durante 40 min
(con la presencia adicional de acetato de amonio al 0,1%, pH 8,8,
ajustado con metilamina). Se recogió el caudal de la columna (50
ml/min) en fracciones (fracciones de 7,5 ml en cada caso). Las
fracciones 5-9 del Ejemplo 7 contuvieron el
compuesto de la fórmula (III) y, después de la cromatografía y
liofilización, proporcionaron 86 mg de bengamida E (pureza >95%).
Después de la cromatografía, las fracciones 10-11
del Ejemplo 7 proporcionaron 145 mg de bengamida (II) (pureza
>95%, mezcla diastereoisómera 70/30) y 5 mg de bengamida F
(pureza >95%). Se obtuvieron 35 mg de bengamida (III) (pureza
>95%) en forma de mezcla diastereoisómera, en una relación de
75:25, de las fracciones 12-14 del Ejemplo 7. Los
diastereoisómeros son, en cada caso, los correspondientes
epímeros
C-16.
C-16.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Después de finalizar la fermentación de
Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) se liofilizó el
caldo de cultivo del Ejemplo 5 (10 L de caldo de cultivo), junto
con la biomasa, y el liofilizado se extrajo con metanol (2 x 3 L).
El extracto de metanol se redujo al vacío a 400 ml y se cargó en una
columna preparada, que se había empaquetado con 0,6 litros de
material CHP-20P (gel MCI®, 75-150,
Mitsubishi Chemical Corporation). Se eluyó con metanol en agua al
5% hasta 95%. El caudal de la columna (100 ml/min) se recogió en
fracciones durante 60 min (0,5 min por fracción). Las fracciones
que contuvieron el derivado deseado (fracciones
45-109) se combinaron y redujeron al vacío a un
volumen de 700 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
A continuación, la solución del Ejemplo 9 se
cargó en una columna Phenomenex Luna® 10 \mu C18 (2) (tamaño: 50
mm x 250 mm), dotada de una pre-columna Phenomenex
Luna® 10 \mu C18 (2) (dimensiones: 21,2 mm x 60 mm) y se eluyó
(acetato de amonio al 0,1%, pH 8,8, ajustado con trietilamina),
usando un gradiente de acetonitrilo en agua al 5% hasta 40%,
durante 60 min. El caudal fue de 150 ml/min y el tamaño de fracción
fue 250 ml. La fracción 22 contuvo el derivado de bengamida
deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
La fracción 22 del Ejemplo 10 se liofilizó y
purificó nuevamente por medio de HPLC en una columna Phenomenex
Luna® 10 \mum C18 (2) (dimensiones: 21 mm x 250 mm), dotada de una
pre-columna Waters XTerra ® Prep MS C18 10 \mum
(dimensiones: 19 x 10 mm). Se eluyó con un gradiente de acetonitrilo
en agua al 5% hasta 95% durante 60 min (con la presencia adicional
de acetato de amonio al 0,1%, pH 4,6, ajustado con ácido acético).
Se recogió el caudal de la columna (50 ml/min) en fracciones
(fracciones de 7,5 ml en cada caso). Se combinaron, desalinizaron y
liofilizaron las fracciones que contuvieron bengamida (fracciones
26-28). En relación con esto, se obtuvieron 7 mg de
bengamida (IV) en forma de mezcla diastereoisómera en una relación
de 75:25.
\newpage
Ejemplo
12
Fórmula empírica:
C_{18}H_{32}N_{2}O_{6}
Peso molecular: 372,47
Mezcla diastereoisómera: 75:25
\newpage
Ejemplo
13
Fórmula empírica:
C_{19}H_{34}N_{2}O_{6}
Peso molecular: 386.49
Mezcla diastereoisómera: 75/25
\newpage
Ejemplo
14
Fórmula empírica:
C_{18}H_{32}N_{2}O_{7}
Peso molecular: 388,46
Mezcla diastereoisómera: 75/25
\newpage
Ejemplo
15
Fórmula empírica:
C_{17}H_{30}N_{2}O_{6}
Peso molecular: 358,44
\newpage
Ejemplo
16
Fórmula empírica:
C_{18}H_{32}N_{2}O_{6}
Peso molecular: 372,47
\newpage
Ejemplo
17
La mezcla diastereoisómera del compuesto de la
fórmula (II) del Ejemplo 6 se separó en una columna quiral (AD/H,
Daicel, 20 x 200 mm, 0,5 ml/min, fase móvil: acetonitrilo:metanol
4:1 + NH_{4}Ac al 0,1%). La pureza óptica se comprobó en una
columna analítica AD/H (Daicel) (4,6 x 250 mm, 30ºC, fase móvil:
acetonitrilo:metanol 4:1 + NH_{4}Ac al 0,1%, 0,75 ml/min, pico 1
de Rt: 9,9 min, pico 2 de Rt: 10,9 min).
Ejemplo
18
Se utilizaron las líneas de células tumorales
Hep-G2 (ATCC No. HB-8065) y COLO 205
(ATCC No. CCL-222) para determinar la proliferación
celular. Las líneas celulares se sembraron en medio de cultivo
celular a razón de 1000 células/pocillo [Hep-G2] y,
respectivamente, 3500 células/pocillo [Colo205], y se incubaron
durante 4 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Medio para
Hep-G2: Medio de Eagle modificado por
Dulbecco/mezcla F12 de Ham (Gibco); NEAA (al 10%; aminoácidos no
esenciales, Gibco), piruvato sódico (al 1%, Gibco),
L-glutamina (al 1%, Gibco), suero de ternero fetal
(al 5%; PAA).
Medio para COLO 205: RPMI 1640 (Gibco),
L-glutamina (al 1%, Gibco), HEPES (al 1%, Gibco),
suero de ternero fetal (al 10%, PAA).
Después de 4 horas, se agregaron los compuestos
(II), (III) y (IV) y las bengamidas E y F, disueltos en DMSO/medio
de cultivo celular, en diversas diluciones, y las mezclas se
incubaron durante 72 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. El contenido
intracelular en ATP se determinó usando el reactivo de ensayo
CellTiterGlo (Promega).
Los resultados de los ensayos de proliferación
celular se ofrecen en la Tabla 1.
Claims (10)
1. Compuesto de la fórmula (I).
en la
que
- R_{1}
- significa H o alquilo-(C_{1}-C_{6}),
- R_{2}
- significa H u OH, y
- R_{3}
- significa H o -C(=O)-alquilo-(C_{1}-C_{6})
o una sal fisiológicamente
aceptable del
mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1} significa H o metilo.
3. Compuesto según una de las reivindicaciones 1
ó 2, en el que R_{3} significa H.
4. Compuesto según una de las reivindicaciones 1
a 3, en el que R_{1} significa H o metilo, R_{2} significa H u
OH, y R_{3} significa H.
5. Compuesto según una de las reivindicaciones 1
a 4, caracterizado por un compuesto de la fórmula (II)
6. Compuesto según una de las reivindicaciones 1
a 4, caracterizado por un compuesto de la fórmula (III)
7. Compuesto según una de las reivindicaciones 1
a 4, caracterizado por un compuesto de la fórmula (IV)
8. Uso de un compuesto de la fórmula (I) o de
una sal fisiológicamente aceptable del mismo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, para preparar un medicamento.
9. Uso de un compuesto de la fórmula (I) o de
una sal fisiológicamente aceptable del mismo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, para preparar un medicamento para el
tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades oncológicas.
10. Medicamento que contiene al menos un
compuesto de la fórmula (I), o una sal fisiológicamente aceptable
del mismo, según una de las reivindicaciones 1 a 7.
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2009
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