ES2242011T3 - Derivado de caloporosidos, procedimiento para su produccion, y su uso. - Google Patents

Abstract

Compuestos de la Fórmula I en los que R1, R2 y R3, independientemente unos de otros, significan H o radicales acilo con 1 a 10 átomos de C; y R4 significa H ó - C(O)(CH2)nCOOH, en que n es igual a 1 hasta 7; con la excepción de que no todos los R1, R2, R3 y R4 han de significar H; así como sus sales fisiológicamente compatibles.

Description

Derivado de caloporosidos, procedimiento para su producción, y su uso.

El presente invento se refiere a nuevas sustancias activas (derivados de caloporosidos), que son formadas durante la fermentación por el microorganismo Gloeoporus dichrous Bres. ST001714, DSM 13784, a procedimientos para su preparación, a su utilización como medicamentos, a medicamentos que contienen derivados de caloporosidos, así como al microorganismo Gloeoporus dichrous Bres. ST001714, DSM 13784.

El caloporosido fue descrito por primera vez en 1994 como agente inhibidor de la fosfolipasa C (W. Weber y colaboradores, J. Antiobiotics, 47, 1.188-1.194). En el mismo año se aislaron otros dos metabolitos secundarios similares (R. Shan y colaboradores, Nat. Prod. Lett. 4, 171-178). Los compuestos de la Fórmula I (presentada más adelante) conformes al invento se diferencian en su estructura de las sustancias que se describen en esa cita.

El cáncer es una enfermedad, que en la mayor parte de los casos evoluciona mortalmente, de seres humanos y animales, que es provocada por el crecimiento incontrolado de células propias del cuerpo. El cáncer es la designación correspondiente a la formación de tumefacciones malignas (malignomas), neoplasmas (tumores y carcinomas), o a la degeneración maligna así como al trastorno de la maduración de células sanguíneas blancas (leucocitos) (leucemia, cáncer de sangre). Las células de cánceres o tumores se forman por transformación de células propias del cuerpo. La malignidad de la célula de cáncer se expresa en la autonomía del crecimiento, es decir en su capacidad para crecer de un modo no inhibido y sin inclusión en la planificación formativa de los órganos e infiltrándose con destrucción de tejidos. Una señal segura de la malignidad es la formación de colonizaciones alejadas del tumor (metástasis) después de una propagación hematógena o linfógena de células tumorales. El cáncer pertenece a las causas más frecuentes de muertes de los seres humanos y por lo tanto existe una gran necesidad en cuanto a métodos y agentes para la curación o el tratamiento de degeneraciones malignas.

La posibilidad de una terapia de tumores malignos abarca, junto con la extirpación quirúrgica - cuando sea posible radical - del tumor, la terapia radiológica con rayos X, rayos \alpha, \beta, \gamma, la inmunoterapia y la quimioterapia. La inmunoterapia es aplicable actualmente sólo en grado limitado. Por la quimioterapia de tumores se entiende la administración de venenos para las células (agentes citostáticos) con el fin de efectuar el tratamiento de tumores y de las células tumorales que hayan quedado después de un tratamiento quirúrgico local o una irradiación local. Estas sustancias intervienen específicamente en determinados procesos de la división celular, de manera tal que los tejidos con una alta proporción de células que se dividen, tal como el tejido tumoral que crece con rapidez, reaccionan de una manera más sensible. Pasan a emplearse compuestos alquilantes, tales como p.ej. la ciclofosfamida (The Merck Index, 12ª edición, página 463), anti-metabolitos, tales como el metotrexato (The Merck Index, 12ª edición, página 1.025), alcaloides, tales como la vincristina (The Merck Index, 12ª edición, página 1.704), y antibióticos, tales como la daunomicina (The Merck Index, 12ª edición, página 479) así como la adriamicina (The Merck Index, 12ª edición, páginas 581-582). Todos estos agentes, sin embargo, por causa de efectos colaterales masivos, tienen grandes desventajas, de manera tal que la muerte del enfermo solamente se retrasa más tiempo, pero no se evita. Además, en el caso de células degeneradas (de cáncer) aparecen resistencias contra los agentes aplicados. Los medicamentos actuales ya no actúan entonces de una manera citostática, sino por el contrario de una manera tóxica, como consecuencia de los efectos colaterales. Además de ello se ha mostrado que una administración combinada o secuencial de agentes citostáticos supera la actividad de un agente citostático individual (en monoterapia) y por ello es posible que los considerables efectos colaterales no se sumen en la poli-quimioterapia. Por todas estas razones se necesitan imperativamente nuevos agentes quimioterapéuticos, y por lo tanto éstos se están buscando por todo el mundo.

Las cinasas dependientes de ciclinas (cyclin-dependent kinases = CDK's) desempeñan un cometido central en la regulación del ciclo celular. Ellas catalizan las reacciones de fosforilación y ponen en marcha con ello una cascada de reacciones, que inicia en el ciclo celular una transición desde la fase G1 (fase de crecimiento 1) a la fase S (fase de síntesis). Las cinasas dependientes de ciclinas constituyen por lo tanto una buena diana terapéutica para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades con un trastorno patológico de la proliferación celular. Los agentes inhibidores de bajo peso molecular que regulen el ciclo celular e impidan una división celular incontrolada serían medicamentos muy útiles en el tratamiento de pacientes de cáncer.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la cepa de microorganismos Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres.
ST001714, DSM 13784, es capaz de formar nuevos agentes citostáticos muy eficaces que inhiben a las cinasas dependientes de ciclinas en concentraciones muy pequeñas.

Son objeto del invento por consiguiente las sustancias activas (derivados de caloporosidos) formadas por la cepa Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, así como sus sales fisiológicamente compatibles, ésteres y equivalentes químicos evidentes.

El invento concierne por consiguiente a compuestos de la Fórmula general I

1

en los que

R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, significan H o un radical acilo con 2-10 átomos de C, preferiblemente con 2 a 6 de tales átomos, de modo especialmente preferido 2 de tales átomos; y

R_{4} significa H ó -C(O)(CH_{2})_{n}COOH, en que n es igual a 1 hasta 7, preferiblemente a 1 hasta 3, de modo especialmente preferido a 1 ó 2;

con la excepción de que no todos los R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} han de significar H;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

Los radicales acilo de los compuestos de la Fórmula I pueden ser lineales o ramificados, saturados, o insaturados una vez o dos veces.

Por un radical acilo con 2 átomos de C ha de entenderse por ejemplo un radical acetilo.

Ejemplos de radicales acilo sin ramificar, saturados, son un radical de ácido acético (C=2), un radical de ácido propiónico (C=3), un radical de ácido butírico (C=4), un radical de ácido valeriánico (C=5), un radical de ácido caproico (C=6), un radical de ácido enántico (C=7), un radical de ácido caprílico (C=8), un radical de ácido pelargónico (C=9) y un radical de ácido cáprico (C=10).

Ejemplos de radicales acilo sin ramificar, insaturados una vez, son un radical de ácido acrílico (C=3), un radical de ácido crotónico (C=4) o un radical de ácido vinil-acético (C=4).

Un ejemplo de un radical acilo sin ramificar, insaturado dos veces, es un radical de ácido sórbico (C=6).

Los caloporosidos son antibióticos débilmente activos, que constan de un ácido salicílico y de un disacárido. Las dos unidades estructurales están unidas a través de una cadena de alquilo. La parte de azúcar del compuesto con la Fórmula I puede ser un disacárido, que consta en cada caso de una D-piranosa de una aldohexosa (tal como p.ej. D-glucopiranosa o D-galactopiranosa) y el ácido "ónico" de una aldohexosa (p.ej. ácido D-glucónico). Se prefiere la parte de azúcar del ácido D-manopiranosil-D-manónico, que está sin sustituir o sustituida con R_{2}, R_{3} y/o R_{4} tal como antes se ha definido.

El invento se refiere además a

a)

un compuesto de la Fórmula I en el que R_{1} es = acetilo; R_{2} = R_{3} = R_{4} son = H

(= caloporosido B; fórmula empírica: C_{38}H_{62}O_{16}, P.M. [peso molecular] 774,9);

así como sus sales fisiológicamente compatibles;

b)

un compuesto de la Fórmula I en el que R_{1} = R_{3} son = acetilo; R_{2} es = H;

R_{4} es = malonilo (= caloporosido C; fórmula empírica: C_{43}H_{66}O_{20}, P.M. 902,99);

así como sus sales fisiológicamente compatibles;

c)

un compuesto de la Fórmula I en el que R_{1} = R_{2} son = H; R_{3} es = acetilo;

R_{4} es = malonilo (= caloporosido D; fórmula empírica: C_{41}H_{64}O_{19}, P.M. 806,96); así como sus sales fisiológicamente compatibles;

d)

un compuesto de la Fórmula I en el que R_{1} = R_{3} son = H; R_{2} es = acetilo;

R_{4} es = malonilo (= caloporosido E; fórmula empírica: C_{41}H_{64}O_{19}, P.M. 806,96);

así como sus sales fisiológicamente compatibles;

e)

un compuesto de la Fórmula I en el que R_{1} = R_{2} = R_{4} son = H; R_{3} es = acetilo

(= caloporosido F; fórmula empírica: C_{38}H_{62}O_{18}, P.M. 774,9);

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

Los centros de quiralidad en los compuestos de la Fórmula I pueden presentarse en la configuración R o en la configuración S, cuando no se indique otra cosa distinta. El invento se refiere tanto a los compuestos ópticamente puros como también a las mezclas de estereoisómeros, tales como mezclas de enantiómeros y mezclas de diastereoisó-
meros.

Conforme al invento, los compuestos de la Fórmula I son obtenibles por fermentación de Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, o de una de sus variantes o mutantes, bajo condiciones apropiadas en un medio de cultivo, hasta que uno o varios de los derivados de caloporosidos de la Fórmula I se acumulen en el medio de cultivo. Por subsiguiente aislamiento de los compuestos y por eventual transformación en equivalentes químicos, así como de sus sales fisiológicamente compatibles, se obtienen los derivados de caloporosidos.

El invento se refiere por lo tanto además a un procedimiento para la preparación de un compuesto de la Fórmula I, caracterizado porque el microorganismo Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, o una de sus variantes o mutantes, se fermenta bajo condiciones apropiadas en un medio de cultivo, hasta que uno o varios de los compuestos dianas se acumule(n) en el medio de cultivo, y a continuación se aísla(n) a partir del medio de cultivo y eventualmente se transforma(n) en equivalentes químicos y/o sales fisiológicamente compatibles.

Con preferencia, la cepa ST001714, DSM 13784, sus mutantes y/o variantes, se fermentan en una solución nutritiva o en un medio sólido (también designado como medio de cultivo) con una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno así como con las sales inorgánicas usuales, hasta que los compuestos conformes al invento se acumulen en el medio de cultivo, a continuación los compuestos se aíslan a partir del medio de cultivo y eventualmente se separan en los componentes activos individuales.

El procedimiento conforme al invento se puede emplear para la fermentación a la escala de laboratorio (en el orden de los mililitros hasta los litros) y para fermentación a la escala industrial (a la escala de los metros cúbicos).

La cepa Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, se multiplicó en un cultivo preliminar. Un material aislado se depositó en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300, Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las reglas del Convenio de Budapest, el 14 de diciembre de 1999, bajo el siguiente número: DSM 13784.

El Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, posee un micelio de color blanco y esporas de color púrpura. Éste se presenta preferiblemente en Betula, pero puede infestar a otros hospedantes por ejemplo Alnus, Salix, Populus, Ulmus y Prunus.

En lugar de la cepa Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, se pueden emplear también sus mutantes y variantes, que sintetizan uno o varios de los compuestos conformes al invento. Tales mutantes se pueden generar de una manera en sí conocida por medios físicos, por ejemplo por irradiación, tal como con rayos ultravioletas o X, o mutágenos químicos, tales como por ejemplo metano-sulfonato de etilo (EMS), 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (MOB) o N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina (MNNG).

El escrutinio en cuanto a mutantes y variantes, que sintetizan uno o varios de los compuestos conformes al invento, se efectúa de acuerdo con el siguiente esquema:

-

Liofilización de los cultivos en placas;

-

Extracción del material liofilizado con un disolvente orgánico;

-

Extracción del compuesto a partir del material filtrado de cultivo con fases sólidas;

-

Analítica mediante HPLC, DC o mediante ensayo de la actividad biológica.

Las condiciones de fermentación descritas en lo que sigue son válidas para Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, para el material aislado depositado DSM 13784, así como para mutantes y variantes de éstos.

En una solución nutritiva que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno así como las sales inorgánicas usuales, el Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, produce los derivados de caloporosidos.

Como fuentes de carbono preferidas para la fermentación se adecuan hidratos de carbono asimilables y azúcares-alcoholes, tales como glucosa, lactosa, sacarosa o D-manita así como productos naturales que contienen hidratos de carbono, tales como p.ej. un extracto de malta. Como materiales nutritivos que contienen nitrógeno entran en consideración: aminoácidos, péptidos y proteínas así como sus productos de descomposición, tales como caseína, peptonas o triptonas, además extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por ejemplo de maíz, trigo, judía, soja o de la planta de algodón, residuos de destilación de la producción de alcoholes, harinas de carne o extractos de levadura, pero también sales de amonio y nitratos, pero en particular también péptidos obtenidos por síntesis o biosíntesis. En cuanto a sales inorgánicas, la solución nutritiva puede contener por ejemplo cloruros, carbonatos, sulfatos o fosfatos de los metales alcalinos o alcalino-térreos, hierro, zinc, cobalto y manganeso.

La formación de los compuestos conformes al invento discurre especialmente bien en una solución nutritiva que contiene aproximadamente de 0,05 a 5%, con preferencia de 1 a 2% de un extracto de malta, de 0,05 a 3%, con preferencia de 0,05 a 1% de un extracto de levadura y de 0,2 a 5%, con preferencia de 0,5 a 2% de glucosa, de 0,5 a 3%, con preferencia de 0,5 a 3% de un polvo de celulosa, y cantidades trazas de sulfato de amonio. Los datos en tantos por ciento están referidos en cada caso al peso de la solución nutritiva total.

En esta solución nutritiva, el Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, forma una mezcla de derivados de caloporosidos. Dependiendo de la composición de la solución nutritiva, puede variar la proporción cuantitativa de uno o varios de los derivados de caloporosidos conformes al invento. Además, mediante la composición de los medios se puede controlar la síntesis de derivados individuales de caloporosido, de manera tal que un derivado de caloporosido no se prepare en absoluto o se prepare en una cantidad situada por debajo del límite de detección por el microorganismo.

La cultivación del microorganismo se efectúa en condiciones aerobias, por lo tanto por ejemplo en condiciones sumergidas, con sacudimiento o agitación en matraces con sacudimiento o fermentadores, eventualmente con introducción de aire u oxígeno, o sobre un medio sólido. Ésta se puede llevar a cabo en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 18 a 35ºC, con preferencia a alrededor de 20 a 30ºC, en particular a 25 hasta 30ºC. El intervalo de valores del pH debería estar situado entre 5 y 8, con preferencia entre 5,5 y 6,5. El microorganismo se cultiva en estas condiciones por lo general durante un período de tiempo de 24 a 720 horas, con preferencia de 288 hasta 576 horas.

Ventajosamente se cultiva en varias etapas, es decir, se prepara(n) en primer lugar uno o varios cultivos preliminares en un medio nutritivo líquido, que luego se sobreinoculan en el medio de producción propiamente dicho, el cultivo principal, por ejemplo en la relación en volumen de 1:10. El cultivo preliminar se obtiene, p.ej., sobreinoculando un micelio en una solución nutritiva y dejándolo crecer durante 36 a 120 horas, con preferencia durante 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener por ejemplo dejando crecer la cepa durante aproximadamente 3 a 40 días, con preferencia durante 10 a 30 días, sobre un substrato o suelo nutritivo sólido o líquido, por ejemplo un agar de malta y levadura o un agar de patata y dextrosa.

La evolución de la fermentación se puede vigilar con ayuda del valor del pH de los cultivos o del volumen del micelio así como por métodos de cromatografía, tales como p.ej. la cromatografía de líquido con alto rendimiento (HPLC), o por comprobación de la actividad biológica.

El procedimiento de aislamiento que se describe a continuación sirve para la purificación de los derivados de caloporosidos conformes al invento.

El aislamiento o la purificación de un derivado de caloporosido conforme al invento a partir del medio de cultivo se efectúa de acuerdo con métodos conocidos tomando en consideración las propiedades químicas, físicas y biológicas de las sustancias naturales. Para el ensayo de la concentración de los respectivos derivados de caloporosidos en el medio de cultivo o en las etapas de aislamiento individuales se puede utilizar la HPLC, siendo comparada la cantidad de la sustancia formada convenientemente con una solución de calibración.

Para el aislamiento de los compuestos conformes al invento, el caldo de cultivo o el cultivo junto con el medio sólido se liofilizan, a continuación los derivados de caloporosidos se extraen desde el material liofilizado con un disolvente orgánico eventualmente miscible con agua. La fase de disolvente orgánico contiene las sustancias naturales conformes al invento, se concentra eventualmente en vacío y se purifica adicionalmente.

La purificación adicional de uno o varios compuestos conformes al invento se efectúa por cromatografía en materiales apropiados, preferiblemente p.ej. en presencia de tamices moleculares, en presencia de un gel de sílice, de óxido de aluminio, en presencia de intercambiadores de iones o en presencia de resinas adsorbentes o bien en presencia de fases inversas (reversed phase, RP). Con ayuda de esta cromatografía se separan los derivados de caloporosidos. La cromatografía de los derivados de caloporosidos se efectúa con soluciones acuosas tamponadas o con mezclas de soluciones acuosas y orgánicas.

Por mezclas de soluciones acuosas u orgánicas se entienden todos los disolventes orgánicos miscibles con agua, preferiblemente metanol, propanol y acetonitrilo, en una concentración de 5 a 80% del disolvente, preferiblemente de 20 a 50% del disolvente, o también todas las soluciones acuosas tamponadas, que son miscibles con disolventes orgánicos. Los tampones que se han de utilizar son los mismos que antes se indican.

La separación de los derivados de caloporosidos en virtud de sus diferentes polaridades se efectúa con ayuda de la cromatografía en fase inversa, por ejemplo en presencia de MCI® (resina adsorbente de Mitsubishi, Japón) o de Amberlite XAD® (TOSOHAAS), en presencia de otros materiales hidrófobos, tales como por ejemplo en fases de RP-8 o RP-18. Además, la separación puede efectuarse con ayuda de la cromatografía en fase normal, por ejemplo en presencia de gel de sílice, óxido de aluminio y materiales similares.

La cromatografía de los derivados de caloporosidos se efectúa con soluciones acuosas tamponadas o acidificadas o con mezclas de soluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes orgánicos miscibles con agua. Como disolvente orgánico se utilizan con preferencia propanol y acetonitrilo. Por soluciones acuosas tamponadas o acidificadas se entienden, p.ej., agua, un tampón de fosfato, acetato de amonio, un tampón de citrato en una concentración de 0 a 0,5 M, así como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los ácidos usuales en el comercio, conocidos por un especialista en la materia, preferiblemente en una concentración de 0 a 1%. En el caso de soluciones acuosas tamponadas se prefiere especialmente el acetato de amonio al 0,1%.

Si se cromatografía con un gradiente, que empieza con 100% de agua y termina con 100% de disolvente, se trabaja de modo preferible con un gradiente lineal de 20 a 100% de propanol o acetonitrilo.

Alternativamente, puede efectuarse también una cromatografía en gel o la cromatografía en fases hidrófobas.

La cromatografía en gel se lleva a cabo en presencia de geles de poli(acrilamida) o de copolímeros, tales como p.ej. Biogel-P 2® (entidad Biorad) o Fractogel TSK HW 40® (entidad Merck, Alemania, o Toso Haas, EE.UU.).

El orden de sucesión de las cromatografías antes mencionadas se puede invertir.

Los compuestos conformes al invento son estables en el estado sólido y en soluciones en el intervalo de valores del pH comprendido entre 3 y 8, en particular entre 5 y 7, y por consiguiente se pueden incorporar en las formulaciones galénicas usuales.

Uno o varios compuestos seleccionados entre los compuestos conformes al invento son apropiados, por causa de sus valiosas propiedades farmacológicas, para su aplicación en la medicina humana o veterinaria como medicamentos.

El presente invento se refiere por consiguiente a la utilización del compuesto de la Fórmula I, o de una sal fisiológicamente compatible del mismo, para la preparación de un agente citostático destinado al tratamiento de enfermedades tumorales.

El presente invento se refiere además a todos los equivalentes químicos evidentes de los compuestos conformes al invento de la Fórmula I. Tales equivalentes son compuestos que presentan una ligera diferencia química, es decir que tienen el mismo efecto o que, en condiciones suaves, se transforman en los compuestos conformes al invento. A los mencionados equivalentes pertenecen p.ej. también sales, productos de reducción, ésteres, éteres, acetales o amidas de los compuestos conformes al invento, así como equivalentes que un especialista en la materia puede preparar con métodos clásicos, además de ello todos los antípodas ópticos, diastereoisómeros y todas las formas estereoisómeras.

Por sales fisiológicamente compatibles de compuestos de la Fórmula I se entienden sus sales tanto orgánicas como también inorgánicas, tal como se han descrito en la obra Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1.418 (1985)). Por causa de la estabilidad física y química y de la solubilidad son preferidas para los grupos ácidos, entre otras, las sales de sodio, potasio, calcio y amonio; para grupos básicos son preferidas, entre otras, las sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o las de ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos, tales como p.ej. ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico y ácido p-tolueno-
sulfónico.

Los ésteres, éteres y acetales se pueden preparar de acuerdo con métodos descritos en la bibliografía, p.ej. en las obras Advanced Organic Synthesis, 4ª edición, J. March, John Wiley & Sons, 1992, o Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª edición, T. W. Greene & P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, 1999.

El grupo carboxilo puede ser reducido por ejemplo con LiAlH_{4} para formar el alcohol.

De los compuestos de la Fórmula I se puede separar en primer lugar la parte de glicósido mediante hidrólisis en condiciones alcalinas (W. Weber y colaboradores J. Antibiotics, 47, 1.188-1.194). A continuación se pueden introducir cualesquiera radicales de azúcares mediante glicosilación (p.ej. la reacción de Königs-Knorr). Métodos correspondientes han sido descritos en la bibliografía, p.ej. en la obra Carbohydrate Chemistry, J. F. Kennedy, Oxford University Press, 1988.

El mecanismo de acción de los derivados de caloporosidos es desconocido, pero se pudo detectar un efecto importante.

Para la detección de los inhibidores de las CDK's se hace uso de un ensayo en el que se mide el régimen de fosforilación de un substrato peptídico específico mediante las cinasas dependientes de ciclinas. Las cinasas dependientes de ciclinas se activan por fijación a la respectiva ciclina. El [\gamma-P]-fosfato es transferido al substrato peptídico por el [\gamma-P]-ATP mediante la enzima. El ensayo se lleva a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos: Se mide la radiactividad del [\gamma-P]-fosfato transferido al substrato.

Los valores de IC_{50} para los derivados de caloporosidos se indican en la Tabla 1; se trata de la concentración que desactiva en un 50% a la CDK-4.

Caloporosido B	1,5 \muM
Caloporosido C	3,1 \muM
Caloporosido D	1,8 \muM
Caloporosido E	1,8 \muM
Caloporosido F	1,5 \muM

Por lo demás, el presente invento se refiere a medicamentos con un cierto contenido de por lo menos un compuesto conforme al invento.

Uno o varios compuestos de los derivados de caloporosidos conformes al invento se puede(n) administrar fundamentalmente como tales en sustancia (en masa). Se prefiere la utilización en mezcla con materiales auxiliares o un material de vehículo apropiado(s). Como material de vehículo se pueden utilizar en medicamentos los materiales de vehículo y/o los materiales auxiliares usuales y farmacológicamente compatibles.

Los medicamentos conformes al invento se administran por lo general por vía oral o parenteral, pero también es posible en principio una administración por vía rectal. Las formas de preparados galénicos sólidos o líquidos apropiados son por ejemplo granulados, polvos, tabletas, grageas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en forma de ampollas, así como formulaciones con liberación retardada de la sustancia activa, en cuya preparación encuentran utilización usualmente materiales de vehículo y aditivos y/o materiales auxiliares tales como agentes disgregantes, aglutinantes, de revestimiento, de hinchamiento, de deslizamiento y lubricantes, materiales saboreantes, agentes edulcorantes o solubilizantes. Como materiales de vehículo o auxiliares frecuentemente utilizados se han de mencionar p.ej. carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manita y otros azúcares, talco, albúmina láctea, gelatina, un almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales, polietilen-glicoles y disolventes, tales como por ejemplo agua estéril, alcoholes, glicerol y alcoholes plurivalentes.

Eventualmente, las unidades de dosificación para la administración por vía oral se pueden microencapsular, con el fin de retrasar la entrega o prolongarla durante un período de tiempo más largo, tal como por ejemplo por revestimiento o imbibición de la sustancia activa en forma de partículas dentro de apropiados/as polímeros, ceras o similares.

Con preferencia, las formulaciones farmacéuticas se preparan y administran en forma de unidades de dosificación, conteniendo cada unidad como constituyente activo una dosis determinada de uno o varios compuestos de los derivados de caloporosidos conformes al invento.

En el caso de unidades de dosificación sólidas, tales como tabletas, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser hasta de aproximadamente 500 mg, pero con preferencia de aproximadamente 0,1 a 200 mg, y en el caso de soluciones para inyección en forma de ampollas hasta de aproximadamente 200 mg, pero con preferencia de aproximadamente 0,5 a 100 mg, por día.

La dosis diaria que se ha de administrar es dependiente del peso corporal, así como de la edad, el sexo y el estado del mamífero. En ciertas circunstancias pueden ser convenientes sin embargo también unas dosis diarias más altas o más bajas. La administración de la dosis diaria puede efectuarse tanto mediante administración en una sola vez en forma de una unidad de dosificación individual o también en la de varias unidades de dosificación de menor magnitud, así como también por administración múltiple de dosis subdivididas a intervalos determinados.

Los medicamentos conformes al invento se preparan llevando a uno o varios de los compuestos conformes al invento, junto con materiales de vehículo así como eventualmente materiales aditivos y/o auxiliares usuales, a la o una forma de presentación apropiada.

En los ejemplos que se presentan seguidamente se explica el invento con mayor detalle. Los datos porcentuales se refieren al peso. Las relaciones de mezcladura en el caso de líquidos se refieren al volumen, cuando no se hubo dado ningún otro dato distinto.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un cultivo en glicerol de Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

100 ml de una solución nutritiva (un extracto de malta al 2,0%, un extracto de levadura al 0,2%, glucosa al 1,0%, (NH_{4})_{2}HPO_{4} al 0,05%, de pH 6,0) dentro de un matraz de Erlenmeyer estéril de 300 ml de capacidad se inoculan con la cepa Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, y se incuban durante 7 días a 25ºC y 140 rpm (revoluciones por minuto) en una máquina sacudidora giratoria. 1,5 ml de este cultivo se diluyen a continuación con 2,5 ml de glicerol al 80% y se almacenan a -35ºC.

Ejemplo 2 Preparación de un cultivo preliminar en un matraz de Erlenmeyer de Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

30 ml de una solución nutritiva (un extracto de malta al 2,0%, un extracto de levadura al 0,2%, glucosa al 1,0%, (NH_{4})_{2}HPO_{4} al 0,05%, de pH 6,0) dentro de un matraz de Erlenmeyer estéril de 100 ml de capacidad se inoculan con la cepa Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, y se incuban durante 4 días a 25ºC y 140 rpm en una máquina sacudidora giratoria. En cada caso con 2 ml de este cultivo preliminar se inoculan a continuación las placas en el caso de la producción de los cultivos principales.

Ejemplo 3 Preparación de un cultivo principal de Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, sobre placas de un medio sólido

Sobre placas estériles de 25 x 25 cm (de la entidad Nunc) se vierten 200 ml de la siguiente solución nutritiva: 20 g/l de un extracto de malta, 2 g/l de un extracto de levadura, 10 g/l de glucosa y 0,5 g/l de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, de pH 6,0. Estas placas se inocularon en cada caso con 2 ml de un cultivo preliminar. La producción máxima de uno o varios de los compuestos conformes al invento se alcanza después de aproximadamente 480 horas.

Ejemplo 4 Preparación de los derivados de caloporosidos

50 unidades de placas de 25 x 25 cm se produjeron y se inocularon con el cultivo preliminar:

Medio nutritivo:

20 g/l de un extracto de malta

2 g/l de un extracto de levadura

10 g/l de glucosa

0,5 g/l (NH_{4})_{2}HPO_{4},

pH 6 (antes de la esterilización)

Tiempo de incubación: 480 horas

Temperatura de incubación: 25ºC.

Ejemplo 5 Aislamiento de la mezcla de caloporosidos procedente de los cultivos en placas de Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

Después de haberse terminado la fermentación de Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres.ST001714, DSM 13784, los cultivos en placas, obtenidos según el Ejemplo 3, se liofilizan, y el material liofilizado se extrae con 5 litros de metanol. La solución metanólica, que contiene la sustancia activa, se libera por filtración del residuo y se concentra en vacío. El material concentrado se diluye con agua y se aplica sobre una columna previamente preparada con MCI GEL, CHP20P, de 1,0 litro de capacidad. Se eluye con un gradiente desde agua a solas hasta 100% de acetonitrilo. El caudal que pasa por la columna (25 ml por minuto) se recoge fraccionadamente (en cada caso 25 ml) y se reúnen las fracciones que contienen derivados de caloporosidos (desde 40% hasta 100% de acetonitrilo). La concentración en vacío y la subsiguiente liofilización proporcionan 8,5 g de un polvo de color pardo amarillento.

Ejemplo 6 Separación previa de los derivados de caloporosidos mediante cromatografía con RP18

0,5 g del producto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 4 se aplican sobre una columna con Nucleosil® 100-7 C18 HD (tamaño: 40 mm x 250 mm). Se eluye con un gradiente desde 20% de acetonitrilo (+ agua con una adición de 0,1% de acetato de amonio) hasta 100% de acetonitrilo con un caudal de 35 ml por minuto. El caudal saliente de la columna se recoge en fracciones (de 35 ml). Principalmente en las fracciones 39 a 68 se encuentran los derivados de caloporosidos. Éstos se reúnen, se liberan en vacío respecto del disolvente y a continuación se liofilizan. En tal caso se obtuvieron el caloporosido B (22,4 mg) y el caloporosido F (10,5 mg) ya puros en >95%. El caloporosido C (fracción 41; 43,4 mg), el caloporosido D (fracciones 43-45; 76,2 mg) y el caloporosido E (fracciones 43-45; 76,2 mg) se obtuvieron en estado puro en aproximadamente 70% y por lo tanto se purificaron aún más por cromatografía.

Ejemplo 7 Purificación de los caloporosidos C, D y E

20 mg del caloporosido C aislado y enriquecido conforme al Ejemplo 5 se aplican sobre una columna con LUNA® 5 \mu C18(2) (tamaño: 10 mm x 250 mm) y se cromatografía con un gradiente de 25 a 35% de acetonitrilo en una mezcla de 0,1% de acetato de amonio y agua. El caudal que pasa del agente de elución es de 6,5 ml por minuto, la magnitud de las fracciones es de 6,5 ml. En las fracciones 35 a 42 se encuentra el caloporosido C. La liofilización de las mencionadas fracciones proporciona >95% del caloporosido C puro (7,5 mg).

25 mg de la mezcla de los caloporosidos D y E, aislada y enriquecida según el Ejemplo 5, se aplican sobre una columna con LUNA® 5 \mu C18(2) (tamaño: 10 mm x 250 mm) y se cromatografían con un gradiente de 30 a 40% de acetonitrilo en presencia de una mezcla de 0,1% de acetato de amonio y agua. El caudal que pasa del agente de elución es de 6,5 ml por minuto, y la magnitud de las fracciones es de 6,5 ml. En las fracciones 18 y 19 se encuentra el caloporosido D y en las fracciones 20 a 21 se encuentra el caloporosido E. La liofilización de las fracciones mencionadas proporciona el caloporosido D (7,0 mg) y el caloporosido E (6,0 mg) puros en >95%.

Las propiedades físicas y químicas así como espectroscópicas de las sustancias conforme al invento se pueden recopilar de la siguiente manera:

Caloporosido B:

Fórmula empírica: C_{38}H_{62}O_{16}

Peso molecular: 774,9

Máximos de UV: 208, 244, 310

^{1}H- y ^{13}C-NMR: véase la Tabla 2

El espectro de masas con FAB (bombardeo con átomos rápidos) de elevada resolución muestra un intenso MH^{+} a m/z 775,4120 Da, en buena coincidencia con la masa calculada (para C_{38}H_{63}O_{16}, mono-isotópica) de 775,4116 Da.

Caloporosido C:

Fórmula empírica: C_{43}H_{66}O_{20}

Peso molecular: 902,99

Máximos de UV: 208, 244, 310

^{1}H- y ^{13}C-NMR: véase la Tabla 3

El espectro de masas con FAB de elevada resolución muestra un intenso M+H^{+} a m/z 903,4264 Da, en buena coincidencia con la masa calculada (para C_{36}H_{71}O_{26}, mono-isotópica) de 903,4284 Da.

Caloporosido D:

Fórmula empírica: C_{41}H_{64}O_{19}

Peso molecular: 860,96

Máximos de UV: 208, 244, 310

^{1}H- y ^{13}C-NMR: véase la Tabla 4

El espectro de masas con FAB de elevada resolución muestra un intenso M+Na^{+} a m/z 883,3942 Da, en buena coincidencia con la masa calculada (para C_{41}H_{64}O_{19}Na, mono-isotópica) de 883,3939 Da.

Caloporosido E:

Fórmula empírica: C_{41}H_{64}O_{19}

Peso molecular: 860,96

Máximos de UV: 208, 244, 310

^{1}H- y ^{13}C-NMR: véase la Tabla 4

El espectro de masas con FAB de elevada resolución muestra un intenso M+Na^{+} a m/z 883,3942 Da, en buena coincidencia con la masa calculada (para C_{41}H_{64}O_{19}Na, mono-isotópica) de 883,3939 Da.

Caloporosido F:

Fórmula empírica: C_{38}H_{62}O_{16}

Peso molecular: 774,9

Máximos de UV: 208, 244, 310

^{1}H- y ^{13}C-NMR: véase la Tabla 5

El espectro de masas con FAB de elevada resolución muestra un intenso M+H^{+} a m/z 775,4128 Da, en buena coincidencia con la masa calculada (para C_{38}H_{63}O_{16}, mono-isotópica) de 775,4116 Da.

TABLA 2 Desplazamientos químicos de ^{1}H y ^{13}C del caloporosido B en metanol-d_{4} y DMSO-d_{6} a 300K

2

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) \+  \begin{minipage}[t]{140mm} Para estos protones/átomos de
carbono no se observa ni en MeOD ni en  DMSO ninguna señal
(agregación).\end{minipage} \cr}

TABLA 3 Desplazamientos químicos de ^{1}H y ^{13}C del caloporosido C en metanol-d_{4} a 300K

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) \+ Para estos núcleos no se observa ninguna señal
(ensanchamiento grande de  la señal)\cr  b) \+ Ensanchamiento de la
señal\cr  c) \+  \begin{minipage}[t]{145mm} La señal para los
protones en posición 8'  es observada solamente en la solución
recientemente formulada (intercambio  rápido por deuterio).
\end{minipage} \cr}

TABLA 4 Desplazamientos químicos de ^{1}H y ^{13}C de los caloporosidos D y E en metanol-d_{4} a 300K

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

a) Estas señales no pueden ser asignadas inequívocamente

TABLA 5 Desplazamientos químicos de ^{1}H y ^{13}C del caloporosido F en metanol-d_{4} a 300K

9

10

Ejemplo 8 Bioanálisis en cuanto a inhibidores de CDK-4

Para la determinación del valor de IC_{50}, a partir de las sustancias naturales conformes al invento se preparan soluciones originales en una concentración de 10 mM. Placas de resolución rápida (Flash Plates) de 384 pocillos se cubren con 50 \mul (50 \mug/pocillo) de un substrato peptídico biotinilado a la temperatura ambiente en el transcurso de 2 horas y a continuación se lava 3 veces con un tampón de PBS (de phosphate buffered saline = solución salina tamponada con fosfato). Para la reacción, se añaden con pipeta sobre las placas 30 \mul de una solución diluida con tampón de los derivados de caloporosidos y 20 \mul de una solución previamente mezclada de ATP, ciclina D1 y CDK4 (concentraciones finales: 1 \muCi de 33P-\gamma-ATP, 2 \mum de ATP y 1 \mug de una mezcla de enzimas). Después de un período de tiempo de reacción de 2 horas a 37ºC, las placas se lavan 3 veces, cada vez con 80 \mul de ácido fosfórico al 3% y a continuación se miden durante 30 segundos en un contador MicroBeta. La determinación de la inhibición porcentual se efectúa con ayuda de ecuaciones matemáticas. Para la determinación de los valores de IC_{50} se ensayan unas 10 concentraciones de una solución en DMSO recientemente diluida de las sustancias conformes al invento.

Claims (16)

1. Compuestos de la Fórmula I

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11

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en los que

R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, significan H o radicales acilo con 1 a 10 átomos de C; y

R_{4} significa H ó -C(O)(CH_{2})_{n}COOH, en que n es igual a 1 hasta 7;

con la excepción de que no todos los R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} han de significar H;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

2. Compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1, en el que:

R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, significan H o acetilo; y

R_{4} significa H o malonilo (n = 1);

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

3. Compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en el que:

R_{1} significa acetilo y

R_{2}, R_{3} y R_{4} significan H;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

4. Compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en el que:

R_{1} y R_{3} significan acetilo;

R_{2} significa H; y

R_{4} significa malonilo;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

5. Compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en el que:

R_{1} y R_{2} significan H;

R_{3} significa acetilo; y

R_{4} significa malonilo;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

6. Compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en el que:

R_{1} y R_{3} significan H;

R_{2} significa acetilo; y

R_{4} significa malonilo;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

7. Compuesto de la Fórmula I según la reivindicación 1 ó 2, en el que:

R_{1}, R_{2} y R_{4} significan H; y

R_{3} significa acetilo;

así como sus sales fisiológicamente compatibles.

8. Compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente compatible de éste, que se puede preparar de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-7, fermentando el microorganismo Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, o una de sus variantes o mutantes bajo condiciones apropiadas, aislando uno o varios de los derivados de caloporosidos y transformando a éstos eventualmente en sales fisiológicamente compatibles.

9. Procedimiento para la preparación de un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente compatible de éste de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el microorganismo Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, o una de sus variantes o mutantes, se fermenta en condiciones apropiadas, se aíslan uno o varios de los derivados de caloporosidos y éstos se transforman eventualmente en sales fisiológicamente compatibles.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo en condiciones aerobias a una temperatura comprendida entre 18 y 35ºC y a un valor del pH comprendido entre 5 y 8.

11. Compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente compatible de éste de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-8 para su utilización como medicamento.

12. Compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente compatible de éste de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-8 para su utilización como un agente inhibidor de las CDK's.

13. Utilización de un compuesto de la Fórmula I o de una sal fisiológicamente compatible del mismo de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-8, para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento del cáncer u otras enfermedades con un trastorno patológico de la proliferación celular.

14. Medicamento con un contenido de por lo menos un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente compatible de éste de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-8.

15. Procedimiento para la preparación de medicamentos según la reivindicación 14, caracterizado porque por lo menos un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente compatible de éste de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-8 se lleva a la forma de presentación apropiada junto con materiales auxiliares y/o de vehículo apropiados.

16. El microorganismo Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784.