ES2336562T3 - Heterociclos sustituidos. - Google Patents

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ES2336562T3 ES04708731T ES04708731T ES2336562T3 ES 2336562 T3 ES2336562 T3 ES 2336562T3 ES 04708731 T ES04708731 T ES 04708731T ES 04708731 T ES04708731 T ES 04708731T ES 2336562 T3 ES2336562 T3 ES 2336562T3
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Anke Mayer-Bartschmid
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Hiroko Togame
Reiko Dodo
Peter Reinemer
Kevin Bacon
Kinji Fuchikami
Satoko Matsukawa
Klaus Urbahns
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Abstract

Compuestos de fórmula **(Ver fórmula)** donde R1 representa hidrógeno, hidroxi o metilcarboniloxi, R2 representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi, y R3 representa hidrógeno o hidroxi. y sus sales, solvatos o solvatos de las sales.

Description

Heterociclos sustituidos.
La presente invención se refiere a heterociclos sustituidos, a su procedimiento de preparación y a su utilización en medicamentos, especialmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, esto es asma o cáncer.
La proteinasa multicatalítica o proteasoma es una estructura celular altamente conservada que es responsable de la proteolisis ATP-dependiente de la mayoría de las proteínas celulares. El proteasoma 20S (700 kDa) contiene al menos cinco actividades proteolíticas distintas que conllevan un nuevo tipo de mecanismo que implica un residuo treonina en el sitio activo (Coux, O., Tanaka, K. y Goldberg, A. 1996 Ann. Rev. Biochem. 65:801-47).
Aunque el proteasoma 20S contiene el núcleo proteolítico, no puede degradar proteínas in vivo a no ser que se compleje con una terminación (cap) 19S en cualquiera de los extremos de su estructura, el que contiene a su vez múltiples actividades ATPasa. Esta estructura de mayor tamaño se conoce como proteasoma 26S y degrada rápidamente las proteínas que han sido el blanco de la degradación mediante la adición de múltiples moléculas del polipéptido de 8,5 kDa ubiquitina.
Ha quedado bien establecido ahora que el proteasoma es un sistema proteolítico extralisosomal principal que está involucrado en las vías de degradación, resultando en numerosas y diversas funciones celulares, tales como la división celular, procesamiento de antígenos y degradación de proteínas reguladoras de vida corta como factores de transcripción, productos oncogénicos y ciclinas (revisado en Ciechanover, A. 1994 Cell 79:13-21). La función primaria del proteasoma consiste en catalizar la proteólisis de proteínas en pequeños péptidos. Sin embargo, se ha demostrado también que la vía ubiquitina-proteasoma puede catalizar el procesamiento proteolítico regulado de un gran precursor inactivo en una proteína activa. Al respecto, el caso mejor documentado incluye la activación del factor de transcripción NF-\kappaB (Palombella, V.J., Rando, O.J., Goldberg, A.L., y Maniatis, T. 1994 Cell 78:773-785). La forma activa del NF-\kappaB es un heterodímero compuesto por una subunidad p65 y una p50. Esta última está presente en el citosol celular en una forma precursora inactiva, a saber p105, polipéptido de 105 kDa precursor de p50. El procesamiento proteolítico de p105 para generar p50 tiene lugar a través de la vía ubiquitina-proteasoma. Además, los p50 y p65 procesados se mantienen en el citosol como complejo inactivo con la proteína de inhibición I\kappaB. Las señales inflamatorias activan NF-\kappaB mediante el inicio de la vía de señalización para la degradación completa de I\kappaB y estimulan también el procesamiento de p105 en p50. Por tanto, se necesitan dos eventos proteolíticos, ambos dirigidos por la vía ubiquitina-proteasoma, para la activación inducida por la señal de NF-\kappaB.
Una vez activado, NF-\kappaB se transloca hacia el núcleo, en el que desempeña un papel central en la regulación de un conjunto notablemente diverso de genes involucrados en las respuestas inmunes e inflamatorias (Grilli y col., International Review of Cytology (1993) 143:1-62). Por ejemplo, se necesita NF-\kappaB para la expresión de diversos genes implicados en la respuesta inflamatoria, como el gen TNF-\alpha y los genes que codifican las moléculas de adhesión celular E-selectina, P-selectina, ICAM y VCAM (Collins, T., Lab. Invest. (1993) 68:499). Se necesita también NF-\kappaB para la expresión de un amplio número de genes de citoquinas, como IL-2, IL-6, factor estimulante de colonias de granulocitos e IFN-\beta. La óxido nítrico-sintetasa inducible se encuentra también bajo el control regulador de NF-\kappaB. Los inhibidores del proteasoma bloquean la degradación de I\kappaB\alpha y la activación de NF-\kappaB (Palombella y col., WO 95/25533 publicada el 28 de Sept., 1995; Traenckner y col., EMBO J. (1994) 13: 5433). Los inhibidores del proteasoma bloquean también la expresión TNF-\alpha-inducida de las moléculas de adhesión de leucocitos E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1 (Read, y col., Immunity (1995) 2:493).
El hecho de que el proteasoma desempeñe un papel crítico en la activación de NF-\kappaB podría ser explotado clínicamente vía la utilización de inhibidores dirigidos hacia la proteólisis del proteasoma. En ciertas enfermedades, la función normal del NF-\kappaB activo puede resultar perjudicial para la salud humana, tal como se observa en las respuestas inflamatorias. Así, los inhibidores de la activación de NF-\kappaB, debido a su capacidad para impedir la secreción de diversas moléculas inflamatorias, tales como las moléculas de adhesión celular o citoquinas, pueden ser potencialmente útiles en el tratamiento de trastornos inflamatorios tales como aquellos que incluyen, por ejemplo, alergia, EPOC, inflamación de las vías aéreas y asma, ARDS (síndrome de distrés respiratorio agudo), SIDA, osteoartritis y artritis reumatoide; enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn; sepsis, rechazo de transplantes e isquemia o lesión por reperfusión, incluyendo derrame cerebral e infarto de miocardio. Debido a que la activación de NF-\kappaB es esencial también para la angiogénesis, los inhibidores del proteasoma pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas a la neovascularización anormal.
En un primer momento se describió la p53 como una oncoproteína, pero se ha demostrado posteriormente que estaba involucrada en numerosos procesos celulares (revisado por Ko, L.J. and Proves, C. 1996 Genes Dev. 10, 1054-1072). Se ha demostrado que p53 induce la apoptosis en varias líneas celulares hematopoyéticas (Oren, M., 1994 Semin. Cancer Biol. 5, 221-227) mediante la acción de muchos estímulos diferentes, incluyendo lesión del ADN, infección viral y eliminación de factores de crecimiento. Sin embargo, es importante observar que la apoptosis puede ser inducida de una forma p53-independiente, por ejemplo por la acción de glucocorticoides. La inducción de p53 conduce a la detención del crecimiento celular en la fase G1 del ciclo celular, así como a la muerte celular por apoptosis. Ambas funciones permiten que p53 controle la lesión del ADN, reduciendo así la propagación de mutaciones de ADN cuando las células se dividen. La p53 secuestra las células en G1 mediante la inducción del inhibidor de la quinasa ciclina-dependiente, p21, que a su vez provoca una acumulación de la forma hipofosforilada del producto genético del retinoblastoma. Se piensa que p53 actúa como punto de verificación en la célula después de la lesión del ADN, causa en primer lugar una detención de la división celular y apoptosis. Es conocido que la degradación de p53 se realiza a través de la vía ubiquitina-proteasoma y la interrupción de la degradación de p53 es una forma posible de inducción de la apoptosis. Otra utilidad potencial de los inhibidores del proteasoma puede encontrarse en el tratamiento de enfermedades que resulten de la proliferación celular anormal.
El hecho de que la vía ubiquitina-proteasoma es crítica para la destrucción regulada de las ciclinas que dirigen la salida de la mitosis y permiten que las células progresen hacia la siguiente fase del ciclo celular está bien documentado. Por tanto, inhibiendo la degradación de las ciclinas mediante la utilización de inhibidores del proteasoma provoca la detención del crecimiento. Así, otra utilidad potencial de los inhibidores del proteasoma consiste en su utilización en el tratamiento de enfermedades que resultan de una división celular acelerada. Éstas incluyen cáncer, enfermedades cardiovasculares como miocarditis, restenosis después de la angioplastia, enfermedades renales como lupus, enfermedad poliquística renal, infecciones fúngicas, enfermedades dermatológicas como psoriasis, cicatrización anormal de heridas, queloides, enfermedades inmunológicas como autoinmunidad, hipersensibilidad aguda y retardada, enfermedad injerto contra huésped, rechazo de transplantes y enfermedades neuroinmunológicas como esclerosis múltiple y encefalomielitis aguda diseminada.
Se descubrió que varios metabolitos microbianos inhibían el proteasoma. Por ejemplo, se han indicado algunos compuestos peptídicos procedentes de estreptomicetos, tales como la serie TMS-96 (Y. Koguchi y col., J. Antibiot., 1999, 52, 63-65 y J. Antibiot., 2000, 53, 1069-1076) y hongos como la serie TMC-95 (J. Kohno y col., J. Org. Chem., 2000, 65, 990-995) como fuertes inhibidores para este objetivo. Se ha reivindicado también que los metabolitos de actinomicetos no peptídicos que poseen una porción beta-lactona o sus análogos químicos respectivos interactúan fuertemente con este objetivo. Entre ellos se encuentran las salinosporamidas provenientes del actinomiceto marino Salinospora sp., conocido de la WO 02/47610 y R. Feling y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42, 355-357 (Salinosporamida A), y las \beta-lactonas de lactacistina conocidas de la WO 96/32105, WO 99/15183 y WO 99/09006.
La salinosporamida E y la Salinosporamida G son conocidas del 10º Internat. Symp. on Marine Natural Prod. en Okinawa 2001 y la "Salinosporamida A" se conoce del 50º Annual Congress Society for Medicinal Plant Research en Barcelona, España, 8-12 de septiembre de 2002.
1
La presente invención se refiere a nuevos heterociclos sustituidos que muestran una fuerte inhibición sin precedentes del proteasoma y al aislamiento de estos compuestos a partir del nuevo actinomiceto JS360 (DSM 15324) del género Streptomyces de SEQ ID NO: 1 tal como se describe en la Fig. 5 y el listado de secuencias.
La presente invención se refiere a los compuestos de fórmula I
2
donde
R^{1}
representa hidrógeno, hidroxi o metilcarboniloxi,
R^{2}
representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi, y
R^{3}
representa hidrógeno o hidroxi.
Los compuestos según la invención pueden estar presentes también en forma de sus sales, solvatos o como solvatos de las sales.
Dependiendo de su estructura, los compuestos de acuerdo con la invención pueden existir en formas estereoisoméricas (enantiómeros, diastereómeros). Por tanto, la invención se refiere a los enantiómeros o diastereómeros y a sus mezclas respectivas. Dichas mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros se pueden separar en sus constituyentes unitarios en forma estereoisomérica de forma conocida.
La invención también se refiere a los tautómeros de los compuestos, dependiendo de la estructura de los mismos.
En el contexto de la invención, las sales son preferentemente sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de acuerdo con la invención.
Las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos (I) incluyen sales de adición de ácido de ácidos inorgánicos, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo sales de ácido clorhídrico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico y ácido benzoico.
Las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos (I) incluyen también sales de bases habituales, por ejemplo y preferentemente sales de metales alcalinos (por ejemplo sales de sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo sales de calcio y magnesio) y sales de amonio procedentes de amoníaco o aminas orgánicas de 1 a 16 átomos de carbono, tales como, de forma ilustrativa y preferente, etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína, dibencilamina, N-metilmorfolina, dihidroabietilamina, arginina, lisina, etilendiamina y metilpiperidina.
En el contexto de la invención, los solvatos son aquellas formas de los compuestos que se coordinan con moléculas de disolvente para formar un complejo en estado sólido o líquido. Los hidratos son una forma específica de solvatos, donde la coordinación se lleva a cabo con agua.
Explicación de las figuras
Fig. 1: Lapso de tiempo de fermentación de la cepa JS360 a escala de 30 litros.
Fig. 2: Esquema para el aislamiento de los Ejemplos 1 a 7 a partir de los extractos crudos de una fermentación de cepa JS360 a escala de 30 litros.
Fig. 3: Cromatogramas HPLC, espectros LC-MS de HPLC-UV y HPLC-ESI del Ejemplo 1 después de la HPLC preparativa.
Fig. 4: Espectro protónico del Ejemplo 1.
Fig. 5: SEQ ID NO.: 1: rADN de 16S parcial, secuencia parcial de la cepa JS360/DSM 15324.
Fig. 6: Dendograma que muestra la relación entre Salinospora sp. y JS360. La escala debajo del árbol representa la distancia entre secuencias. Las unidades indican el número de eventos de sustitución. El grupo de Salinospora sp. está en la rama superior, mientras que JS360 y el grupo de secuencias similares se encuentran en la rama inferior.
Fig. 7: Gráfica ORTEP (50%) del Ejemplo 1 con el recuento de átomos distintos de hidrógeno.
Fig. 8: Empaquetamiento de cristales del Ejemplo 1 visto a lo largo de los ejes a y c que muestra las capas polares y no polares.
En otra realización, la presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula (I), en la que
R^{1}
representa hidrógeno o hidroxi,
R^{2}
representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi, y
R^{3}
representa hidrógeno o hidroxi.
En otra realización, la presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
3
en la que R^{1}, R^{2} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba.
En otra realización, la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula (I), tales como
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-
diona
4
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-[1-hidroxihexil]-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]hep-
tano-3,7-diona
5
y
(1R,4R,5S)-1-[(1R)-2-ciclohexen-1-ilmetil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-aza-biciclo[3.2.0]-heptano-3,7-diona
6
En otra realización, la presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
7
en la que
R^{4}
representa hidrógeno o hidroxi,
R^{5}
representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi,
R^{6}
representa hidrógeno o hidroxi, y
R^{7}
representa hidroxi o un sustituyente de fórmula seleccionada de entre:
8
donde R^{8} representa hidrógeno o metilo y * representa la posición de conexión a la molécula.
En otra realización, la presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que
R^{4}
representa hidrógeno o hidroxi,
R^{5}
representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a2 grupos hidroxi,
R^{6}
representa hidrógeno o hidroxi, y
R^{7}
representa hidroxi o un sustituyente de fórmula
10
donde R^{8} representa hidrógeno o metilo y * representa la posición de conexión a la molécula.
En otra realización, la presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
11
en la que R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} tienen el significado descrito más arriba.
\newpage
En otra realización, la presente invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula (II), tales como
(3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-3-hidroxi-4-[1-hidroxihexil]-3-metil-5-oxo-D-prolina
12
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteína
13
y
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteinato de metilo
14
En otra realización, la presente invención se refiere a un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1 (Fig. 5 y listado de secuencias).
En otra realización, la presente invención se refiere a
[A]
un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
15
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba,
\quad
caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la fermentación y aislamiento de un Actinomiceto JS360 (DSM 15324) del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
[B]
un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
16
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba,
\quad
caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la hidrogenación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
[C]
un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
17
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba y el grupo hidroxi está unido al átomo de carbono 1 ó 2,
\quad
caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la hidratación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
[D]
un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
18
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba,
\quad
caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la oxidación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
[E]
un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
19
\quad
en la que R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito más arriba, y R^{7} representa hidroxi o un sustituyente de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
20
\quad
en la que R^{8} tiene el significado descrito más arriba,
\quad
caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la fermentación y aislamiento de un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
[F]
un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
21
\quad
en la que R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito más arriba, y R^{7} representa un sustituyente de fórmula seleccionada entre el grupo compuesto de
22
\quad
caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la reacción de los compuestos de fórmula
23
\quad
donde R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito más arriba,
\quad
con tioles.
\quad
La fórmula (I) contiene los compuestos de fórmulas (Ib), (Ic), (Id) y (Ie).
\quad
La fórmula (II) contiene los compuestos de fórmulas (IIb), (IIc) y (IId).
Los procesos [A] y [E] se pueden llevar a cabo tal como se describe en la sección experimental o el Streptomyces sp. JS360 se fermenta sumergido en un medio nutriente acuoso en condiciones aeróbicas. Típicamente, el microorganismo se fermenta en un medio nutriente que contiene una fuente de carbono y un material proteináceo. Las fuentes preferentes de carbono incluyen glucosa, azúcar morena, sacarosa, glicerol, almidón, almidón de maíz, lactosa, dextrina, melazas y similares. Las fuentes preferentes de nitrógeno incluyen harina de semilla de algodón, licor de maceración de maíz, levadura, levadura de cerveza autolisada con sólidos de la leche, torta de soja, torta de semilla de algodón, torta de maíz, sólidos de la leche, producto de la digestión pancréatica de la caseína, productos sólidos de destilería, licores de peptona animal, sobras de carne y huesos, y similares. Ventajosamente se pueden utilizar combinaciones de estas fuentes de carbono y nitrógeno. No es necesario añadir al medio de fermentación metales traza, por ejemplo zinc, magnesio, manganeso, cobalto, hierro y similares, ya que se utilizan agua de grifo e ingredientes no purificados como componentes del medio.
La producción de los compuestos puede ser inducida a cualquier temperatura que conlleve un crecimiento satisfactorio de los microorganismos, entre aproximadamente 23ºC y 32ºC y preferentemente alrededor de 28ºC. Normalmente, la producción óptima de los compuestos se obtiene en aproximadamente 2 a 6 días de fermentación y preferentemente en alrededor de 4 a 5 días de fermentación. El caldo de fermentación permanece de débilmente a moderadamente ácido durante la fermentación, y ventajosamente la fermentación finaliza a un pH de 4-4,5. El pH final depende, en parte, de los tampones presentes, si los hay, y en parte, del pH inicial del medio de cultivo. Se ajusta ventajosamente a un pH aproximadamente de 6,5-7,5, y preferentemente 7,2, antes de la esterilización.
La producción se obtiene en matraces oscilantes pero también en medios sólidos y fermentadores bajo agitación. Cuando se lleva a cabo el cultivo en matraces oscilantes o grandes recipientes y tanques, es preferible utilizar la forma vegetativa en lugar de la forma en esporas del microorganismo para la inoculación, con el fin de evitar un retraso pronunciado en la producción de los compuestos y la utilización ineficaz asociada del equipo. En consecuencia, es conveniente producir un inóculo vegetativo en un medio nutriente acuoso mediante la inoculación de este medio con una parte alícuota procedente del suelo o de un cultivo sesgado. Cuando se ha asegurado así un inóculo joven activo, se traslada asépticamente a otros matraces oscilantes u otros dispositivos adecuados para la fermentación de microorganismos. El medio en el que se produce el inóculo vegetativo puede ser el mismo o diferente del que se utiliza para la producción de compuestos, siempre que se obtenga un cultivo adecuado del microorganismo.
En general, se utiliza la siembra de Streptomyces sp. JS360 y la fermentación así como la producción de compuestos en una fermentación aeróbica sumergida en recipientes bajo agitación. La producción es independiente de los recipientes empleados, fermentadores y procedimientos de arranque. Los compuestos se pueden obtener también mediante cultivo en matraces oscilantes. Para fermentaciones de grandes volúmenes, es preferible utilizar un inóculo vegetativo. El inóculo vegetativo se prepara mediante la inoculación de un pequeño volumen de medio de cultivo en forma de esporas, fragmentos miceliales o como un gránulo liofilizado del organismo. El inóculo vegetativo se traslada entonces a un recipiente de fermentación donde, después de un tiempo de incubación adecuado, los compuestos se obtienen con una producción óptima.
Como es habitual en el proceso de cultivo aeróbico sumergido, se dispersa aire estéril por todo el medio de cultivo. Para un desarrollo eficaz del organismo, el volumen de aire utilizado se encuentra en el rango de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 volumen de aire por volumen de medio de cultivo por minuto (vvm). Una velocidad óptima en un recipiente de 10 l es de aproximadamente 0,3 vvm con agitación proporcionada por impulsores convencionales que giran a aproximadamente 240 r.p.m. Es necesaria la adición de una pequeña cantidad (esto es 1 ml/l) de un agente antiespumante tal como silicona a los medios de fermentación cuando la formación de espuma empieza a ser un problema. Se proporcionan las condiciones y medios de fermentación preferentes en los Procedimientos Experimentales Generales.
Los compuestos están presentes en la biomasa de los Streptomyces sp. JS360 fermentados, así como en el filtrado de cultivo del caldo de fermentación. El caldo de cultivo se puede separar mediante filtración en una prensa fil-
tradora.
Se pueden emplear varios procedimientos para aislar y purificar los compuestos procedentes del caldo de fermentación, por ejemplo mediante procedimientos de cromatografía de adsorción seguida de elución con un disolvente adecuado, cromatografía en columna, cromatografía de partición, así como cristalización de disolventes y combinaciones de los mismos.
En el proceso de recuperación preferente, los compuestos se extraen de la cerveza total, de los micelios o de extractos del sobrenadante. Este último se puede preparar mediante la utilización de resinas adsorbentes como XAD, HP20 o Bayer Lewapol. Se emplean técnicas de cromatografía en columna, preferentemente sobre geles de sílice o geles de sílice modificados, para realizar la purificación inicial. La purificación final de los compuestos se lleva a cabo preferentemente mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento preparativa.
La hidrogenación en el proceso [B] se puede llevar a cabo en presencia de un catalizador tal como paladio/carbón vegetal e hidrógeno, en un disolvente apropiado, en un rango de temperaturas de 0ºC a +100ºC, a presión normal o a presión elevada hasta 3 bar.
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Disolventes adecuados son, por ejemplo, éteres tales como dietil éter, metil t-butil éter, dioxano o tetrahidrofurano, alcoholes como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol o t-butanol, siendo preferente metanol, etanol, isopropanol o tetrahidrofurano.
La hidratación en el proceso [C] se puede llevar a cabo por hidroboración con tratamiento oxidativo utilizando por ejemplo diborano (B_{2}H_{6}) en tetrahidrofurano seguido de peróxido de hidrógeno. Alternativamente, se puede generar y abrir un epóxido mediante un método de reducción. Todos los procesos se pueden llevar a cabo en un disolvente adecuado en un rango de temperaturas de -78ºC a +25ºC, a presión normal o a presión elevada hasta 3 bar.
Disolventes adecuados son, por ejemplo, tetrahidrofurano, dietil éter, tert-butil metil éter y disolventes asociados.
La oxidación en el proceso [D] se puede llevar a cabo por métodos de deshidroxilación quiral o aquiral utilizando permanganato de potasio (KMnO_{4}) o tetróxido de osmio (OsO_{4}). En el caso de tetróxido de osmio, pueden resultar suficientes cantidades catalíticas cuando se utilizan N-óxidos de tert-amina, por ejemplo, N-metilmorfolina-N-óxido u otros oxidantes como ferricianuro de potasio (K_{3}FeCN_{6}). Todos los procesos se pueden llevar a cabo en un disolvente adecuado, en un rango de temperaturas de 0ºC a +100ºC, a presión normal o a presión elevada hasta 3 bar.
Disolventes apropiados son alcoholes como etanol o t-butanol, con cantidades adecuadas de agua añadida.
La reacción con tioles en el proceso [F] se puede llevar a cabo en presencia de una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina, en un disolvente apropiado, en un rango de temperaturas de 0ºC a 50ºC, a presión normal.
Disolventes adecuados son por ejemplo, tetrahidrofurano, diclorometano, dimetilformamida y disolventes asociados.
Los compuestos de acuerdo con la invención muestran un espectro de actividades imprevisible, farmacológico y farmacocinético. Por tanto, son apropiados para su uso como medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos en humanos y animales.
Los compuestos de acuerdo con la invención, debido a sus propiedades farmacológicas, son útiles solos o en combinación con otros componentes activos para proporcionar un tratamiento eficaz en procesos inflamatorios agudos y crónicos tales como síndrome de shock tóxico, shock endotóxico, tuberculosis, alergia, ateroesclerosis, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, gota, artritis traumática, artritis por rubeola y sinovitis aguda, artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis, artritis gotosa y otras condiciones artríticas, sepsis, shock séptico, sepsis gram-negativa, malaria cerebral, meningitis, derrame cerebral isquémico y hemorrágico, neurotrauma/lesión en la cabeza abierta o cerrada, silicosis, sarcososis pulmonar, enfermedad de resorción ósea, osteoporosis, restenosis, lesión cardiaca, cerebral y renal por reperfusión, trombosis, glomerulonefritis, insuficiencia renal crónica, diabetes, retinopatía diabética, degeneración macular, reacción de injerto con huésped, rechazo de aloinjertos, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad neurodegenerativa, degeneración muscular, enfermedad angiogénica, eczema, dermatitis de contacto, psoriasis, quemaduras solares, conjuntivitis, síndrome de distrés respiratorio en adulto (ARDS), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación de las vías aéreas, asma, fiebre, enfermedades periodontales, piresis, enfermedades de Alzheimer y de Parkinson y dolor, especialmente EPOC y asma.
Los compuestos de la presente invención son útiles también para el tratamiento del cáncer, tal como cáncer de ovario o cáncer de colon, crecimiento tumoral y metástasis, trastornos autoinmunes, enfermedades cardiovasculares como miocarditis, restenosis después de angioplastia, enfermedades renales como lupus, enfermedad poliquística renal, infecciones fungales, infección por virus, tal como VIH, infección bacteriana, enfermedades dermatológicas como psoriasis, cicatrización anormal de heridas, queloides, enfermedades inmunológicas como autoinmunidad, hipersensibilidad aguda y retardada, enfermedad injerto contra huésped, rechazo de transplantes y enfermedades neuroinmunológicas como esclerosis múltiple y encefalomielitis aguda diseminada.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición que contiene al menos un compuesto de fórmula general (I) y un diluyente farmacológicamente aceptable, así como a la utilización de dicha composición para el tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos o cáncer y al proceso de preparación de estas composiciones, caracterizada porque los compuestos de fórmula general (I) junto con los productos auxiliares habituales se llevan a una forma de aplicación apropiada. Por tanto, los compuestos de fórmula general (I) sirven para la preparación de medicamentos, especialmente medicamentos para el tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos, especialmente EPOC o cáncer.
Para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente, los compuestos de acuerdo con la invención pueden mostrar actividad no sistémica o sistémica, siendo preferente esta última. Para obtener actividad sistémica, los compuestos activos se pueden administrar, entre otras vías, por vía oral o parenteral, entre ellas es preferente la administración oral. Para obtener actividad no sistémica, los compuestos activos se pueden administrar, entre otras vías, por vía tópica.
Para la administración parenteral, las formas de administración a membranas mucosas (es decir, bucal, lingual, sublingual, rectal, nasal, pulmonar, conjuntival o intravaginal) o dentro del cuerpo son particularmente apropiadas. La administración se puede llevar a cabo evitando la absorción (es decir, administración intracardíaca, intraarterial, intravenosa, intraespinal o intralumbar) o incluyendo la absorción (es decir, administración intracutánea, subcutánea, percutánea, intramuscular o intraperitoneal).
Con el propósito mencionado anteriormente, los compuestos activos se pueden administrar por sí o en formas de administración.
Las formas de administración apropiadas para administración oral son, entre otras, tabletas con recubrimiento normal y entérico, cápsulas, tabletas recubiertas, píldoras, gránulos, bolitas, polvos, aerosoles sólidos y líquidos, jarabes, emulsiones, suspensiones y soluciones. Las formas de administración adecuadas para administración parenteral son soluciones para inyección e infusión.
El compuesto activo puede estar presente en las formas de administración en concentraciones del 0,001 al 100% en peso, la concentración del compuesto activo debe ser preferentemente del 0,5 al 90% en peso, es decir, cantidades que sean suficientes para permitir el rango específico de dosificación.
Los compuestos activos se pueden convertir de manera conocida en las formas de administración mencionadas anteriormente por medio de productos auxiliares inertes, no tóxicos, farmacéuticamente adecuados, por ejemplo excipientes, disolventes, vehículos, emulsionantes y/o dispersantes.
Se pueden mencionar por ejemplo los siguientes productos auxiliares: agua, excipientes sólidos tales como minerales naturales procedentes del suelo o sintéticos (por ejemplo, talco o silicatos), azúcar (por ejemplo, lactosa), disolventes orgánicos no tóxicos tales como parafinas, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de sésamo), alcoholes (por ejemplo, etanol, glicerol), glicoles (por ejemplo, polietilenglicol), agentes emulsionantes, dispersantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona) y lubricantes (por ejemplo, sulfato de magnesio).
En caso de administración oral, las tabletas pueden contener también por supuesto aditivos tales como citrato de sodio así como aditivos como almidón, gelatina y similares. Se pueden añadir también potenciadores del sabor o colorantes a las preparaciones acuosas para administración oral.
Para obtener resultados efectivos en el caso de la administración parenteral, se ha demostrado que generalmente era ventajoso administrar cantidades de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, preferentemente alrededor de 0,01 a 1 mg/kg de peso corporal. En caso de administración oral, la cantidad es aproximadamente de 0,01 a 100 mg/kg, preferentemente alrededor de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal.
A pesar de ello, puede resultar necesario en ciertas circunstancias desviarse de las cantidades mencionadas, a saber en función del peso corporal, vía de aplicación, comportamiento individual hacia el componente activo, forma de preparación y momento o intervalo en el que tiene lugar la administración. Por ejemplo, puede resultar suficiente en algunos casos utilizar menos cantidad que la cantidad mínima mencionada anteriormente, mientras que en otros casos se tendrá que sobrepasar el límite superior mencionado. En caso de aplicar cantidades superiores, puede ser recomendable dividirlas en una pluralidad de dosis individuales repartidas durante el día.
Los porcentajes en las pruebas y ejemplos que siguen son, salvo que se estipule de otro modo, en peso; las partes son en peso. Las proporciones de disolvente, proporciones de dilución y concentraciones indicadas para soluciones líquido-líquido se basan todas en el volumen.
A. Ejemplos
Se utilizan en las descripciones las siguientes abreviaturas:
ACN
acetonitrilo
aq.
acuoso
Bn
bencilo
BOP
benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfoniohexafluorofosfato
DCI
ionización química directa
DCM
diclorometano
DMF
N,N-dimetilformamida
DMSO
dimetilsulfóxido
EDTA
ácido etilendiamintetraacético
ESI
ionización por electropulverización
FCS
Suero de ternera fetal
h
hora/horas
HPLC alta
Cromatografía líquida de alta presión
LC/MS
Cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas
min.
minuto(s)
pf
punto de fusión
MS
Espectroscopía de masas
NMR
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear
PBS
Solución salina tamponada con fosfato
RP
Fase reversa (HPLC)
R_{t}
Tiempo de retención (HPLC)
rt
Temperatura ambiente
SDS
Dodecil sulfato de sodio
TFA
Ácido trifluoroacético
THF
Tetrahidrofurano
UV
Ultravioleta
UV/Vis
Ultravioleta-visible
% de th.
% de rendimiento teórico
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Procedimientos Experimentales Generales
Los productos químicos se obtienen en su grado analítico de Merck (Darmstadt, Alemania) o Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania). Los espectros de NMR se registran en DMSO-d_{6} mediante la utilización de un espectrómetro Bruker DRX 500 (que funciona a una frecuencia del protón de 500,13 MHz).
Los análisis HPLC-MS se realizan por medio de un cromatógrafo líquido Agilent HP1100 con un espectrómetro de masas LCT (Micromass, Manchester, R.U.) en el modo de ionización positiva y negativa por electropulverización (ESI), basándose en la ligera modificación de un método descrito anteriormente (M. Stadler y col., Phytochemistry 2001, 56, 787-793). Se utiliza como fase estacionaria una columna simétrica de Waters. Fase móvil A: un 0,1% de ácido fórmico en agua; Fase móvil B: un 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo; Gradiente: de 0-1 min hasta 100% A, de 1-6 min hasta 90% B, de 6-8 min hasta 100% B, de 8-10 min hasta 100% B. Se registran los espectros de LC-MS en el rango de pesos moleculares situados entre 150 y 1,600.
Los análisis HPLC-UV/Vis se llevan a cabo por analogía con M. Stadler y col., Mycol. Res., 2001, 105, 1190-1205 en una sistema de HPLC analítica de la serie HP 1100 (Agilent, Waldbronn, Alemana) que comprende un sistema de bombeo binario G 1312A, un detector de ordenación de diodos G 1315A, un compartimento de columna G 1316A, un desgasificador G 1322A y un autoinyector G 1313A. Como fase móvil, se elige un 0,01% de ácido fosfórico:acetonitrilo, mientras que una columna de Merck (Darmstadt, Alemania) Lichrospher RP 18 (125 x 4 mm, tamaño de partícula de 7 \mum) sirve de fase estacionaria. Se analizan partes alícuotas de las muestras (que representan de 2 a 10 \mug de materiales solubles en metanol, de acuerdo con las concentraciones de los principales metabolitos) a 40ºC con un caudal de 1 ml/min, en el siguiente gradiente: lineal desde el 0% de acetonitrilo hasta el 100% de acetonitrilo en 10 min, a continuación condiciones isocráticas al 100% de acetonitrilo durante 5 min; que se siguen de la regeneración de la columna durante 5 min. Los cromatogramas de HPLC-UV se registran a 210 nm con una longitud de onda de referencia de 550 nm y un ancho de banda de 80 nm. Se emplea la detección de ordenación de diodos (DAD) para registrar los espectros de HPLC-UV/Vis en el rango de 210-600 nm. El software HP ChemStation cuenta con una búsqueda automatizada para compuestos estándar calibrados en extractos crudos.
La HPLC preparativa se realiza a temperatura ambiente en un sistema HPLC preparativo (Gilson Abimed, Ratingen, Alemania), que comprende el software Gilson Unipoint, sistema de bombeo binario 306, colector de fracciones 205, detector de 119 UV-Vis, módulo manométrico 806, y mezclador dinámico 811C, utilizando distintos gradientes y fases estacionarias tal como se describe más abajo.
Los espectros NMR se registran en un Bruker DMX500, que funciona a una frecuencia del protón de 500,13 MHz. Todos los espectros se miden en una solución de DMSO-d_{6} a 302 K. El pico de disolvente se utiliza como referencia interna para ambos desplazamientos químicos de protones y carbonos (\delta_{H}: 2,50, \delta_{C}: 39,5).
Caracterización y conservación de la cepa Streptomyces sp. JS360 Medios de cultivo
Medio de cultivo de Levadura-Malta-Glucosa (YMG): D-Glucosa: 0,4%; extracto de malta: 1%; extracto de levadura: 0,4%; pH: 7,2.
Medio de cultivo Q6: D-glucosa: 0,4%; glicerol: 2%; torta de semilla de algodón: 1%; agua de grifo; pH: 7,2.
Medio de cultivo C: D-glucosa: 1%; extracto de levadura: 1%; NZ amina (Sheffield Chemicals, Sheffield, R.U., Lote ONA 20 2): 0,5%; almidón soluble: 2%; sin ajuste de pH.
Medio de cultivo GS: D-glucosa: 2%; torta de soja desgrasada (Soyamin 50 T, Degussa, Düsseldorf, Alemania): 2%; almidón soluble: 2%; carbonato de calcio: 0,5%; cloruro de sodio: 0,25%; sulfato de magnesio: 0,05%, dihidrogenofosfato de potasio: 0,025%; ajuste del pH a 6,5-6,8.
Medio de cultivo MC: D-glucosa: 1%; extracto de levadura: 0,5%, torta de soja desgrasada (Soyamin 50 T, Degussa, Düsseldorf, Alemania): 1%; almidón soluble: 1%; cloruro de sodio: 0,5%; carbonato de calcio: 0,3%; ajuste del pH a 7,2 (0,1N disolución de hidróxido de sodio).
Medio de cultivo MCPM: Diamant Malitzin hell (Meistermarken GmbH, Bremen, Alemania): 4,5%, NZ amina (Sheffield Chemicals, Sheffield, R.U., Lote ONA 202): 1%; cloruro de sodio: 0,3%; dihidrogenofosfato de sodio: 0,1%; sulfato de magnesio: 0,05%; sulfato ferroso: 0,01%; pH: 6,8.
Medio de cultivo MS: Manitol: 2%; torta de soja desgrasada (Soyamin 50 T, Degussa, Düsseldorf, Alemania): 2%; carbonato de calcio: 0,3%; pH ajustado a 7,5.
Medio de cultivo SP: Manitol: 3%; extracto de levadura: 0,75%; almidón soluble: 0,2%; peptona de soja (Merck, Darmstadt, Alemania (# 107212.0500)): 0,5%; ajuste de pH a 6,0 (ácido clorhídrico).
La cepa JS360 se obtiene a partir de una muestra de suelo recogida en Japón. Se mantiene en la colección de cultivos de Bayer AG (Wuppertal, Alemania) en un 10% de glicerol bajo nitrógeno líquido. También ha sido depositada en DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania), a 27 de noviembre de 2002 bajo el número de designación DSM 15324.
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Identificación de la cepa
Las características morfológicas, culturales y fisiológicas de la cepa JS360 indican que la cepa constituye un especie no descrita del género Streptomyces. 
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Morfología
En el medio YMG, colonias únicas de la cepa JS360 alcanzan un diámetro de 25 mm después de la incubación durante 12 días a 28ºC. Las colonias desarrollan un micelio blanco, algodonoso, aéreo, mientras que el micelio del sustrato es de color cremoso. El reverso del cultivo es marrón rojizo, y se libera en el medio un pigmento rojizo.
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Secuenciación del 16S rADN (SEQ ID NO: 1)
Se llevan a cabo comparaciones de las secuencias de 16S rADN (SEQ ID NO: 1) para caracterizar además la cepa JS360 en su posición taxonómica. Por tanto, la extracción y secuenciación del ADN de la parte principal del gen 16S rARN se amplifican de forma analógica a Mincer TJ, Jensen PR, Kaufmann CA, Fenical W. 2002. Appl. Environ. Microbiology 60 (10) 5005-5011, PCR que utiliza los cebadores 41f y 1486r-P (no publicado), aplicando un perfil térmico estándar con una temperatura de alineamiento de 50ºC. Los productos de amplificación se purifican mediante perlas paramagnéticas de unión de ADN (Mag Prep PCR Clean Up Kit, Tecan Schweiz AG; Hombrechtikon, Suiza) utilizando el protocolo suministrado por el fabricante.
Se obtienen secuencias de nucleótidos mediante secuenciación por ciclos utilizando el Kit de Secuenciación por Ciclos mediante Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator (Amersham Biosciences), cebador 41f, y el Analizador Genético LI-COR 4200 (LI-COR Inc. Lincoln, Nebraska, USA). Una búsqueda de secuencias similares a las determinadas y los alineamientos asociados a las mejores coincidencias se obtienen por FASTA tal como es proporcionado como servicio en línea por el European Bioinformatics Institute (EBI) (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/). Las secuencias que muestran las mejores coincidencias se obtienen a partir de la base de datos que se debe utilizar como entrada para el módulo MegAlign del software LASERGENE (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, USA). Se toman en consideración también las secuencias de Salinospora sp. publicadas por Mincer y col., Appl. Environm. Microbiol., 2002, 68, 5005-5011.
Para la comparación se utilizan las siguientes secuencias de nucleótidos:
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Se obtienen aproximadamente 240 bases de secuencia a partir de la cepa JS360 (Fig. 5). La secuencia se utiliza como entrada FASTA para buscar secuencias similares en la base de datos EMBL. Se descubre que la secuencia está estrechamente relacionada con las secuencias de rARN 16S de elementos de Streptomyces. Entre las tres mejores coincidencias se encuentran dos aislados sin nombre de Streptomyces procedentes del suelo y de un gusano, respectivamente, y un aislado de Streptomyces cinnabarinus. La similitud entre estas tres secuencias y la secuencia obtenida de JS360 se sitúa en el rango del 91%. No se encuentra ninguna secuencia idéntica en la base de datos. Se lleva a cabo un alineamiento (método clustal) incluyendo la secuencia de JS360 y tres de las secuencias más similares, así como seis secuencias de la especie Salinospora. A partir del alineamiento se elabora un dendograma para demostrar la relación filogenética. Se encuentra una clara distinción entre Salinospora sp. y el grupo que incluye JS360 (Fig. 6). Los resultados revelan que JS360 es claramente distinto de Salinospora spp. La cepa pertenece al género Streptomyces según se concluye del alineamiento de su secuencia parcial de rADN 16S.
Fermentación y extracción de la cepa JS360 1. Cultivo de siembra
Se utilizan dos ml de un cultivo con glicerol al 10% para inocular 11 frascos Erlenmeyer que contienen 150 ml de medio YMG estéril y se propagan en un agitador rotativo a 28ºC y 240 r.p.m. durante 72-96 horas.
2. Fermentación de la cepa JS360 a escala de frasco
Después de la inoculación a partir del cultivo de siembra YMG bien desarrollado (2 ml de inóculo por frasco), la cepa JS360 se propaga en diez frascos 11 Erlenmeyer que contienen 150 ml de medio Q6 (véase más arriba) y se propaga en una agitador rotativo a 28ºC y 240 r.p.m. durante 118 horas. Durante la fermentación se toman muestras diariamente. Se determina el pH y se evalúa la glucosa libre mediante Bayer Diastix Harnzuckerstreifren. El micelio húmedo se separa del fluido por centrifugación (10 min a 3.000xg) y se extrae con 2 l de acetona. La acetona se evapora al vacío (40ºC). El residuo acuoso restante se diluye con agua hasta 500 ml y se extrae tres veces con cantidades iguales de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan al vacío (40ºC) para producir 830 mg de extracto crudo, que se somete a continuación a HPLC preparativa tal como se describe más abajo (aislamiento).
El fluido de cultivo se aplica sobre una columna de adsorción que contiene 500 ml de resina Bayer Lewapol CA 9225 y se enjuaga con 1 l de agua. La columna se eluye con 1,5 l de acetona:metanol 4:1. El disolvente se evapora al vacío (40ºC). El residuo acuoso restante se diluye con agua hasta 500 ml y se extrae tres veces con cantidades iguales de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan al vacío (40ºC) para producir 650 mg de extracto crudo, que se somete después a HPLC preparativa tal como se describe a continuación (aislamiento).
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3. Fermentación de la cepa JS360 a escala de 30 l (fermentador bajo agitación)
Un fermentador Biostat P de 40 l (Braun Bioengineering, Melsungen, Alemania) que contiene 30 l del medio Q6 se esteriliza in situ (1 h a 121ºC y 1,1 bar) y se inocula con dos cultivos de siembra YMG bien desarrollados de 150 ml que han sido propagados durante 76 horas. El cultivo de producción se desarrolla bajo agitación (240 r.p.m.) y aireación (0,3 vvm). Se determina el pH y se evalúa la glucosa libre utilizando Diastix Harnzuckerstreifen. Además, el fermentador está provisto de un electrodo de oxígeno Braun para determinar la saturación de oxígeno del caldo de cultivo. La HPLC analítica de los extractos crudos preparados a partir de muestras de 50 ml tomadas en condiciones estériles y extraídas con cantidades iguales de acetato de etilo sirven de medio de detección para el Ejemplo 1. Los Ejemplos 2 a 5 y 7 son detectados también durante la fermentación por HPLC-MS, pero no se pueden evaluar en los extractos crudos nativos debido a las cantidades limitadas y a la coelución de otros metabolitos con tiempos de retención similares en el sistema de HPLC empleado. Los extractos de acetato de etilo se secan sobre sulfato de sodio, se evaporan a sequedad, se vuelven a disolver en metanol y se analizan utilizando los sistemas de HPLC-UV descritos en los Procedimientos Experimentales Generales. Se describe en la Fig. 1 el lapso de tiempo típico de la fermentación de JS360 en 30 l de medio Q6. Aunque el cultivo está totalmente saturado según se deduce de los valores de saturación de oxígeno, el pH cae a valores de aprox. 4,5. Después de que la glucosa libre en el medio se haya consumido, la producción del Ejemplo 1, según es estimada por la metodología de HPLC analítica, empieza aproximadamente a las 60 horas de la fermentación y alcanza un punto óptimo después de 114 horas. Entonces se cosecha el cultivo, debido a que se observa degradación en etapas posteriores del Ejemplo 1. Después de la cosecha del cultivo, el fluido se separa del micelio por centrifugación (10 min a 3.000xg) y se aplica sobre una columna llena de resina de adsorción Bayer Lewapol CA 9225 y se enjuaga con 5 l de agua. A continuación, se eluye la columna con 6 l de acetona:metanol 4:1. Los eluatos se evaporan al vacío (40ºC) para producir un residuo acuoso, que se diluye hasta 1 l con agua y se extrae tres veces con 1 l de acetato de etilo. Se combinan las fases orgánicas, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan al vacío (40ºC). El extracto resultante (22,7 g) se somete a continuación a HPLC preparativa tal como se describe más abajo (aislamiento).
El micelio se extrae tres veces con 5 l de acetona cada vez y la acetona se evapora al vacío (40ºC) para producir un residuo acuoso, que se diluye hasta 1 l con agua y se extrae tres veces con 1 l de acetato de etilo. Se combinan las fases orgánicas, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan al vacío (40ºC). El extracto resultante (13,4 g) se somete a continuación a HPLC preparativa tal como se describe más abajo (aislamiento).
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4. Fermentación en otros medios de cultivo (a escala de frasco)
La cepa JS360 se propaga en varios otros medios de cultivo en intentos de optimizar la producción del Ejemplo 1 y de metabolitos químicamente asociados. Con este propósito, se llevan a cabo fermentaciones en matraces oscilantes de forma similar a la que se describe para la fermentación en el medio Q6 (véase 2 más arriba). Frascos de Erlenmeyer de 1 l que contienen 150 ml de los medios se propagan entonces en un agitador rotativo a 28ºC y 240 r.p.m. durante 118 horas. Durante la fermentación, se toman muestras diariamente. Se determina el pH y se evalúa la glucosa libre utilizando Bayer Diastix Harnzuckerstreifen. Partes alícuotas del caldo de cultivo (50 ml) se extraen con acetato de etilo. Estos extractos de acetato de etilo se secan sobre sulfato de sodio, se evaporan a sequedad, se vuelven a disolver en metanol y se analizan por medio de los sistemas HPLC-UV y HPLC-MS descritos en los Procedimientos Experimentales Generales. Al comparar los tiempos de retención y los espectros, se detectan el Ejemplo 1 y compuestos asociados en los siguientes medios de cultivo: medio YM, medio C, medio GS, medio MC, medio MCPM, medio MS, y medio SP después de 72-96 horas de fermentación. Sin embargo, se observan las más altas producciones del Ejemplo 1 en los medios Q6 y GS.
Ejemplo 1 (1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-diona 
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25 
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Preparación: véase más abajo.
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Ejemplo 2 (1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-[1-hidroxihexil]-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-diona 
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26 
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Preparación: véase más abajo.
Ejemplo 3 (1R,4R,5S)-1-[(1R)-2-ciclohexen-1-ilmetil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.0]-heptan-3,7-diona 
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27 
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Preparación: véase más abajo.
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Ejemplo 4 (3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-3-hidroxi-4-[1-hidroxihexil]-3-metil-5-oxo-D-prolina 
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28 
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Preparación: véase más abajo.
Ejemplo 5 N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteína 
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29 
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Preparación: véase más abajo.
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Ejemplo 6 N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteinato de metilo 
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30 
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Preparación: véase más abajo.
Ejemplo 7 (3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-3-hidroxi-4-hexil-3-metil-5-oxo-D-prolina
31
Preparación: véase más abajo.
La estereoquímica de los Ejemplos 2 a 7 se extrae por analogía con la estructura del Ejemplo 1 que se determina por medio de análisis de rayos X.
Aislamiento de los Ejemplos 1 a 7 1. Materiales procedentes de fermentaciones en matraces oscilantes
Los extractos crudos (620 mg procedentes del micelio y 830 mg procedentes del fluido de cultivo, respectivamente) se disolvieron en 5 ml de metanol, se filtraron a través de un cartucho de extracción en fase sólida de 500 mg de Bond Elut C18 (Baker, Deventer, Holanda) y se aplicaron sobre una columna Kromasil RP 18 de MZ Analysentechnik (Mainz, Alemania) (tamaño de partícula, 7 \mum; 250 x 40 mm). Como fase móvil se emplea un gradiente del 0,01% de TFA:acetonitrilo a un caudal de 10 ml/min:20% de acetonitrilo a t = 0 min; gradiente lineal: del 20% al 50% de acetonitrilo en 40 min; a continuación el gradiente lineal del 50% al 100% de acetonitrilo en 20 min; después en condiciones isocráticas a un 75% de acetonitrilo durante 30 min, luego regeneración de la columna. Se combinan las fracciones de acuerdo con la adsorción UV a 210 nm. El Ejemplo 1 se eluye a un tiempo de retención (R_{t}) de 80-83 min, y se obtienen cantidades de 14 mg del extracto de micelio y 1,5 mg del extracto de fluido de cultivo, respectivamente. Los Ejemplos 2 a 5 y 7 se localizan en fracciones intermedias menores y no se aíslan de este extracto hasta la pureza, mientras que el Ejemplo 6 no se detecta en absoluto.
2. Materiales procedentes de la fermentación a escala de 30 l
Partes alícuotas de 2,5-3 gramos de extractos crudos que se preparan tal como se describe anteriormente (13,4 g procedentes del micelio, 22,7 g procedentes del fluido de cultivo) se disuelven en 5 ml de metanol, se filtran a través de un cartucho de extracción en fase sólida de 500 mg de Bond Elut C18 (Baker, Deventer, Holanda) y se aplican sobre una columna Kromasil RP 18 de MZ Analysentechnik (Mainz, Alemania) (tamaño de partícula, 7 \mum; 250 x 40 mm; fase móvil: 0,01% de TFA:acetonitrilo). Como fase móvil, se emplea un gradiente del 0,01% de TFA:acetonitrilo a un caudal de 10 ml/min:20% de acetonitrilo a t = 0 min; gradiente lineal: del 20% al 50% de acetonitrilo en 40 min; a continuación el gradiente lineal del 50% al 100% de acetonitrilo en 20 min; después en condiciones isocráticas a un 75% de acetonitrilo durante 30 min, luego regeneración de la columna. Se combinan las fracciones de acuerdo con la adsorción UV a 210 nm. Se obtienen así cinco productos intermedios bioactivos. Se observan sus tiempos de retención (R_{t}) en este sistema de gradientes como sigue: 61-64 min para el producto intermedio 1 (que contiene los Ejemplos 4 y 7), 65-71 min para el producto intermedio 2 (que contiene los Ejemplos 5 y 6), 72-79 min para el producto intermedio 3 (que contiene el Ejemplo 2), 79-85 min para el producto intermedio 4 (que contiene el Ejemplo 1) y 86-93 min para el producto intermedio 5 (que contiene el Ejemplo 3).
La purificación final de los componentes activos de los productos intermedios 1 a 5 se obtiene mediante HPLC preparativa de fase inversa, utilizando un caudal de 7 ml/min, y una columna Inertsil C18 de MZ Analysentechnik (7 \mum; 250 x 30mm) como fase estacionaria y el siguiente gradiente. Condiciones isocráticas de t = 0 min => 30 min; a continuación el gradiente lineal del 30% de acetonitrilo => 100% de acetonitrilo en 50 min, después condiciones isocráticas (100% de acetonitrilo) durante 20 min, luego regeneración de la columna. En la Tabla 1 se resumen las producciones y los R_{t} de los Ejemplos 1 a 6. Se ilustra en la Fig. 2 un esquema general para el aislamiento.
TABLA 1
32 
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Caracterización de los Ejemplos 1 a 7
Los Ejemplos 1 a 6 se detectan mediante HPLC-UV y HPLC-MS por medio de los métodos descritos en los Procedimientos Experimentales Generales. Sus características en los sistemas analíticos por HPLC se resumen en la Tabla 2. La detección del Ejemplo 1 en los gradientes empleados se ilustra en la Fig. 3. Mientras los Ejemplos 1, 2, 4 y 7 producen resultados concluyentes con respecto a sus picos moleculares, la LC-MS del Ejemplo 3 sólo revela el pico molecular en el modo ESI positivo, mientras que, debido a la pérdida de dióxido de carbono en el modo ESI negativo, se observa un fragmento más pequeño de alta masa. En los Ejemplos 5 y 6 se forman fácilmente dímeros en las condiciones de empleo de HPLC-MS, y la mayor señal de LC-MS se refiere por tanto a estos dímeros, mientras que los picos moleculares sólo constituyen señales menores. Estas características sirven también para identificar los ejemplos mediante HPLC analítica en caldos de fermentación y fracciones intermedias obtenidas durante la extracción, mediante procesamiento aguas abajo y cromatografía.
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TABLA 2
33 
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Las estructuras de los Ejemplos 1 a 7 se determinan mediante espectrometría LC-MS de baja resolución y alta resolución y mediante espectroscopía NMR (resonancia magnética nuclear) en una y dos dimensiones. Para los parámetros instrumentales, véase los Procedimientos Experimentales Generales.
Los datos de la NMR revelan la presencia de un doble enlace cis dentro de un anillo ciclohexilo. El análisis detallado de los datos de HSQC, HMBC y COSY/TOCSY permite establecer la estructura de anillo bicíclico que, junto con la porción ciclohexenilcarbinol, es idéntica a la que se encuentra en Salinosporamida A. Los datos de HSQC señalan la presencia de al menos dos grupos metilo en cada molécula. Junto con TOCSY y HMBC, se identifica una porción hexilo no ramificada. Un pico cruzado inequívoco en el espectro COSY localiza esta cadena en la posición 2 del sistema de anillo heterocíclico. El Ejemplo 7 (en comparación con el Ejemplo 1) y el Ejemplo 4 (en comparación con el Ejemplo 2) revelan mediante los datos de NMR y MS que constituyen las seco-formas respectivas de las moléculas beta-lactona correspondientes. La presencia de un grupo hidroxilo adicional (en comparación con Salinosporamida A) en la posición 12 (Ejemplos 2 y 4) se evidencia debido a la multiplicidad y a los desplazamientos químicos característicos de carbonos y protones.
Los espectros NMR de los Ejemplos 5 y 6 muestran un nuevo subconjunto completo de señales que pertenecen a una porción de cisteína N-acilada. La N-acetilcisteína está enlazada a la estructura de anillo heterocíclico a través del grupo carbonilo del anillo beta-lactona anterior, o el grupo carboxilo del Ejemplo 7, respectivamente. El enlace tioéster se identifica mediante su desplazamiento químico de carbonilo (>200 ppm) y la conectividad derivada de HMBC a los hidrógenos-beta de cisteína. Todas las conectividades dentro del residuo de cisteína se estabilizan mediante la asignación de las señales correspondientes en los espectros de HMBC y COSY. Por tanto, las estructuras de los Ejemplos 5 y 6 son análogas a las de la lactacistina.
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Datos espectroscópicos Ejemplo 1
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (t), 1,28 (m), 1,29 (m), 1,23 (m), 1,40 (m), 1,45 (m), 1,47 (m), 1,54 (m), 1,58 (m), 1,68 (m), 1,74 (s), 1,80 (m), 1,90 (m), 2,29 (m), 2,41 (t), 3,65 (m), 5,47 (m), 5,73 (m), 5,81 (m), 8,92 (s).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,8; 21,7; 21,8; 24,2; 25,2; 26,1; 26,8; 28,5; 30,8; 37,3; 47,5; 69,3; 78,4; 86,4; 127,8; 128,6; 169,1; 174,1.
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Ejemplo 2
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,88 (t), 1,27 (m), 1,29 (m), 1,35 (s) 1,37 (m), 1,49 (m), 1,58 (m), 1,59 (m), 1,71 (m), 1,75 (m), 1,93 (m), 2,35 (d), 2,76 (m), 3,49 (m), 4,00 (d), 4,68 (m), 5,70 (m), 5,91 (m), 6,11 (ancho), 8,52 (s).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,4; 21,0; 21,4; 23,7; 24,2; 29,6; 30,1; 31,5; 36,1; 54,6; 69,4; 75,0; 76,0; 76,5; 127,9; 170,9; 172,3.
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Ejemplo 3
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,88 (t), 1,27 (m), 1,30 (m), 1,31 (m), 1,33 (m), 1,46 (m), 1,48 (m), 1,50 (m), 1,61 (s), 1,62 (m), 1,63 (m), 1,76 (m), 1,92 (m), 2,27 (m), 2,55 (t), 5,45 (m), 5,68 (m), 8,98 (s).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,3; 19,6; 21,4; 24,0; 24,2; 26,5; 28,2; 28,5; 29,9; 30,9; 32,5; 46,7; 74,0; 86,1; 127,7; 130,9; 170,4; 170,8.
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Ejemplo 4
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,82 (m), 1,17 (m), 1,20 (m), 1,24 (m), 1,32 (m), 1,47 (m), 1,60 (m), 1,62 (m), 1,63 (m), 1,84 (m), 2,08 (m), 2,44 (d), 3,68 (m), 3,80 (m), 5,60 (m), 5,76 (m).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,1; 20,1; 20,6; 21,0; 23,5; 23,6; 30,5; 33,5; 37,7; 52,7; 67,1; 73,6; 75,2; 80,1; 126,3; 128,6; 171,2; 176,5.
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Ejemplo 5
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (m), 1,09 (m), 1,24 (m), 1,25 (m), 1,27 (m), 1,33 (m), 1,35 (m), 1,37 (m), 1,44 (m), 1,46 (m), 1,50 (m), 1,61 (m), 1,64 (m), 1,84 (s), 1,87 (m), 2,13 (m), 2,47 (t), 2,96 (m), 3,30 (m) 3,78 (m), 4,36 (m), 5,64 (m), 5,79 (m).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,9; 20,8; 21,7; 22,0; 22,1; 22,2; 23,4; 24,3; 26,8; 27,7; 28,7; 29,2; 31,1; 38,1; 50,3; 51,0; 75,3; 79,7; 80,6; 127,0; 129,3; 169,3; 178,9; 201,2.
Ejemplo 6
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (m), 1,09 (m), 1,24 (m), 1,25 (m), 1,27 (m), 1,33 (m), 1,35 (m), 1,37 (m), 1,44 (m), 1,46 (m), 1,50 (m), 1,61 (m), 1,64 (m), 1,84 (s), 1,87 (m), 2,13 (m), 2,47 (t), 3,00 (m), 3,24 (m), 3,64 (s), 3,78 (m), 4,39 (m), 5,64 (m), 5,79 (m).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,6; 20,8; 21,7; 22,0; 22,1; 23,4; 24,3; 26,8; 27,7; 28,7; 29,3; 31,1; 38,1; 50,3; 51,4; 51,8; 75,3; 79,7; 80,6; 127,0; 129,3; 169,3; 171,0; 178,9; 201,2.
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Ejemplo 7
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (t), 1,25 (m), 1,26 (m), 1,33 (m), 1,34 (m), 1,36 (m), 1,44 (m), 1,46 (s), 1,51 (m), 1,66 (m), 1,67 (m), 1,88 (m), 2,12 (m), 2,45 (t), 3,77 (d), 5,64 (m), 5,82 (m), 7,66 (s).
^{13}C-NMR (DMSO-d_{6}): \delta = 13,8; 20,3; 21,5; 21,7, 23,3; 24,4; 26,5; 27,9; 28,9; 31,0; 38,5; 50,5; 74,6; 75,5; 80,4; 127,4; 129,7; 177,5.
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Interpretación del listado de picos NMR
Ejemplo 1: R^{1} = H, R^{2} = OH; Ejemplo 2: R^{1} = OH, R^{2} = OH, Ejemplo 3: R^{1} = H, R^{2} = H.
34
Ejemplo 4: Ejemplo 5: R^{8} = H, Ejemplo 6: R^{8} = CH_{3}, Ejemplo 7 (no se ha determinado la estereoquímica por NMR).
35
TABLA 3a
36
TABLA 3b
38
TABLA 3c
40
TABLA 4a
41
TABLA 4b
42
TABLA 4c
43 
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Espectrometría de masas de alta resolución
\quad
Ejemplo 1: ESI-; Masa encontrada: 334,1977, calculada: 334,2014 (correspondiente a una desviación de 4,1 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{28}NO_{4}).
\quad
Ejemplo 2: ESI-; Masa encontrada: 350,1968, calculada: 350,1967 (correspondiente a una desviación de 0,1 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{28}NO_{5}).
\quad
Ejemplo 3: ESI+; Masa encontrada: 276,2327, calculada: 276,2327 (correspondiente a una desviación de 6,1 mDa para la fórmula molecular C_{18}H_{30}NO). Aquí, sólo se pudo observar el fragmento (M - CO_{2}) en condiciones de ESI.
\quad
Ejemplo 4: ESI+; Masa encontrada: 368,2107, calculada: 368,2073 (correspondiente a una desviación de 3,3 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{31}NO_{6}).
\quad
Ejemplo 5: ESI-; Masa encontrada: 497,2322, calculada: 497,2321 (correspondiente a una desviación de 0,0 mDa para la fórmula molecular C_{24}H_{38}N_{2}O_{7}S).
\quad
Ejemplo 6: ESI-; Masa encontrada: 511,2594, calculada: 511,2478 (correspondiente a una desviación de 11,6 mDa para la fórmula molecular C_{25}H_{40}N_{2}O_{7}S).
\quad
Ejemplo 7: ESI+; Masa encontrada: 354,2268, calculada: 354,2280 (correspondiente a una desviación de 1,3 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{32}NO_{5}).
\newpage
Análisis por rayos X de estructuras de cristal único del Ejemplo 1 y determinación de la configuración absoluta
Varios cristales del Ejemplo 1 se cristalizan mediante evaporación lenta de unadi solución saturada de propanol/alcohol diacetílico 97:3 a 46ºC. Se recoge un conjunto completo de datos de un cristal adecuado con dimensiones 0,30 x 0,20 x 0,03 mm^{3} a -183,5ºC utilizando radiación Cu_{\kappa \alpha} como fuente de rayos X. Se obtiene una propuesta de estructura en una célula ortorrómbica por medio del grupo en el espacio quiral P2_{1}2_{1}2_{1} (véase la Fig. 7). La célula cristalina tiene ejes extremadamente grandes y contiene 12 moléculas independientes del Ejemplo1 con quiralidad idéntica. Todas las moléculas muestran distintas conformaciones. Las moléculas están empaquetadas en capas polares y no polares (véase la Fig. 8). Las capas polares simples están conectadas de forma bidimensional a lo largo de enlaces de hidrógeno. La configuración absoluta del Ejemplo 1 se determina por tanto como R(C2); S(C4); R(CS); S(C6); S(C7) obteniendo un Parámetro Flack de 0,0 con una desviación estándar de 0,2 (H.-D. Flack, Acta Cryst., 1983, A39, 876-881). Los valores esperados son de 0 (dentro de 3 esd) para una estructura correcta y de +1 para una estructura inversa absoluta.
Recuento de centros quirales en la estructura de rayos X del Ejemplo 1
44
Recogida de datos para el análisis por rayos X: Las mediciones se realizan en un difractómetro Bruker-Nonius provisto de un detector de área Proteum CCD, un ánodo rotativo FR591 con radiación Cu_{\kappa \alpha}, espejos Montel como monocromador y un dispositivo a baja temperatura Kryoflex (T = 90 K). Las mediciones se realizan en el rango de 4,69 a 54,33º. Se recogen 205.845 reflexiones de las cuales 26.995 son únicas (R_{int} = 0,1073). Recogida de datos de esfera completa \omega y barridos \varphi. Programas usados: Recogida de datos Proteum V. 1.37 (Bruker-Nonius 2002), recogida de datos Saint Plus Version 1.6 (Bruker-Nonius 2002) y corrección de absorción SADABS V. 2.03 (2002).
Solución y refinamiento de la estructura: SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick 2000, Universidad de Goettingen, Alemania); 21119 Fo > 4sig(Fo), 2629 parámetros refinados, R_{1} = 0,0796, wR2 = 0,1892, Bondad de ajuste en
F^{2} = 1,083, parámetro de Flack 0,0 (2), densidad electrónica residual máxima 0,464 (-0,314) e \ring{A}^{3}.
Datos sobre los cristales: C_{19}H_{29}N_{1}O_{4} x 12, M_{r} = 335,26 (4023,17); ortorrómbicos; grupo espacial P2_{1}2_{1}2_{1},
a = 13,0624(2) \ring{A}, b = 29,0543(5) \ring{A}, c = 58,4559(11) \ring{A}, V = 22178,2(7) \ring{A}^{3}, Z = 4, \rho_{cal} = 1,205 Mg/m^{3}, \mu = 0,674 mm^{-1}.
Método de preparación de los compuestos
Cromatografía Líquida - Espectroscopia de Masas (LC-MS): Plataforma de Micromasas LC con columna de Shimadzu Phenomenex ODS (4,6 mm \diameter x 30 mm) descargando una mezcla de acetonitro-agua (9:1 a 1:9) a 1 ml/min de caudal. Se obtuvieron espectros de masas por medio de técnicas de ionización por electropulverización (ES).
Determinación de la masa: Finnigan MAT MAT95.
Los puntos de fusión no están corregidos.
Se registraron los espectros de ^{1}H-NMR en un espectrómetro Bruker DRX-300 (300 MHz para ^{1}H) o Brucker 500 UltraShieled^{TM} (500 MHz para 1H). Los desplazamientos químicos se registran en partes por millón (ppm) con tetrametilsilano (TMS) como estándar interno a cero ppm. Las constantes de acoplamiento (J) se dan en hertz y las abreviaturas s, d, t, q, m y br se refiere a singlete, doblete, triplete, cuadruplete, multiplete y ancho, respectivamente.
Se realizó una TLC en una placa de gel de sílice pre-recubierta (Merck silica gel 60 F-254). Se utilizó gel de sílice (WAKO-gel C-200 (75-150 \mum)) para todas las separaciones de cromatografía en columna. Todos los productos químicos fueron de grado reactivo y se compraron a Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Gran Bretaña, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., Nacalai Tesque Inc., Watanabe Chemical Ind. Ltd., Maybridge Pic, Lancaster Synthesis Ltd., Merck KgaA, Alemania, o Kanto Chemical Co., Ltd.
Todos los materiales de partida están comercialmente disponibles o se pueden preparar por medio de métodos citados en la documentación.
Ejemplo 1 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-aza-biciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
45
A una solución de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carboxílico (Ejemplo 7) (130 mg, 0,37 mmol) en diclorometano (10 ml) se añadió trietilamina (0,15 ml, 1,1 mmol) y BOPCI (140 mg, 0,55 mmol) a rt. Después de agitación durante 1 hora, se añadió una disolución saturada de bicarbonato de sodio (20 ml) y después se extrajo la capa orgánica con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de concentración, se purificó el residuo mediante cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto (98 mg, 79%).
Pf: 157ºC
LCMS (método de 4 min): R_{t} = 2,56 min, m/z = 336 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,10-1,70 (13H, m), 1,74 (3H, s), 1,82 (1H, m), 1,92 (2H, m), 2,29 (1H, m); 2,41 (1H, d, J = 5,8 Hz), 3,66 (1H, t, J = 8,9 Hz), 5,49 (1H, d, J = 7,9 Hz), 5,70 (1H, m), 5,80 (1H, d, J = 11,5 Hz), 8,91 (1H, s).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-(1-hidroxihexil)-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]-heptan-3,7-diona
46
A una solución de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carboxílico (Ejemplo 4) (239 mg, 0,65 mmol) en diclorometano (14 ml) se añadió trietilamina (0,27 ml, 1,9 mmol) y BOPCI (247 mg, 0,97 mmol) a rt. Después de agitación durante 1 hora, se añadió una disolución saturada de bicarbonato de sodio (20 ml) y después se extrajo la capa orgánica con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de concentración, se purificó el residuo mediante cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto (92 mg, 40%).
Pf: 144ºC
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,55 min., m/z = 352 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,17-1,33 (6H, m), 1,46-1,52 (3H, m), 1,77 (3H, s), 1,54-1,86 (3H, m), 1,92 (2H, m); 2,29 (1H, m), 2,57 (1H, d, J = 5,7 Hz), 3,65 (1H, t, J = 8,8 Hz), 3,92 (1H, m), 4,77 (1H, d, J = 3,8 Hz), 5,48 (1H, d, J = 7,9 Hz), 5,72 (1H, m), 5,80 (1H, d, J = 10,4 Hz), 9,07 (1H, s).
Ejemplo 8 1-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-aza-biciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
47
A una suspensión de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona (Ejemplo 1) (100 mg, 0,3 mmol) y un 10% de Pd/C (5 mg) en diclorometano (2 ml) se cargó cuidadosamente hidrógeno. Después de su agitación a rt durante 3 horas, se eliminó el catalizador mediante filtración. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo = 4/1) para producir el producto (50 mg, 50%).
Pf: 167ºC
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,73 min., m/z = 338 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J = 6,9 Hz), 0,90-1,35 (12H, m), 1,73 (3H, s), 1,40-1,86 (9H, m), 2,40 (1H, t, J = 7,6 Hz), 3,67 (1H, t, J = 7,9 Hz), 5,23 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,85 (1H, s).
Ejemplo 9 (1S)-ciclohex-2-en-1-il[(1R,4R,5S)-4-hexil-5-metil-3,7-dioxo-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.0]hept-1-il]metil-acetato
48
Una mezcla de (1R,4R,5S)-1-[(1S)-ciclohex-2-en-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]
heptan-3,7-diona (Ejemplo 1) (8,30 mg, 0,025 mmol) y anhídrido acético (2,78 mg, 0,027 mmol) en piridina (0,002 ml) se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla se diluyó con tolueno y se concentró a presión reducida para producir (1S)-ciclohex-2-en-1-il[(1R,4R,5S)-4-hexil-5-metil-3,7-dioxo-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]hept-1-il]-metil-acetato (9,00 mg, 96%).
MS: m/z = 378 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,22-1,34 (6H, m), 1,40-1,85 (8H, m), 1,70 (3H, s), 1,85-2,02 (3H, m), 2,07 (3H, s), 2,67 (1H, dd, J = 8,0, 5,5 Hz), 5,19 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,41 (1H, dd, J = 10,5, 2,1 Hz), 5,74 (1H, m), 8,17 (1H, s).
Ejemplo 10 S-bencil éster de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbotioico
49
A una solución de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (37 \mul, 0,27 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo (0,1 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (25 mg, 61%).
Pf: 138ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,92 min., m/z = 460 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 6,9 Hz), 0,98 (1H, m), 1,46 (3H, s), 1,12-1,58 (13H, m), 1,81 (2H, m), 2,07 (1H, m), 2,43 (1H, m), 3,79 (1H, t, J = 6,5 Hz), 4,00 (1H, d, J = 13,8 Hz), 4,09 (1H, d, J = 13,8 Hz), 4,84 (1H, s), 5,00 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,60 (1H, m), 5,76 (1H, d, J = 12,0 Hz), 7,18-7,32 (5H, m), 8,14 (1H, s).
Ejemplo 11 S-(2-acetilaminoetil)éster de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-car-botioico
50
A una solución de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,27 mmol) en diclorometano (1 ml), se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 1 hora, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (10 mg, 37%).
Pf: 82ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,38 min., m/z = 455 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 6,8 Hz), 1,09 (1H, m), 1,44 (3H, s), 1,19-1,55 (11H, m), 1,62 (2H, m), 1,79 (3H, m), 1,85 (2H, m), 2,13 (1H, m), 2,44 (1H, m), 2,82 (2H, m), 3,13 (2H, m), 3,79 (1H, t, J = 7,0 Hz), 4,76 (1H, s), 5,02 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,63 (1H, m), 5,79 (1H, d, J = 10,1 Hz), 7,93 (1H, m), 8,18 (1H, s).
Ejemplo 12 Metil éster de ácido 3-[2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbonilsulfanil]propiónico
51
A una solución de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (10 mg, 37%).
Pf: 64ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,64 min., m/z = 456 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 6,9 Hz), 1,09 (1H, m), 1,43 (3H, s), 1,15-1,54 (11H, m), 1,61 (2H, m), 1,86 (2H, m), 2,12 (1H, m), 2,44 (1H, t, J = 5,9 Hz), 2,56 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,95 (2H, t, J = 7,1 Hz), 3,60 (3H, s), 3,77 (1H, t, J = 7,1 Hz), 4,76 (1H, s), 5,01 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,63 (1H, m), 5,78 (1H, d, J = 11,9 Hz), 8,18 (1H, s).
Ejemplo 13 S-ciclohexil éster de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbotioico
52
A una solución de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (83 \mul, 0,6 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,1 ml) a rt. Después de agitación durante 40 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (16 mg, 59%).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Pf: 85ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 3,04 min., m/z = 452 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,43 (3H, s), 1,09-1,56 (18H, m), 1,56-1,73 (4H, m), 1,74-1,89 (4H, m), 2,15 (1H, m), 2,42 (1H, m), 3,36 (1H, m), 3,79 (1H, t, J = 6,6 Hz), 4,69 (1H, s), 4,94 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,64 (1H, m), 5,78 (1H, d, J = 10,1 Hz), 8,02 (1H, s).
Ejemplo 14 S-bencil éster de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbotioico
53
A una solución de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-(1-hidroxihexil)-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona (Ejemplo 2) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (36 \mul, 0,26 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (17 mg, 41%).
Pf: 123ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,84 min., m/z = 476 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J = 7,0 Hz), 0,94 (1H, m), 1,49 (3H, s), 1,14-1,56 (9H, m), 1,71 (2H, m), 1,81 (2H, m), 2,08 (1H, m), 2,48 (1H, m), 3,77 (1H, t, J = 7,3 Hz), 3,82 (1H, m), 4,01 (1H, d, J = 13,8 Hz), 4,11 (1H, d, J = 13,9 Hz), 5,11 (1H, d, J = 7,3 Hz), 5,20 (1H, d, J = 2,9 Hz), 5,48 (1H, s), 5,61 (1H, m), 5,75 (1H, d,
J = 10,7 Hz), 7,17-7,32 (5H, m), 8,45 (1H, s).
Ejemplo 15 S-(2-acetilaminoetil) éster de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbotioico
54
A una solución de 1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-(1-hidroxihexil)-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona (Ejemplo 2) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (36 \mul, 0,26 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 1 hora, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (25 mg, 62%).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Pf: 80ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,19 min., m/z = 471 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J = 6,3 Hz), 1,48 (3H, s), 1,01-1,75 (12H, m), 1,79 (3H, s), 1,87 (2H, m), 2,14 (1H, m), 2,48 (1H, m), 2,84 (2H, t, J = 7,0 Hz), 3,13 (2H, m), 3,77 (1H, t, J = 7,0 Hz), 3,82 (1H, m), 5,11 (1H, d, J = 7,3 Hz), 5,19 (1H, m), 5,41 (1H, s), 5,64 (1H, m), 5,77 (1H, d, J = 10,1 Hz), 7,93 (1H, m), 8,49 (1H, s).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 Metil éster de ácido [2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbonilsulfanil]acético 
\vskip1.000000\baselineskip
55 
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido 2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carboxílico (Ejemplo 2) (50 mg, 0,14 mmol) en THF (3 ml) se añadió trietilamina (57 \mul, 0,4 mmol), tiol (0,05 ml) y BOPCI (52 mg, 0,2 mmol) a rt. Después de agitación durante 3 horas, se añadió una disolución saturada de bicarbonato de sodio (10 ml) y después se extrajo la capa orgánica con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para dar el producto (21 mg, 34%).
Pf: 75ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,46 min., m/z = 458 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 6,9 Hz), 1,02 (1H, m), 1,19-1,39 (7H, m), 1,46 (3H, s), 1,56-1,76 (4H, m), 1,86 (2H, m), 2,17 (1H, m), 2,48 (1H, m), 3,61 (3H, s), 3,68 (2H, s), 3,74 (1H, t, J = 7,2 Hz), 3,80 (1H, m), 5,13 (1H, d, J = 7,3 Hz), 5,17 (1H, d, J = 2,8 Hz), 5,45 (1H, s), 5,64 (1H, m), 5,78 (1H, d, J = 10,4 Hz), 8,57 (1H, s).
Ejemplo 17 S-bencil éster de ácido 2-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carbotioico
56
A una solución de 1-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona (Ejemplo 8) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 18 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (15 mg, 55%).
Pf: 181ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,89 min., m/z = 462 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 7,0 Hz), 0,87-1,05 (4H, m), 1,20-1,50 (15H, m), 1,45 (3H, s), 1,56 (1H, m), 1,79 (1H, m), 2,42 (1H, t, J = 6,3 Hz), 3,75 (1H, dd, J = 5,4 Hz, 7,0 Hz), 4,00 (1H, d, J = 13,9 Hz), 4,10 (1H, d, J = 13,9 Hz), 4,79-7,83 (2H, m), 7,20-7,30 (5H, m), 7,85 (1H, s).
Ejemplo 18 Metil éster de ácido 3-[2-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidina2-carbonilsulfanil]propiónico
57
A una solución de 1-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona (Ejemplo 8) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 18 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (14 mg, 52%).
Pf: 132ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,66 min., m/z = 458 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J = 6,9 Hz), 1,43 (3H, s), 0,85-1,90 (21H, m), 2,41 (1H, m), 2,55 (2H, m), 2,96 (2H, m), 3,23 (3H, s), 3,73 (1H, t, J = 5,6 Hz), 4,73 (1H, s), 4,83 (1H, d, J = 7,3 Hz), 7,95 (1H, s).
B. Evaluación de la actividad fisiológica
El efecto in vitro de los compuestos de acuerdo con la invención se puede demostrar en los siguientes ensayos:
Ensayo HTS
Los compuestos de prueba se diluyen 6 veces con 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA, un 0,005% TritonX-100 y un 0,075% SDS que contiene 150 \muM de Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA.
En cada pocillo de una placa negra de 1.536 pocillos, se pipetan 2 \mul de una solución del compuesto diluido y después se añaden 3 \mul de 0,5 \mug/ml de proteasoma 20S (de mamífero, AFFINITI, Exeter, R.U.), disuelto en 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA y un 0,005% TritonX-100. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, la reacción termina por la adición de 3 \mul de 13 \muM Z-Leu-Leu-Leu-H y se mide la intensidad de fluorescencia a \lambdaex 355 nm y \lambdaem 460 nm en un contador multietiquetas ARVO (Perkin Elmer, Tokio, Japón).
Ensayo de inhibición del proteasoma
El compuesto de prueba se diluye a varias concentraciones en un 2,5% de DMSO en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Como control interno, se diluye MG-132 (Cat. #3175-v; Peptide Institute; Osaka, Japón) utilizando el mismo procedimiento que para el compuesto de prueba. La solución de trabajo diluida (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de polipropileno de 96 pocillos. El tampón de ensayo consiste en 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA, un 0,005% TritonX-100, un 0,005% SDS, preparado como solución stock a 10x la concentración. El sustrato peptídico (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA; 3120v; Peptide Institute; Osaka, Japón) se almacena a 10 mM en un 100% DMSO. El sustrato peptídico se diluye a 125 \muM en 1,25x la concentración del tampón de ensayo y 40 \mul de la solución de sustrato se añade a la solución de los compuestos. El compuesto y el sustrato se preincuban durante 10 min a temperatura ambiente. Después, la mezcla del compuesto y del sustrato (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de ensayo negra de 384 pocillos no recubiertos (Nunc) y se mide la emisión de autofluorescencia a 460 nm (\lambdaex, 360 nm) por medio de un puntero de placa de fluorescencia ARVO (Perkin Elmer, Tokio, Japón).
Se obtiene proteasoma S20 de glóbulos rojos humanos de Affinity Research Products Ltd., (Cat#PW8720; Exeter, R.U.) y se almacena a -80ºC. Se diluye el proteasoma 1 en 1.000 con 1x la concentración del tampón de ensayo y se añaden 10 \mul a la mezcla de sustratos e inhibidor en la placa. Se realiza la reacción proteolítica a temperatura ambiente. Se mide continuamente la emisión de fluorescencia durante 90 min. Se determinan los valores IC_{50} de los compuestos a la velocidad inicial de la reacción. Se presentan los datos seleccionados en el Tabla A.
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TABLA A
58
Ensayo con quimotripsina
El compuesto de prueba se diluye a varias concentraciones en un 2,5% de DMSO en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Como control interno, se diluye quimostatina (Cat. #4063; Peptide Institute; Osaka, Japón) utilizando el mismo procedimiento que para el compuesto de prueba. La solución de trabajo diluida (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de polipropileno de 96 pocillos. El tampón de ensayo consiste en 50 mM TES (pH 8,0), 10 mM CaCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA, preparado como solución stock a 10x la concentración. El sustrato peptídico (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA; 3120v; Peptide Institute; Osaka, Japón) se almacena a 10 mM en un 100% DMSO. El sustrato peptídico se diluye a 50 \muM en 1,25x la concentración del tampón de ensayo y 40 \mul de la solución de sustrato se añade a la solución de los compuestos. El compuesto y el sustrato se preincuban durante 10 min a temperatura ambiente. Después, la mezcla del compuesto y del sustrato (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de ensayo negra de 384 pocillos no recubiertos (Nunc) y se mide la emisión de autofluorescencia a 460 nm (\lambdaex, 360 nm) por medio de un puntero de placa de fluorescencia ARVO (Perkin Elmer, Tokio, Japón).
Se obtiene quimotripsina humana de Calbiochem., (Cat#230900) y se diluye a 0,5 mg/ml en un 50% de glicerol y se almacena a -20ºC. Se diluye la solución stock de quimotripsina a 18 ng/ml en 1x la concentración del tampón de ensayo y se añaden 10 \mul a la mezcla de sustratos e inhibidor en la placa. Se realiza la reacción proteolítica a temperatura ambiente. Se mide continuamente la emisión de fluorescencia durante 60 min. Se determinan los valores IC_{50} de los compuestos a la velocidad inicial de la reacción.
Ensayo con tripsina
El compuesto de prueba se diluye a varias concentraciones en un 2,5% de DMSO en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Como control interno, se diluye leupeptina (Cat. #4041-v; Peptide Institute; Osaka, Japón) utilizando el mismo procedimiento que para el compuesto de prueba. La solución de trabajo diluida (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de polipropileno de 96 pocillos. El tampón de ensayo consiste en 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA 50 mM, preparado como solución stock a 10x la concentración. El sustrato peptídico (Boc-Gln-Ala-Arg-MCA; 3135-v; Peptide Institute; Osaka, Japón) se almacena a 1 mM en un 100% DMSO. El sustrato peptídico se diluye a 15 \muM en 1,25x la concentración del tampón de ensayo y 40 \mul de la solución de sustrato se añade a la solución de los compuestos. El compuesto y el sustrato se preincuban durante 10 min a temperatura ambiente. Después, la mezcla del compuesto y del sustrato (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de ensayo negra de 384 pocillos no recubiertos (Nunc) y se mide la emisión de autofluorescencia a 460 nm (\lambdaex, 360 nm) por medio de un puntero de placa de fluorescencia ARVO (Perkin Elmer, Tokio, Japón).
Se obtiene tripsina de Calbiochem., y se diluye a 1 mg/ml en 1 mM HCl y se almacena a -20ºC. Se diluye la solución stock de tripsina a 1 ng/ml en 1x la concentración del tampón de ensayo y se añaden 10 \mul a la mezcla de sustratos e inhibidor en la placa. Se realiza la reacción proteolítica a temperatura ambiente. Se mide continuamente la emisión de fluorescencia durante 60 min. Se determinan los valores IC_{50} de los compuestos a la velocidad inicial de la reacción.
Producción de RANTES inducida por TNF\alpha en células A549
La línea celular del epitelio de pulmón humano A549 (ATCC#CCL-885) se mantiene en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM, Nikken Biomedical Institute) suplementado con un 10% FCS (Gibco), 100 U/ml penicilina, 100 \mug/ml estreptomicina y 2 mM glutamina. Se tratan células A549 (4 x 10^{4} células en 80 \mul/pocillo) en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano durante 1 h con un vehículo (0,1% DMSO) o con los compuestos de prueba. Después, se estimulan las células con 100 ng/ml TNF-\alpha durante 24 h. La concentración de RANTES en los sobrenadantes, que se recogen pasadas 24 horas, se determina por medio de una técnica cuantitativa de inmunoensayo de fluorescencia de tipo sandwich (intercalación) siguiendo las recomendaciones del fabricante (R&D Systems, Oxon, R.U.).
Degradación de I\kappaB\alpha inducida por TNF-\alpha en células A549
Se pretratan células A549 subconfluentes que se desarrollan en placas de 6 pocillos con varias concentraciones de inhibidor o vehículo (0,1% DMSO) durante 30 min a 37ºC. A continuación, se dejan las células sin tratar o estimuladas con 10 ng/ml TNF-\alpha durante el período de tiempo indicado. Se lavan dos veces las células con PBS frío y se lisan mediante 100 \mul de tampón de muestra de SDS-PAGE sobre hielo. Los lisados celulares se sonican brevemente, se centrifugan y los sobrenadantes se someten a SDS-PAGE así como análisis Western Blot mediante anti-I\kappaB\alpha (New England Biolabs #9242) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Inhibición de MDA MB 231 y de proliferación de células tumorales H460
Se colocan células (3.000) en placas de ensayo de 96 pocillos a 3.000 células/pocillo en medios de cultivo completos con un 10% de Suero de Ternera Fetal y se incuban durante 24 h a 37ºC. Tras 24 h de permanencia en placas, se añaden los compuestos a un rango de concentración final de entre 10 \muM con diluciones seriales y 10 nM a una concentración final de DMSO del 0,1%. Se incuban las células durante 72 h a 37ºC en medios de cultivo completos después de la adición del compuesto. Por medio del kit de ensayo de luminiscencia Promega Cell TiterGlo ATP (Promega Corp.), se determina el número de células viables/pocillo mediante la medición de la señal luminiscente basándose en la cantidad de ATP celular como medición indirecta del número de células. Los valores leídos 72 horas después de la incubación con los compuestos de prueba se restan de los valores del Día 0. Se determinan los valores IC_{50} con el programa Analyze 5. Relación Señal/Ruido media por los tipos de células = 3 - 5 veces.
C. Ejemplos operativos con relación a las composiciones farmacéuticas
Los compuestos de acuerdo con la invención se pueden convertir en preparaciones farmacéuticas como sigue:
Tabletas
Composición
100 mg del compuesto del Ejemplo 1, 50 mg de lactosa (monohidrato), 50 mg de almidón de maíz (nativo), 10 mg de polivinilpirrolidona (PVP 25) (de BASF, Ludwigshafen, Alemania) y 2 mg de estearato de magnesio.
Peso de la tableta: 212 mg, diámetro: 8 mm, radio de curvatura: 12 mm.
Preparación
La mezcla de componente activo, lactosa y almidón se granula con una solución al 5% (m/m) de PVA en agua. Después de su secado, se mezclan los gránulos con estearato de magnesio durante 5 min. Esta mezcla se moldea por medio de una prensa de tabletas habitual (formato de las tabletas, véase más arriba). La fuerza de moldeo aplicada es típicamente de 15 kN.
\vskip1.000000\baselineskip
Suspensión de administración oral
Composición
1.000 mg del compuesto del Ejemplo 1, 1.000 mg de etanol (96%), 400 mg de Rhodigel (goma xantán de FMC, Pennsylvania, USA) y 99 g de agua.
10 ml de la suspensión oral proporcionan una sola dosis de 100 mg del compuesto de acuerdo con la invención.
Preparación
Se suspende el Rhodigel en etanol y se añade a la suspensión el componente activo. Se añade bajo agitación agua. Se continúa con la agitación durante aproximadamente 6 horas hasta que se complete la expansión del Rhodigel.

Claims (16)

1. Compuestos de fórmula
59
donde
R^{1} representa hidrógeno, hidroxi o metilcarboniloxi,
R^{2} representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos 
\hbox{hidroxi, y}
R^{3} representa hidrógeno o hidroxi.
y sus sales, solvatos o solvatos de las sales.
2. Compuestos de fórmula (I) según la reivindicación 1, de fórmula
60
donde R^{1}, R^{2} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba
y sus sales, solvatos o solvatos de las sales.
3. Compuestos de fórmula (I) según la reivindicación 1, tales como
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-
diona
61
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-[1-hidroxihexil]-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
62
y
(1R,4R,5S)-1-[(1R)-2-ciclohexen-1-ilmetil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
63
4. Compuestos de fórmula
64
donde
R^{4} representa hidrógeno o hidroxi,
R^{5} representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi,
R^{6} representa hidrógeno o hidroxi, y
R^{7} representa hidroxi o un sustituyente de fórmula seleccionada de entre el grupo formado por
\vskip1.000000\baselineskip
65 
\vskip1.000000\baselineskip
donde R^{8} representa hidrógeno o metilo y * representa la posición de conexión a la molécula
y sus sales, solvatos o solvatos de las sales.
5. Compuestos de fórmula (II) según la reivindicación 4, con la fórmula
66
donde R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} tienen el significado descrito en la reivindicación 4,
y sus sales, solvatos o disolvatos de las sales.
\newpage
6. Compuestos de fórmula (II) según la reivindicación 4, tales como
(3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-3-hidroxi-4-[1-hidroxihexil]-3-metil-5-oxo-D-prolina
67
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteína
68
y N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteinato de metilo
69
7. Procedimiento para sintetizar los compuestos de fórmula general (I) y (Ia), donde la fórmula (I) contiene los compuestos de fórmulas (Ib), (Ic), (Id) y (Ie) según la reivindicación 1 ó 2, y procedimiento para sintetizar los compuestos de fórmula general (II) y (IIa), donde la fórmula (II) contiene los compuestos de fórmulas (IIb), (IIc) y (IId) según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque
[A]
los compuestos de fórmula general
70
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1,
\quad
se preparan mediante fermentación y aislamiento de un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
[B]
los compuestos de fórmula general
71
\quad
en la que R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1,
\quad
se preparan mediante hidrogenación del doble enlace de los compuestos de fórmula (Ib), ó
[C]
los compuestos de fórmula general
72
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1, y el grupo hidroxi está unido al átomo de carbono 1 ó 2,
\quad
se preparan mediante la hidratación del doble enlace de los compuestos de fórmula (Ib), ó
[D]
los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1,
\quad
se preparan mediante la oxidación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
[E]
los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
74 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
donde R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito en la reivindicación 4, y R^{7} representa hidroxi o un sustituyente de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
en la que R^{8} tiene el significado descrito en la reivindicación 4,
\quad
se preparan mediante fermentación y aislamiento de un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
[F]
los compuestos de fórmula general
76
\quad
donde R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito en la reivindicación 4, y R^{7} representa un sustituyente de fórmula seleccionada entre el grupo compuesto por
77
\quad
se preparan mediante la reacción con tioles de los compuestos de fórmula
78
\quad
en la que R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito en la reivindicación 4.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Composición que contiene al menos un compuesto de fórmula general (I), (Ia), (II) o (IIa) según las reivindicaciones 1 a 6 y un diluyente farmacológicamente aceptable.
9. Composición según la reivindicación 8 para el tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos o cáncer.
10. Procedimiento para la preparación de las composiciones según las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque los compuestos de fórmula general (I), (Ia), (II) y (IIa) según las reivindicaciones 1 a 6 junto con los productos auxiliares habituales se llevan a una forma de aplicación apropiada.
11. Utilización de los compuestos de fórmula general (I), (Ia), (II) o (IIa) según las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de medicamentos.
12. Utilización según la reivindicación 11 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos o cáncer.
13. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 para su utilización en el control de procesos inflamatorios agudos y crónicos en humanos y animales.
14. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6 para su utilización en el control de procesos cancerosos en humanos y animales.
15. Microorganismo con número de designación DSM 15324 y de SEQ ID NO: 1.
16. Microorganismo con el número de designación DSM 15324 y SEQ ID NO: 1 para la preparación de los compuestos de fórmulas (I), (Ia), (II) y (IIa).
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