ES2336562T3 - Heterociclos sustituidos. - Google Patents
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Abstract
Compuestos de fórmula **(Ver fórmula)** donde R1 representa hidrógeno, hidroxi o metilcarboniloxi, R2 representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi, y R3 representa hidrógeno o hidroxi. y sus sales, solvatos o solvatos de las sales.
Description
Heterociclos sustituidos.
La presente invención se refiere a heterociclos
sustituidos, a su procedimiento de preparación y a su utilización en
medicamentos, especialmente para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias, esto es asma o cáncer.
La proteinasa multicatalítica o proteasoma es
una estructura celular altamente conservada que es responsable de la
proteolisis ATP-dependiente de la mayoría de las
proteínas celulares. El proteasoma 20S (700 kDa) contiene al menos
cinco actividades proteolíticas distintas que conllevan un nuevo
tipo de mecanismo que implica un residuo treonina en el sitio activo
(Coux, O., Tanaka, K. y Goldberg, A. 1996 Ann. Rev. Biochem.
65:801-47).
Aunque el proteasoma 20S contiene el núcleo
proteolítico, no puede degradar proteínas in vivo a no ser
que se compleje con una terminación (cap) 19S en cualquiera de los
extremos de su estructura, el que contiene a su vez múltiples
actividades ATPasa. Esta estructura de mayor tamaño se conoce como
proteasoma 26S y degrada rápidamente las proteínas que han sido el
blanco de la degradación mediante la adición de múltiples moléculas
del polipéptido de 8,5 kDa ubiquitina.
Ha quedado bien establecido ahora que el
proteasoma es un sistema proteolítico extralisosomal principal que
está involucrado en las vías de degradación, resultando en numerosas
y diversas funciones celulares, tales como la división celular,
procesamiento de antígenos y degradación de proteínas reguladoras de
vida corta como factores de transcripción, productos oncogénicos y
ciclinas (revisado en Ciechanover, A. 1994 Cell
79:13-21). La función primaria del proteasoma
consiste en catalizar la proteólisis de proteínas en pequeños
péptidos. Sin embargo, se ha demostrado también que la vía
ubiquitina-proteasoma puede catalizar el
procesamiento proteolítico regulado de un gran precursor inactivo en
una proteína activa. Al respecto, el caso mejor documentado incluye
la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB (Palombella, V.J., Rando, O.J.,
Goldberg, A.L., y Maniatis, T. 1994 Cell
78:773-785). La forma activa del
NF-\kappaB es un heterodímero compuesto por una
subunidad p65 y una p50. Esta última está presente en el citosol
celular en una forma precursora inactiva, a saber p105, polipéptido
de 105 kDa precursor de p50. El procesamiento proteolítico de p105
para generar p50 tiene lugar a través de la vía
ubiquitina-proteasoma. Además, los p50 y p65
procesados se mantienen en el citosol como complejo inactivo con la
proteína de inhibición I\kappaB. Las señales inflamatorias activan
NF-\kappaB mediante el inicio de la vía de
señalización para la degradación completa de I\kappaB y estimulan
también el procesamiento de p105 en p50. Por tanto, se necesitan dos
eventos proteolíticos, ambos dirigidos por la vía
ubiquitina-proteasoma, para la activación inducida
por la señal de NF-\kappaB.
Una vez activado, NF-\kappaB
se transloca hacia el núcleo, en el que desempeña un papel central
en la regulación de un conjunto notablemente diverso de genes
involucrados en las respuestas inmunes e inflamatorias (Grilli y
col., International Review of Cytology (1993)
143:1-62). Por ejemplo, se necesita
NF-\kappaB para la expresión de diversos genes
implicados en la respuesta inflamatoria, como el gen
TNF-\alpha y los genes que codifican las moléculas
de adhesión celular E-selectina,
P-selectina, ICAM y VCAM (Collins, T., Lab. Invest.
(1993) 68:499). Se necesita también NF-\kappaB
para la expresión de un amplio número de genes de citoquinas, como
IL-2, IL-6, factor estimulante de
colonias de granulocitos e IFN-\beta. La óxido
nítrico-sintetasa inducible se encuentra también
bajo el control regulador de NF-\kappaB. Los
inhibidores del proteasoma bloquean la degradación de
I\kappaB\alpha y la activación de NF-\kappaB
(Palombella y col., WO 95/25533 publicada el 28 de Sept., 1995;
Traenckner y col., EMBO J. (1994) 13: 5433). Los inhibidores del
proteasoma bloquean también la expresión
TNF-\alpha-inducida de las
moléculas de adhesión de leucocitos E-selectina,
VCAM-1 y ICAM-1 (Read, y col.,
Immunity (1995) 2:493).
El hecho de que el proteasoma desempeñe un papel
crítico en la activación de NF-\kappaB podría ser
explotado clínicamente vía la utilización de inhibidores dirigidos
hacia la proteólisis del proteasoma. En ciertas enfermedades, la
función normal del NF-\kappaB activo puede
resultar perjudicial para la salud humana, tal como se observa en
las respuestas inflamatorias. Así, los inhibidores de la activación
de NF-\kappaB, debido a su capacidad para impedir
la secreción de diversas moléculas inflamatorias, tales como las
moléculas de adhesión celular o citoquinas, pueden ser
potencialmente útiles en el tratamiento de trastornos inflamatorios
tales como aquellos que incluyen, por ejemplo, alergia, EPOC,
inflamación de las vías aéreas y asma, ARDS (síndrome de distrés
respiratorio agudo), SIDA, osteoartritis y artritis reumatoide;
enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo colitis
ulcerativa y enfermedad de Crohn; sepsis, rechazo de transplantes e
isquemia o lesión por reperfusión, incluyendo derrame cerebral e
infarto de miocardio. Debido a que la activación de
NF-\kappaB es esencial también para la
angiogénesis, los inhibidores del proteasoma pueden ser útiles en el
tratamiento de enfermedades asociadas a la neovascularización
anormal.
En un primer momento se describió la p53 como
una oncoproteína, pero se ha demostrado posteriormente que estaba
involucrada en numerosos procesos celulares (revisado por Ko, L.J.
and Proves, C. 1996 Genes Dev. 10, 1054-1072). Se ha
demostrado que p53 induce la apoptosis en varias líneas celulares
hematopoyéticas (Oren, M., 1994 Semin. Cancer Biol. 5,
221-227) mediante la acción de muchos estímulos
diferentes, incluyendo lesión del ADN, infección viral y eliminación
de factores de crecimiento. Sin embargo, es importante observar que
la apoptosis puede ser inducida de una forma
p53-independiente, por ejemplo por la acción de
glucocorticoides. La inducción de p53 conduce a la detención del
crecimiento celular en la fase G1 del ciclo celular, así como a la
muerte celular por apoptosis. Ambas funciones permiten que p53
controle la lesión del ADN, reduciendo así la propagación de
mutaciones de ADN cuando las células se dividen. La p53 secuestra
las células en G1 mediante la inducción del inhibidor de la quinasa
ciclina-dependiente, p21, que a su vez provoca una
acumulación de la forma hipofosforilada del producto genético del
retinoblastoma. Se piensa que p53 actúa como punto de verificación
en la célula después de la lesión del ADN, causa en primer lugar una
detención de la división celular y apoptosis. Es conocido que la
degradación de p53 se realiza a través de la vía
ubiquitina-proteasoma y la interrupción de la
degradación de p53 es una forma posible de inducción de la
apoptosis. Otra utilidad potencial de los inhibidores del proteasoma
puede encontrarse en el tratamiento de enfermedades que resulten de
la proliferación celular anormal.
El hecho de que la vía
ubiquitina-proteasoma es crítica para la destrucción
regulada de las ciclinas que dirigen la salida de la mitosis y
permiten que las células progresen hacia la siguiente fase del ciclo
celular está bien documentado. Por tanto, inhibiendo la degradación
de las ciclinas mediante la utilización de inhibidores del
proteasoma provoca la detención del crecimiento. Así, otra utilidad
potencial de los inhibidores del proteasoma consiste en su
utilización en el tratamiento de enfermedades que resultan de una
división celular acelerada. Éstas incluyen cáncer, enfermedades
cardiovasculares como miocarditis, restenosis después de la
angioplastia, enfermedades renales como lupus, enfermedad
poliquística renal, infecciones fúngicas, enfermedades
dermatológicas como psoriasis, cicatrización anormal de heridas,
queloides, enfermedades inmunológicas como autoinmunidad,
hipersensibilidad aguda y retardada, enfermedad injerto contra
huésped, rechazo de transplantes y enfermedades neuroinmunológicas
como esclerosis múltiple y encefalomielitis aguda diseminada.
Se descubrió que varios metabolitos microbianos
inhibían el proteasoma. Por ejemplo, se han indicado algunos
compuestos peptídicos procedentes de estreptomicetos, tales como la
serie TMS-96 (Y. Koguchi y col., J. Antibiot., 1999,
52, 63-65 y J. Antibiot., 2000, 53,
1069-1076) y hongos como la serie
TMC-95 (J. Kohno y col., J. Org. Chem., 2000, 65,
990-995) como fuertes inhibidores para este
objetivo. Se ha reivindicado también que los metabolitos de
actinomicetos no peptídicos que poseen una porción
beta-lactona o sus análogos químicos respectivos
interactúan fuertemente con este objetivo. Entre ellos se encuentran
las salinosporamidas provenientes del actinomiceto marino
Salinospora sp., conocido de la WO 02/47610 y R. Feling y
col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42, 355-357
(Salinosporamida A), y las \beta-lactonas de
lactacistina conocidas de la WO 96/32105, WO 99/15183 y WO
99/09006.
La salinosporamida E y la Salinosporamida G son
conocidas del 10º Internat. Symp. on Marine Natural Prod. en Okinawa
2001 y la "Salinosporamida A" se conoce del 50º Annual Congress
Society for Medicinal Plant Research en Barcelona, España,
8-12 de septiembre de 2002.
La presente invención se refiere a nuevos
heterociclos sustituidos que muestran una fuerte inhibición sin
precedentes del proteasoma y al aislamiento de estos compuestos a
partir del nuevo actinomiceto JS360 (DSM 15324) del género
Streptomyces de SEQ ID NO: 1 tal como se describe en la Fig.
5 y el listado de secuencias.
La presente invención se refiere a los
compuestos de fórmula I
donde
- R^{1}
- representa hidrógeno, hidroxi o metilcarboniloxi,
- R^{2}
- representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi, y
- R^{3}
- representa hidrógeno o hidroxi.
Los compuestos según la invención pueden estar
presentes también en forma de sus sales, solvatos o como solvatos de
las sales.
Dependiendo de su estructura, los compuestos de
acuerdo con la invención pueden existir en formas estereoisoméricas
(enantiómeros, diastereómeros). Por tanto, la invención se refiere a
los enantiómeros o diastereómeros y a sus mezclas respectivas.
Dichas mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros se pueden separar
en sus constituyentes unitarios en forma estereoisomérica de forma
conocida.
La invención también se refiere a los tautómeros
de los compuestos, dependiendo de la estructura de los mismos.
En el contexto de la invención, las sales son
preferentemente sales fisiológicamente aceptables de los compuestos
de acuerdo con la invención.
Las sales fisiológicamente aceptables de los
compuestos (I) incluyen sales de adición de ácido de ácidos
inorgánicos, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo
sales de ácido clorhídrico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico,
ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
toluensulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido
naftalenodisulfónico, ácido acético, ácido propiónico, ácido
láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido
fumárico, ácido maleico y ácido benzoico.
Las sales fisiológicamente aceptables de los
compuestos (I) incluyen también sales de bases habituales, por
ejemplo y preferentemente sales de metales alcalinos (por ejemplo
sales de sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (por
ejemplo sales de calcio y magnesio) y sales de amonio procedentes de
amoníaco o aminas orgánicas de 1 a 16 átomos de carbono, tales
como, de forma ilustrativa y preferente, etilamina, dietilamina,
trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina,
trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína,
dibencilamina, N-metilmorfolina,
dihidroabietilamina, arginina, lisina, etilendiamina y
metilpiperidina.
En el contexto de la invención, los solvatos son
aquellas formas de los compuestos que se coordinan con moléculas de
disolvente para formar un complejo en estado sólido o líquido. Los
hidratos son una forma específica de solvatos, donde la coordinación
se lleva a cabo con agua.
Fig. 1: Lapso de tiempo de fermentación de la
cepa JS360 a escala de 30 litros.
Fig. 2: Esquema para el aislamiento de los
Ejemplos 1 a 7 a partir de los extractos crudos de una fermentación
de cepa JS360 a escala de 30 litros.
Fig. 3: Cromatogramas HPLC, espectros
LC-MS de HPLC-UV y
HPLC-ESI del Ejemplo 1 después de la HPLC
preparativa.
Fig. 4: Espectro protónico del Ejemplo 1.
Fig. 5: SEQ ID NO.: 1: rADN de 16S parcial,
secuencia parcial de la cepa JS360/DSM 15324.
Fig. 6: Dendograma que muestra la relación entre
Salinospora sp. y JS360. La escala debajo del árbol
representa la distancia entre secuencias. Las unidades indican el
número de eventos de sustitución. El grupo de Salinospora sp.
está en la rama superior, mientras que JS360 y el grupo de
secuencias similares se encuentran en la rama inferior.
Fig. 7: Gráfica ORTEP (50%) del Ejemplo 1 con el
recuento de átomos distintos de hidrógeno.
Fig. 8: Empaquetamiento de cristales del Ejemplo
1 visto a lo largo de los ejes a y c que muestra las capas polares y
no polares.
En otra realización, la presente invención se
refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula (I), en la que
- R^{1}
- representa hidrógeno o hidroxi,
- R^{2}
- representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi, y
- R^{3}
- representa hidrógeno o hidroxi.
En otra realización, la presente invención se
refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} tienen el significado descrito más
arriba.
En otra realización, la presente invención se
refiere a los compuestos de fórmula (I), tales como
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptano-3,7-
diona
diona
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-[1-hidroxihexil]-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]hep-
tano-3,7-diona
tano-3,7-diona
y
(1R,4R,5S)-1-[(1R)-2-ciclohexen-1-ilmetil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-aza-biciclo[3.2.0]-heptano-3,7-diona
En otra realización, la presente invención se
refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
en la
que
- R^{4}
- representa hidrógeno o hidroxi,
- R^{5}
- representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi,
- R^{6}
- representa hidrógeno o hidroxi, y
- R^{7}
- representa hidroxi o un sustituyente de fórmula seleccionada de entre:
donde R^{8} representa hidrógeno
o metilo y * representa la posición de conexión a la
molécula.
En otra realización, la presente invención se
refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- R^{4}
- representa hidrógeno o hidroxi,
- R^{5}
- representa ciclohexilo o ciclohex-2-enilo, donde el ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a2 grupos hidroxi,
- R^{6}
- representa hidrógeno o hidroxi, y
- R^{7}
- representa hidroxi o un sustituyente de fórmula
donde R^{8} representa hidrógeno
o metilo y * representa la posición de conexión a la
molécula.
En otra realización, la presente invención se
refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula
en la que R^{4}, R^{5}, R^{6}
y R^{7} tienen el significado descrito más
arriba.
\newpage
En otra realización, la presente invención se
refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula (II), tales como
(3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-3-hidroxi-4-[1-hidroxihexil]-3-metil-5-oxo-D-prolina
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteína
y
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteinato
de metilo
En otra realización, la presente invención se
refiere a un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID
NO.: 1 (Fig. 5 y listado de secuencias).
En otra realización, la presente invención se
refiere a
- [A]
- un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba,
- \quad
- caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la fermentación y aislamiento de un Actinomiceto JS360 (DSM 15324) del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
- [B]
- un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba,
- \quad
- caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la hidrogenación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
- [C]
- un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba y el grupo hidroxi está unido al átomo de carbono 1 ó 2,
- \quad
- caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la hidratación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
- [D]
- un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito más arriba,
- \quad
- caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la oxidación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
- [E]
- un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito más arriba, y R^{7} representa hidroxi o un sustituyente de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que R^{8} tiene el significado descrito más arriba,
- \quad
- caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la fermentación y aislamiento de un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
- [F]
- un proceso para sintetizar los compuestos de fórmula general
- \quad
- en la que R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito más arriba, y R^{7} representa un sustituyente de fórmula seleccionada entre el grupo compuesto de
- \quad
- caracterizado porque los compuestos se preparan mediante la reacción de los compuestos de fórmula
- \quad
- donde R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito más arriba,
- \quad
- con tioles.
- \quad
- La fórmula (I) contiene los compuestos de fórmulas (Ib), (Ic), (Id) y (Ie).
- \quad
- La fórmula (II) contiene los compuestos de fórmulas (IIb), (IIc) y (IId).
Los procesos [A] y [E] se pueden llevar a cabo
tal como se describe en la sección experimental o el
Streptomyces sp. JS360 se fermenta sumergido en un medio
nutriente acuoso en condiciones aeróbicas. Típicamente, el
microorganismo se fermenta en un medio nutriente que contiene una
fuente de carbono y un material proteináceo. Las fuentes
preferentes de carbono incluyen glucosa, azúcar morena, sacarosa,
glicerol, almidón, almidón de maíz, lactosa, dextrina, melazas y
similares. Las fuentes preferentes de nitrógeno incluyen harina de
semilla de algodón, licor de maceración de maíz, levadura, levadura
de cerveza autolisada con sólidos de la leche, torta de soja, torta
de semilla de algodón, torta de maíz, sólidos de la leche, producto
de la digestión pancréatica de la caseína, productos sólidos de
destilería, licores de peptona animal, sobras de carne y huesos, y
similares. Ventajosamente se pueden utilizar combinaciones de estas
fuentes de carbono y nitrógeno. No es necesario añadir al medio de
fermentación metales traza, por ejemplo zinc, magnesio, manganeso,
cobalto, hierro y similares, ya que se utilizan agua de grifo e
ingredientes no purificados como componentes del medio.
La producción de los compuestos puede ser
inducida a cualquier temperatura que conlleve un crecimiento
satisfactorio de los microorganismos, entre aproximadamente 23ºC y
32ºC y preferentemente alrededor de 28ºC. Normalmente, la producción
óptima de los compuestos se obtiene en aproximadamente 2 a 6 días de
fermentación y preferentemente en alrededor de 4 a 5 días de
fermentación. El caldo de fermentación permanece de débilmente a
moderadamente ácido durante la fermentación, y ventajosamente la
fermentación finaliza a un pH de 4-4,5. El pH final
depende, en parte, de los tampones presentes, si los hay, y en
parte, del pH inicial del medio de cultivo. Se ajusta ventajosamente
a un pH aproximadamente de 6,5-7,5, y
preferentemente 7,2, antes de la esterilización.
La producción se obtiene en matraces oscilantes
pero también en medios sólidos y fermentadores bajo agitación.
Cuando se lleva a cabo el cultivo en matraces oscilantes o grandes
recipientes y tanques, es preferible utilizar la forma vegetativa
en lugar de la forma en esporas del microorganismo para la
inoculación, con el fin de evitar un retraso pronunciado en la
producción de los compuestos y la utilización ineficaz asociada del
equipo. En consecuencia, es conveniente producir un inóculo
vegetativo en un medio nutriente acuoso mediante la inoculación de
este medio con una parte alícuota procedente del suelo o de un
cultivo sesgado. Cuando se ha asegurado así un inóculo joven
activo, se traslada asépticamente a otros matraces oscilantes u
otros dispositivos adecuados para la fermentación de
microorganismos. El medio en el que se produce el inóculo vegetativo
puede ser el mismo o diferente del que se utiliza para la producción
de compuestos, siempre que se obtenga un cultivo adecuado del
microorganismo.
En general, se utiliza la siembra de
Streptomyces sp. JS360 y la fermentación así como la
producción de compuestos en una fermentación aeróbica sumergida en
recipientes bajo agitación. La producción es independiente de los
recipientes empleados, fermentadores y procedimientos de arranque.
Los compuestos se pueden obtener también mediante cultivo en
matraces oscilantes. Para fermentaciones de grandes volúmenes, es
preferible utilizar un inóculo vegetativo. El inóculo vegetativo se
prepara mediante la inoculación de un pequeño volumen de medio de
cultivo en forma de esporas, fragmentos miceliales o como un gránulo
liofilizado del organismo. El inóculo vegetativo se traslada
entonces a un recipiente de fermentación donde, después de un tiempo
de incubación adecuado, los compuestos se obtienen con una
producción óptima.
Como es habitual en el proceso de cultivo
aeróbico sumergido, se dispersa aire estéril por todo el medio de
cultivo. Para un desarrollo eficaz del organismo, el volumen de aire
utilizado se encuentra en el rango de aproximadamente 0,25 a
aproximadamente 0,5 volumen de aire por volumen de medio de cultivo
por minuto (vvm). Una velocidad óptima en un recipiente de 10 l es
de aproximadamente 0,3 vvm con agitación proporcionada por
impulsores convencionales que giran a aproximadamente 240 r.p.m. Es
necesaria la adición de una pequeña cantidad (esto es 1 ml/l) de un
agente antiespumante tal como silicona a los medios de fermentación
cuando la formación de espuma empieza a ser un problema. Se
proporcionan las condiciones y medios de fermentación preferentes en
los Procedimientos Experimentales Generales.
Los compuestos están presentes en la biomasa de
los Streptomyces sp. JS360 fermentados, así como en el
filtrado de cultivo del caldo de fermentación. El caldo de cultivo
se puede separar mediante filtración en una prensa
fil-
tradora.
tradora.
Se pueden emplear varios procedimientos para
aislar y purificar los compuestos procedentes del caldo de
fermentación, por ejemplo mediante procedimientos de cromatografía
de adsorción seguida de elución con un disolvente adecuado,
cromatografía en columna, cromatografía de partición, así como
cristalización de disolventes y combinaciones de los mismos.
En el proceso de recuperación preferente, los
compuestos se extraen de la cerveza total, de los micelios o de
extractos del sobrenadante. Este último se puede preparar mediante
la utilización de resinas adsorbentes como XAD, HP20 o Bayer
Lewapol. Se emplean técnicas de cromatografía en columna,
preferentemente sobre geles de sílice o geles de sílice
modificados, para realizar la purificación inicial. La purificación
final de los compuestos se lleva a cabo preferentemente mediante
Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento preparativa.
La hidrogenación en el proceso [B] se puede
llevar a cabo en presencia de un catalizador tal como paladio/carbón
vegetal e hidrógeno, en un disolvente apropiado, en un rango de
temperaturas de 0ºC a +100ºC, a presión normal o a presión elevada
hasta 3 bar.
\newpage
Disolventes adecuados son, por ejemplo, éteres
tales como dietil éter, metil t-butil éter, dioxano
o tetrahidrofurano, alcoholes como metanol, etanol,
n-propanol, isopropanol, n-butanol o
t-butanol, siendo preferente metanol, etanol,
isopropanol o tetrahidrofurano.
La hidratación en el proceso [C] se puede llevar
a cabo por hidroboración con tratamiento oxidativo utilizando por
ejemplo diborano (B_{2}H_{6}) en tetrahidrofurano seguido de
peróxido de hidrógeno. Alternativamente, se puede generar y abrir un
epóxido mediante un método de reducción. Todos los procesos se
pueden llevar a cabo en un disolvente adecuado en un rango de
temperaturas de -78ºC a +25ºC, a presión normal o a presión elevada
hasta 3 bar.
Disolventes adecuados son, por ejemplo,
tetrahidrofurano, dietil éter, tert-butil metil éter
y disolventes asociados.
La oxidación en el proceso [D] se puede llevar a
cabo por métodos de deshidroxilación quiral o aquiral utilizando
permanganato de potasio (KMnO_{4}) o tetróxido de osmio
(OsO_{4}). En el caso de tetróxido de osmio, pueden resultar
suficientes cantidades catalíticas cuando se utilizan N-óxidos de
tert-amina, por ejemplo,
N-metilmorfolina-N-óxido u otros
oxidantes como ferricianuro de potasio (K_{3}FeCN_{6}). Todos
los procesos se pueden llevar a cabo en un disolvente adecuado, en
un rango de temperaturas de 0ºC a +100ºC, a presión normal o a
presión elevada hasta 3 bar.
Disolventes apropiados son alcoholes como etanol
o t-butanol, con cantidades adecuadas de agua
añadida.
La reacción con tioles en el proceso [F] se
puede llevar a cabo en presencia de una base tal como trietilamina o
diisopropiletilamina, en un disolvente apropiado, en un rango de
temperaturas de 0ºC a 50ºC, a presión normal.
Disolventes adecuados son por ejemplo,
tetrahidrofurano, diclorometano, dimetilformamida y disolventes
asociados.
Los compuestos de acuerdo con la invención
muestran un espectro de actividades imprevisible, farmacológico y
farmacocinético. Por tanto, son apropiados para su uso como
medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos en
humanos y animales.
Los compuestos de acuerdo con la invención,
debido a sus propiedades farmacológicas, son útiles solos o en
combinación con otros componentes activos para proporcionar un
tratamiento eficaz en procesos inflamatorios agudos y crónicos
tales como síndrome de shock tóxico, shock endotóxico, tuberculosis,
alergia, ateroesclerosis, artritis psoriásica, síndrome de Reiter,
gota, artritis traumática, artritis por rubeola y sinovitis aguda,
artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis,
artritis gotosa y otras condiciones artríticas, sepsis, shock
séptico, sepsis gram-negativa, malaria cerebral,
meningitis, derrame cerebral isquémico y hemorrágico,
neurotrauma/lesión en la cabeza abierta o cerrada, silicosis,
sarcososis pulmonar, enfermedad de resorción ósea, osteoporosis,
restenosis, lesión cardiaca, cerebral y renal por reperfusión,
trombosis, glomerulonefritis, insuficiencia renal crónica,
diabetes, retinopatía diabética, degeneración macular, reacción de
injerto con huésped, rechazo de aloinjertos, enfermedad
inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa,
enfermedad neurodegenerativa, degeneración muscular, enfermedad
angiogénica, eczema, dermatitis de contacto, psoriasis, quemaduras
solares, conjuntivitis, síndrome de distrés respiratorio en adulto
(ARDS), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación
de las vías aéreas, asma, fiebre, enfermedades periodontales,
piresis, enfermedades de Alzheimer y de Parkinson y dolor,
especialmente EPOC y asma.
Los compuestos de la presente invención son
útiles también para el tratamiento del cáncer, tal como cáncer de
ovario o cáncer de colon, crecimiento tumoral y metástasis,
trastornos autoinmunes, enfermedades cardiovasculares como
miocarditis, restenosis después de angioplastia, enfermedades
renales como lupus, enfermedad poliquística renal, infecciones
fungales, infección por virus, tal como VIH, infección bacteriana,
enfermedades dermatológicas como psoriasis, cicatrización anormal
de heridas, queloides, enfermedades inmunológicas como
autoinmunidad, hipersensibilidad aguda y retardada, enfermedad
injerto contra huésped, rechazo de transplantes y enfermedades
neuroinmunológicas como esclerosis múltiple y encefalomielitis aguda
diseminada.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una composición que contiene al menos un compuesto de
fórmula general (I) y un diluyente farmacológicamente aceptable, así
como a la utilización de dicha composición para el tratamiento de
procesos inflamatorios agudos y crónicos o cáncer y al proceso de
preparación de estas composiciones, caracterizada porque los
compuestos de fórmula general (I) junto con los productos auxiliares
habituales se llevan a una forma de aplicación apropiada. Por
tanto, los compuestos de fórmula general (I) sirven para la
preparación de medicamentos, especialmente medicamentos para el
tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos,
especialmente EPOC o cáncer.
Para el tratamiento de las enfermedades
mencionadas anteriormente, los compuestos de acuerdo con la
invención pueden mostrar actividad no sistémica o sistémica, siendo
preferente esta última. Para obtener actividad sistémica, los
compuestos activos se pueden administrar, entre otras vías, por vía
oral o parenteral, entre ellas es preferente la administración
oral. Para obtener actividad no sistémica, los compuestos activos se
pueden administrar, entre otras vías, por vía tópica.
Para la administración parenteral, las formas de
administración a membranas mucosas (es decir, bucal, lingual,
sublingual, rectal, nasal, pulmonar, conjuntival o intravaginal) o
dentro del cuerpo son particularmente apropiadas. La administración
se puede llevar a cabo evitando la absorción (es decir,
administración intracardíaca, intraarterial, intravenosa,
intraespinal o intralumbar) o incluyendo la absorción (es decir,
administración intracutánea, subcutánea, percutánea, intramuscular
o intraperitoneal).
Con el propósito mencionado anteriormente, los
compuestos activos se pueden administrar por sí o en formas de
administración.
Las formas de administración apropiadas para
administración oral son, entre otras, tabletas con recubrimiento
normal y entérico, cápsulas, tabletas recubiertas, píldoras,
gránulos, bolitas, polvos, aerosoles sólidos y líquidos, jarabes,
emulsiones, suspensiones y soluciones. Las formas de administración
adecuadas para administración parenteral son soluciones para
inyección e infusión.
El compuesto activo puede estar presente en las
formas de administración en concentraciones del 0,001 al 100% en
peso, la concentración del compuesto activo debe ser preferentemente
del 0,5 al 90% en peso, es decir, cantidades que sean suficientes
para permitir el rango específico de dosificación.
Los compuestos activos se pueden convertir de
manera conocida en las formas de administración mencionadas
anteriormente por medio de productos auxiliares inertes, no tóxicos,
farmacéuticamente adecuados, por ejemplo excipientes, disolventes,
vehículos, emulsionantes y/o dispersantes.
Se pueden mencionar por ejemplo los siguientes
productos auxiliares: agua, excipientes sólidos tales como
minerales naturales procedentes del suelo o sintéticos (por ejemplo,
talco o silicatos), azúcar (por ejemplo, lactosa), disolventes
orgánicos no tóxicos tales como parafinas, aceites vegetales (por
ejemplo, aceite de sésamo), alcoholes (por ejemplo, etanol,
glicerol), glicoles (por ejemplo, polietilenglicol), agentes
emulsionantes, dispersantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona) y
lubricantes (por ejemplo, sulfato de magnesio).
En caso de administración oral, las tabletas
pueden contener también por supuesto aditivos tales como citrato de
sodio así como aditivos como almidón, gelatina y similares. Se
pueden añadir también potenciadores del sabor o colorantes a las
preparaciones acuosas para administración oral.
Para obtener resultados efectivos en el caso de
la administración parenteral, se ha demostrado que generalmente era
ventajoso administrar cantidades de aproximadamente 0,001 a 100
mg/kg, preferentemente alrededor de 0,01 a 1 mg/kg de peso
corporal. En caso de administración oral, la cantidad es
aproximadamente de 0,01 a 100 mg/kg, preferentemente alrededor de
0,1 a 10 mg/kg de peso corporal.
A pesar de ello, puede resultar necesario en
ciertas circunstancias desviarse de las cantidades mencionadas, a
saber en función del peso corporal, vía de aplicación,
comportamiento individual hacia el componente activo, forma de
preparación y momento o intervalo en el que tiene lugar la
administración. Por ejemplo, puede resultar suficiente en algunos
casos utilizar menos cantidad que la cantidad mínima mencionada
anteriormente, mientras que en otros casos se tendrá que sobrepasar
el límite superior mencionado. En caso de aplicar cantidades
superiores, puede ser recomendable dividirlas en una pluralidad de
dosis individuales repartidas durante el día.
Los porcentajes en las pruebas y ejemplos que
siguen son, salvo que se estipule de otro modo, en peso; las partes
son en peso. Las proporciones de disolvente, proporciones de
dilución y concentraciones indicadas para soluciones
líquido-líquido se basan todas en el volumen.
Se utilizan en las descripciones las siguientes
abreviaturas:
- ACN
- acetonitrilo
- aq.
- acuoso
- Bn
- bencilo
- BOP
- benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfoniohexafluorofosfato
- DCI
- ionización química directa
- DCM
- diclorometano
- DMF
- N,N-dimetilformamida
- DMSO
- dimetilsulfóxido
- EDTA
- ácido etilendiamintetraacético
- ESI
- ionización por electropulverización
- FCS
- Suero de ternera fetal
- h
- hora/horas
- HPLC alta
- Cromatografía líquida de alta presión
- LC/MS
- Cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas
- min.
- minuto(s)
- pf
- punto de fusión
- MS
- Espectroscopía de masas
- NMR
- Espectroscopia de resonancia magnética nuclear
- PBS
- Solución salina tamponada con fosfato
- RP
- Fase reversa (HPLC)
- R_{t}
- Tiempo de retención (HPLC)
- rt
- Temperatura ambiente
- SDS
- Dodecil sulfato de sodio
- TFA
- Ácido trifluoroacético
- THF
- Tetrahidrofurano
- UV
- Ultravioleta
- UV/Vis
- Ultravioleta-visible
- % de th.
- % de rendimiento teórico
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos químicos se obtienen en su grado
analítico de Merck (Darmstadt, Alemania) o
Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania). Los
espectros de NMR se registran en DMSO-d_{6}
mediante la utilización de un espectrómetro Bruker DRX 500 (que
funciona a una frecuencia del protón de 500,13 MHz).
Los análisis HPLC-MS se realizan
por medio de un cromatógrafo líquido Agilent HP1100 con un
espectrómetro de masas LCT (Micromass, Manchester, R.U.) en el modo
de ionización positiva y negativa por electropulverización (ESI),
basándose en la ligera modificación de un método descrito
anteriormente (M. Stadler y col., Phytochemistry 2001, 56,
787-793). Se utiliza como fase estacionaria una
columna simétrica de Waters. Fase móvil A: un 0,1% de ácido fórmico
en agua; Fase móvil B: un 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo;
Gradiente: de 0-1 min hasta 100% A, de
1-6 min hasta 90% B, de 6-8 min
hasta 100% B, de 8-10 min hasta 100% B. Se registran
los espectros de LC-MS en el rango de pesos
moleculares situados entre 150 y 1,600.
Los análisis HPLC-UV/Vis se
llevan a cabo por analogía con M. Stadler y col., Mycol. Res., 2001,
105, 1190-1205 en una sistema de HPLC analítica de
la serie HP 1100 (Agilent, Waldbronn, Alemana) que comprende un
sistema de bombeo binario G 1312A, un detector de ordenación de
diodos G 1315A, un compartimento de columna G 1316A, un
desgasificador G 1322A y un autoinyector G 1313A. Como fase móvil,
se elige un 0,01% de ácido fosfórico:acetonitrilo, mientras que una
columna de Merck (Darmstadt, Alemania) Lichrospher RP 18 (125 x 4
mm, tamaño de partícula de 7 \mum) sirve de fase estacionaria. Se
analizan partes alícuotas de las muestras (que representan de 2 a
10 \mug de materiales solubles en metanol, de acuerdo con las
concentraciones de los principales metabolitos) a 40ºC con un
caudal de 1 ml/min, en el siguiente gradiente: lineal desde el 0% de
acetonitrilo hasta el 100% de acetonitrilo en 10 min, a
continuación condiciones isocráticas al 100% de acetonitrilo durante
5 min; que se siguen de la regeneración de la columna durante 5
min. Los cromatogramas de HPLC-UV se registran a 210
nm con una longitud de onda de referencia de 550 nm y un ancho de
banda de 80 nm. Se emplea la detección de ordenación de diodos
(DAD) para registrar los espectros de HPLC-UV/Vis en
el rango de 210-600 nm. El software HP ChemStation
cuenta con una búsqueda automatizada para compuestos estándar
calibrados en extractos crudos.
La HPLC preparativa se realiza a temperatura
ambiente en un sistema HPLC preparativo (Gilson Abimed, Ratingen,
Alemania), que comprende el software Gilson Unipoint, sistema de
bombeo binario 306, colector de fracciones 205, detector de 119
UV-Vis, módulo manométrico 806, y mezclador dinámico
811C, utilizando distintos gradientes y fases estacionarias tal
como se describe más abajo.
Los espectros NMR se registran en un Bruker
DMX500, que funciona a una frecuencia del protón de 500,13 MHz.
Todos los espectros se miden en una solución de
DMSO-d_{6} a 302 K. El pico de disolvente se
utiliza como referencia interna para ambos desplazamientos químicos
de protones y carbonos (\delta_{H}: 2,50, \delta_{C}:
39,5).
Medio de cultivo de
Levadura-Malta-Glucosa (YMG):
D-Glucosa: 0,4%; extracto de malta: 1%; extracto de
levadura: 0,4%; pH: 7,2.
Medio de cultivo Q6: D-glucosa:
0,4%; glicerol: 2%; torta de semilla de algodón: 1%; agua de grifo;
pH: 7,2.
Medio de cultivo C: D-glucosa:
1%; extracto de levadura: 1%; NZ amina (Sheffield Chemicals,
Sheffield, R.U., Lote ONA 20 2): 0,5%; almidón soluble: 2%; sin
ajuste de pH.
Medio de cultivo GS: D-glucosa:
2%; torta de soja desgrasada (Soyamin 50 T, Degussa, Düsseldorf,
Alemania): 2%; almidón soluble: 2%; carbonato de calcio: 0,5%;
cloruro de sodio: 0,25%; sulfato de magnesio: 0,05%,
dihidrogenofosfato de potasio: 0,025%; ajuste del pH a
6,5-6,8.
Medio de cultivo MC: D-glucosa:
1%; extracto de levadura: 0,5%, torta de soja desgrasada (Soyamin 50
T, Degussa, Düsseldorf, Alemania): 1%; almidón soluble: 1%; cloruro
de sodio: 0,5%; carbonato de calcio: 0,3%; ajuste del pH a 7,2 (0,1N
disolución de hidróxido de sodio).
Medio de cultivo MCPM: Diamant Malitzin hell
(Meistermarken GmbH, Bremen, Alemania): 4,5%, NZ amina (Sheffield
Chemicals, Sheffield, R.U., Lote ONA 202): 1%; cloruro de sodio:
0,3%; dihidrogenofosfato de sodio: 0,1%; sulfato de magnesio: 0,05%;
sulfato ferroso: 0,01%; pH: 6,8.
Medio de cultivo MS: Manitol: 2%; torta de soja
desgrasada (Soyamin 50 T, Degussa, Düsseldorf, Alemania): 2%;
carbonato de calcio: 0,3%; pH ajustado a 7,5.
Medio de cultivo SP: Manitol: 3%; extracto de
levadura: 0,75%; almidón soluble: 0,2%; peptona de soja (Merck,
Darmstadt, Alemania (# 107212.0500)): 0,5%; ajuste de pH a 6,0
(ácido clorhídrico).
La cepa JS360 se obtiene a partir de una muestra
de suelo recogida en Japón. Se mantiene en la colección de cultivos
de Bayer AG (Wuppertal, Alemania) en un 10% de glicerol bajo
nitrógeno líquido. También ha sido depositada en DSMZ (Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Alemania), a 27 de noviembre
de 2002 bajo el número de designación DSM 15324.
\vskip1.000000\baselineskip
Las características morfológicas, culturales y
fisiológicas de la cepa JS360 indican que la cepa constituye un
especie no descrita del género Streptomyces.
\vskip1.000000\baselineskip
En el medio YMG, colonias únicas de la cepa
JS360 alcanzan un diámetro de 25 mm después de la incubación durante
12 días a 28ºC. Las colonias desarrollan un micelio blanco,
algodonoso, aéreo, mientras que el micelio del sustrato es de color
cremoso. El reverso del cultivo es marrón rojizo, y se libera en el
medio un pigmento rojizo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevan a cabo comparaciones de las secuencias
de 16S rADN (SEQ ID NO: 1) para caracterizar además la cepa JS360 en
su posición taxonómica. Por tanto, la extracción y secuenciación del
ADN de la parte principal del gen 16S rARN se amplifican de forma
analógica a Mincer TJ, Jensen PR, Kaufmann CA, Fenical W. 2002.
Appl. Environ. Microbiology 60 (10) 5005-5011, PCR
que utiliza los cebadores 41f y 1486r-P (no
publicado), aplicando un perfil térmico estándar con una temperatura
de alineamiento de 50ºC. Los productos de amplificación se purifican
mediante perlas paramagnéticas de unión de ADN (Mag Prep PCR Clean
Up Kit, Tecan Schweiz AG; Hombrechtikon, Suiza) utilizando el
protocolo suministrado por el fabricante.
Se obtienen secuencias de nucleótidos mediante
secuenciación por ciclos utilizando el Kit de Secuenciación por
Ciclos mediante Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator (Amersham
Biosciences), cebador 41f, y el Analizador Genético
LI-COR 4200 (LI-COR Inc. Lincoln,
Nebraska, USA). Una búsqueda de secuencias similares a las
determinadas y los alineamientos asociados a las mejores
coincidencias se obtienen por FASTA tal como es proporcionado como
servicio en línea por el European Bioinformatics Institute (EBI)
(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/). Las secuencias que muestran las
mejores coincidencias se obtienen a partir de la base de datos que
se debe utilizar como entrada para el módulo MegAlign del software
LASERGENE (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, USA). Se toman en
consideración también las secuencias de Salinospora sp.
publicadas por Mincer y col., Appl. Environm. Microbiol., 2002, 68,
5005-5011.
Para la comparación se utilizan las siguientes
secuencias de nucleótidos:
Se obtienen aproximadamente 240 bases de
secuencia a partir de la cepa JS360 (Fig. 5). La secuencia se
utiliza como entrada FASTA para buscar secuencias similares en la
base de datos EMBL. Se descubre que la secuencia está estrechamente
relacionada con las secuencias de rARN 16S de elementos de
Streptomyces. Entre las tres mejores coincidencias se
encuentran dos aislados sin nombre de Streptomyces
procedentes del suelo y de un gusano, respectivamente, y un aislado
de Streptomyces cinnabarinus. La similitud entre estas tres
secuencias y la secuencia obtenida de JS360 se sitúa en el rango del
91%. No se encuentra ninguna secuencia idéntica en la base de
datos. Se lleva a cabo un alineamiento (método clustal) incluyendo
la secuencia de JS360 y tres de las secuencias más similares, así
como seis secuencias de la especie Salinospora. A partir del
alineamiento se elabora un dendograma para demostrar la relación
filogenética. Se encuentra una clara distinción entre
Salinospora sp. y el grupo que incluye JS360 (Fig. 6). Los
resultados revelan que JS360 es claramente distinto de
Salinospora spp. La cepa pertenece al género
Streptomyces según se concluye del alineamiento de su
secuencia parcial de rADN 16S.
Se utilizan dos ml de un cultivo con glicerol al
10% para inocular 11 frascos Erlenmeyer que contienen 150 ml de
medio YMG estéril y se propagan en un agitador rotativo a 28ºC y 240
r.p.m. durante 72-96 horas.
Después de la inoculación a partir del cultivo
de siembra YMG bien desarrollado (2 ml de inóculo por frasco), la
cepa JS360 se propaga en diez frascos 11 Erlenmeyer que contienen
150 ml de medio Q6 (véase más arriba) y se propaga en una agitador
rotativo a 28ºC y 240 r.p.m. durante 118 horas. Durante la
fermentación se toman muestras diariamente. Se determina el pH y se
evalúa la glucosa libre mediante Bayer Diastix Harnzuckerstreifren.
El micelio húmedo se separa del fluido por centrifugación (10 min a
3.000xg) y se extrae con 2 l de acetona. La acetona se evapora al
vacío (40ºC). El residuo acuoso restante se diluye con agua hasta
500 ml y se extrae tres veces con cantidades iguales de acetato de
etilo. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de
sodio y se evaporan al vacío (40ºC) para producir 830 mg de extracto
crudo, que se somete a continuación a HPLC preparativa tal como se
describe más abajo (aislamiento).
El fluido de cultivo se aplica sobre una columna
de adsorción que contiene 500 ml de resina Bayer Lewapol CA 9225 y
se enjuaga con 1 l de agua. La columna se eluye con 1,5 l de
acetona:metanol 4:1. El disolvente se evapora al vacío (40ºC). El
residuo acuoso restante se diluye con agua hasta 500 ml y se extrae
tres veces con cantidades iguales de acetato de etilo. Las fases
orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan
al vacío (40ºC) para producir 650 mg de extracto crudo, que se
somete después a HPLC preparativa tal como se describe a
continuación (aislamiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Un fermentador Biostat P de 40 l (Braun
Bioengineering, Melsungen, Alemania) que contiene 30 l del medio Q6
se esteriliza in situ (1 h a 121ºC y 1,1 bar) y se inocula
con dos cultivos de siembra YMG bien desarrollados de 150 ml que
han sido propagados durante 76 horas. El cultivo de producción se
desarrolla bajo agitación (240 r.p.m.) y aireación (0,3 vvm). Se
determina el pH y se evalúa la glucosa libre utilizando Diastix
Harnzuckerstreifen. Además, el fermentador está provisto de un
electrodo de oxígeno Braun para determinar la saturación de oxígeno
del caldo de cultivo. La HPLC analítica de los extractos crudos
preparados a partir de muestras de 50 ml tomadas en condiciones
estériles y extraídas con cantidades iguales de acetato de etilo
sirven de medio de detección para el Ejemplo 1. Los Ejemplos 2 a 5
y 7 son detectados también durante la fermentación por
HPLC-MS, pero no se pueden evaluar en los extractos
crudos nativos debido a las cantidades limitadas y a la coelución de
otros metabolitos con tiempos de retención similares en el sistema
de HPLC empleado. Los extractos de acetato de etilo se secan sobre
sulfato de sodio, se evaporan a sequedad, se vuelven a disolver en
metanol y se analizan utilizando los sistemas de
HPLC-UV descritos en los Procedimientos
Experimentales Generales. Se describe en la Fig. 1 el lapso de
tiempo típico de la fermentación de JS360 en 30 l de medio Q6.
Aunque el cultivo está totalmente saturado según se deduce de los
valores de saturación de oxígeno, el pH cae a valores de aprox.
4,5. Después de que la glucosa libre en el medio se haya consumido,
la producción del Ejemplo 1, según es estimada por la metodología
de HPLC analítica, empieza aproximadamente a las 60 horas de la
fermentación y alcanza un punto óptimo después de 114 horas.
Entonces se cosecha el cultivo, debido a que se observa degradación
en etapas posteriores del Ejemplo 1. Después de la cosecha del
cultivo, el fluido se separa del micelio por centrifugación (10 min
a 3.000xg) y se aplica sobre una columna llena de resina de
adsorción Bayer Lewapol CA 9225 y se enjuaga con 5 l de agua. A
continuación, se eluye la columna con 6 l de acetona:metanol 4:1.
Los eluatos se evaporan al vacío (40ºC) para producir un residuo
acuoso, que se diluye hasta 1 l con agua y se extrae tres veces con
1 l de acetato de etilo. Se combinan las fases orgánicas, se secan
sobre sulfato de sodio y se evaporan al vacío (40ºC). El extracto
resultante (22,7 g) se somete a continuación a HPLC preparativa tal
como se describe más abajo (aislamiento).
El micelio se extrae tres veces con 5 l de
acetona cada vez y la acetona se evapora al vacío (40ºC) para
producir un residuo acuoso, que se diluye hasta 1 l con agua y se
extrae tres veces con 1 l de acetato de etilo. Se combinan las
fases orgánicas, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan al
vacío (40ºC). El extracto resultante (13,4 g) se somete a
continuación a HPLC preparativa tal como se describe más abajo
(aislamiento).
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La cepa JS360 se propaga en varios otros medios
de cultivo en intentos de optimizar la producción del Ejemplo 1 y
de metabolitos químicamente asociados. Con este propósito, se llevan
a cabo fermentaciones en matraces oscilantes de forma similar a la
que se describe para la fermentación en el medio Q6 (véase 2 más
arriba). Frascos de Erlenmeyer de 1 l que contienen 150 ml de los
medios se propagan entonces en un agitador rotativo a 28ºC y 240
r.p.m. durante 118 horas. Durante la fermentación, se toman muestras
diariamente. Se determina el pH y se evalúa la glucosa libre
utilizando Bayer Diastix Harnzuckerstreifen. Partes alícuotas del
caldo de cultivo (50 ml) se extraen con acetato de etilo. Estos
extractos de acetato de etilo se secan sobre sulfato de sodio, se
evaporan a sequedad, se vuelven a disolver en metanol y se analizan
por medio de los sistemas HPLC-UV y
HPLC-MS descritos en los Procedimientos
Experimentales Generales. Al comparar los tiempos de retención y
los espectros, se detectan el Ejemplo 1 y compuestos asociados en
los siguientes medios de cultivo: medio YM, medio C, medio GS,
medio MC, medio MCPM, medio MS, y medio SP después de
72-96 horas de fermentación. Sin embargo, se
observan las más altas producciones del Ejemplo 1 en los medios Q6 y
GS.
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Preparación: véase más abajo.
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Preparación: véase más abajo.
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Preparación: véase más abajo.
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Preparación: véase más abajo.
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Preparación: véase más abajo.
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Preparación: véase más abajo.
Preparación: véase más abajo.
La estereoquímica de los Ejemplos 2 a 7 se
extrae por analogía con la estructura del Ejemplo 1 que se determina
por medio de análisis de rayos X.
Los extractos crudos (620 mg procedentes del
micelio y 830 mg procedentes del fluido de cultivo, respectivamente)
se disolvieron en 5 ml de metanol, se filtraron a través de un
cartucho de extracción en fase sólida de 500 mg de Bond Elut C18
(Baker, Deventer, Holanda) y se aplicaron sobre una columna Kromasil
RP 18 de MZ Analysentechnik (Mainz, Alemania) (tamaño de partícula,
7 \mum; 250 x 40 mm). Como fase móvil se emplea un gradiente del
0,01% de TFA:acetonitrilo a un caudal de 10 ml/min:20% de
acetonitrilo a t = 0 min; gradiente lineal: del 20% al 50% de
acetonitrilo en 40 min; a continuación el gradiente lineal del 50%
al 100% de acetonitrilo en 20 min; después en condiciones
isocráticas a un 75% de acetonitrilo durante 30 min, luego
regeneración de la columna. Se combinan las fracciones de acuerdo
con la adsorción UV a 210 nm. El Ejemplo 1 se eluye a un tiempo de
retención (R_{t}) de 80-83 min, y se obtienen
cantidades de 14 mg del extracto de micelio y 1,5 mg del extracto
de fluido de cultivo, respectivamente. Los Ejemplos 2 a 5 y 7 se
localizan en fracciones intermedias menores y no se aíslan de este
extracto hasta la pureza, mientras que el Ejemplo 6 no se detecta en
absoluto.
Partes alícuotas de 2,5-3 gramos
de extractos crudos que se preparan tal como se describe
anteriormente (13,4 g procedentes del micelio, 22,7 g procedentes
del fluido de cultivo) se disuelven en 5 ml de metanol, se filtran
a través de un cartucho de extracción en fase sólida de 500 mg de
Bond Elut C18 (Baker, Deventer, Holanda) y se aplican sobre una
columna Kromasil RP 18 de MZ Analysentechnik (Mainz, Alemania)
(tamaño de partícula, 7 \mum; 250 x 40 mm; fase móvil: 0,01% de
TFA:acetonitrilo). Como fase móvil, se emplea un gradiente del
0,01% de TFA:acetonitrilo a un caudal de 10 ml/min:20% de
acetonitrilo a t = 0 min; gradiente lineal: del 20% al 50% de
acetonitrilo en 40 min; a continuación el gradiente lineal del 50%
al 100% de acetonitrilo en 20 min; después en condiciones
isocráticas a un 75% de acetonitrilo durante 30 min, luego
regeneración de la columna. Se combinan las fracciones de acuerdo
con la adsorción UV a 210 nm. Se obtienen así cinco productos
intermedios bioactivos. Se observan sus tiempos de retención
(R_{t}) en este sistema de gradientes como sigue:
61-64 min para el producto intermedio 1 (que
contiene los Ejemplos 4 y 7), 65-71 min para el
producto intermedio 2 (que contiene los Ejemplos 5 y 6),
72-79 min para el producto intermedio 3 (que
contiene el Ejemplo 2), 79-85 min para el producto
intermedio 4 (que contiene el Ejemplo 1) y 86-93 min
para el producto intermedio 5 (que contiene el Ejemplo 3).
La purificación final de los componentes activos
de los productos intermedios 1 a 5 se obtiene mediante HPLC
preparativa de fase inversa, utilizando un caudal de 7 ml/min, y una
columna Inertsil C18 de MZ Analysentechnik (7 \mum; 250 x 30mm)
como fase estacionaria y el siguiente gradiente. Condiciones
isocráticas de t = 0 min => 30 min; a continuación el gradiente
lineal del 30% de acetonitrilo => 100% de acetonitrilo en 50
min, después condiciones isocráticas (100% de acetonitrilo) durante
20 min, luego regeneración de la columna. En la Tabla 1 se resumen
las producciones y los R_{t} de los Ejemplos 1 a 6. Se ilustra en
la Fig. 2 un esquema general para el aislamiento.
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Los Ejemplos 1 a 6 se detectan mediante
HPLC-UV y HPLC-MS por medio de los
métodos descritos en los Procedimientos Experimentales Generales.
Sus características en los sistemas analíticos por HPLC se resumen
en la Tabla 2. La detección del Ejemplo 1 en los gradientes
empleados se ilustra en la Fig. 3. Mientras los Ejemplos 1, 2, 4 y
7 producen resultados concluyentes con respecto a sus picos
moleculares, la LC-MS del Ejemplo 3 sólo revela el
pico molecular en el modo ESI positivo, mientras que, debido a la
pérdida de dióxido de carbono en el modo ESI negativo, se observa
un fragmento más pequeño de alta masa. En los Ejemplos 5 y 6 se
forman fácilmente dímeros en las condiciones de empleo de
HPLC-MS, y la mayor señal de LC-MS
se refiere por tanto a estos dímeros, mientras que los picos
moleculares sólo constituyen señales menores. Estas características
sirven también para identificar los ejemplos mediante HPLC
analítica en caldos de fermentación y fracciones intermedias
obtenidas durante la extracción, mediante procesamiento aguas abajo
y cromatografía.
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Las estructuras de los Ejemplos 1 a 7 se
determinan mediante espectrometría LC-MS de baja
resolución y alta resolución y mediante espectroscopía NMR
(resonancia magnética nuclear) en una y dos dimensiones. Para los
parámetros instrumentales, véase los Procedimientos Experimentales
Generales.
Los datos de la NMR revelan la presencia de un
doble enlace cis dentro de un anillo ciclohexilo. El análisis
detallado de los datos de HSQC, HMBC y COSY/TOCSY permite
establecer la estructura de anillo bicíclico que, junto con la
porción ciclohexenilcarbinol, es idéntica a la que se encuentra en
Salinosporamida A. Los datos de HSQC señalan la presencia de
al menos dos grupos metilo en cada molécula. Junto con TOCSY y HMBC,
se identifica una porción hexilo no ramificada. Un pico cruzado
inequívoco en el espectro COSY localiza esta cadena en la posición
2 del sistema de anillo heterocíclico. El Ejemplo 7 (en comparación
con el Ejemplo 1) y el Ejemplo 4 (en comparación con el Ejemplo 2)
revelan mediante los datos de NMR y MS que constituyen las
seco-formas respectivas de las moléculas
beta-lactona correspondientes. La presencia de un
grupo hidroxilo adicional (en comparación con Salinosporamida A) en
la posición 12 (Ejemplos 2 y 4) se evidencia debido a la
multiplicidad y a los desplazamientos químicos característicos de
carbonos y protones.
Los espectros NMR de los Ejemplos 5 y 6 muestran
un nuevo subconjunto completo de señales que pertenecen a una
porción de cisteína N-acilada. La
N-acetilcisteína está enlazada a la estructura de
anillo heterocíclico a través del grupo carbonilo del anillo
beta-lactona anterior, o el grupo carboxilo del
Ejemplo 7, respectivamente. El enlace tioéster se identifica
mediante su desplazamiento químico de carbonilo (>200 ppm) y la
conectividad derivada de HMBC a los hidrógenos-beta
de cisteína. Todas las conectividades dentro del residuo de cisteína
se estabilizan mediante la asignación de las señales
correspondientes en los espectros de HMBC y COSY. Por tanto, las
estructuras de los Ejemplos 5 y 6 son análogas a las de la
lactacistina.
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^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (t), 1,28 (m), 1,29
(m), 1,23 (m), 1,40 (m), 1,45 (m), 1,47 (m), 1,54 (m), 1,58 (m),
1,68 (m), 1,74 (s), 1,80 (m), 1,90 (m), 2,29 (m), 2,41 (t), 3,65
(m), 5,47 (m), 5,73 (m), 5,81 (m), 8,92 (s).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,8; 21,7; 21,8; 24,2;
25,2; 26,1; 26,8; 28,5; 30,8; 37,3; 47,5; 69,3; 78,4; 86,4; 127,8;
128,6; 169,1; 174,1.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,88 (t), 1,27 (m), 1,29
(m), 1,35 (s) 1,37 (m), 1,49 (m), 1,58 (m), 1,59 (m), 1,71 (m), 1,75
(m), 1,93 (m), 2,35 (d), 2,76 (m), 3,49 (m), 4,00 (d), 4,68 (m),
5,70 (m), 5,91 (m), 6,11 (ancho), 8,52 (s).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,4; 21,0; 21,4; 23,7;
24,2; 29,6; 30,1; 31,5; 36,1; 54,6; 69,4; 75,0; 76,0; 76,5; 127,9;
170,9; 172,3.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,88 (t), 1,27 (m), 1,30
(m), 1,31 (m), 1,33 (m), 1,46 (m), 1,48 (m), 1,50 (m), 1,61 (s),
1,62 (m), 1,63 (m), 1,76 (m), 1,92 (m), 2,27 (m), 2,55 (t), 5,45
(m), 5,68 (m), 8,98 (s).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,3; 19,6; 21,4; 24,0;
24,2; 26,5; 28,2; 28,5; 29,9; 30,9; 32,5; 46,7; 74,0; 86,1; 127,7;
130,9; 170,4; 170,8.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,82 (m), 1,17 (m), 1,20
(m), 1,24 (m), 1,32 (m), 1,47 (m), 1,60 (m), 1,62 (m), 1,63 (m),
1,84 (m), 2,08 (m), 2,44 (d), 3,68 (m), 3,80 (m), 5,60 (m), 5,76
(m).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,1; 20,1; 20,6; 21,0;
23,5; 23,6; 30,5; 33,5; 37,7; 52,7; 67,1; 73,6; 75,2; 80,1; 126,3;
128,6; 171,2; 176,5.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (m), 1,09 (m), 1,24
(m), 1,25 (m), 1,27 (m), 1,33 (m), 1,35 (m), 1,37 (m), 1,44 (m),
1,46 (m), 1,50 (m), 1,61 (m), 1,64 (m), 1,84 (s), 1,87 (m), 2,13
(m), 2,47 (t), 2,96 (m), 3,30 (m) 3,78 (m), 4,36 (m), 5,64 (m), 5,79
(m).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,9; 20,8; 21,7; 22,0;
22,1; 22,2; 23,4; 24,3; 26,8; 27,7; 28,7; 29,2; 31,1; 38,1; 50,3;
51,0; 75,3; 79,7; 80,6; 127,0; 129,3; 169,3; 178,9; 201,2.
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (m), 1,09 (m), 1,24
(m), 1,25 (m), 1,27 (m), 1,33 (m), 1,35 (m), 1,37 (m), 1,44 (m),
1,46 (m), 1,50 (m), 1,61 (m), 1,64 (m), 1,84 (s), 1,87 (m), 2,13
(m), 2,47 (t), 3,00 (m), 3,24 (m), 3,64 (s), 3,78 (m), 4,39 (m),
5,64 (m), 5,79 (m).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,6; 20,8; 21,7; 22,0;
22,1; 23,4; 24,3; 26,8; 27,7; 28,7; 29,3; 31,1; 38,1; 50,3; 51,4;
51,8; 75,3; 79,7; 80,6; 127,0; 129,3; 169,3; 171,0; 178,9;
201,2.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (t), 1,25 (m), 1,26
(m), 1,33 (m), 1,34 (m), 1,36 (m), 1,44 (m), 1,46 (s), 1,51 (m),
1,66 (m), 1,67 (m), 1,88 (m), 2,12 (m), 2,45 (t), 3,77 (d), 5,64
(m), 5,82 (m), 7,66 (s).
^{13}C-NMR
(DMSO-d_{6}): \delta = 13,8; 20,3; 21,5; 21,7,
23,3; 24,4; 26,5; 27,9; 28,9; 31,0; 38,5; 50,5; 74,6; 75,5; 80,4;
127,4; 129,7; 177,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1: R^{1} = H, R^{2} = OH;
Ejemplo 2: R^{1} = OH, R^{2} = OH, Ejemplo 3:
R^{1} = H, R^{2} = H.
Ejemplo 4: Ejemplo 5:
R^{8} = H, Ejemplo 6: R^{8} = CH_{3}, Ejemplo 7
(no se ha determinado la estereoquímica por
NMR).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Ejemplo 1: ESI-; Masa encontrada: 334,1977, calculada: 334,2014 (correspondiente a una desviación de 4,1 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{28}NO_{4}).
- \quad
- Ejemplo 2: ESI-; Masa encontrada: 350,1968, calculada: 350,1967 (correspondiente a una desviación de 0,1 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{28}NO_{5}).
- \quad
- Ejemplo 3: ESI+; Masa encontrada: 276,2327, calculada: 276,2327 (correspondiente a una desviación de 6,1 mDa para la fórmula molecular C_{18}H_{30}NO). Aquí, sólo se pudo observar el fragmento (M - CO_{2}) en condiciones de ESI.
- \quad
- Ejemplo 4: ESI+; Masa encontrada: 368,2107, calculada: 368,2073 (correspondiente a una desviación de 3,3 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{31}NO_{6}).
- \quad
- Ejemplo 5: ESI-; Masa encontrada: 497,2322, calculada: 497,2321 (correspondiente a una desviación de 0,0 mDa para la fórmula molecular C_{24}H_{38}N_{2}O_{7}S).
- \quad
- Ejemplo 6: ESI-; Masa encontrada: 511,2594, calculada: 511,2478 (correspondiente a una desviación de 11,6 mDa para la fórmula molecular C_{25}H_{40}N_{2}O_{7}S).
- \quad
- Ejemplo 7: ESI+; Masa encontrada: 354,2268, calculada: 354,2280 (correspondiente a una desviación de 1,3 mDa para la fórmula molecular C_{19}H_{32}NO_{5}).
\newpage
Varios cristales del Ejemplo 1 se cristalizan
mediante evaporación lenta de unadi solución saturada de
propanol/alcohol diacetílico 97:3 a 46ºC. Se recoge un conjunto
completo de datos de un cristal adecuado con dimensiones 0,30 x
0,20 x 0,03 mm^{3} a -183,5ºC utilizando radiación Cu_{\kappa
\alpha} como fuente de rayos X. Se obtiene una propuesta de
estructura en una célula ortorrómbica por medio del grupo en el
espacio quiral P2_{1}2_{1}2_{1} (véase la Fig. 7). La
célula cristalina tiene ejes extremadamente grandes y contiene 12
moléculas independientes del Ejemplo1 con quiralidad idéntica. Todas
las moléculas muestran distintas conformaciones. Las moléculas están
empaquetadas en capas polares y no polares (véase la Fig. 8). Las
capas polares simples están conectadas de forma bidimensional a lo
largo de enlaces de hidrógeno. La configuración absoluta del Ejemplo
1 se determina por tanto como R(C2); S(C4);
R(CS); S(C6); S(C7) obteniendo un Parámetro
Flack de 0,0 con una desviación estándar de 0,2 (H.-D. Flack, Acta
Cryst., 1983, A39, 876-881). Los valores esperados
son de 0 (dentro de 3 esd) para una estructura correcta y de +1 para
una estructura inversa absoluta.
Recogida de datos para el análisis por rayos
X: Las mediciones se realizan en un difractómetro
Bruker-Nonius provisto de un detector de área
Proteum CCD, un ánodo rotativo FR591 con radiación Cu_{\kappa
\alpha}, espejos Montel como monocromador y un dispositivo a baja
temperatura Kryoflex (T = 90 K). Las mediciones se realizan en el
rango de 4,69 a 54,33º. Se recogen 205.845 reflexiones de las cuales
26.995 son únicas (R_{int} = 0,1073). Recogida de datos de esfera
completa \omega y barridos \varphi. Programas usados: Recogida
de datos Proteum V. 1.37 (Bruker-Nonius 2002),
recogida de datos Saint Plus Version 1.6
(Bruker-Nonius 2002) y corrección de absorción
SADABS V. 2.03 (2002).
Solución y refinamiento de la estructura:
SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick 2000, Universidad de Goettingen,
Alemania); 21119 Fo > 4sig(Fo), 2629 parámetros refinados,
R_{1} = 0,0796, wR2 = 0,1892, Bondad de ajuste en
F^{2} = 1,083, parámetro de Flack 0,0 (2), densidad electrónica residual máxima 0,464 (-0,314) e \ring{A}^{3}.
F^{2} = 1,083, parámetro de Flack 0,0 (2), densidad electrónica residual máxima 0,464 (-0,314) e \ring{A}^{3}.
Datos sobre los cristales:
C_{19}H_{29}N_{1}O_{4} x 12, M_{r} = 335,26 (4023,17);
ortorrómbicos; grupo espacial P2_{1}2_{1}2_{1},
a = 13,0624(2) \ring{A}, b = 29,0543(5) \ring{A}, c = 58,4559(11) \ring{A}, V = 22178,2(7) \ring{A}^{3}, Z = 4, \rho_{cal} = 1,205 Mg/m^{3}, \mu = 0,674 mm^{-1}.
a = 13,0624(2) \ring{A}, b = 29,0543(5) \ring{A}, c = 58,4559(11) \ring{A}, V = 22178,2(7) \ring{A}^{3}, Z = 4, \rho_{cal} = 1,205 Mg/m^{3}, \mu = 0,674 mm^{-1}.
Cromatografía Líquida - Espectroscopia de Masas
(LC-MS): Plataforma de Micromasas LC con columna de
Shimadzu Phenomenex ODS (4,6 mm \diameter x 30 mm) descargando una
mezcla de acetonitro-agua (9:1 a 1:9) a 1 ml/min de
caudal. Se obtuvieron espectros de masas por medio de técnicas de
ionización por electropulverización (ES).
Determinación de la masa: Finnigan MAT
MAT95.
Los puntos de fusión no están corregidos.
Se registraron los espectros de
^{1}H-NMR en un espectrómetro Bruker
DRX-300 (300 MHz para ^{1}H) o Brucker 500
UltraShieled^{TM} (500 MHz para 1H). Los desplazamientos químicos
se registran en partes por millón (ppm) con tetrametilsilano (TMS)
como estándar interno a cero ppm. Las constantes de acoplamiento (J)
se dan en hertz y las abreviaturas s, d, t, q, m y br se refiere a
singlete, doblete, triplete, cuadruplete, multiplete y ancho,
respectivamente.
Se realizó una TLC en una placa de gel de sílice
pre-recubierta (Merck silica gel 60
F-254). Se utilizó gel de sílice
(WAKO-gel C-200
(75-150 \mum)) para todas las separaciones de
cromatografía en columna. Todos los productos químicos fueron de
grado reactivo y se compraron a Sigma-Aldrich, Wako
Pure Chemical Industries, Ltd., Gran Bretaña, Tokyo Kasei Kogyo
Co., Ltd., Nacalai Tesque Inc., Watanabe Chemical Ind. Ltd.,
Maybridge Pic, Lancaster Synthesis Ltd., Merck KgaA, Alemania, o
Kanto Chemical Co., Ltd.
Todos los materiales de partida están
comercialmente disponibles o se pueden preparar por medio de métodos
citados en la documentación.
A una solución de ácido
2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carboxílico
(Ejemplo 7) (130 mg, 0,37 mmol) en diclorometano (10 ml) se añadió
trietilamina (0,15 ml, 1,1 mmol) y BOPCI (140 mg, 0,55 mmol) a rt.
Después de agitación durante 1 hora, se añadió una disolución
saturada de bicarbonato de sodio (20 ml) y después se extrajo la
capa orgánica con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó
sobre sulfato de magnesio. Después de concentración, se purificó el
residuo mediante cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo
= 3/1-1/1) para producir el producto (98 mg,
79%).
Pf: 157ºC
LCMS (método de 4 min): R_{t} = 2,56 min, m/z
= 336 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J =
7,0 Hz), 1,10-1,70 (13H, m), 1,74 (3H, s), 1,82 (1H,
m), 1,92 (2H, m), 2,29 (1H, m); 2,41 (1H, d, J = 5,8 Hz),
3,66 (1H, t, J = 8,9 Hz), 5,49 (1H, d, J = 7,9 Hz),
5,70 (1H, m), 5,80 (1H, d, J = 11,5 Hz), 8,91 (1H, s).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido
2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carboxílico
(Ejemplo 4) (239 mg, 0,65 mmol) en diclorometano (14 ml) se añadió
trietilamina (0,27 ml, 1,9 mmol) y BOPCI (247 mg, 0,97 mmol) a rt.
Después de agitación durante 1 hora, se añadió una disolución
saturada de bicarbonato de sodio (20 ml) y después se extrajo la
capa orgánica con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó
sobre sulfato de magnesio. Después de concentración, se purificó el
residuo mediante cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo
= 3/1-1/1) para producir el producto (92 mg,
40%).
Pf: 144ºC
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,55 min.,
m/z = 352 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J =
7,0 Hz), 1,17-1,33 (6H, m),
1,46-1,52 (3H, m), 1,77 (3H, s),
1,54-1,86 (3H, m), 1,92 (2H, m); 2,29 (1H, m), 2,57
(1H, d, J = 5,7 Hz), 3,65 (1H, t, J = 8,8 Hz), 3,92
(1H, m), 4,77 (1H, d, J = 3,8 Hz), 5,48 (1H, d, J =
7,9 Hz), 5,72 (1H, m), 5,80 (1H, d, J = 10,4 Hz), 9,07 (1H,
s).
A una suspensión de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (100 mg, 0,3 mmol) y un 10% de Pd/C (5 mg) en
diclorometano (2 ml) se cargó cuidadosamente hidrógeno. Después de
su agitación a rt durante 3 horas, se eliminó el catalizador
mediante filtración. Se purificó el residuo mediante cromatografía
en columna (hexano/acetato de etilo = 4/1) para producir el producto
(50 mg, 50%).
Pf: 167ºC
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,73 min.,
m/z = 338 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J =
6,9 Hz), 0,90-1,35 (12H, m), 1,73 (3H, s),
1,40-1,86 (9H, m), 2,40 (1H, t, J = 7,6 Hz),
3,67 (1H, t, J = 7,9 Hz), 5,23 (1H, d, J = 7,9 Hz),
8,85 (1H, s).
Una mezcla de
(1R,4R,5S)-1-[(1S)-ciclohex-2-en-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]
heptan-3,7-diona (Ejemplo 1) (8,30 mg, 0,025 mmol) y anhídrido acético (2,78 mg, 0,027 mmol) en piridina (0,002 ml) se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla se diluyó con tolueno y se concentró a presión reducida para producir (1S)-ciclohex-2-en-1-il[(1R,4R,5S)-4-hexil-5-metil-3,7-dioxo-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]hept-1-il]-metil-acetato (9,00 mg, 96%).
heptan-3,7-diona (Ejemplo 1) (8,30 mg, 0,025 mmol) y anhídrido acético (2,78 mg, 0,027 mmol) en piridina (0,002 ml) se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla se diluyó con tolueno y se concentró a presión reducida para producir (1S)-ciclohex-2-en-1-il[(1R,4R,5S)-4-hexil-5-metil-3,7-dioxo-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]hept-1-il]-metil-acetato (9,00 mg, 96%).
MS: m/z = 378 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J =
7,0 Hz), 1,22-1,34 (6H, m),
1,40-1,85 (8H, m), 1,70 (3H, s),
1,85-2,02 (3H, m), 2,07 (3H, s), 2,67 (1H, dd,
J = 8,0, 5,5 Hz), 5,19 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,41 (1H,
dd, J = 10,5, 2,1 Hz), 5,74 (1H, m), 8,17 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (37 \mul, 0,27 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo (0,1 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (25 mg, 61%).
(Ejemplo 1) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (37 \mul, 0,27 mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo (0,1 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (25 mg, 61%).
Pf: 138ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,92 min.,
m/z = 460 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
6,9 Hz), 0,98 (1H, m), 1,46 (3H, s), 1,12-1,58 (13H,
m), 1,81 (2H, m), 2,07 (1H, m), 2,43 (1H, m), 3,79 (1H, t, J
= 6,5 Hz), 4,00 (1H, d, J = 13,8 Hz), 4,09 (1H, d, J =
13,8 Hz), 4,84 (1H, s), 5,00 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,60 (1H,
m), 5,76 (1H, d, J = 12,0 Hz), 7,18-7,32 (5H,
m), 8,14 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,27 mmol) en diclorometano (1 ml), se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 1 hora, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (10 mg, 37%).
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,27 mmol) en diclorometano (1 ml), se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 1 hora, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (10 mg, 37%).
Pf: 82ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,38 min.,
m/z = 455 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
6,8 Hz), 1,09 (1H, m), 1,44 (3H, s), 1,19-1,55
(11H, m), 1,62 (2H, m), 1,79 (3H, m), 1,85 (2H, m), 2,13 (1H, m),
2,44 (1H, m), 2,82 (2H, m), 3,13 (2H, m), 3,79 (1H, t, J =
7,0 Hz), 4,76 (1H, s), 5,02 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,63 (1H,
m), 5,79 (1H, d, J = 10,1 Hz), 7,93 (1H, m), 8,18 (1H,
s).
A una solución de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (10 mg, 37%).
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (10 mg, 37%).
Pf: 64ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,64 min.,
m/z = 456 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
6,9 Hz), 1,09 (1H, m), 1,43 (3H, s), 1,15-1,54
(11H, m), 1,61 (2H, m), 1,86 (2H, m), 2,12 (1H, m), 2,44 (1H, t,
J = 5,9 Hz), 2,56 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,95 (2H, t,
J = 7,1 Hz), 3,60 (3H, s), 3,77 (1H, t, J = 7,1 Hz),
4,76 (1H, s), 5,01 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,63 (1H, m), 5,78
(1H, d, J = 11,9 Hz), 8,18 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (83 \mul, 0,6 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,1 ml) a rt. Después de agitación durante 40 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (16 mg, 59%).
(Ejemplo 1) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (83 \mul, 0,6 mmol) en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,1 ml) a rt. Después de agitación durante 40 horas, la mezcla se purificó mediante cromatografía en columna (hexano-sólo-hexano/acetato de etilo = 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se lavó con hexano para producir un sólido blanco (16 mg, 59%).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Pf: 85ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 3,04 min.,
m/z = 452 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
7,0 Hz), 1,43 (3H, s), 1,09-1,56 (18H, m),
1,56-1,73 (4H, m), 1,74-1,89 (4H,
m), 2,15 (1H, m), 2,42 (1H, m), 3,36 (1H, m), 3,79 (1H, t, J
= 6,6 Hz), 4,69 (1H, s), 4,94 (1H, d, J = 7,6 Hz), 5,64 (1H,
m), 5,78 (1H, d, J = 10,1 Hz), 8,02 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-(1-hidroxihexil)-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 2) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (36 \mul, 0,26
mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo
(0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 4 horas, la mezcla se
purificó mediante cromatografía en columna
(hexano-sólo-hexano/acetato de etilo
= 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se
lavó con hexano para producir un sólido blanco (17 mg, 41%).
Pf: 123ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,84 min.,
m/z = 476 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J =
7,0 Hz), 0,94 (1H, m), 1,49 (3H, s), 1,14-1,56 (9H,
m), 1,71 (2H, m), 1,81 (2H, m), 2,08 (1H, m), 2,48 (1H, m), 3,77
(1H, t, J = 7,3 Hz), 3,82 (1H, m), 4,01 (1H, d, J =
13,8 Hz), 4,11 (1H, d, J = 13,9 Hz), 5,11 (1H, d, J =
7,3 Hz), 5,20 (1H, d, J = 2,9 Hz), 5,48 (1H, s), 5,61 (1H,
m), 5,75 (1H, d,
J = 10,7 Hz), 7,17-7,32 (5H, m), 8,45 (1H, s).
J = 10,7 Hz), 7,17-7,32 (5H, m), 8,45 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-4-(1-hidroxihexil)-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 2) (30 mg, 0,09 mmol) y trietilamina (36 \mul, 0,26
mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt.
Después de agitación durante 1 hora, la mezcla se purificó mediante
cromatografía en columna
(hexano-sólo-hexano/acetato de etilo
= 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se
lavó con hexano para producir un sólido blanco (25 mg, 62%).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Pf: 80ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,19 min.,
m/z = 471 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,87 (3H, t, J =
6,3 Hz), 1,48 (3H, s), 1,01-1,75 (12H, m), 1,79
(3H, s), 1,87 (2H, m), 2,14 (1H, m), 2,48 (1H, m), 2,84 (2H, t,
J = 7,0 Hz), 3,13 (2H, m), 3,77 (1H, t, J = 7,0 Hz),
3,82 (1H, m), 5,11 (1H, d, J = 7,3 Hz), 5,19 (1H, m), 5,41
(1H, s), 5,64 (1H, m), 5,77 (1H, d, J = 10,1 Hz), 7,93 (1H,
m), 8,49 (1H, s).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido
2-(ciclohex-2-enilhidroximetil)-3-hidroxi-4-(1-hidroxihexil)-3-metil-5-oxopirrolidin-2-carboxílico
(Ejemplo 2) (50 mg, 0,14 mmol) en THF (3 ml) se añadió trietilamina
(57 \mul, 0,4 mmol), tiol (0,05 ml) y BOPCI (52 mg, 0,2 mmol) a
rt. Después de agitación durante 3 horas, se añadió una disolución
saturada de bicarbonato de sodio (10 ml) y después se extrajo la
capa orgánica con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó
sobre sulfato de magnesio. El residuo se purificó mediante
cromatografía en columna (hexano/acetato de etilo =
3/1-1/1) para dar el producto (21 mg, 34%).
Pf: 75ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,46 min.,
m/z = 458 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
6,9 Hz), 1,02 (1H, m), 1,19-1,39 (7H, m), 1,46 (3H,
s), 1,56-1,76 (4H, m), 1,86 (2H, m), 2,17 (1H, m),
2,48 (1H, m), 3,61 (3H, s), 3,68 (2H, s), 3,74 (1H, t, J =
7,2 Hz), 3,80 (1H, m), 5,13 (1H, d, J = 7,3 Hz), 5,17 (1H, d,
J = 2,8 Hz), 5,45 (1H, s), 5,64 (1H, m), 5,78 (1H, d,
J = 10,4 Hz), 8,57 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 8) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18
mmol) en diclorometano (2 ml) se añadió hidrosulfuro de bencilo
(0,05 ml) a rt. Después de agitación durante 18 horas, la mezcla se
purificó mediante cromatografía en columna
(hexano-sólo-hexano/acetato de etilo
= 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se
lavó con hexano para producir un sólido blanco (15 mg, 55%).
Pf: 181ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,89 min.,
m/z = 462 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
7,0 Hz), 0,87-1,05 (4H, m),
1,20-1,50 (15H, m), 1,45 (3H, s), 1,56 (1H, m), 1,79
(1H, m), 2,42 (1H, t, J = 6,3 Hz), 3,75 (1H, dd, J =
5,4 Hz, 7,0 Hz), 4,00 (1H, d, J = 13,9 Hz), 4,10 (1H, d,
J = 13,9 Hz), 4,79-7,83 (2H, m),
7,20-7,30 (5H, m), 7,85 (1H, s).
A una solución de
1-(ciclohexilhidroximetil)-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
(Ejemplo 8) (20 mg, 0,06 mmol) y trietilamina (25 \mul, 0,18 mmol)
en diclorometano (1 ml) se añadió tiol (0,05 ml) a rt. Después de
agitación durante 18 horas, la mezcla se purificó mediante
cromatografía en columna
(hexano-sólo-hexano/acetato de etilo
= 3/1-1/1) para producir el producto, el cual se
lavó con hexano para producir un sólido blanco (14 mg, 52%).
Pf: 132ºC;
LCMS (método de 4 min.): R_{t} = 2,66 min.,
m/z = 458 (M+H)^{+};
^{1}H-NMR (500 MHz,
DMSO-d_{6}): \delta = 0,86 (3H, t, J =
6,9 Hz), 1,43 (3H, s), 0,85-1,90 (21H, m), 2,41
(1H, m), 2,55 (2H, m), 2,96 (2H, m), 3,23 (3H, s), 3,73 (1H, t,
J = 5,6 Hz), 4,73 (1H, s), 4,83 (1H, d, J = 7,3 Hz),
7,95 (1H, s).
El efecto in vitro de los compuestos de
acuerdo con la invención se puede demostrar en los siguientes
ensayos:
Los compuestos de prueba se diluyen 6 veces con
50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA, un 0,005%
TritonX-100 y un 0,075% SDS que contiene 150 \muM
de
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA.
En cada pocillo de una placa negra de 1.536
pocillos, se pipetan 2 \mul de una solución del compuesto diluido
y después se añaden 3 \mul de 0,5 \mug/ml de proteasoma 20S (de
mamífero, AFFINITI, Exeter, R.U.), disuelto en 50 mM
Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA y un 0,005%
TritonX-100. Tras 1 hora de incubación a temperatura
ambiente, la reacción termina por la adición de 3 \mul de 13
\muM
Z-Leu-Leu-Leu-H
y se mide la intensidad de fluorescencia a \lambdaex 355 nm y
\lambdaem 460 nm en un contador multietiquetas ARVO (Perkin Elmer,
Tokio, Japón).
El compuesto de prueba se diluye a varias
concentraciones en un 2,5% de DMSO en una placa de polipropileno de
96 pocillos. Como control interno, se diluye MG-132
(Cat. #3175-v; Peptide Institute; Osaka, Japón)
utilizando el mismo procedimiento que para el compuesto de prueba.
La solución de trabajo diluida (10 \mul/pocillo) se traslada a
una placa de polipropileno de 96 pocillos. El tampón de ensayo
consiste en 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA,
un 0,005% TritonX-100, un 0,005% SDS, preparado como
solución stock a 10x la concentración. El sustrato peptídico
(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA;
3120v; Peptide Institute; Osaka, Japón) se almacena a 10 mM en un
100% DMSO. El sustrato peptídico se diluye a 125 \muM en 1,25x la
concentración del tampón de ensayo y 40 \mul de la solución de
sustrato se añade a la solución de los compuestos. El compuesto y el
sustrato se preincuban durante 10 min a temperatura ambiente.
Después, la mezcla del compuesto y del sustrato (10 \mul/pocillo)
se traslada a una placa de ensayo negra de 384 pocillos no
recubiertos (Nunc) y se mide la emisión de autofluorescencia a 460
nm (\lambdaex, 360 nm) por medio de un puntero de placa de
fluorescencia ARVO (Perkin Elmer, Tokio, Japón).
Se obtiene proteasoma S20 de glóbulos rojos
humanos de Affinity Research Products Ltd., (Cat#PW8720; Exeter,
R.U.) y se almacena a -80ºC. Se diluye el proteasoma 1 en 1.000 con
1x la concentración del tampón de ensayo y se añaden 10 \mul a la
mezcla de sustratos e inhibidor en la placa. Se realiza la reacción
proteolítica a temperatura ambiente. Se mide continuamente la
emisión de fluorescencia durante 90 min. Se determinan los valores
IC_{50} de los compuestos a la velocidad inicial de la reacción.
Se presentan los datos seleccionados en el Tabla A.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto de prueba se diluye a varias
concentraciones en un 2,5% de DMSO en una placa de polipropileno de
96 pocillos. Como control interno, se diluye quimostatina (Cat.
#4063; Peptide Institute; Osaka, Japón) utilizando el mismo
procedimiento que para el compuesto de prueba. La solución de
trabajo diluida (10 \mul/pocillo) se traslada a una placa de
polipropileno de 96 pocillos. El tampón de ensayo consiste en 50 mM
TES (pH 8,0), 10 mM CaCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA, preparado como
solución stock a 10x la concentración. El sustrato peptídico
(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA;
3120v; Peptide Institute; Osaka, Japón) se almacena a 10 mM en un
100% DMSO. El sustrato peptídico se diluye a 50 \muM en 1,25x la
concentración del tampón de ensayo y 40 \mul de la solución de
sustrato se añade a la solución de los compuestos. El compuesto y el
sustrato se preincuban durante 10 min a temperatura ambiente.
Después, la mezcla del compuesto y del sustrato (10 \mul/pocillo)
se traslada a una placa de ensayo negra de 384 pocillos no
recubiertos (Nunc) y se mide la emisión de autofluorescencia a 460
nm (\lambdaex, 360 nm) por medio de un puntero de placa de
fluorescencia ARVO (Perkin Elmer, Tokio, Japón).
Se obtiene quimotripsina humana de Calbiochem.,
(Cat#230900) y se diluye a 0,5 mg/ml en un 50% de glicerol y se
almacena a -20ºC. Se diluye la solución stock de quimotripsina a 18
ng/ml en 1x la concentración del tampón de ensayo y se añaden 10
\mul a la mezcla de sustratos e inhibidor en la placa. Se realiza
la reacción proteolítica a temperatura ambiente. Se mide
continuamente la emisión de fluorescencia durante 60 min. Se
determinan los valores IC_{50} de los compuestos a la velocidad
inicial de la reacción.
El compuesto de prueba se diluye a varias
concentraciones en un 2,5% de DMSO en una placa de polipropileno de
96 pocillos. Como control interno, se diluye leupeptina (Cat.
#4041-v; Peptide Institute; Osaka, Japón)
utilizando el mismo procedimiento que para el compuesto de prueba.
La solución de trabajo diluida (10 \mul/pocillo) se traslada a
una placa de polipropileno de 96 pocillos. El tampón de ensayo
consiste en 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1
mM CaCl_{2}, 0,1 mg/ml BSA 50 mM, preparado como solución stock a
10x la concentración. El sustrato peptídico
(Boc-Gln-Ala-Arg-MCA;
3135-v; Peptide Institute; Osaka, Japón) se almacena
a 1 mM en un 100% DMSO. El sustrato peptídico se diluye a 15 \muM
en 1,25x la concentración del tampón de ensayo y 40 \mul de la
solución de sustrato se añade a la solución de los compuestos. El
compuesto y el sustrato se preincuban durante 10 min a temperatura
ambiente. Después, la mezcla del compuesto y del sustrato (10
\mul/pocillo) se traslada a una placa de ensayo negra de 384
pocillos no recubiertos (Nunc) y se mide la emisión de
autofluorescencia a 460 nm (\lambdaex, 360 nm) por medio de un
puntero de placa de fluorescencia ARVO (Perkin Elmer, Tokio,
Japón).
Se obtiene tripsina de Calbiochem., y se diluye
a 1 mg/ml en 1 mM HCl y se almacena a -20ºC. Se diluye la solución
stock de tripsina a 1 ng/ml en 1x la concentración del tampón de
ensayo y se añaden 10 \mul a la mezcla de sustratos e inhibidor
en la placa. Se realiza la reacción proteolítica a temperatura
ambiente. Se mide continuamente la emisión de fluorescencia durante
60 min. Se determinan los valores IC_{50} de los compuestos a la
velocidad inicial de la reacción.
La línea celular del epitelio de pulmón humano
A549 (ATCC#CCL-885) se mantiene en un medio de Eagle
modificado por Dulbecco (D-MEM, Nikken Biomedical
Institute) suplementado con un 10% FCS (Gibco), 100 U/ml penicilina,
100 \mug/ml estreptomicina y 2 mM glutamina. Se tratan células
A549 (4 x 10^{4} células en 80 \mul/pocillo) en una placa de
cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano durante 1 h con un
vehículo (0,1% DMSO) o con los compuestos de prueba. Después, se
estimulan las células con 100 ng/ml TNF-\alpha
durante 24 h. La concentración de RANTES en los sobrenadantes, que
se recogen pasadas 24 horas, se determina por medio de una técnica
cuantitativa de inmunoensayo de fluorescencia de tipo sandwich
(intercalación) siguiendo las recomendaciones del fabricante
(R&D Systems, Oxon, R.U.).
Se pretratan células A549 subconfluentes que se
desarrollan en placas de 6 pocillos con varias concentraciones de
inhibidor o vehículo (0,1% DMSO) durante 30 min a 37ºC. A
continuación, se dejan las células sin tratar o estimuladas con 10
ng/ml TNF-\alpha durante el período de tiempo
indicado. Se lavan dos veces las células con PBS frío y se lisan
mediante 100 \mul de tampón de muestra de SDS-PAGE
sobre hielo. Los lisados celulares se sonican brevemente, se
centrifugan y los sobrenadantes se someten a
SDS-PAGE así como análisis Western Blot mediante
anti-I\kappaB\alpha (New England Biolabs #9242)
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Se colocan células (3.000) en placas de ensayo
de 96 pocillos a 3.000 células/pocillo en medios de cultivo
completos con un 10% de Suero de Ternera Fetal y se incuban durante
24 h a 37ºC. Tras 24 h de permanencia en placas, se añaden los
compuestos a un rango de concentración final de entre 10 \muM con
diluciones seriales y 10 nM a una concentración final de DMSO del
0,1%. Se incuban las células durante 72 h a 37ºC en medios de
cultivo completos después de la adición del compuesto. Por medio del
kit de ensayo de luminiscencia Promega Cell TiterGlo ATP (Promega
Corp.), se determina el número de células viables/pocillo mediante
la medición de la señal luminiscente basándose en la cantidad de
ATP celular como medición indirecta del número de células. Los
valores leídos 72 horas después de la incubación con los compuestos
de prueba se restan de los valores del Día 0. Se determinan los
valores IC_{50} con el programa Analyze 5. Relación Señal/Ruido
media por los tipos de células = 3 - 5 veces.
Los compuestos de acuerdo con la invención se
pueden convertir en preparaciones farmacéuticas como sigue:
Composición
100 mg del compuesto del Ejemplo 1, 50 mg de
lactosa (monohidrato), 50 mg de almidón de maíz (nativo), 10 mg de
polivinilpirrolidona (PVP 25) (de BASF, Ludwigshafen, Alemania) y 2
mg de estearato de magnesio.
Peso de la tableta: 212 mg, diámetro: 8 mm,
radio de curvatura: 12 mm.
Preparación
La mezcla de componente activo, lactosa y
almidón se granula con una solución al 5% (m/m) de PVA en agua.
Después de su secado, se mezclan los gránulos con estearato de
magnesio durante 5 min. Esta mezcla se moldea por medio de una
prensa de tabletas habitual (formato de las tabletas, véase más
arriba). La fuerza de moldeo aplicada es típicamente de 15 kN.
\vskip1.000000\baselineskip
Composición
1.000 mg del compuesto del Ejemplo 1, 1.000 mg
de etanol (96%), 400 mg de Rhodigel (goma xantán de FMC,
Pennsylvania, USA) y 99 g de agua.
10 ml de la suspensión oral proporcionan una
sola dosis de 100 mg del compuesto de acuerdo con la invención.
Preparación
Se suspende el Rhodigel en etanol y se añade a
la suspensión el componente activo. Se añade bajo agitación agua. Se
continúa con la agitación durante aproximadamente 6 horas hasta que
se complete la expansión del Rhodigel.
Claims (16)
1. Compuestos de fórmula
donde
R^{1} representa hidrógeno, hidroxi o
metilcarboniloxi,
R^{2} representa ciclohexilo o
ciclohex-2-enilo, donde el
ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos
\hbox{hidroxi, y}
R^{3} representa hidrógeno o hidroxi.
y sus sales, solvatos o solvatos de las
sales.
2. Compuestos de fórmula (I) según la
reivindicación 1, de fórmula
donde R^{1}, R^{2} y R^{3}
tienen el significado descrito más
arriba
y sus sales, solvatos o solvatos de las
sales.
3. Compuestos de fórmula (I) según la
reivindicación 1, tales como
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-
diona
diona
(1R,4R,5S)-1-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-[1-hidroxihexil]-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
y
(1R,4R,5S)-1-[(1R)-2-ciclohexen-1-ilmetil]-4-hexil-5-metil-6-oxa-2-azabiciclo[3.2.0]heptan-3,7-diona
4. Compuestos de fórmula
donde
R^{4} representa hidrógeno o hidroxi,
R^{5} representa ciclohexilo o
ciclohex-2-enilo, donde el
ciclohexilo puede estar sustituido con 0 a 2 grupos hidroxi,
R^{6} representa hidrógeno o hidroxi, y
R^{7} representa hidroxi o un sustituyente de
fórmula seleccionada de entre el grupo formado por
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R^{8} representa hidrógeno o metilo y *
representa la posición de conexión a la molécula
y sus sales, solvatos o solvatos de las
sales.
5. Compuestos de fórmula (II) según la
reivindicación 4, con la fórmula
donde R^{4}, R^{5}, R^{6} y
R^{7} tienen el significado descrito en la reivindicación
4,
y sus sales, solvatos o disolvatos de las
sales.
\newpage
6. Compuestos de fórmula (II) según la
reivindicación 4, tales como
(3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-3-hidroxi-4-[1-hidroxihexil]-3-metil-5-oxo-D-prolina
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteína
y
N-acetil-S-({(2R,3S,4R)-2-[(S)-(1S)-2-ciclohexen-1-il(hidroxi)metil]-4-hexil-3-hidroxi-3-metil-5-oxo-2-pirrolidinil}carbonil)cisteinato
de
metilo
7. Procedimiento para sintetizar los compuestos
de fórmula general (I) y (Ia), donde la fórmula (I) contiene los
compuestos de fórmulas (Ib), (Ic), (Id) y (Ie) según la
reivindicación 1 ó 2, y procedimiento para sintetizar los compuestos
de fórmula general (II) y (IIa), donde la fórmula (II) contiene los
compuestos de fórmulas (IIb), (IIc) y (IId) según la reivindicación
4 ó 5, caracterizado porque
- [A]
- los compuestos de fórmula general
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1,
- \quad
- se preparan mediante fermentación y aislamiento de un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
- [B]
- los compuestos de fórmula general
- \quad
- en la que R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1,
- \quad
- se preparan mediante hidrogenación del doble enlace de los compuestos de fórmula (Ib), ó
- [C]
- los compuestos de fórmula general
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1, y el grupo hidroxi está unido al átomo de carbono 1 ó 2,
- \quad
- se preparan mediante la hidratación del doble enlace de los compuestos de fórmula (Ib), ó
- [D]
- los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- donde R^{1} y R^{3} tienen el significado descrito en la reivindicación 1,
- \quad
- se preparan mediante la oxidación del doble enlace de los compuestos de la fórmula (Ib), ó
- [E]
- los compuestos de fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- donde R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito en la reivindicación 4, y R^{7} representa hidroxi o un sustituyente de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que R^{8} tiene el significado descrito en la reivindicación 4,
- \quad
- se preparan mediante fermentación y aislamiento de un Actinomiceto del género Streptomyces de SEQ ID NO.: 1, ó
- [F]
- los compuestos de fórmula general
- \quad
- donde R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito en la reivindicación 4, y R^{7} representa un sustituyente de fórmula seleccionada entre el grupo compuesto por
- \quad
- se preparan mediante la reacción con tioles de los compuestos de fórmula
- \quad
- en la que R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen el significado descrito en la reivindicación 4.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Composición que contiene al menos un
compuesto de fórmula general (I), (Ia), (II) o (IIa) según las
reivindicaciones 1 a 6 y un diluyente farmacológicamente
aceptable.
9. Composición según la reivindicación 8 para el
tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos o
cáncer.
10. Procedimiento para la preparación de las
composiciones según las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado
porque los compuestos de fórmula general (I), (Ia), (II) y (IIa)
según las reivindicaciones 1 a 6 junto con los productos auxiliares
habituales se llevan a una forma de aplicación apropiada.
11. Utilización de los compuestos de fórmula
general (I), (Ia), (II) o (IIa) según las reivindicaciones 1 a 6
para la preparación de medicamentos.
12. Utilización según la reivindicación 11 para
la preparación de medicamentos para el tratamiento de procesos
inflamatorios agudos y crónicos o cáncer.
13. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6
para su utilización en el control de procesos inflamatorios agudos y
crónicos en humanos y animales.
14. Compuesto según las reivindicaciones 1 a 6
para su utilización en el control de procesos cancerosos en humanos
y animales.
15. Microorganismo con número de designación DSM
15324 y de SEQ ID NO: 1.
16. Microorganismo con el número de designación
DSM 15324 y SEQ ID NO: 1 para la preparación de los compuestos de
fórmulas (I), (Ia), (II) y (IIa).
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