CN111995647B

CN111995647B - 从绿萼梅中分离的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法

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Publication number: CN111995647B
Application number: CN202010773815.9A
Authority: CN
Inventors: 张伟; 吴德玲; 王灿灿; 金传山; 乔金为; 陈箫箫; 陈仕云
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111995647A

Abstract

本发明公开了从绿萼梅中分离的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法。本发明从绿萼梅花蕾中分离得到一种新的黄酮化合物，该化合物的分子式为C₂₉H₂₆O₁₃，其结构式为图1所示。体外抗肿瘤活性试验表明，该化合物对于乳腺癌细胞株具有显著的体外抑制活性。本发明进一步提供了抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效量的化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成。

Description

从绿萼梅中分离的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及从植物中分离得到的具有抗肿瘤活性的化合物，尤其涉及从绿萼梅干燥花蕾中分离得到的具有抗乳腺癌活性的黄酮类化合物，属于抗肿瘤黄酮类化合物的分离及其应用领域。

背景技术

绿萼梅又名梅花、白梅花，是蔷薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，具有疏肝和中、化痰散结之功效。绿萼梅原产中国华中至西南山区，已有多年的栽培历史，但以长江流域以南为多，日本、朝鲜、新西兰亦有分布。绿萼梅化学成分丰富，目前从绿萼梅中分离得到化学成分包括黄酮类，苯丙素类，其他类等，但发挥药效作用的化学成分尚不明确，作用机制也有待进一步探讨。因此，开发利用绿萼梅资源是有必要的。

乳腺癌(Breast invasive carcinoma,BRCA)是威胁女性身心健康的常见肿瘤，对全球公共卫生产生重大影响。化疗是乳腺癌现在的主要治疗方法，但其非选择性也导致正常细胞死亡。现有的治疗乳腺细胞性乳腺癌的化学药物均存在疗效不够显著的缺陷，如果从植物中分离得到新的具有显著抗乳腺癌活性的化合物，这对于乳腺癌的治疗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一种从绿萼梅中分离得到的具有抗肿瘤活性的化合物。

本发明的目的之二是提供一种从绿萼梅花蕾中分离得到该化合物的方法。

本发明的目的之三是将该化合物制备成适用于临床应用的各种抗肿瘤制剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

从绿萼梅干燥花蕾中分离得到的具有抗肿瘤活性的化合物，其化学结构为式Ⅰ所示：

该化合物的分子式为C₂₉H₂₆O₁₃，呈黄色粉末，其英文名称全称为((2R,3S,4S,5R,6S)-6-((5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-3-yl)oxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl benzoate。

上述式Ⅰ化合物的碱加成的盐也包括在本发明之中。

所述碱加成的盐优选为药学上可以接受的与适当的碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠等)形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明之中。

本发明进一步提供了一种从绿萼梅干燥花蕾中分离得到该化合物的方法，包括：

(1)将绿萼梅干燥花蕾粉碎后用乙醇渗漉提取；

(2)将乙醇渗漉液进行减压浓缩得到粗提物；

(3)将粗提分散后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，将萃取得到的乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇在硅胶柱上洗脱，依次得到Fr.1、Fr.2、Fr.3和Fr.4四个组分；

(4)将其中的Fr.4通过MCI柱，依次用10％MeOH、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、80％MeOH和100％MeOH洗脱，获得Fr.4.1、Fr.4.2、Fr.4.3、Fr.4.4和Fr.4.5五个流分；

(5)将其中的Fr.4.3用CH₂Cl₂：MeOH在硅胶柱上洗脱，依次得到Fr.4.3.1、Fr.4.3.2、Fr.4.3.3和Fr.4.3.4四个洗脱成分；

(6)将其中的Fr.4.3.1经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱后即得到本发明化合物。

优选的，步骤(1)中所述的乙醇优选为40-95％乙醇；更优选的，步骤(1)中将绿萼梅花蕾粉碎后先用90％乙醇提取，再用50％乙醇进行提取。

优选的，步骤(3)中所述的硅胶柱优选为200～300目的硅胶柱；步骤(3)中所述的二氯甲烷-甲醇的体积配比为100:0～0:100；更优选的，二氯甲烷-甲醇的配比为100:0,95:5,90:10,80:20,0:100；步骤(5)中将其中的Fr.4.3用二氯甲烷-甲醇在硅胶柱上进行梯度洗脱时，二氯甲烷-甲醇的梯度体积配比分别为100:0,90:10,80:20,0:100。

本发明采用硅胶柱色谱、MCI柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱与试剂，大部分材料均可重复利用，大大降低了对环境的污染。

对本发明化合物进行体外抗乳腺癌试验，试验结果表明本发明化合物具有显著的抑制乳腺癌细胞株活性的效果。所述的肿瘤包括肝癌、乳腺癌、白血病、结肠癌等，优选为乳腺癌。

本发明的另外一个目的是提供一种抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效量的式Ⅰ化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成；

将药学上可接受用量的式Ⅰ化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的单体化合物。

所述的载体是指药学领域常规的载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂可以是纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂可以是淀粉等物质；崩裂剂可以是碳酸钙或碳酸氢钙等；另外，还可以药物组合物加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。

按照常规的制剂工艺，可以将本发明所述的抗肿瘤的药物组合物制成口服制剂或注射药物制剂。所述的口服制剂可以是片剂、丸剂、散剂、膏剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂等；所述的注射制剂可以是粉针剂或注射液等。

本发明药物制剂的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的肿瘤类型和严重程度等进行相应的变化，这些都是本领域人员所习知。

本发明药物制剂可通过临床可接受的治疗方式给药，包括注射、口服、吸入、植入或灌注等。

附图说明

图1本发明化合物的结构式。

图2本发明化合物¹H-NMR图(600MHz,DMSO-d6)。

图3本发明化合物¹³C-NMR图(150MHz,DMSO-d6)。

图4本发明化合物HMBC图(600MHz,DMSO-d6)。

图5本发明化合物HSQC图(600MHz,DMSO-d6)。

图6本发明化合物红外图。

图7本发明化合物高分辨质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1抗肿瘤化合物的分离及鉴别

将干燥的绿萼梅花蕾(8kg)粉碎后先用90％乙醇渗漉提取，再用50％乙醇进行渗漉提取；减压浓缩乙醇渗漉液，得到棕色粗提物。

将粗提物用水分散依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。将乙酸乙酯部位硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱色谱(200～300目)，使用二氯甲烷-甲醇(100:0,95:5,90:10,80:20,0:100)进行梯度洗脱，依次得到4个流分Fr.1～Fr.4。Fr.4通过MCI柱色谱，采用甲醇-水(10:100,20:80,40:60,60:40,80:20,100:0)梯度洗脱，得到5个流份Fr.4.1-Fr.4.5，Fr.4.3经硅胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱(100:0,90:10,80:20,0:100)，得四个流分Fr.4.3.1-Fr.4.3.4。Fr.4.3.1经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱后，得到本发明化合物。

该化合物为黄色粉末，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 582.1291[M-H]^-(计算值582.13734)，推测其分子式为C₂₉H₂₆O₁₃，不饱和度为17。

经¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC光谱分析后，确定了该化合物的化学结构式为图1所示。图2为本发明化合物¹H-NMR图(600MHz,DMSO-d6)，图3为本发明化合物¹³C-NMR图(150MHz,DMSO-d6)，图4为本发明化合物HMBC图(600MHz,DMSO-d6)，图5为本发明化合物HSQC图(600MHz,DMSO-d6)，图6为本发明化合物红外图，图7为本发明化合物高分辨质谱图。

本发明化合物氢、碳谱数据如下：¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ_C：149.4(C-4′),147.1(C-3′),122.0(C-1′),121.3(C-6′),115.1(C-2′),113.5(C-5′),177.4(C＝O),156.4(C-2),133.1(C-3),165.5(C-7),161.1(C-5),156.5(C-9),103.9(C-10),98.8(C-6),93.9(C-8),101.3(C-1″),73.2(C-3″),72.9(C-5″),71.1(C-2″),68.2(C-4″),63.9(C-6″),133.1(C-1″′),129.6(C-4″′),128.8(C-2″′,-6″′),128.4(C-3″′,-5″′),165.5(C＝O),56.0(-OCH₃)；¹H-NMR(600MHz,DMSO d₆)δ_H：7.91(1H,d,J＝2.1Hz,H-2′),7.63(1H,dd,J＝8.4,2.1Hz,H-6′),6.88(1H,d,J＝8.4Hz,H-5′),6.35(1H,d,J＝2.1Hz,H-8),6.18(1H,d,J＝2.1Hz,H-6),7.63(2H,dd,J＝8.4,1.2Hz,H-2″′,-6″′),7.47(1H,m,H-4″′),7.23(2H,m,H-3″′,-5″′),5.57(1H,d,J＝7.8Hz,H-1″),4.38(1H,dd,J＝11.4,8.4Hz,H-6″b),4.24(1H,dd,J＝11.4,4.2Hz,H-6″a),3.60(1H,dd,J＝8.7,6.0Hz,H-5″),3.81(2H,m,H-2″,-4″),3.48(1H,dd,J＝10.2,3.6Hz,H-3″),3.16(3H,s).

试验例1本发明化合物体外抗肿瘤活性试验

本试验中所用的细胞株为国际通用的人乳腺癌细胞株-MCF-7。

试验方法采用国际通用的MTT测定方法，具体如下：

将对数生长期MCF-7细胞以1×10⁴cells/孔接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂条件下培养，直至细胞90％融合后，用无血清的RPMI-1640培养基孵育2h使细胞同步化。随后，弃去上清，分别加入浓度分别为0μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，50μM，100μM的本发明化合物完全培养基孵育72h。孵育结束前4h，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。孵育结束后，弃去各孔上清液，每孔加入150μL DMSO，细胞振荡仪上振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD₅₇₀。

细胞株活性测定结果发现，乳腺癌细胞MCF-7的IC₅₀为15.85μM，测定结果表明本发明化合物具有显著的体外抑制乳腺癌细胞株活性。

Claims

1.一种制备式Ⅰ所述化合物的方法，其特征在于，式Ⅰ所述化合物的结构式如下：

其制备方法包括：

(1)将绿萼梅花蕾粉碎后用乙醇渗漉提取；

(2)将乙醇渗漉提取物进行减压浓缩得到粗提物；

(3)将粗提物用水液分散后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，将萃取得到的乙酸乙酯部位用不同配比的二氯甲烷-甲醇在硅胶柱上洗脱，依次得到Fr.1、Fr.2、Fr.3和Fr.4四个组分；

(4)将Fr.4通过MCI柱，依次用10％MeOH、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、80％MeOH和100％MeOH洗脱，获得Fr.4.1、Fr.4.2、Fr.4.3、Fr.4.4和Fr.4.5五个流分；

(5)将其中的Fr.4.3用二氯甲烷-甲醇在硅胶柱上进行梯度洗脱，依次得到Fr.4.3.1、Fr.4.3.2、Fr.4.3.3和Fr.4.3.4四个洗脱成分；

(6)将Fr.4.3.1经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱后即得式Ⅰ化合物。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的乙醇为40-90％乙醇。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将绿萼梅花蕾粉碎后先用90％乙醇提取再用50％乙醇提取。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶柱为200～300目的硅胶柱；步骤(3)中所述的二氯甲烷-甲醇的体积配比为100:0～0:100；步骤(5)中将其中的Fr.4.3用二氯甲烷-甲醇在硅胶柱上进行梯度洗脱时，二氯甲烷-甲醇的梯度体积配比分别为100:0,90:10,80:20,0:100。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的二氯甲烷-甲醇的体积配比分别为100:0,95:5,90:10,80:20,0:100。