CN113061153B - 吲哚苷类化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然提取物技术领域，具体而言，涉及吲哚苷类化合物、其制备方法及其应用。吲哚苷类化合物为下述结构式所示化合物中的任意一种：

和

其为一种新的化合物，其丰富了七叶树属植物的化学多样性，同时，该化合物具有良好的神经保护活性和抗肿瘤活性，可以用于神经保护和抗肿瘤的药物的制备。

Description

吲哚苷类化合物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及天然提取物技术领域，具体而言，涉及吲哚苷类化合物、其制备方法及其应用。

背景技术

娑罗子是七叶树科植物七叶树Aesculus Chinenis Bge.的干燥成熟的种子。据《本草纲目》记载，娑罗子性温味甘，归肝、胃经。具有疏肝、解郁、和胃、止痛的功效，用于治疗胸闷胁痛、脘腹胀痛，妇女经前乳房胀痛。本品既能疏肝解郁以行滞，又能理气宽中以和胃。治疗肝胃气滞之胸闷胁痛、脘腹胀痛等证。现代研究证实娑罗子提取物具有抗炎、抗渗、抗肿瘤、增加静脉张力、胃肠道保护、缺血损伤保护等药理作用，临床上用于治疗脑出血、脑水肿、肢体肿胀、瀑泄、放射性直肠炎、美尼尔氏病、支气管哮喘、周围性面神经炎、烧伤等多种疾病。

目前研究的娑罗子的化学成分主要包含皂苷类、黄酮类、有机酸类等，且大多具有显著的生物活性，如抗炎、消肿、抗渗出、保护血管、降低血粘度、促皮质素作用等。但这些成分都是从娑罗子大极性部分提取物(例如正丁醇萃取物)中研究得到的，但对娑罗子小极性部分提取物研究的比较少。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供吲哚苷类化合物、其制备方法及其应用。本发明实施例提供一种新的化合物，其丰富了七叶树属植物的化学多样性，同时，该化合物具有良好的神经保护活性和抗肿瘤活性，可以用于神经保护和抗肿瘤的药物的制备。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种吲哚苷类化合物，其为下述结构式所示化合物中的任意一种：

第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的吲哚苷类化合物的制备方法，对娑罗子的提取物进行后处理得到所述吲哚苷类化合物。

在可选的实施方式中，所述提取物为所述娑罗子的醇-水提取物。

在可选的实施方式中，所述提取物的制备方法包括：将所述娑罗子与醇-水溶液混合进行多次浸提得到提取物；

所述提取物的制备方法包括：将每千克所述娑罗子与1.5-2.5升醇-水溶液混合在25-30℃的条件下进行至少3次浸提，并合并每次浸提得到的浸提液，每次浸提的时间为20小时以上；

优选地，所述醇-水溶液为醇的质量含量为55-65％的醇溶液。

在可选的实施方式中，所述后处理包括对所述提取物依次进行浓缩、萃取、柱层析分离和液相色谱分离。

在可选的实施方式中，萃取包括：浓缩后，利用醚类物质进行初萃，而后再利用酯类物质进行对初萃得到的水相进行深度萃取，并收集酯类物质部位的萃取物；

优选地，深度萃取的步骤包括：利用乙酯类溶剂对所述水相进行萃取，收集乙酯类溶剂部位的第一萃取物，再利用乙酯类溶剂对所述第一萃取物再次进行萃取，接着收集乙酯类溶剂部位的第二萃取物；

优选地，所述乙酯类溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯和丙酸乙酯中的任意一种。

在可选的实施方式中，柱层析分离包括：利用多氯取代甲烷-醇类混合溶剂对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到多个组分；

优选地，柱层析分离包括：将多氯取代甲烷和醇类溶剂以490-510:1、190-210:1、45-55:1、8-12:1和5.5-6.5:4的体积比混合，而后对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到16个组分；

优选地，柱层析分离包括：将多氯取代甲烷和醇类溶剂以500:1、200:1、50:1、10:1、6:4的体积比混合，而后对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到16个组分；

优选地，所述多氯取代甲烷为二氯甲烷或三氯甲烷；所述醇类溶剂为C1-C5一元醇溶剂；

优选地，所述醇类溶剂为甲醇。

在可选的实施方式中，液相色谱分离：利用醇-水混合溶剂对柱层析分离得到的第9个组分进行第一次梯度洗脱，并收集第二组分，而后再利用醇-水混合溶剂对所述第二组分进行第二次梯度洗脱；

优选地，第一次梯度洗脱的洗脱条件为0-10min 20％醇类溶剂；10-15min 20～80％醇类溶剂；15-35min 80％醇类溶剂；

优选地，第二次梯度洗脱的洗脱条件为：0-30min 20～100％醇类溶剂；30-40min100％醇类溶剂；

优选地，所述醇类溶剂为C1-C5一元醇溶剂；

优选地，所述醇类溶剂为甲醇。

第三方面，本发明提供前述实施方式所述的吲哚苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用；

优选地，所述的吲哚苷类化合物作为唯一的活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用。

第四方面，本发明提供前述实施方式所述的吲哚苷类化合物在制备保护神经的药物中的应用；

优选地，所述的吲哚苷类化合物作为唯一的活性成分在制备保护神经的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种新的化合物，该化合物为首次从娑罗子中提取得到的新的化合物，该化合物丰富了七叶树属植物的化学多样性，且该化合物具有良好的神经保护活性和抗肿瘤活性，可以用于神经保护和抗肿瘤的药物的制备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的化合物1的核磁氢谱图；

图2为本发明实施例提供的化合物1的核磁碳谱图；

图3为本发明实施例提供的化合物1的HSQC谱图；

图4为本发明实施例提供的化合物1的HMBC谱图；

图5为本发明实施例提供的化合物1的质谱图；

图6为本发明实施例提供的化合物1的圆二色谱图；

图7为本发明实施例提供的化合物2的核磁氢谱图；

图8为本发明实施例提供的化合物2的核磁碳谱图；

图9为本发明实施例提供的化合物2的HSQC谱图；

图10为本发明实施例提供的化合物2的HMBC谱图；

图11为本发明实施例提供的化合物2的质谱图；

图12为本发明实施例提供的化合物2的圆二色谱图；

图13为本发明实施例1提供的高效液相分离的色谱图；

图14为本发明实验例1提供的化合物1和化合物2对HepG2细胞增殖的影响结果图；

图15为本发明实验例1提供的化合物1和化合物2对HCT-116细胞增殖的影响结果图；

图16为本发明实验例1提供的化合物1和化合物2对HeLa细胞增殖的影响结果图；

图17为本发明实验例2提供的化合物1和化合物2神经保护作用的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种新的吲哚苷类化合物，其为下述结构式所示化合物中的任意一种：

本发明实施例还提供一种上述吲哚苷类化合物的制备方法，包括：

对娑罗子进行提取，具体地，将所述娑罗子与醇-水溶液混合进行多次浸提得到提取物；例如，将每千克所述娑罗子与1.5-2.5升醇-水溶液混合在25-30℃的条件下进行至少3次浸提，并合并每次浸提得到的浸提液，每次浸提的时间为20小时以上；其中，所述醇-水溶液为醇的质量含量为55-65％的醇溶液。采用上述溶剂和方法进行提取能够保证所需的化合物在浸提液中，继而保证能够顺利从娑罗子中提取得到所需的化合物。上述醇可以采用甲醇、乙醇以及丙醇等一元醇中的任意一种。

而后对娑罗子的提取进行后处理，即对上述娑罗子的醇-水提取物进行后处理。

具体地，后处理包括浓缩，其中，浓缩的步骤包括：去除所述提取物中的溶剂得到浓缩物；去除浸提液中的溶剂，可以是用旋转蒸发仪将水和醇类溶剂全部去除，也可以仅去除醇味即去除醇类溶剂，也就是部分去除溶剂。

浓缩后进行萃取，具体地，利用醚类物质进行初萃，即将上述浓缩物与水混合，而后加入醚类物质脱脂，该醚类物质可以是石油醚等常规的醚类物质。而后再将利用酯类物质进行对初萃得到的水相进行深度萃取，并收集酯类物质部位的萃取物。利用酯类物质进行萃取的次数，可以是一次，也可以多次。多次是对酯类物质部位的萃取物再进行萃取，并再收集酯类物质部位的萃取物。例如，利用乙酯类溶剂对初萃得到的水相进行第一次萃取，收集乙酯类溶剂部位的第一萃取物，再利用乙酯类溶剂对所述第一萃取物再次进行萃取，接着收集乙酯类溶剂部位的第二萃取物；采用上述多次萃取能够尽可能地将浸提液中所需的化合物萃取出来，继而有利于提升纯度，减少杂质的含量。

需要说明的是，上述第一和第二仅仅是为了区分萃取次数对应的萃取物，序号可以随着萃取次数的增减。

其中，所述乙酯类溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯和丙酸乙酯中的任意一种。上述乙酯类溶剂仅仅为本发明实施例的举例，其他可以实现萃取并能得到所需化合物的乙酯类溶剂也在本发明实施例的保护范围内。

萃取后，对乙酯类溶剂部分的萃取物进行柱层析分离，采用多氯取代甲烷-醇类混合溶剂对上述第二萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到多个组分；具体地，将多氯取代甲烷和醇类溶剂以490-510:1、190-210:1、45-55:1、8-12:1和5.5-6.5:4的体积比混合，而后对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到16个组分；例如，柱层析分离包括：将多氯取代甲烷和醇类溶剂以500:1、200:1、50:1、10:1、6:4的体积比混合，而后对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到16个组分。其中，上述多氯取代甲烷为二氯甲烷或三氯甲烷；所述醇类溶剂为C1-C5一元醇溶剂；优选地，所述醇类溶剂为甲醇。

接着，对柱层析分离得到的第9个组分进行液相色谱分离，具体地，利用醇-水混合溶剂对柱层析分离得到的第9个组分进行第一次梯度洗脱，并收集第二组分，而后再利用醇-水混合溶剂对所述第二组分进行第二次梯度洗脱；其中，第一次梯度洗脱的洗脱条件为0-10min 20％醇类溶剂；10-15min 20～80％醇类溶剂；15-35min 80％醇类溶剂；优选地，第二次梯度洗脱的洗脱条件为：0-30min 20～100％醇类溶剂；30-40min 100％醇类溶剂；所述醇类溶剂为C1-C5一元醇溶剂；所述醇类溶剂为甲醇。

采用上述液相分离方法有利于分离得到所需的化合物，上述％指的是醇的质量百分数。

进一步地，此化合物能够抑制肿瘤细胞生长，继而可以作为抗肿瘤药物的活性成分，制备抗肿瘤药物。该化合物还能够保护神经，也可以用于制备神经保护的药物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明实施例提供2个吲哚苷类化合物，其结构式依次如下所示：

(记为化合物1)和

(记为化合物2)。

本实施例还提供上述两个化合物的制备方法，包括：

取12.0kg干燥的娑罗子中药材粉碎，在室温下，用质量分数为60％的乙醇溶液，每25L浸提3次，每次浸提时间为24h。过滤并合并浸提液，浓缩至无醇味，将浓缩物与1.5L水混合，而后加入1.5L石油醚萃取，充分振摇混合，放置4h，按上述方法重复萃取3次脱脂，得到接近1.5L水相，而后与1.5L乙酸乙酯混合萃取3次(此处1.5L乙酸乙酯混合萃取3次是：1.5L的乙酸乙酯分为3次添加，每次添加0.5L，即将0.5L乙酸乙酯与水相萃取，而后再将0.5L乙酸乙酯与第一次萃取得到的乙酸乙酯萃取部分混合萃取；最后再将剩余0.5L乙酸乙酯与第二次萃取得到的乙酸乙酯萃取部分混合萃取)，得第一萃取物50g，取上述第一萃取物50g利用1.5L乙酸乙酯再次萃取3次(此处1.5L乙酸乙酯再次萃取3次与上述萃取3次的过程相同，1.5L乙酸乙酯分3次添加，萃取3次)，得到20g第二萃取物。

取第二萃取物20g，以物料比0.5:1拌样，以备干法上样。以物料比20:1取正相硅胶400g，加入1000ml二氯甲烷溶液搅拌均匀，迅速倒入层析柱，另取1000ml二氯甲烷溶液冲洗柱子。待液面与硅胶相差5cm左右，算出柱体积。以二氯甲烷:甲醇500:1、200:1、50:1、10:1、6:4冲洗，按柱体积收集接收液，通过薄层色谱点板合并，得到16个组分。

取薄层色谱点比较清晰、分离度较好的第9个组分(记为Fr.9)478.6mg，加甲醇溶解至10mg/ml。用半制备高效液相色谱进行制备分离，对于样品量相对较大的，选取20mm×250mm的半制备柱进行制备。样品量小的，选取10mm×250mm的半制备柱进行制备。Fr.9选用甲醇-水洗脱，洗脱条件为0-10min 20％甲醇，10-15min 20～80％甲醇，15-35min 80％甲醇，流速3ml/min,吸收波长280nm。以上得到第一个组分(记为Fr.9-1)和第二组分(记为Fr.9-2)，同时也采用甲醇-水体系进行制备分离。Fr.9-2分离色谱条件为0-30min 20～100％甲醇，30-40min 100％甲醇洗脱，流速3ml/min，吸收波长254nm，得到化合物1(12.7mg)、化合物2(13.6mg)，参见图13。

鉴定：化合物1和化合物2的核磁结果参见图1-图12和下表：

化合物1为黄色无定形粉末。

HR-ESI-MS显示[M+H]⁺为322.12827(计算值322.12459)表明化合物1中存在奇数个氮原子。结合核磁氢碳谱确定其分子式为C₁₆H₁₉NO₆。¹H-NMR(600MHz，CD₃OD-d₄)显示了四个芳香质子信号的自旋偶合系统:δ7.51(1H,dd,J＝1.2,2.4Hz)，7.18(1H,td,J＝0.6，7.8Hz)，7.09(1H,td,J＝0.6，7.8Hz)，7.50(1H,dd,J＝1.2,3.0Hz)，表明芳香环邻位被取代。δ7.32(1H,s)信号为3-取代吲哚部分有一个双键质子信号，δ3.78(2H,s)信号显示有一个亚甲基质子，δ3.69(3H,s)信号显示有一个甲氧基。δ5.34(1H,d,J＝9.0Hz)信号为β糖的端基氢质子，提示该化合物含有一个糖；¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD-d₄)显示16个碳信号的共振，其中有9个不饱和碳:δ174.84(C-9)，138.40(C-7a)，129.90(C-3a)，125.64(C-2)，123.28(C-6)，121.17(C-5)，119.97(C-4)，111.64(C-7)，109.97(C-3)；5个糖碳：δ87.64(C-1′)，79.08(C-3′)，73.73(C-2′)，71.22(C-4′)，69.65(C-5′)，和1个甲氧基δ52.64(C-10)，1个亚甲基碳：δ31.70(C-8)。

HSQC谱明确证实了所有质子和碳的共振。通过HMBC谱，H-4(δ7.51,1H,dd,J＝1.2,2.4Hz)与C-3(δ109.97)，C-6(δ123.28)，C-7a(δ138.40)相关联；H-5(δ7.09,1H,td,J＝0.6，7.8Hz)与C-7(δ111.64)，C-3a(δ129.90)相关联；H-6(δ7.18,1H,td,J＝0.6，7.8Hz)与C-4(δ119.97)，C-7a(δ138.40)相关联；H-7(δ7.50,1H,dd,J＝1.2,3.0Hz)与和C-5(δ121.17)、C-3a(δ129.90)偶合，证实了化合物1中存在邻位取代芳环。根据H-2(δ7.32 1H,s)与C-3a(δ129.90)、C-7a(δ138.40)、C-8(δ31.70)偶合，以及H-8(δ3.78)与C-2(δ125.64)、C-3(δ109.97)、C-3a(δ129.90)、C9(δ174.84)、C-10(δ52.64)之间的HMBC关联，推测C-3上的取代基为-CH₂COOCH₃基团。H-10(δ3.690)与C-9(δ174.84)的HMBC偶合显示-COOCH₃取代。此外，H-1′(δ5.34)与C-2、C-7a的HMBC相关性揭示了-Xyl糖基与苷元部分的氮连接；结合以上数据信息，故推断化合物1为N-β-D-xylopyranosyl-indole-3-methyl acetate。

化合物2为黄色无定形粉末。

HR-ESI-MS显示[M+H]⁺为322.12857(计算值322.12459)表明化合物2中存在奇数个氮原子。结合氢碳谱确定其分子式：C₁₆H₁₉NO₆。化合物2的分子量与化合物1有微小的差别，两者的核磁数据也仅仅是糖基的差异性。¹H-NMR(600MHz，MeOD-d₄)δH-1′5.92(1H,d,J＝2.4Hz)，H-2′4.10(1H,t,J＝2.4，4.2Hz)，H-3′3.90(1H,d,J＝4.2Hz)，H-4′3.64(1H,m)，H-5a′4.13(1H,dd,J＝2.1,12Hz)，H-5b′3.80(1H,dd,J＝3.3,12HZ)；通过糖端基质子化学位移δH-1′5.92，偶合常数J_H-3′＝4.2Hz和J_{H-1′/H-2′}＝2.4Hz可推测该糖为α-吡喃木糖，并符合化合物2构象。再通过圆二色谱在230nm处呈现负的Cotton效应，故可以推测该糖为S构型。结合以上数据信息，故推断化合物2为N-α-D-xylopyranosyl-indole-3-methyl acetate。

实验例1毒性试验

人癌细胞系HepG2、HCT-116细胞和HeLa细胞，以5-氟尿嘧啶为阳性对照，MTT法测定化合物1和化合物2的体外细胞毒性。将受试细胞系以1×10⁴细胞/孔的密度在96孔板中培养并培养24小时。随后，分别用3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM和100μM剂量的化合物1和化合物2处理细胞。24小时后，用MTT溶液(5mg/mL)改变上清液并再培养4小时。然后最后用150μL二甲基亚砜溶解细胞，并用微孔板读取器在490nm处测量吸光度。细胞活力以活对照细胞的百分比表示。

A0：空白孔吸光度A1：给药孔吸光度A2：对照孔吸光度

结果参见图14-图16。根据图14可知，化合物1和化合物2分别对Hep G2细胞增殖均具有一定的抑制作用，且抑制率随给药浓度升高而增加呈剂量依赖性。在给药浓度超过50μM时与5-氟尿嘧啶阳性对照作用相当。根据图15可知，化合物1和化合物2分别对Hep G2细胞增殖均具有一定的抑制作用，且抑制率随给药浓度升高而增加呈剂量依赖性。在给药浓度超过50μM时与5-氟尿嘧啶阳性对照作用相当。根据图16可知，化合物1和化合物2分别对HeLa细胞增殖均具有一定的抑制作用，且抑制率随给药浓度升高而增加，呈剂量依赖性。在给药浓度超过100μM时与5-氟尿嘧啶阳性对照作用相当。

用Graphpad Prism 8.0软件计算相应化合物1和化合物2对三种癌细胞的IC₅₀值(μM)，结果如下表。

根据上述表格可知，化合物1和化合物2对三种癌细胞的IC₅₀值均小于50μM。化合物1、2在低中剂量给药剂量时对三种癌细胞均有良好的抑制增殖作用。

实验例2神经保护实验

在CoCl₂损伤的PC12细胞模型上评估化合物1和化合物2的神经保护作用。大鼠嗜铬细胞瘤细胞系(PC12)在RPMI-1640培养基中，加入10％(v/v)灭活胎牛血清和100U/mL青霉素/链霉素。细胞在37℃的5％CO₂和95％加湿空气培养箱中生长和处理。将细胞置于密度为2×10⁴个细胞/孔的96孔板中，放置24h，观察细胞贴壁情况。分别用浓度为10μM的化合物处理细胞2h。培养后，添加1mM CoCl₂并培养24h。处理24h后，用MTT溶液(5mg/mL)改变上清液。在37℃培养4小时后，最终用150μL二甲基亚砜溶解细胞。用酶标仪在490nm处测定吸光度。细胞活力以活对照细胞的百分比表示。结果表示为三个独立实验所示数值的平均值±标准差。使用SPSS统计软件通过单因素方差分析检验进行统计分析。P值低于0.05被认为具有统计学意义。

结果参见图17，根据图17可知，化合物1和化合物2在不同浓度下的作用趋势与乙酸乙酯提取物一致，其中化合物1在12.5、25、50μM浓度下，对氯化钴引起的PC12细胞损伤具有明显的保护作用(P＜0.01)。化合物2对受损PC12细胞的保护作用较化合物1弱，在25μM浓度显示出保护活性(P＜0.05)。药理实验研究发现化合物1和化合物2均对氯化钴诱导受损的PC12细胞具有一定保护作用，其中化合物1在氯化钴损伤的PC12细胞中表现出较为明显的保护作用，在12.5～50μM时能显著提高细胞存活率，抑制PC12细胞凋亡，说明化合物1和化合物2有神经保护的作用，可以用于制备神经保护的药物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.吲哚苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用；

所述吲哚苷类化合物为下述结构式所示化合物中的任意一种：

所述吲哚苷类化合物的制备方法包括：

对娑罗子的醇-水提取物进行浓缩后，利用醚类物质进行初萃，而后再利用酯类物质进行对初萃得到的水相进行深度萃取，并收集酯类物质部位的萃取物；

接着，进行柱层析分离，其中，柱层析分离包括：将多氯取代甲烷和醇类溶剂以490-510:1、190-210:1、45-55:1、8-12:1和5.5-6.5:4的体积比混合，而后对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到16个组分；

而后，利用醇-水混合溶剂对柱层析分离得到的第9个组分进行第一次梯度洗脱，并收集第二组分，而后再利用醇-水混合溶剂对所述第二组分进行第二次梯度洗脱；

其中，第一次梯度洗脱的洗脱条件为0-10min 20％醇类溶剂；10-15min 20～80％醇类溶剂；15-35min 80％醇类溶剂；

第二次梯度洗脱的洗脱条件为：0-30min 20～100％醇类溶剂；30-40min 100％醇类溶剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述娑罗子的醇-水提取物的制备方法包括：将每千克所述娑罗子与1.5-2.5升醇-水溶液混合在25-30℃的条件下进行至少3次浸提，并合并每次浸提得到的浸提液，每次浸提的时间为20小时以上；

其中，所述醇-水溶液为醇的质量含量为55-65％的醇溶液。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

深度萃取的步骤包括：利用乙酯类溶剂对所述水相进行萃取，收集乙酯类溶剂部位的第一萃取物，再利用乙酯类溶剂对所述第一萃取物再次进行萃取，接着收集乙酯类溶剂部位的第二萃取物；

其中，所述乙酯类溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯和丙酸乙酯中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，柱层析分离包括：将多氯取代甲烷和醇类溶剂以500:1、200:1、50:1、10:1、6:4的体积比混合，而后对萃取得到的萃取物进行梯度洗脱，并收集通过薄层色谱点板合并，得到16个组分。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多氯取代甲烷为二氯甲烷或三氯甲烷；所述醇类溶剂为C1-C5一元醇溶剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述醇类溶剂为甲醇。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的吲哚苷类化合物作为唯一的活性成分在制备抗肿瘤药物中的应用。

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