CN1962684B - 一类三萜皂苷化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有通式(I)的一类新三萜皂苷化合物、其制备方法及其在抗癌领域中的应用：

其中：R₁为

或-ara²--¹rha或-ara²--¹rha³--¹ara，R₂为-glc⁶--¹glc⁴--¹rha。

Description

一类三萜皂苷化合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一类新三萜皂苷化合物、其制备方法及其在抗肿瘤领域中的应用。

背景技术

两头尖为毛茛科植物多被银莲花(Anemone raddeana Regel.)的根茎，始载于明代刘文泰所著《本草品汇精要》。临床上具有祛风湿、消痈肿的作用，用于治疗风湿寒痹，四肢拘挛，痈肿溃烂等疾病，是著名中成药“活络丹”和“再造丸”的主要原料。新华本草纲要记载，中药两头尖多分布于山东、辽宁、吉林、黑龙江等地区。该植物的化学成分有三萜、有机酸类化合物，近年来，国内外学者已经从两头尖中分离出多种三萜皂甙成分，药理实验显示，两头尖总皂甙具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静和抗惊厥作用。

对其进行进一步研究以期开发出具有活性的新化合物一直是本领域的技术人员着力解决的问题。

发明内容

本发明公开了如分子式(I)的一类新化合物、其溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药：

                           (I)

其中：R₁为

或-ara²-¹rha或-ara²--¹rha³--¹ara，R₂为-glc⁶--¹glc⁴--¹rha。

注：ara为α-L-阿拉伯糖；glc为β-D-葡萄糖；rha为α-L-鼠李糖。

上述的化合物不仅是化合物本身，适当时也可以是立体异构体(包括光学异构体，例如对映体和外消旋体)。

下文中为简便起见，本发明限定的任何化合物、其溶剂化物及其立体异构体、互变异构体及前药都简称为本发明的化合物。

本发明还公开了如分子式(I)的这类新化合物的制备方法，包括：

干燥的两头尖药材粉碎后，用乙醇回流提取，提取液减压回收溶剂得乙醇提取浸膏。将其悬浮于水中，分别以等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别回收各部分溶剂后得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。正丁醇萃取物经AB-8大孔树脂柱，依次用水、不同浓度的乙醇梯度洗脱并减压回收乙醇后得浸膏，再反复经硅胶柱层析、Sephadex LH20柱层析和HPLC制备得化合物1、2、3。

本发明还公开了含有上述化合物的药物组合物，其包括上述式(I)化合物作为活性成分和可药用载体。药物组合物的制备方法为本领域常用方法。

本发明的活性化合物可以本身形式给药的，或者以药物组合物形式给药，其中活性化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合的。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。

本发明还公开了涉及上述化合物和药物组合物用于制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

附图说明

附图1：化合物1的¹H-NMR图谱

附图2：化合物1的¹³C-NMR图谱

附图3：化合物1的DEPT图谱

附图4：化合物1的ESI-MS图谱

附图5：化合物1的COSY图谱

附图6：化合物1的HSQC图谱

附图7：化合物1的HMBC图谱

附图8：化合物1的TOCSY图谱

附图9：化合物2的¹H-NMR图谱

附图10：化合物2的¹³C-NMR图谱

附图11：化合物2的DEPT图谱

附图12：化合物2的ESI-MS图谱

附图13：化合物2的COSY图谱

附图14：化合物2的HSQC图谱

附图15：化合物2的HMBC图谱

附图16：化合物2的TOCSY图谱

附图17：化合物3的¹H-NMR图谱

附图18：化合物3的¹³C-NMR图谱

附图19：化合物3的ESI-MS图谱

附图20：化合物3的COSY图谱

附图21：化合物3的HSQC图谱

附图22：化合物3的HMBC图谱

附图23：化合物3的TOCSY图谱

附图24：化合物3的NOESY图谱

具体实施方式

下面的实施例、实验例将对本发明做更详细的说明，它们并不构成对本发明的限制。除非特别言明，本发明中所有百分比均为体积百分比。

实施例

中药两头尖购自：石家庄乐仁堂有限公司

AB-8大孔树脂：南开大学化工厂

柱层析硅胶：青岛海洋化工厂

Sephadex LH-20：安玛西亚公司

薄层层析用硅胶板及色谱纯乙腈：默克公司

熔点仪：BüCHI B-540

HPLC：Waters 996

HPLC色谱柱：Phenomenex 250×21.2mm，10um

INVOA 500型核磁共振波谱仪(Volian公司)，TMS为内标。

ZMD Micromass型质谱仪(英国Micromass公司)。

实施例1：化合物的制备

干燥的两头尖药材4.5Kg粉碎后，用80％乙醇(乙醇/水，以下同)回流提取2次，每次3小时，合并提取液，减压回收溶剂得乙醇提取浸膏580g。将其悬浮于5L水中，分别以等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别回收各部分溶剂后得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。正丁醇萃取物经AB-8大孔树脂柱，依次用水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，40％乙醇洗脱液减压回收乙醇后干燥得干膏，再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水(8∶2∶1，6∶4∶1体积比)洗脱，薄层层析检测合并成5份，第2份高效液相制备，色谱条件30％乙腈-水，检测波长203nm，得到化合物2(15mg)；第3份再经硅胶柱层析(氯仿-甲醇-水7∶3∶1体积比)，薄层层析检测合并成4份，其中第2份经Sephadex LH20柱层析(60％甲醇-水)得化合物1(50mg)，第3份经硅胶柱层析(氯仿-甲醇-水7∶3∶1体积比)得化合物3(30mg)。

实施例2：化合物的波谱解析：

根据理化性质与波谱数据确定化合物结构。

化合物1：白色粉末，mp.228-230℃，Liebermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性，提示分子可能为三萜化合物。酸水解检出阿拉伯糖，鼠李糖，葡萄糖及一苷元。¹³C-NMR谱中给出δ：95.8，101.8，102.8，104.9，104.9，106.4六个糖的端基C信号，与¹H-NMR谱给出六个端基质子δ4.71(d，J＝5.0Hz)，4.98(d，J＝7.5Hz)，5.11(d，J＝8.0Hz)，5.83(brs)，6.14(brs)，6.23(d，J＝8.0Hz)一致，提示化合物含有六个糖。苷元部分给出30个C信号，故确定该化合物为含有六个单糖的三萜皂苷。苷元部分的C信号与齐墩果酸比较，少了一个C-27的甲基信号，多了一个δ64.5连氧碳信号，同时C-8，12，13，14，15位信号都发生了一定变化。C-3位信号也向低场位移至δ88.8，C-28位向高场位移至176.8，其他C信号与齐墩果酸一致，故推测苷元部分可能是C-27位为一个羟甲基的齐墩果酸，并且在C-3，C-28位成苷，是一个含有六个糖的双糖链皂苷。ESI-MS给出m/z：1381[M-1]^-，1401[M+H₂O-1]⁺的准分子离子峰，结合H谱、C谱可推测分子式为C₆₅H₁₀₆O₃₁。

糖链连接位置和连接顺序的确定：该化合物碱水解液减压蒸干后再酸水解只检出葡萄糖及鼠李糖，并且存在负离子碎片峰m/z911[M-rha-glc-glc-1]^-，说明该化合物的28位糖链由两个葡萄糖和一个鼠李糖组成。通过与标准糖的甲基糖苷信号对比，并根据苷化位移规律，可推知可能含有一个末端鼠李糖，一个4位取代的内侧葡萄糖和一个6位取代的内侧葡萄糖，HMBC谱中可以看到δ6.23(1H，d，J＝8.0Hz，内侧葡萄糖H-1)，4.98(d，1H，J＝7.5Hz，中间葡萄糖H-1)，5.83(brs，1H，末端鼠李糖H-1)分别与δ176.8(苷元C-28)，69.2(内侧葡萄糖H-6)，78.6(中间葡萄糖H-4)有远程相关峰，证明28位酯糖链的连接顺序为rha¹-⁴glc¹-⁶glc-苷元。化合物的¹H-NMR中只给出两个特征的鼠李糖上的CH₃信号δ1.62(d，3H)，1.67(d，3H)，表明该化合物总共含有两个鼠李糖，去掉C-28位糖链上的一个鼠李糖证明苷元C-3位糖链上只有一个鼠李糖。推测苷元C-3位的3个糖中含有一个鼠李糖、一个阿拉伯糖和一个葡萄糖。三个糖的C信号与标准糖的甲基苷信号对比，并根据苷化位移规律，可知该化合物存在一个末端鼠李糖，一个末端葡萄糖和一个2，4位取代的阿拉伯糖。在HMBC中可看到δ4.71(d，J＝5.0Hz，2，4位取代的阿拉伯糖H-1)，6.14(brs，末端鼠李糖H-1)，5.11(d，J＝8.0Hz，末端葡萄糖H-1)分别与δ88.8(苷元C-3)，76.3(阿拉伯糖C-2)，79.6(阿拉伯糖C-4)存在远程相关峰，进一步证明糖连接顺序为阿拉伯糖接在苷元3位，鼠李糖与葡萄糖分别接在内侧阿拉伯糖的2，4位。根据糖的端基H的偶合常数和C谱数据判断糖的端基构型分别为葡萄糖β型，阿拉伯糖α型，鼠李糖α型。因此最终确认该化合物为：3-O-α-L-鼠李糖(1-2)-[β-D-葡萄糖(1-4)]-α-L-阿拉伯糖-27-羟基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。

化合物2：白色粉末，mp.234-236℃，Liebermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性，提示分子可能为三萜化合物。酸水解检出阿拉伯糖，鼠李糖，葡萄糖及一苷元。¹³C-NMR谱中给出δ：95.8，101.7，102.8，104.8，104.8五个糖的端基C信号，与¹H-NMR谱给出5个端基质子δ4.58(d，J＝6.0Hz)，4.98(d，J＝7.5Hz)，5.82(brs)，6.08(brs)，6.22(d，J＝8.0Hz)一致，提示化合物含有5个糖。苷元部分给出30个C信号，故确定该化合物为含有5个单糖的三萜皂苷。苷元与化合物1水解得到的苷元共薄层斑点与Rf值一致且¹³C-NMR数据与化合物1的苷元¹³C-NMR数据也一致，确定该化合物苷元为27-羟基齐墩果酸。C-3位信号向低场位移至δ88.6，C-28位向高场位移至176.7，说明在C-3，C-28位成苷，是一个含有5个糖的双糖链皂苷。ESI-MS给出m/z：1239[M+H₂O+1]⁺，1219[M-1]^-的准分子离子峰，结合H谱、C谱可推测分子式为C₅₉H₉₆O₂₆。

糖链连接位置和连接顺序的确定：该化合物碱水解液减压蒸干后再酸水解只检出葡萄糖及鼠李糖，并且存在负离子碎片峰m/z749[M-rha-glc-glc-1]^-，说明该化合物的28位糖链由两个葡萄糖和一个鼠李糖组成。通过与标准糖的甲基糖苷信号对比，并根据苷化位移规律，可推知可能含有一个末端鼠李糖，一个4位取代的内侧葡萄糖和一个6位取代的内侧葡萄糖。HMBC谱中可以看到δ6.22(1H，d，J＝8.0Hz，内侧葡萄糖H-1)，4.98(d，1H，J＝7.5Hz，中间葡萄糖H-1)，5.82(brs，1H，末端鼠李糖H-1)分别与δ176.7(苷元C-28)，69.9(内侧葡萄糖H-6)，78.8(中间葡萄糖H-4)有远程相关峰。推断苷元C-28位酯糖链的连接为rha¹-⁴glc¹-⁶glc-苷元。化合物的¹H-NMR中只给出两个特征的鼠李糖上的CH₃信号δ1.60(d，3H)，1.66(d，3H)，表明该化合物总共含有两个鼠李糖，去掉C-28位糖链上的一个鼠李糖证明苷元C-3位糖链上只有一个鼠李糖。推测苷元C-3位的2个糖中含有一个鼠李糖和一个阿拉伯糖。通过与标准糖的甲基糖苷信号对比，并根据苷化位移规律，确认化合物3位存在一个末端Rha，一个2位被取代的内侧Ara。HMBC谱中可看到δ4.81(d，J＝6.0Hz，阿拉伯糖H-1)，6.08(brs，鼠李糖H-1)分别与δ88.9(苷元C-3)，75.9(阿拉伯糖C-2)有远程相关峰，进一步证实了苷元C-3位糖的连接为Rha¹-²Ara-苷元。根据糖的端基H的偶合常数和C谱数据判断糖的端基构型分别为葡萄糖β型，阿拉伯糖α型，鼠李糖α型。因此最终确认该化合物为：3-O-α-L-鼠李糖(1-2)-α-L-阿拉伯糖-27羟基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：白色粉末，mp.254-256℃，Liebermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性，提示分子可能为三萜化合物。TLC酸水解检出阿拉伯糖，鼠李糖，葡萄糖及一苷元。苷元与化合物1水解得到的苷元共薄层斑点与Rf值一致且¹³C-NMR数据与化合物1的苷元¹³C-NMR数据也一致，确定该化合物苷元为27-羟基齐墩果酸。

糖链连接位置和连接顺序的确定：¹³C-NMR数据显示苷元3位向低场位移至88.7ppm，28位向高场位移至176.6ppm，说明该化合物含有两个糖链且分别连在3位和28位。¹³C-NMR谱中给出δ：95.7，101.4，102.8，104.8，104.9，105.4六个糖的端基C信号，与¹H-NMR谱给出六个端基质子δ4.74(d，J＝6.0Hz)，4.99(d，J＝8.0Hz)，5.85(brs)，5.94(d，J＝4.5Hz)，6.24(d，J＝8.0Hz)，6.29(brs)一致，显示化合物含有六个糖。¹³C-NMR数据与化合物比较，显示28位也存在相同的三糖链(rha¹-⁴glc¹-⁶glc-)，HMBC谱中可以看到δ6.24(1H，d，J＝8.0Hz，内侧葡萄糖H1)，4.99(d，1H，J＝8.0Hz，中间葡萄糖H₁)，5.85(brs，1H，末端鼠李糖H₁)分别与δ176.6(苷元C-28)，69.2(内侧葡萄糖H₆)，78.8(中间葡萄糖H₄)有远程相关峰，也证实了28位酯糖链的连接顺序为rha¹-⁴glc¹-⁶glc-苷元。¹H-NMR中给出两个特征的鼠李糖上的CH₃信号δ1.52(d，J＝6.0Hz)，1.69(d，J＝6.0Hz)表明该化合物总共含有两个鼠李糖，去掉C-28位糖链上的一个鼠李糖证明苷元C-3位糖链上只有一个鼠李糖。推测苷元C-3位的3个糖中含有两个阿拉伯糖和一个鼠李糖。通过与标准糖的甲基糖苷信号对比，并根据苷化位移规律，确认该化合物存在一个末端Ara，一个3位被取代的Rha和一个2位被取代的Ara，在HMBC中可看到δ4.79(d，J＝6.0Hz，2位取代的阿拉伯糖H-1)，6.29(brs，3位取代的鼠李糖H-1)，5.94(d，J＝4.5Hz，末端阿拉伯糖H-1)分别与δ88.7(苷元C-3)，75.2(内侧阿拉伯糖C-2)，81.3(鼠李糖C-3)存在远程相关峰，推断苷元C-3位糖的连接为Ara¹-³Rha¹-²Ara-苷元。根据糖的端基H的偶合常数和C谱数据判断糖的端基构型分别为葡萄糖β型，阿拉伯糖α型，鼠李糖α型。因此最终确认该化合物为：3-O-α-L-阿拉伯糖(1-3)-α-L-鼠李糖(1-2)-α-L-阿拉伯糖-27-羟基齐墩果酸28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。

化合物1-3的¹³C-NMR和¹H-NMR数据如下：

表1化合物1-3苷元部分的¹³C-NMR(C₅D₅N，125MHz)

表2化合物1-3糖部分¹³CNMR数据(C₅D₅N，125MHz)

表3化合物1-3的¹H-NMR(C₅D₅N，500MHz)

实验例：

1、MTT法体外抑瘤实验

实验仪器：CO₂恒温细胞培养箱(美国SHELLAN公司)，RPMI1640培养液(GIBCO公司)，MTT(Sigma公司)。

实验材料：人红白血病细胞K562、人胃癌细胞BGC-823。

实验方法：采用常规MTT法。收集处于对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后用10％的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1.0×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100ul，分别加入不同浓度的样品，阳性对照为浓度20ug/ml的顺铂，阴性对照药为磷酸盐缓冲液。每组均设3个复孔。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72h，于培养结束前4h，各培养孔加入10ulMTT(5mg/ml)，培养结束后，吸去培养上清，每孔加入10％的SDS 100ul，震荡10min，使结晶物充分溶解，放置过夜，最后用酶标仪于490nm波长处测定各孔OD值，进行细胞增殖分析，统计数据并进行t检验。结果见表4：

表4本发明化合物的抗肿瘤活性测定结果

实验结果：结果表4所示，三个化合物在100ug/ml剂量以上对K562和BGC-823两种细胞生长有明显的抑制作用。

2、动物实验

实验材料：小鼠S180，河北医科大学。顺铂，山东省德州制药厂生产，批号030601。清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18-20g，购自河北省实验动物中心，编号DK0402-0007。

实验方法：采用昆明种小鼠皮下接种S-180肉瘤模型。瘤种体外培养至对数生长期，记数，调节细胞数为6×10⁶个/ml，接种于小鼠右前肢腋下，每只0.2ml，随机分成5组，每组动物10只，同时记录每组小鼠体重。设正常对照组和顺铂阳性对照组，三个化合物设5.0mg/Kg剂量组，于接种后次日连续腹腔注射给药8天，第9天脱颈椎处死动物，记录小鼠体重，解剖取出瘤块，称重，计算抑瘤率。结果见表5。

抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)×100％/对照组平均瘤重

表5本发明化合物对昆明种小鼠S180肉瘤抑制作用

组别	剂量(mg/kg)	动物数(n)	体重变化(％)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
						生理盐水	--	10	+5.7	1.51±0.61	---
顺铂	2.0	10	-9.2	0.96±0.51	36.4
						化合物1	5.0	10	-1.6	0.89±0.28	41.0
化合物2	5.0	10	+1.4	1.05±0.38	30.4
						化合物3	5.0	10	-2.7	1.02±0.37	32.4

实验结果：三个化合物对S-180小鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为41.0％，30.4％，32.4％，而对小鼠体重无明显影响。

Claims (5)

1.如下式(I)的化合物：

其中：R₁为

或-ara²--¹rha或-ara²--¹rha³--¹ara，R₂为-glc⁶--¹glc⁴--¹rha，ara为α-L-阿拉伯糖，glc为β-D-葡萄糖，rha为α-L-鼠李糖。

2.一种制备权利要求1化合物的方法，包括将两头尖药材粉碎，用乙醇提取得乙醇提取浸膏；然后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取；正丁醇萃取物经AB-8大孔树脂柱，依次用水、乙醇梯度洗脱并减压回收溶剂得浸膏，再经硅胶柱层析、Sephadex LH20柱层析和HPLC制得。

3.一种药物组合物，其含有权利要求1化合物作为活性成分和可药用载体。

4.权利要求1的化合物或权利要求3所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤药物中的用途。

5.权利要求4的用途，其中所述的肿瘤为以下之一：胃癌、白血病。

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