KR100628209B1

KR100628209B1 - 헤데라게닌3-Ｏ-α-Ｌ-람노피라노실(1→2)-[β-Ｄ-글루코피라노실(1→4)]-α-Ｌ-아라비노피라노사이드 또는 그를 함유하는백두옹 추출물의 고형암 치료제로서의 용도

Info

Publication number: KR100628209B1
Application number: KR1020050090609A
Authority: KR
Inventors: 안병준; 김용; 김송배
Original assignee: 김송배
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2006-09-27
Also published as: KR20050105942A

Abstract

본 발명은 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-α-L-arabinopyranoside) 또는 그를 함유하는 백두옹(Pulsatillae radix) 추출물의 고형암(solid tumors) 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

헤데라게닌 3-Ｏ-α-Ｌ-람노피라노실(1→2)-[β-Ｄ-글루코피라노실(1→4)]-α-Ｌ-아라비노피라노사이드 또는 그를 함유하는 백두옹 추출물의 고형암 치료제로서의 용도{Use of hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-α-L-arabinopyranoside or extracts from Pulsatillae radix containing the same as therapeutic agents for solid tumors}

도 1은 분획 WT의 실리카겔 TLC 패턴을 보여주는 도면이고;

도 2는 세파덱스(Sephadex) LH20 칼럼 분획 SPX3의 실리카겔 TLC 패턴을 보여주는 도면이며;

도 3은 분획 SPX3의 HPLC 크로마토그램이고;

도 4는 SB365의 HPLC 크로마토그램이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-α-L-arabinopyranoside) 또는 그를 함유하는 백두옹 추출물의 고형암(solid tumors) 치료제로서의 용도에 관한 것이다:

백두옹(白頭翁; Pulsatillae radix)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 할미꽃(Pulsatilla koreana)(배기환, 한국의 약용식물, 1999)의 뿌리를 건조한 것이다. 한방에서 백두옹은 청열, 양혈, 해독의 효능이 있는 것으로 알려져 있고 소염, 수렴, 지혈, 지사약으로서 열독성 혈리, 말라리아, 비출혈, 치출혈, 인종(咽腫)의 치료제로 사용되어 왔다. 그 꽃을 백두옹화(白頭翁花)라고 하여 학질, 두창(頭瘡)을 치료하는데 사용하며, 그 잎을 백두옹엽(白頭翁葉)이라고 하여 요슬통풍(腰膝風痛), 부종, 심장통을 치료하는데 사용한다. 또한, 백두옹을 물로 달인 액은 아메바성 적리균에 대한 항균작용이 있고, 트리코모나스에 대해 살충작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

백두옹에는 약 9%의 사포닌(saponins)이 함유되어 있으며, 현재까지 분리된 성분들로는 하기 화학식 2에 나타낸 바와 같은 프로토아네모닌(protoanemonin), 아네모닌(anemonin), 라눈큘린(ranunculin), 헤데라게닌(hederagenin), 베튤린산(betulinic acid) 및 올레아놀산(oleanolic acid) 유도체와 그 배당체 등이 있다:

지금까지 위 성분들의 작용에 대하여 그다지 많은 연구가 이루어지지는 않았으나, 프로토아네모닌은 유사분열독성(mitotoxicity)을 갖는 것으로 보고되어 있으며(Vonderbank, F., Pharmazie, 5, 210, 1950), Li 등(Li, R. Z. 등, Yao Hsueh Hsueh Pao. 28, 326 31, 1993)은 라눈큘린이 KB 세포 등에 대해 세포독성을 나타내며, 그 세포독성 기전은 DNA 중합효소 저해라고 보고한 바 있다.

한편, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드는 Shimizu 등(Chem . Pharm . Bull., 26, 1666, 1978)이 Pulsatilla cerna 와 P. koreana로부터, Yoshihiro 등(J. Nat. Pro., 62, 1279, 1999)이 P. chinensis로부터, 그리고 Ekabo 등(J. Nat. Prod., 59, 431, 1996)은 Serjania salzmanniana Schlecht로부터 분리한 바 있으며, 강 등(Arch. Pharm. Res., 12(1), 42-47, 1989)이 P. koreana로부터 이미 분리하여 그 구조를 재확인한 바 있다. Yoshihiro 등은 위 문헌에서 헤데라게닌 유도체 및 올레아놀산 유도체 등이 HL-60 인간 백혈병(leukemia) 세포에 대해 세포독성을 갖는다고 보고하였다. 이들은 중국 할미꽃 뿌리로부터 분리한 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드가 HL-60 세포에 대하여 ED₅₀ 3.8 ㎍/㎖의 약한 세포독성을 나타낸다고 보고하였다. 그러나 이 정도의 세포독성은 대다수의 사포닌과 많은 종류의 천연물들이 나타내는 일반적인 정도의 것으로서, 이것을 근거로 상기 물질이 항암효과를 갖는다고 말할 수는 없다. 이와 같이, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드가 항암 효과, 특히 고형암에 대한 항암 효과를 갖는다는 사실은 지금까지 전혀 알려진 바 없었다.

본 발명자들은 전호(Anthriscus sylvestris Hoffman), 백두옹을 비롯한 수종의 생약으로부터 데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin)을 분리해내어, 이 물질이 혈관신생(angiogenesis) 억제에 의해 고형암 세포의 성장을 억제한다는 사실을 밝혀내고, 한국특허 제315,200호를 이미 획득한 바 있다. 본 발명자들은 생약으로부터 또 다른 항암 물질을 찾아내기 위하여 지속적인 연구를 수행하던 중, 백두옹으로부터 유기용매에는 잘 녹지 않으면서 물에는 잘 녹는 분획을 얻어 그로부터 항암 물질을 분리해내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 유효성분으로서, 백두옹으로부터 분리된 항암 물질 또는 그를 함유하는 백두옹 분획을 포함하는, 고형암 치료제를 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은 유효성분으로서, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드를 함유하는 백두옹 추출물을 포함하는 고형암 치료제에 관한 것이다.

본 발명에서, 고형암이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암을 가리키며, 그 대표적인 예로 폐암을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드를 함유하는 백두옹 추출물은 백두옹을 에탄올 수용액으로 추출한 후 아세톤을 가하여 침전시켜 수용성 분획(WT)을 제조함으로써 얻을 수 있다. 또는, 백두옹을 에탄올 수용액으로 추출한 후 아세톤을 가하여 침전시켜 수용성 분획을 얻고, 이를 세파덱스(Sephadex) LH20 칼럼을 통과시켜, Rf가 0.48∼0.5이고 황산 분무 후 가열 시 적색을 나타낸 후 청색을 나타내는 분획(SPX3)을 제조함으로써 얻을 수 있다.

둘째, 본 발명은 유효성분으로서, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드를 포함하는 고형암 치료제에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 백두옹을 50% 에탄올로 추출한 후 그 중 아세톤에 용해되지 않는 WT 분획을 얻고, 이를 세파덱스 LH20 상에서 더욱 정제하여 SPX3 분획을 얻었으며, 이로부터 최종적으로 순수 물질인 SB365를 얻었다. 이 물질은 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드로서, 마우스 폐암 세포인 LLC(Lewis Lung Carcinoma) 세포 또는 인체 폐암 세포인 NCI-H23 세포로 발생시킨 고형암에 대하여 임상 약물인 아드리아마이신(adriamycin) 보다 우수한 항암 효과를 나타낸다.

이상과 같이, 백두옹으로부터 항암 분획을 제조하고 그로부터 항암 물질을 분리하기 위하여 다음과 같은 과정을 거친다.

(1) 백두옹으로부터 항암 분획 WT의 제조

백두옹 분말을 50% 에탄올 수용액으로 추출하고 감압 하에서 건조하였다. 얻어진 건조물에 5∼10 배량의 아세톤을 가하여 흔들어 준 후, 3000 rpm에서 원심분리하여 상징액을 제거하고 침전물을 얻었다. 이 침전물에 대하여 상기 조작을 2 회 반복하였다. 최종적으로 얻은 침전물은 물에 잘 용해되므로 분획 WT로 표시하였다. 이 분획은 LLC 세포를 이식한 BDF1 마우스 및 NCI-H23을 이식한 누드 마우스에 대한 항암성 측정 결과 비교적 높은 항암성을 나타내었다.

(2) 분획 WT로부터 분획 SPX3 의 제조

분획 WT로부터 일정량을 취하여 여러 농도의 메탄올 수용액 일정량에 용해시킨 후, 동일한 용매로 안정화시킨 세파덱스 LH20 칼럼에 가하고 분획을 행하였다. 이 때 80% 메탄올 수용액 사용 시 분리 효과가 가장 좋았으며, 분획 WT 500 ㎎을 취한 경우 칼럼의 채운 크기는 60×4 ㎝가 적합하였다. 그 결과, 분획 SPX1(시험관 번호 66-91), SPX2(시험관 번호 66-91), SPX3(시험관 번호 91-111) 및 SPX4(시험관 번호 111-138)를 얻었다. 그 중 SPX3는 황산 분무 후 가열 시 처음에는 적색을 나타내다가 시간이 경과하면 청색을 나타내며, Rf 값이 0.48∼0.50인 반점을 주 물질로 하는 분획으로서, LLC 세포를 이식한 BDF1 마우스 및 NCI-H23을 이식한 누드 마우스에 대한 항암성 측정 결과 높은 항암성을 갖는 것으로 나타났다.

(3) 분획 SPX3 로부터 활성 물질 SB365 의 단리

항암성을 나타낸 SPX3 분획으로부터 항암 물질을 단리하기 위하여, HPLC를 수행하여 순수한 물질 SB365를 얻었다. SB365의 구조를 확인하기 위하여, 리베르만-부흐카르트(Liebermann-Burchard) 반응, IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 에탄올/황산 가수분해를 수행한 결과, SB365는 백두옹에서 이미 분리된 바 있는 사포닌 성분인 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드인 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 백두옹 추출물이나 그로부터 분리된 순수 물질 SB365는 고형암 세포에 대하여 세포독성을 거의 나타내지 않음에도 불구하고, 동물실험에서 우수한 항암 효과를 나타내는 점을 특징으로 한다. 그러므로 임상에서 사용하고 있는 기존 항암제들이 혈액세포 감소를 통해 면역기능을 저하시키는 문제점을 개선할 수 있으며, 조혈세포 등과 같이 세포분열 속도가 빠른 세포에 대하여 작은 독성을 보일 것으로 기대된다.

본 발명의 백두옹 추출물과 SB365는 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 배합하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사 시 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등과 같은 형태의 주사용 제제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등과 같은 다양한 제제로 제형화할 수 있다. 특히, 본 발명의 활성성분은 수용성이므로, 생리식염수, 링거액, 영양제 등의 다양한 수액에 용해시켜 간편하게 사용될 수 있다. 이러한 약제학적 제제는 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용될 수 있다.

본 활성 성분의 사람에 대한 추천 용량은 SB365의 경우 3.5∼8.0 ㎎/㎏ 체중이고, SPX3의 경우 20∼40 ㎎/㎏ 체중이며, WT의 경우 200∼300 ㎎/㎏ 체중이다. 최적 용량은 WT의 경우 250 ㎎/㎏ 체중이고, SPX3의 경우 25 ㎎/㎏ 체중이며, SB365의 경우 6.5 ㎎/㎏ 체중이다. 그러나 상기 투여 용량은 투여 대상의 나이, 체중, 식이, 건강상태, 질병의 중증도 등을 고려하여 적의 증감될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: WT 분획의 제조

백두옹 분말 50 g을 50% 에탄올 수용액 500 ㎖로 3 회 추출하고 감압 하에서 건조하여 건조물 22 g을 얻었다. 이 건조물에 아세톤 300 ㎖를 가하여 흔들어 준 후 3000 rpm에서 원심분리하여 상징액을 제거하고 침전물을 얻었다. 이 침전물에 대하여 상기 조작을 2 회 반복한 후, 아세톤 층은 버리고 불용분을 건조하여 건조물(WT 분획) 17.8 g을 얻었다. 얻어진 WT 분획에 대하여 실리카겔 TLC를 수행하였으며(전개용매; 부탄올:아세트산:물=4:1:1, 색반응; 황산을 분무한 후 가열함), 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, Rf 값이 0.48∼0.50 사이에 있는 청색 반점이 후술하는 작용물질에 해당한다. WT 분획은 하기 실험예 1에 나타낸 바와 같이, LLC 세포를 이식한 BDF1 마우스에 대해 비교적 높은 항암 활성(암성장 억제율(inhibition rate of tumor growth): 57%)을 나타내었다.

실시예 2: SPX 분획의 제조

분획 WT 560 ㎎을 메탄올:물=80:20을 사용하여 세파덱스 LH20 칼럼(200 g, 60×4 cm)에서 유출속도를 1 분당 1 ㎖, 분획량을 한 개의 튜브당 0.5 ㎖로 하여 분획을 행하였다. 이들 분획을 차례대로 실리카겔 박막 상에 점적한 후 전개하여 분획을 나누었다(전개용매; 부탄올:아세트산:물=4:1:1, 색반응; 황산을 분무한 후 가열함). 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서, SPX1(139 ㎎, 24.8%)은 시험관 번호 26∼66을 모은 것으로 주 반점은 4 개이고 아래 것은 황산과 황색으로 반응한다. SPX2(344 ㎎, 61.4%)는 시험관 번호 66∼91을 모은 것으로 2 개의 주 반점으로 구성되는 분획이다. SPX3(61 ㎎, 10.9%)는 시험관 91∼111을 모은 것이며 황산 분무 후 가열시 처음에는 적색을 나타내다가 시간이 경과하면 청색을 나타내며, Rf 값이 평균적으로 0.48∼0.50 사이에 있는 반점을 주 물질로 하는 분획이다. SPX4(15.7 ㎎, 2.8%)는 시험관 111∼138을 모은 분획이며, SPX3 와 SPX4는 박막 상 에서는 한 개의 반점을 보이는 비교적 순도가 높은 분획들이다.

하기 실험예 1에 나타낸 바와 같이, SPX3는 투약 후 15 일째에 암성장 억제율 60%를 보임으로써 강한 항암성을 나타내었으며, SPX1, SPX2 및 SPX4는 작용이 없는 것으로 보아 황산에 대해 청색 반응을 나타내는 물질이 항암 물질임을 추정할 수 있었다. 이러한 SPX3 분획은 그 자체로 항암제로 사용할 수 있다.

실시예 3: SB365 의 단리

SPX3 분획으로부터 순수 물질을 분리하기 위하여 아래와 같이 HPLC를 행하였다. 즉, 고정상으로는 실리카겔(RP-C₁₈, 250×10 ㎜, Metachem사)을, 이동상으로는 메탄올:물= 80:20을 사용하고, 검출파장은 210 ㎚, 유속은 1 ㎖/분이었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, SPX3는 3 개의 주 물질로 구성되어 있다. 실제 분획량으로 보면 rt 8.5 분, 10.4 분의 피크는 소량의 물질을 함유하고 있었으며, rt 23.3 분의 피크에 해당하는 물질이 주 물질이었다. 그러므로 후자가 항암 물질일 가능성이 크다고 생각하였다. 이와 같이 활성 물질일 가능성이 높고 황산에 청색으로 반응하는 23.3 분대의 물질을 포집하여 SPX3 31 ㎎으로부터 SB365 2.8 ㎎을 얻었다. 포집한 23.3 분대의 분획을 건조한 후 순도를 확인하기 위하여 동일한 조건 하에서 다시 HPLC를 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었으며, 이로부터 SB365가 순수한 물질임이 확인되었다. 이렇게 하여 얻은 SB365를 하기 구조 동정 및 항암 실험에 직접 사용하였다.

하기 실험예 1 및 2에 나타낸 바와 같이, SB365는 LLC 세포를 이식한 BDF1 마우스 및 NCI-H23 세포를 이식한 누드마우스에서 각각 81% 및 82.1%의 암성장 억제율을 나타내어 우수한 항암 활성을 나타내었다.

실시예 4: 활성 물질 SB365 의 구조 동정 및 확인

상기에서 분리한 물질 SB365는 m.p. 239∼241 ℃, [α]_D=+23.6 °(c, 0.2, MeOH)의 백색 무정형으로 리베르만-부카르트 반응에서 양성으로 나타난 것으로 보아 배당체로 확인되었다. 또한, IR(cm^-1)에서는 3400(br, -OH), 2940(br, C-H), 1695(C=O), 1455, 1040(C-O)에서 관찰되었으며, 1000-1100, 3000-3400상의 흡수대를 보면 배당체일 가능성이 큰 것으로 판단하였다.

¹H-NMR을 보면 전형적인 사포닌의 NMR 패턴을 따르고 있으며, 6 개의 -CH₃기들이 0.91, 0.92, 0.98, 1.00, 1.07, 1.21 ppm에서 관찰되었고, 또 하나의 -CH₃기가 1.64 ppm에서 더블렛(doublet)으로 관찰되었는데 이로부터 구성 당 중 1 개의 람노스가 존재할 것으로 추정되었으며, 아노머 프로톤(anomeric proton)이 6.25(br.), 5.11(1H, J=7.80 Hz)와 4.97 ppm(1H, J=6.66 Hz)에서 관찰되었다. 따라서 SB365는 3 개의 당이 결합된 배당체인 것으로 확인되었다.

¹³C-NMR에서는 65.4 ppm(C-23)에서 하이드록시메틸기가 관찰되었으며 3 개의아노머 탄소 시그널들이 각각 140.2(C-1′), 106.7(C-1″′), 101.7 ppm (C-1′)에 서, 두 개의 올레핀 탄소가 122.5 ppm(C-12)과 144.8 ppm(C-13)에서 관찰되었고, 하나의 카복시 탄소가 180.2 ppm(C-28)에서 관찰되었다. 통상적으로 28 위치에 당이 결합될 때 약 4 Hz의 글리코실화 업필드 쉬프트(glycosylation upfield shift)가 나타나지만(180.2 ppm→176.2 ppm), 이 화합물에서는 위와 같은 현상이 발견되지 않은 것으로 보아 28 위치에 당이 결합된 배당체는 아닌 것으로 확신할 수 있었다.

다음으로 당의 구성과 아글리콘(aglycone)의 구조를 확인하기 위하여 에탄올/황산에서 가수분해를 수행하였다. 가수분해 산물인 아글리콘의 물리화학적 데이터와 ¹³C-NMR과 ¹H-NMR을 비교해본 결과 SB465가 헤데라게닌임을 확인하였다. 또한, 가수분해된 당은 비교 TLC에 의하여 람노스, 아라비노스 및 글루코스인 것으로 확인되었다.

이상의 결과와 발표된 문헌의 데이터를 종합 분석한 결과, SB365는 본 식물로부터 이미 분리된 바 있는 사포닌인, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드임을 확인하였다.

*SB365의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 데이터는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

실험예 1: LLC 세포를 이식한 BDF1 마우스에 대한 항암활성

실험에 사용한 마우스 종은 BDF1 마우스로 수컷 중 체중 18∼25 g에 속하는 건강한 것이었다. 이들 동물을 23∼24 ℃로 온도 조절이 된 곳에서 물과 먹이를 제한 없이 공급하고 사료는 항생제 무첨가 마우스용을 사용하여 사육하였다. C57BL/6 마우스의 피하에 14 일간 배양된 LLC 세포를 함유한 조직을 취한 후 조직 1 g당 5 ㎖의 멸균된 냉 생리식염수를 가하여 세포 현탁액을 제조하였다. 이 세포 현탁액 0.2 ㎖를 BDF1 마우스의 서혜부에 피하로 이식하였다.

이식 후 24 시간부터 각 군을 5 마리로 나눈 후, 시료를 생리식염수에 용해시킨 후 WT는 280 ㎎/㎏, SPX 분획들은 각각 70 ㎎/㎏(SPX1), 171 ㎎/㎏(SPX2), 30.5 ㎎/㎏(SPX3) 및 8.1 ㎎/㎏(SPX4), SB365는 6.4 ㎎/㎏으로 복강내 주사하였다. 음성 대조군에는 생리식염수만을, 양성 대조군에는 아드리아마이신(0.5 ㎎/㎏ 체중)을 주사하였다. 주사 일정은 암 이식 24 시간 후부터 매일 1 회 7 일간 투여한 후 하루 휴약하고, 다시 6 일간 연속적으로 투여하였다. 마우스에 대한 SB365의 독성을 측정하기 위해 1 주일에 2 회 몸무게를 측정하였으며, 항암 효과는 약물 투여 14 일 및 15일에 대조군과 약물 처치군의 암 부피를 측정한 후 다음과 같이 계산하였다.

암 부피(㎣)=길이(㎜)×폭²(㎟)/2

암성장 억제율(%)=(C-T)×100/C

(C; 대조군의 평균 암 부피, T; 시료 투약군의 평균 암 부피)

그 결과를 표 2에 나타내었다.

백두옹 분획과 SB365의 LLC 세포를 이식한 BDF1 마우스에 대한 암성장 억제율(IR, %)

분획 및 물질	마우스 수	암성장 억제율(%)
분획 및 물질	마우스 수	14 일^a)	15 일
WT	5	56	55
SPX1	5	10	12
SPX2	5	25	30
SPX3	5	57	60
SPX4	5	8	10
SB365	5	82	79
아드리아마이신	5	60	64

^a): 암세포 이식 후 일수

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 WT와 SPX3 분획은 암세포 이식 후 15 일째에 55% 및 60%의 암성장 억제율을 나타내었고, SB365는 아드리아마이신의 64% 보다도 높은 79%의 암성장 억제율을 나타내었다.

실험예 2: NCI- H23 세포를 이식한 누드 마우스에 대한 항암활성

실험동물로는 5 주령의 체중 16∼25 g인, 미국 Harlan사의 암컷 누드 마우스를 사용하였다. 실험동물은 1 주일 이상 무균 동물실에서 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 동물실의 온도는 22±2 ℃, 습도는 55±5%이었고, 명암은 12 시간 주기로 자동 조절하였다. 실험동물용 고형 사료는 방사선 멸균 제품이었으며 음수는 고압증기멸균기로 멸균하였다. 사료와 음수는 자유 섭취시켰다. 세포주는 미국 국립암연구소(NCI)에서 공급받아 생명공학연구소에서 보존중인 인체 암세포주를 사용하였다.

인체 암세포 중 폐암 세포인 NCI-H23를 누드 마우스에 이식하였다. 3×10⁷ 세포/㎖의 암세포를 마우스 20 g당 0.3 ㎖씩 피하로 이식하였다. 시료는 1.6, 3.2, 6.4 ㎎/㎏의 농도(0.032, 0.064, 0.128 ㎎/20 g 체중)로 처리하였는데, 암세포 이식 후 8 일째를 제외하고 1 일부터 14 일까지 13 일 동안 매일 복강으로 주사하였다. 처리 기간 중 형성된 종양의 크기는 개체별로 측정하였으며 처리 동물의 체중 변화도 측정하였다. 암세포 이식 후 16 일째에 누드 마우스를 희생시켜 종양을 분리하여 무게를 측정하였다. 양성 대조군에는 아드리아마이신을 0.5 ㎎/㎏ 체중의 용량으로 첫째 날부터 1, 5, 9 및 14 일째 되는 날에 복강으로 투여하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

SB365의 NCI-H23 세포를 이식한 누드 마우스에서의 암성장 억제율(IR, %)

그룹	NCI-H23에 대한 암성장 억제율 (%)
그룹	음성 대조군	아드리아마이신 (0.5 ㎎/㎏)	SB365 (1.6 ㎎/㎏)	SB365 (3.2 ㎎/㎏)	SB365 (6.4 ㎎/㎏)
16 일^a)	-	61.5	40.1	52.3	82.1

^a): 암세포 이식 후 일수

표 3에 나타낸 바와 같이, SB365는 6.4 ㎎/㎏으로 투여 시 암세포 이식 후 16 일째에 82.1%에 달하는 높은 암성장 억제율을 나타내었다.

실험예 3: 세포독성 실험

실험에 사용한 암세포인 A549, SK-MEL-2 및 MCF7은 생명공학연구소에서 분양 받아 사용하였다. 배양액은 멸균 주사용 증류수에 L-글루타민이 포함된 RPMI 1640 배지 한 봉지, 50 ℃ 수조에서 30 분간 가열하여 불활성화시킨 우태아혈청(FBS) 100 ㎖, NaHCO₃ 2 g, 페니실린 10만 단위, 스트렙토마이신 100 ㎎을 가하여 용해시킨 후, 0.1 N 염산으로 pH를 조절하여 전체를 1 ℓ가 되게 하고 세균 여과하여 제조하였으며, 4 ℃에서 보관하면서 사용하였다. 세포는 3 일에 한 번씩 계대 (propagation)하여 유지하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기 위하여 인산 완충 식염수(PBS)에 0.5% 트립신과 2% EDTA를 녹인 용액을 사용하였다.

암세포에 대한 독성실험은 1989년에 미국 국립암연구소에서 약물의 in vitro 항암활성을 측정하기 위하여 개발된 설포로다민(sulforrhodamine)-B(SRB)법을 사용하였다. 실험에 사용할 세포들을 0.5% 트립신-EDTA 용액으로 부착면으로부터 분리시키고 3∼5×10⁴ 세포/㎖의 세포 현탁액을 제조한 후, 96 웰 플레이트의 각 웰에 180 ㎕씩 가하여 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 시료는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 실험에 필요한 농도까지 실험용 배지 또는 3차 증류수로 희석하여 최종 DMSO의 농도가 0.2% 이하가 되도록 단계별로 희석하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 단계별 농도로 희석한 시료를 각각 20 ㎕씩 넣어준 후, 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 48 시간 배양하였다. 시료를 가한 시점에서 Time zero(Tz) 플레이트를 수집하였다. Tz 플레이트 및 배양이 끝난 후 각 플레이트의 배지를 제거하고 10% 트리클로로아세트산(TCA)을 각 웰당 50 ㎕씩 가하여 4 ℃에서 1 시간 동안 방치하여 세포들을 플레이트의 바닥면에 고정시켰다. 세포의 고정이 끝난 후 플레이트를 물로 5∼6 회 세척하여 남아 있는 TCA 용액을 완전히 제거하고 실온에서 남은 물기가 없도록 건조시켰다. 완전히 건조된 플레이트는 웰당 50 ㎕의 1% 아세트산 용액에 0.4% SRB를 녹인 염색 용액을 가하여 30 분간 세포를 염색하고 다시 1% 아세트산 용액으로 수회 세척하여 세포에 결합하지 않은 SRB를 모두 제거하였다. 이렇게 염색한 후 플레이트를 다시 실온에서 건조시켰다. 여기에 10 mM 트리스 용액 100 ㎕를 가해 염료를 녹여 마이크로플레이드 리더로 520 nM에서 광학 밀도(O.D.) 값을 측정하였다. 암세포에 대한 ED₅₀(50% effective dose) 값은 다음과 같이 계산하였다. 시료를 가하여 배양을 시작하는 시간에 수집하여 SRB 단백질 양을 측정하여 그 값을 Tz로 하였다. 즉, 초기의 살아 있는 세포수를 초기값(Tz)으로 정하였다. 시료를 처리하지 않고 배양한 O.D. 값을 대조군(C)으로 하고 시료를 처리하고 배양한 웰의 O.D. 값을 약물 처리된 실험값(T)으로 하였다. Tz, C 및 T로부터 다음의 수식에 의해 물질들의 세포독성 정도를 측정하였다. 즉 Tz≥T인 경우에는 (T-Tz)/(C-Tz)×100의 수식으로 계산하고 Tz<T인 경우에는 (T-Tz)/Tz×100의 수식으로 계산하였다. 이렇게 계산된 값들로부터 로터스 프로그램의 데이터 회귀 기능을 이용하여 약물의 암세포 성장을 50% 억제하는 농도인 ED₅₀ 값을 계산하여 각 물질들의 세포독성 정도를 비교하였다.

분리한 물질은 A549 사람 폐암 세포에 대하여는 ED₅₀>20 ㎍/㎖, 살마의 흑색종 세포인 SK-MEL-2에 대하여는 ED₅₀>10㎍/㎖, 및 사람의 유방암 세포인 MCF7에 대하여는 ED₅₀>10㎍/㎖를 나타내어, 사실상 고형암 세포에 대한 세포독성은 없는 것으로 판단되었다.

제제예 1: WT 분획을 함유하는 주사용 용액의 제조

실시예 1에서 얻은 WT 분획 250 ㎎을 생리식염수 10 ㎖에 용해시켜 주사용 용액을 제조하였다.

제제예 2: SPX3 분획을 함유하는 주사용 건조분말의 제조

실시예 2에서 얻은 SPX3 분획 25 ㎎을 링거액 10 ㎖에 용해시킨 후 동결건조하여 즉시 사용형 주사용 건조분말을 제조하였다. 이 분말은 주사 시 주사용 증류수로 재조제하여 사용한다.

제제예 3: SB365 를 함유하는 주사용 용액의 제조

실시예 3에서 얻은 SB365 6.5 ㎎을 링거액 10 ㎖에 용해시켜 주사용 용액을 제조하였다.

본 발명에 따른 백두옹 분획 WT 및 SPX3, 및 이로부터 분리된 SB365, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드는 고형암 세포에 대하여 높은 암성장 억제율을 나타낼 뿐 아니라, 수용성이므로 생리식염수, 링거액 또는 영양제와 같은 다양한 수액에 용해시켜 간편하게 사용될 수 있으며, 세포독성이 낮아 기존 항암제의 부작용을 경감시킬 수 있어, 고형암에 대한 치료제로서 매우 유용할 것으로 기대된다.

Claims

유효성분으로서, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드를 함유하고,

백두옹(Pulsatillae radix)을 에탄올 수용액으로 추출한 후 아세톤을 가하여 침전시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 백두옹의 수용성 분획을 포함하되,

상기 백두옹의 수용성 분획을 1 일 용량 200∼300 ㎎/㎏ 체중으로 투여하는 고형암 치료제.
삭제
제1항에 있어서, 백두옹의 수용성 분획이 추가로 세파덱스(Sephadex) LH20 칼럼을 통해 통과시켜 얻어지는, Rf가 0.48∼0.50(전개용매; 부탄올:아세트산:물=4:1:1)이고, 황산 분무 후 가열 시 적색을 나타낸 후 청색을 나타내는 분획인 치료제.
제3항에 있어서, 백두옹의 수용성 분획을 1 일 용량 20∼40 ㎎/㎏ 체중으로 투여하는 치료제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생리식염수, 링거액 및 영양제로 구성된 그룹으로터 선택되는 수액에 용해시켜 투여하는 치료제.