ES2320894T3

ES2320894T3 - Derivados de bengamida y su uso para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

Info

Publication number: ES2320894T3
Application number: ES04765884T
Authority: ES
Inventors: Holger Hoffmann; Sabine Haag-Richter; Michael Kurz; Heiko Tietgen
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2009-05-29
Anticipated expiration: 2024-10-08
Also published as: CN101294173A; UY28574A1; MEP33108A; SI1680405T1; CN100398520C; MXPA06004084A; HRP20090187T1; CY1110458T1; EP1873146A3; DK1680405T3; JP2007509084A; EP1873146A2; DE502004008837D1; IL174524A; DE502004011536D1; RU2006117769A; ATE420074T1; CL2009000674A1; BRPI0415529A; PT1680405E

Abstract

Compuesto de la fórmula (I). ** ver fórmula** en la que R1 significa H o alquilo-(C1-C6), R2 significa H u OH, y R3 significa H o -C(=O)-alquilo-(C1-C6) o una sal fisiológicamente aceptable del mismo.

Description

Derivados de bengamida y su uso para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

El cáncer es una enfermedad que afecta a seres humanos y animales que, en su mayor parte, es mortal y que está causada por el crecimiento incontrolado de células endógenas. Cáncer es el término que designa la formación de tumores malignos (malignomas) y de neoplasias (tumores o carcinomas), o la degeneración maligna y la maduración alterada de leucocitos (leucemia, cáncer de la sangre). Las células cancerosas o las células tumorales surgen como consecuencia de la transformación de células endógenas. El carácter maligno de la célula cancerosa se expresa por la autonomía de su crecimiento, es decir la capacidad de la célula para crecer de manera no inhibida y sin ajustarse a la estructura de los órganos, así como para crecer a modo de infiltración, destruyendo el tejido. La formación de diseminaciones (metástasis) a distancia del tumor, después de que se hayan diseminado células tumorales a través de la sangre o la linfa, es un signo seguro de malignidad. El cáncer es una de las causas más frecuentes de muerte en el ser humano y
existe, por consiguiente, una elevada necesidad de métodos y medios para curar o tratar las degeneraciones malignas.

Aparte de la eliminación quirúrgica, a ser posible, radical, del tumor, las posibilidades para tratar tumores malignos incluyen radioterapia, utilizando rayos X, rayos \alpha, rayos \beta y rayos \gamma, inmunoterapia y quimioterapia. En la actualidad, la inmunoterapia sólo se puede emplear en un grado limitado. Por quimioterapia de tumores se entiende la administración de venenos celulares (agentes citostáticos) para tratar tumores y las células tumorales que permanecen habitualmente después del tratamiento quirúrgico local o la irradiación. Estas sustancias interfieren de manera específica con ciertos procesos de división celular, lo que significa que los tejidos que contienen una elevada proporción de células en división, tales como los tejidos tumorales de rápido crecimiento, reaccionan de forma más sensible. Los agentes citostáticos que se utilizan son compuestos alquilantes tales como ciclofosfamida, antimetabolitos tales como metotrexatos, alcaloides tales como vincristina, y antibióticos tales como daunomicina o adriamicina. Sin embargo, debido a los masivos efectos secundarios, todos estos agentes presentan graves inconvenientes, de modo que sólo se retrasa, pero no se evita la muerte del paciente afectado. Además, las células degeneradas (cancerosas) desarrollan resistencias a los agentes que se utilizan; aunque los medicamentos que se emplean en ese momento ya no exhiben efecto citostático, siguen siendo tóxicos como consecuencia de los efectos secundarios. Adicionalmente, se ha observado que la eficacia alcanzada mediante el uso de agentes citostáticos en combinación o de forma secuencial es superior a la que se logra con el uso de un único agente citostático (monoterapia) y, por lo tanto, es posible que los efectos secundarios sustanciales no sean aditivos en relación con la poliquimioterapia. Por todas estas razones, se necesitan urgentemente nuevos agentes quimioterapéuticos y se les investiga, por consiguiente, en todo el mundo.

Los primeros ejemplos de bengamidas fueron las bengamidas A y B, que están sustituidas con dodecanoílo en el anillo de caprolactama, y que se aíslan de la esponja marina Jaspis cf. Coriacea (familia Coppatiidae, orden Choristida B Astrophorida) (Adamczewski et al., J. Org. Chem. 1986, 51, 4497-4498), y que se ha comunicado que resultan biotóxicas para células eucariotas, nematodos y bacterias.

Ejemplos de derivados de bengamida, en los que se detectó una actividad antitumoral, son la bengamida E

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y su derivado N-metilado, bengamida F. Bengamida E inhibe la proliferación celular al detener la división celular en el punto de restricción G1/S y en la fase G2/M del ciclo celular. Los derivados de bengamida B inhiben la proliferación de células de cáncer de mama MDA-MB-435 (Kinder et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 3692-3699).

Una característica común de los derivados de bengamida conocidos es que se les ha aislado de esponjas marinas del género Jaspis sp. o Pachastrissa sp. (Thale et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 1733-1741).

Se ha encontrado ahora que la cepa de microorganismos Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) es capaz de formar nuevos derivados de bengamida que inhiben la proliferación celular a bajas concentraciones y que, por lo tanto, son adecuados para ser utilizados en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades oncológicas. La presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I),

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en la que

R_{1}: significa H o alquilo-(C_{1}-C_{6}),

R_{2}: significa H u OH, y

R_{3}: significa H o -C(=O)-alquilo-(C_{1}-C_{6}),

o a una sal fisiológicamente aceptable de un compuesto de la fórmula (I).

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De forma independiente entre sí, R_{1} es, preferentemente, H o metilo, y R_{3} es, preferentemente, H.

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La invención se refiere, preferentemente, a un compuesto de la fórmula (I) en la que

R_{1}: significa H o metilo,

R_{2}: significa H u OH, y

R_{3}: significa H.

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Alquilo-(C_{1}-C_{6}) significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene hasta 6 átomos de carbono, por ejemplo metilo (Me), etilo, n-propilo, isopropilo, terc-butilo o n-hexilo, preferentemente metilo.

Adicionalmente, la invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I) que se distingue por un compuesto de la fórmula (II)

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un compuesto de la fórmula (III)

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y un compuesto de la fórmula (IV)

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La presente invención se refiere, además, a sales fisiológicamente compatibles de los compuestos de la fórmula (I) según la invención.

A menos que se indique lo contrario, los centros quirales en los compuestos de las fórmulas (I) pueden encontrarse presentes en configuración R o en configuración S. La invención se refiere tanto a los compuestos ópticamente puros como a las mezclas estereoisómeras tales como mezclas enantiómeras y mezclas diastereoisómeras.

Por sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de la fórmula (I) se entienden tanto sus sales orgánicas como sus sales inorgánicas, como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418 (1985)). Debido a su estabilidad física y química y a su solubilidad, se prefieren las sales de sodio, potasio, calcio y amonio, entre otras, para grupos ácidos; se prefieren las sales del ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o de ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico y ácido p-toluenosulfónico, entre otras, para grupos básicos.

Compuestos de la fórmula (I) pueden prepararse mediante

1.: la fermentación de la cepa Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), o una de sus variantes y/o mutantes, bajo condiciones adecuadas en un medio de cultivo hasta que se acumule uno o más de los compuestos de la fórmula (I) en el medio de cultivo,

2.: aislamiento de un compuesto de la fórmula (I) desde el medio de cultivo, y

3.: derivatización del compuesto de la fórmula (I), cuando sea apropiada, y/o, cuando resulte adecuado, conversión en una sal fisiológicamente aceptable.

El medio de cultivo es una solución de nutrientes o un medio sólido que contiene al menos una fuente habitual de carbono y una fuente de nitrógeno, así como sales inorgánicas habituales. Si se agrega hidroxilisina al medio de cultivo, la cepa de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) produce un compuesto de la fórmula (I) en el que R_{2} es OH como consecuencia de la digestión de hidroxilisina.

El procedimiento se puede utilizar para fermentar a escala de laboratorio (escala de mililitro a litro), y para fermentar a escala industrial (escala de metro cúbico).

Como fuentes de carbono para la fermentación son adecuados hidratos de carbono y alcoholes sacáricos asimilables tales como glucosa, lactosa, sacarosa o D-manitol, así como productos naturales que contienen hidratos de carbono tales como extracto de malta o extracto de levadura. Ejemplos de nutrientes que contienen nitrógeno son aminoácidos, péptidos y proteínas, así como sus productos de degradación, por ejemplo caseína, peptonas o triptonas; extractos de carne; extractos de levadura; gluten; semillas trituradas, por ejemplo de maíz, trigo, habas, soja o de la planta del algodón; residuos de destilación de la producción de alcohol; harinas de carne; extractos de levadura; sales de amonio; nitratos. Se prefiere que la fuente de nitrógeno sea uno o múltiples péptidos obtenidos por síntesis o biosíntesis. Ejemplos de sales inorgánicas son cloruros, carbonatos, sulfatos o fosfatos de metales alcalinos, metales alcalino-térreos, hierro, cinc, cobalto y manganeso. Ejemplos de elementos traza son cobalto y manganeso.

Condiciones adecuadas para formar bengamidas según la invención son las siguientes: las bengamidas según la invención se forman, preferentemente, en un medio de cultivo que contiene 0,05 a 5%, preferentemente 0,1 a 2,5% de extracto de levadura; 0,2 a 5,0%, preferentemente 0,1 a 2% de casitona; 0,02 a 1,0%, preferentemente 0,05 a 0,5% de CaCl_{2} x 2 H_{2}O; 0,02 a 1,5%, preferentemente 0,05 a 0,7% de MgSO_{4} x 7 H_{2}O, así como 0,00001% a 0,001% de cianocobalamina. Los valores porcentuales indicados están basados, en todos los casos, en el peso de la solución de nutrientes total.

El microorganismo se cultiva bajo condiciones aeróbicas, es decir, por ejemplo sumergido, mientras se agita o remueve en frascos de agitación o fermentadores, o en medio sólido, cuando resulte apropiado, mientras se hace pasar aire u oxígeno. Los microorganismos se pueden cultivar en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 18 a 35ºC, preferentemente de aproximadamente 20 a 32ºC y, en particular, de 27 a 30ºC. El intervalo de pH debe estar comprendido entre 4 y 10, preferentemente entre 6,5 y 7,5. Por lo general, el microorganismo se cultiva bajo estas condiciones durante un período de 2 a 10 días, preferentemente de 72 a 168 horas. De manera ventajosa, el microorganismo se cultiva en varias etapas, es decir, se preparan inicialmente uno o múltiples cultivos preliminares en un medio de nutrientes líquido, inoculando entonces estos cultivos preliminares en el medio de producción real, es decir, el cultivo principal, por ejemplo, en una relación por volumen de 1:10 hasta 1:100. El cultivo preliminar se obtiene, por ejemplo, inoculando la cepa, en forma de células vegetativas o cuerpos fructíferos, en una solución nutriente y dejándola crecer durante aproximadamente 20 a 120 horas, preferentemente desde 48 a 96 horas. Se pueden obtener células vegetativas y/o cuerpos fructíferos dejando crecer la cepa, por ejemplo, durante 1 a 15 días, preferentemente 4 a 10 días, sobre un sustrato nutriente sólido o líquido, por ejemplo, agar de
levadura.

Se aísla o purifica un derivado de bengamida de la fórmula (I) a partir del medio de cultivo, usando métodos conocidos y teniendo en consideración las propiedades químicas, físicas y biológicas de las sustancias naturales. Se empleó HPLC para analizar las concentraciones de los respectivos derivados de bengamida en el medio de cultivo o en las etapas individuales de aislamiento, comparando convenientemente la cantidad de sustancia formada con una solución de calibración.

Para el aislamiento, el caldo de cultivo, o el cultivo junto con el medio sólido, se liofilizan, tras lo cual se extraen los derivados de bengamida del liofilizado usando un disolvente orgánico, por ejemplo metanol ó 2-propanol. La fase de disolvente orgánico contiene las sustancias naturales según la invención; cuando es adecuado, se concentra al vacío y se somete a una purificación adicional.

La purificación adicional de uno o múltiples compuestos según la invención se realiza por cromatografía sobre materiales adecuados, preferentemente, por ejemplo, sobre tamices moleculares, sobre gel de sílice, sobre óxido de aluminio, sobre intercambiadores de iones, o sobre resinas adsorbentes o sobre fases inversas (RP). Con ayuda de esta cromatografía se separan los derivados de bengamida. Los derivados de bengamida se cromatografían usando soluciones acuosas tamponadas o mezclas de soluciones acuosas y orgánicas.

Como mezclas de soluciones acuosas u orgánicas se entienden todos los disolventes orgánicos miscibles con agua, preferentemente metanol, 2-propanol o acetonitrilo, en una concentración de 5 a 95% de disolvente, preferentemente 5 a 40% de disolvente, o también todas las soluciones acuosas tamponadas que son miscibles con disolventes orgánicos. Los tampones que se deben utilizar son los mismos que se han especificado anteriormente.

Los derivados de bengamida se separan, sobre la base de sus diferentes polaridades, con ayuda de cromatografía de fase inversa, por ejemplo sobre MCI® (resina adsorbente de Mitsubishi, Japón), o Amberlite XAD® (TOSO-HAAS), o sobre otros materiales hidrófobos, por ejemplo sobre fases RP-8 o RP-18. Adicionalmente, la separación se puede efectuar mediante cromatografía de fase normal, por ejemplo sobre gel de sílice, óxido de aluminio, y similares.

Los derivados de bengamida se cromatografían usando soluciones acuosas tamponadas, básicas o acidificadas, o mezclas de soluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes orgánicos miscibles con agua. Se utilizan, preferentemente, acetonitrilo y metanol como disolvente orgánico.

Como soluciones acuosas tamponadas, básicas o acidificadas se entienden, por ejemplo, agua, tampón fosfato, acetato de amonio y tampón citrato, a una concentración de hasta 0,5 M, así como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, amoniaco y trietilamina, o todos los ácidos y bases disponibles en el comercio y conocidos por los expertos, preferentemente a una concentración de hasta 1%. En el caso de soluciones acuosas tamponadas, se prefiere de manera especial acetato de amonio al 0,1%.

La cromatografía se llevó a cabo usando un gradiente que comenzó con agua al 100% y finalizó con disolvente al 100%; la cromatografía se efectuó, preferentemente, con un gradiente lineal de acetonitrilo al 5 a 95%.

De forma alternativa, también es posible llevar a cabo una cromatografía sobre gel o cromatografía sobre fases hidrófobas. La cromatografía sobre gel se lleva a cabo sobre geles de poliacrilamida o geles copolímeros tales como Biogel-P 2® (Biorad), o Fractogel TSK HW 40® (Merck, Alemania). Es posible invertir la secuencia de las etapas cromatográficas anteriormente mencionadas.

En el caso en que las bengamidas estén presentes como diastereoisómeros, se les puede separar usando métodos conocidos, por ejemplo mediante separación usando una columna quiral.

La derivatización de los grupos OH en la cadena lateral de los compuestos de la fórmula (I) (R_{3} es, en cada caso, H), para dar un grupo acilo (R_{4} es, en cada caso, -C(=O)-alquilo-(C_{1}-C_{6})) se efectúa empleando métodos que son conocidos en sí mismos (J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4ª edición, 1992), por ejemplo por medio de una reacción con un anhídrido ácido. Por ejemplo, Adamczeski et al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 647-654, describen la reacción con anhídrido acético para dar un compuesto de la fórmula (I), en la que R_{3} significa -C(=O)-CH_{3}.

Del mismo modo, la alquilación del grupo NH en el anillo de caprolactama de un compuesto de la fórmula (I) (R_{1} es, en cada caso, H) se lleva a cabo usando métodos conocidos en sí mismos (J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4ª edición, 1982), por ejemplo por reacción con Me_{2}CO_{3} o Me_{2}SO_{4}, para preparar los correspondientes derivados N-metilados, o por reacción con bromuro de alquilo-(C_{1}-C_{6}) en presencia de una base.

Con el número DSM 15898, se depositó con fecha 11.09.2003 un aislado de la cepa de microorganismo Myxococcus virescens ST200611 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las normas del Tratado de Budapest.

Las células vegetativas de la cepa DSM 15898 tienen forma de bacilo característica de Myxococcus virescens. Sobre sustratos nutrientes sólidos, Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) forma cuerpos fructíferos naranja-amarillentos que contienen mixosporas redondas.

En lugar de la cepa Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), también es posible usar sus mutantes y/o variantes que sintetizan uno o múltiples compuestos según la invención.

Un mutante es un microorganismo en el que uno o múltiples genes del genoma se han modificado con el gen o los genes responsables de la capacidad del organismo para producir el compuesto según la invención, conservándose éstos últimos en forma funcional y hereditaria.

Estos mutantes se pueden producir, de manera conocida en sí misma, usando medios físicos, por ejemplo irradiación tal como, por ejemplo, con rayos ultravioletas o rayos X, o mutágenos químicos tales como metanosulfonato etílico (EMS); 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (MOB) o N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), o del modo descrito por Brock et al. en "Biology of Microorganisms", Prentice Hall, páginas 238-247 (1984).

Una variante es un fenotipo del microorganismo. Los microorganismos tienen la capacidad de adaptarse a su ambiente y, por consiguiente, exhiben una flexibilidad fisiológica altamente desarrollada. En la adaptación fenotípica intervienen todas las células del microorganismo, sin que la naturaleza de la variación esté genéticamente condicionada y siendo reversible con la alteración de las condiciones (H. Stolp, Microbial ecology: organism, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, página 180, 1988).

El análisis de mutantes y/o variantes que sintetizan uno o más de los compuestos según la invención tiene lugar de acuerdo con el siguiente esquema:

-: \vtcortauna liofilización del medio de fermentación;

-: \vtcortauna extracción del liofilizado con un disolvente orgánico;

-: \vtcortauna extracción del compuesto del filtrado del cultivo, usando fases sólidas;

-: \vtcortauna análisis por HPLC o CCF, o por ensayo de la actividad biológica.

Las condiciones de fermentación que se han descrito son aplicables a Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) y a sus mutantes y/o variantes.

Se emplea un ensayo basado en la determinación de la concentración intracelular de ATP para detectar la inhibición de la proliferación celular. Resulta posible utilizar líneas celulares tumorales tales como Hep-G2 y Colo205. En este ensayo, el contenido en ATP de células metabólicamente activas sirve, en una reacción con luciferasa, como medición del número de células vivas.

Los compuestos de las fórmulas (II)-(VI) se utilizaron en el ensayo en una concentración única de 0,3 - 40 \muM y una dependencia de dosis indicada como valor de CT_{50}, indicando en cada caso (IIA) y (IIB) una diastereoisómero del compuesto de la fórmula (II):

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Por lo tanto, objeto de la invención es, además, el uso del compuesto de la fórmula (I) o de una sal fisiológicamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento en medicina humana o veterinaria, en particular para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades oncológicas. La invención se refiere, preferentemente, al uso de un compuesto de la fórmula (I), o de una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para preparar un medicamento para tratar el cáncer de mama, cáncer intestinal, cáncer de estómago, cáncer de hígado, tumores cerebrales, tumores ováricos, cáncer de esófago, cáncer renal y carcinoma de células musculares, en especial carcinoma de los músculos de cabeza y cuello.

Además, la presente invención se refiere a un medicamento que contiene al menos un compuesto de la fórmula (I) o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, existiendo la posibilidad de administrar el o los compuestos de la fórmula (I) como tales o, preferentemente, estando presentes en una mezcla con uno o más de las sustancias de vehículo o sustancias auxiliares habituales, farmacéuticamente adecuadas.

Los compuestos según la invención son estables en estado sólido y en soluciones, en un intervalo de pH entre 2 y 9, en particular entre 5 y 7 y, en consecuencia, se pueden incorporar en preparaciones galénicas habituales.

Aun cuando los medicamentos según la invención se pueden administrar por vía oral o parenteral, también resulta posible, en principio, su uso por vía rectal. Ejemplos de formas de preparaciones galénicas sólidas o líquidas adecuadas son gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en forma de ampolla, así como preparaciones que proporcionan una liberación prolongada del compuesto activo; en su preparación se utilizan habitualmente sustancias de vehículo o sustancias auxiliares farmacológicamente adecuadas tales como desintegrantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchamiento, deslizantes, lubricantes, sustancias saborizantes, edulcorantes o solubilizantes, por ejemplo carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, proteína de la leche, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales, polietilenglicoles y disolventes tales como, por ejemplo, agua esterilizada, alcoholes, glicerol y alcoholes polihídricos.

Eventualmente, las unidades de dosificación para administración oral pueden estar micro-encapsuladas para retrasar la liberación o prolongarla durante un período relativamente largo de tiempo, por ejemplo mediante recubrimiento o inclusión del compuesto activo en forma de partículas en polímeros o ceras adecuados, y similares.

Es preferible producir y administrar las preparaciones farmacéuticas en unidades de dosificación, conteniendo cada unidad, como componente activo, una dosis definida de uno o múltiples compuestos de los derivados de bengamida de la fórmula (I). En el caso de unidades de dosificación sólidas tales como comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de hasta aproximadamente 500 mg, pero, preferentemente, es de aproximadamente 0,1 hasta 200 mg y, en el caso de soluciones inyectables en forma de ampolla, hasta aproximadamente 200 mg, pero, preferentemente, de aproximadamente 0,5 hasta 100 mg al día.

La dosis diaria a administrar depende del peso corporal, edad, sexo y estado del mamífero. Sin embargo, también dosis diarias mayores o menores pueden ser apropiadas. La dosis diaria se puede administrar tanto por medio de una administración única al día, en forma de una unidad de dosificación única, o en varias unidades de dosificación menores, y por medio de la administración múltiple de dosis subdivididas, a intervalos definidos.

Los medicamentos según la invención se fabrican dando forma adecuada para la administración a uno o múltiples compuestos de la fórmula (I) según la invención, opcionalmente junto con una o múltiples sustancias de vehículo y sustancias auxiliares habituales.

Los siguientes Ejemplos pretenden explicar la invención de forma más detallada, sin limitar su alcance en absoluto.

A menos que se indique lo contrario, los valores porcentuales se refieren al peso y las relaciones de mezcla, en el caso de líquidos, se refieren al volumen.

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Ejemplo 1

Almacenamiento de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) a -135ºC

Se inocula una placa de agar (levadura de panadería fresca al 1%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM, cianocobalamina al 0,00005%, agar al 1,5%, pH 7,2) con la cepa de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) y se incuba a 30ºC durante aproximadamente 7 días. De la superficie de agar se retiran por rascado las células en este cultivo superficial usando una espátula estéril, se resuspenden en 0,5 ml de medio de casitona (casitona al 1% (Difco), MgSO_{4} x 7 H_{2}O al 0,15%, pH 7,0) y se almacenan a -135ºC.

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Ejemplo 2

Preparación de un cultivo preliminar de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) en un matraz Erlenmayer

Un matraz Erlenmayer de 300 ml con 100 ml de solución nutriente (levadura de panadería fresca al 1%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM, cianocobalamina al 0,00005%, pH 7,2) se inocula con la cepa de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), y el cultivo se incuba durante 4 días a 30ºC y 180 rpm en un agitador rotatorio. Se utilizan, entonces, 5 ml de este cultivo preliminar para preparar los cultivos principales.

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Ejemplo 3

Preparación de un cultivo principal líquido de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898)

Un matraz Erlenmayer estéril de 300 ml, que contiene 100 ml de la siguiente solución nutriente (extracto de levadura al 0,5%, casitona al 0,5%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 0,1%, MgSO_{4} x 7 H_{2}O al 0,2%, cianocobalamina al 0,00005%, pH 7,4) se inocula con 5 ml del cultivo preliminar (véase el Ejemplo 2), o un cultivo realizado en un placa de agar fresco (levadura de panadería fresca al 1%, CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM, cianocobalamina al 0,00005%, pH 7,2, más agar al 1,5%), y se incuba a 30ºC y 180 rpm en una agitadora. La producción máxima de bengamidas según la invención se alcanza después de 72-96 horas. Un cultivo sumergido de 72-96 horas de antigüedad (cantidad de inoculación aprox. 5-10%) de la misma solución nutriente descrita en el Ejemplo 2, es suficiente para inocular fermentadores de 10 a 200 L.

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Ejemplo 4

Preparación de un cultivo principal líquido de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), con alimentación de hidroxilisina para producir el derivado de bengamida (IV)

Un matraz Erlenmayer estéril, de 300 ml, que contiene 100 ml de la siguiente solución de nutrientes (extracto de levadura al 0,5%, casitona al 0,5%, CaCl_{2} x 2H_{2}O al 0,1%, MgSO_{4} x 7H_{2}O al 0,2%, cianocobalamina al 0,00005% e hidroxilisina 1 mM, pH 7,4) se inocula con 5 ml de un cultivo preliminar del Ejemplo 2, o un cultivo que se ha hecho crecer sobre una placa de agar fresco (levadura de panadería fresca al 1%, CaCl_{2} x 2H_{2}O al 1%, HEPES 20 mM, cianocobalamina al 0,00005%, pH 7,2, más agar al 1,5%), y se incuba a 30ºC y 180 rpm en una agitadora. La producción máxima del derivado de bengamida (IV) se alcanza después de 72-96 horas. Se utilizó HPLC-MS para el análisis. Un cultivo sumergido de 72-96 horas de antigüedad (cantidad de inoculación, aprox. 5-10%) de la misma solución de nutrientes descrita en el Ejemplo 2, es suficiente para inocular fermentadores de 10 a 200 L.

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Ejemplo 5

Preparación de derivados de bengamida en un fermentador

Los fermentadores de 10 L y 30 L se hicieron funcionar bajo las siguientes condiciones:

100

El pH se reguló siempre utilizando KOH al 10% o, respectivamente, H_{2}SO_{4} al 10%. La formación de espuma se puede suprimir agregando repetidamente Clerol FBA 265 (Cognis Alemania GmbH). La producción máxima se alcanza después de aprox. 72 a 96 horas.

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Ejemplo 6

Aislamiento de los derivados de bengamida (II) y (III), así como de bengamidas E y F, de los cultivos agitados de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898)

Después de finalizar la fermentación de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898), se liofilizó el caldo de cultivo del Ejemplo 3 (30 L de caldo de cultivo), junto con la biomasa, y el liofilizado se extrajo con metanol (2 x 5 L). El extracto de metanol se redujo a 1,2 L al vacío y se cargó, seguidamente, en una columna preparada empaquetada con aprox. 1,5 litros de material CHP-20P (gel MCI®, 75-150 \mu, Mitsubishi Chemical Corporation). Se eluyó con metanol al 95%. Se recogió el caudal de la columna (120 ml/min) y se redujo a un volumen de 1,5 L al vacío.

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Ejemplo 7

Pre-separación de los derivados de bengamida (II) y (III), así como de las bengamidas E y F, mediante cromatografía RP-18

Se cargaron 1,5 L de la solución obtenida de la forma descrita en el Ejemplo 6 en una columna Phenomenex Luna® 10 \mu C18 (2) (tamaño: 50 mm x 250 mm), dotada con una pre-columna Luna® 10 \mu C18 (2) (dimensiones: 21,2 mm x 60 mm), y se eluyó (acetato de amonio al 0,1%, pH 4,6, ajustado con ácido acético) durante 60 min, usando un gradiente de acetonitrilo en agua al 5% hasta 95%. El caudal fue de 150 ml/min y el tamaño de fracción fue de 200 ml. Las bengamidas estuvieron presentes en las fracciones 5-9, 10-11 y 12-14.

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Ejemplo 8

Purificación de los derivados de bengamida (II) y (III), así como de las bengamidas E y F (ensayo comparativo)

Se liofilizaron las fracciones individuales del Ejemplo 7 y se purificaron una vez más por HPLC sobre una columna Phenomenex Luna® 10 \mum C18 (2) (dimensiones: 21 mm x 250 mm), dotada con una pre-columna XTerra® Prep MS C18 10 \mum (Waters, dimensiones: 19 x 10 mm). Se eluyó usando un gradiente de acetonitrilo en agua al 5% hasta 40% durante 40 min (con la presencia adicional de acetato de amonio al 0,1%, pH 8,8, ajustado con metilamina). Se recogió el caudal de la columna (50 ml/min) en fracciones (fracciones de 7,5 ml en cada caso). Las fracciones 5-9 del Ejemplo 7 contuvieron el compuesto de la fórmula (III) y, después de la cromatografía y liofilización, proporcionaron 86 mg de bengamida E (pureza >95%). Después de la cromatografía, las fracciones 10-11 del Ejemplo 7 proporcionaron 145 mg de bengamida (II) (pureza >95%, mezcla diastereoisómera 70/30) y 5 mg de bengamida F (pureza >95%). Se obtuvieron 35 mg de bengamida (III) (pureza >95%) en forma de mezcla diastereoisómera, en una relación de 75:25, de las fracciones 12-14 del Ejemplo 7. Los diastereoisómeros son, en cada caso, los correspondientes epímeros
C-16.

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Ejemplo 9

Aislamiento de la hidroxi-bengamida (IV) de los cultivos agitados de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898)

Después de finalizar la fermentación de Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) se liofilizó el caldo de cultivo del Ejemplo 5 (10 L de caldo de cultivo), junto con la biomasa, y el liofilizado se extrajo con metanol (2 x 3 L). El extracto de metanol se redujo al vacío a 400 ml y se cargó en una columna preparada, que se había empaquetado con 0,6 litros de material CHP-20P (gel MCI®, 75-150, Mitsubishi Chemical Corporation). Se eluyó con metanol en agua al 5% hasta 95%. El caudal de la columna (100 ml/min) se recogió en fracciones durante 60 min (0,5 min por fracción). Las fracciones que contuvieron el derivado deseado (fracciones 45-109) se combinaron y redujeron al vacío a un volumen de 700 ml.

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Ejemplo 10

Pre-purificación de la hidroxi-bengamida (IV) mediante cromatografía RP-18

A continuación, la solución del Ejemplo 9 se cargó en una columna Phenomenex Luna® 10 \mu C18 (2) (tamaño: 50 mm x 250 mm), dotada de una pre-columna Phenomenex Luna® 10 \mu C18 (2) (dimensiones: 21,2 mm x 60 mm) y se eluyó (acetato de amonio al 0,1%, pH 8,8, ajustado con trietilamina), usando un gradiente de acetonitrilo en agua al 5% hasta 40%, durante 60 min. El caudal fue de 150 ml/min y el tamaño de fracción fue 250 ml. La fracción 22 contuvo el derivado de bengamida deseado.

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Ejemplo 11

Purificación de la hidroxi-bengamida (IV)

La fracción 22 del Ejemplo 10 se liofilizó y purificó nuevamente por medio de HPLC en una columna Phenomenex Luna® 10 \mum C18 (2) (dimensiones: 21 mm x 250 mm), dotada de una pre-columna Waters XTerra ® Prep MS C18 10 \mum (dimensiones: 19 x 10 mm). Se eluyó con un gradiente de acetonitrilo en agua al 5% hasta 95% durante 60 min (con la presencia adicional de acetato de amonio al 0,1%, pH 4,6, ajustado con ácido acético). Se recogió el caudal de la columna (50 ml/min) en fracciones (fracciones de 7,5 ml en cada caso). Se combinaron, desalinizaron y liofilizaron las fracciones que contuvieron bengamida (fracciones 26-28). En relación con esto, se obtuvieron 7 mg de bengamida (IV) en forma de mezcla diastereoisómera en una relación de 75:25.

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Ejemplo 12

Caracterización del compuesto de la fórmula (II)

Fórmula empírica: C_{18}H_{32}N_{2}O_{6}

Peso molecular: 372,47

Mezcla diastereoisómera: 75:25

7

8

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Ejemplo 13

Caracterización del compuesto de la fórmula (III)

Fórmula empírica: C_{19}H_{34}N_{2}O_{6}

Peso molecular: 386.49

Mezcla diastereoisómera: 75/25

10

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Ejemplo 14

Caracterización del compuesto de la fórmula (IV)

Fórmula empírica: C_{18}H_{32}N_{2}O_{7}

Peso molecular: 388,46

Mezcla diastereoisómera: 75/25

12

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Ejemplo 15

Caracterización de bengamida E

Fórmula empírica: C_{17}H_{30}N_{2}O_{6}

Peso molecular: 358,44

14

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Ejemplo 16

Caracterización de bengamida F

Fórmula empírica: C_{18}H_{32}N_{2}O_{6}

Peso molecular: 372,47

16

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Ejemplo 17

Separación de los diastereoisómeros del compuesto (II)

La mezcla diastereoisómera del compuesto de la fórmula (II) del Ejemplo 6 se separó en una columna quiral (AD/H, Daicel, 20 x 200 mm, 0,5 ml/min, fase móvil: acetonitrilo:metanol 4:1 + NH_{4}Ac al 0,1%). La pureza óptica se comprobó en una columna analítica AD/H (Daicel) (4,6 x 250 mm, 30ºC, fase móvil: acetonitrilo:metanol 4:1 + NH_{4}Ac al 0,1%, 0,75 ml/min, pico 1 de Rt: 9,9 min, pico 2 de Rt: 10,9 min).

18

Ejemplo 18

Mediciones de la proliferación celular, realizadas en diversas líneas de células tumorales

Se utilizaron las líneas de células tumorales Hep-G2 (ATCC No. HB-8065) y COLO 205 (ATCC No. CCL-222) para determinar la proliferación celular. Las líneas celulares se sembraron en medio de cultivo celular a razón de 1000 células/pocillo [Hep-G2] y, respectivamente, 3500 células/pocillo [Colo205], y se incubaron durante 4 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Medio para Hep-G2: Medio de Eagle modificado por Dulbecco/mezcla F12 de Ham (Gibco); NEAA (al 10%; aminoácidos no esenciales, Gibco), piruvato sódico (al 1%, Gibco), L-glutamina (al 1%, Gibco), suero de ternero fetal (al 5%; PAA).

Medio para COLO 205: RPMI 1640 (Gibco), L-glutamina (al 1%, Gibco), HEPES (al 1%, Gibco), suero de ternero fetal (al 10%, PAA).

Después de 4 horas, se agregaron los compuestos (II), (III) y (IV) y las bengamidas E y F, disueltos en DMSO/medio de cultivo celular, en diversas diluciones, y las mezclas se incubaron durante 72 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. El contenido intracelular en ATP se determinó usando el reactivo de ensayo CellTiterGlo (Promega).

Los resultados de los ensayos de proliferación celular se ofrecen en la Tabla 1.

Claims

1. Compuesto de la fórmula (I).

20

en la que

R_{1}: significa H o alquilo-(C_{1}-C_{6}),

R_{2}: significa H u OH, y

R_{3}: significa H o -C(=O)-alquilo-(C_{1}-C_{6})

o una sal fisiológicamente aceptable del mismo.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R_{1} significa H o metilo.

3. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que R_{3} significa H.

4. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R_{1} significa H o metilo, R_{2} significa H u OH, y R_{3} significa H.

5. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por un compuesto de la fórmula (II)

21

6. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por un compuesto de la fórmula (III)

22

7. Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por un compuesto de la fórmula (IV)

23

8. Uso de un compuesto de la fórmula (I) o de una sal fisiológicamente aceptable del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 7, para preparar un medicamento.

9. Uso de un compuesto de la fórmula (I) o de una sal fisiológicamente aceptable del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 7, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades oncológicas.

10. Medicamento que contiene al menos un compuesto de la fórmula (I), o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, según una de las reivindicaciones 1 a 7.