SK287405B6

SK287405B6 - Deriváty caloporozidu, liečivá s ich obsahom, spôsob prípravy týchto látok pomocou mikroorganizmu a tento mikroorganizmus

Info

Publication number: SK287405B6
Application number: SK1118-2003A
Authority: SK
Inventors: Claudia Eder; Michael Kurz; Mark Br�Nstrup; Luigi Toti
Original assignee: Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-23
Publication date: 2010-09-07
Also published as: BG108151A; KR20030084973A; WO2002072110A1; US6596694B2; US20020193316A1; MEP56208A; NO20033965L; HRP20030712A2; RU2282634C2; ES2242011T3; CA2439857A1; NZ528070A; KR100862546B1; PL205951B1; JP4206271B2; DE10111682B4; IL157793A; EE200300433A; EP1372670B1; DE10111682A1

Abstract

Opisujú sa zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R1, R2 a R3 nezávisle jeden od druhého znamenajú atóm vodíka alebo acylovú skupinu obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov; a R4 znamená atóm vodíka alebo skupinu -C(O)(CH2)nCOOH, kde n znamená 1 až 7; s tou výhradou, že R1, R2, R3 a R4 neznamenajú všetky atóm vodíka; ako aj ich fyziologicky prijateľné soli, liečivá s ich obsahom na ošetrovanie nádorových ochorení, spôsob prípravy týchto zlúčenín fermentáciou mikroorganizmu Gloeoporus dichrous (Fr. : Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, alebo jeho mutácií, alebo variantov a tento mikroorganizmus.

Description

Predložený vynález sa týka nových účinných látok (derivátov caloporozidu), ktoré sú tvorené v priebehu fermentácie pomocou mikroorganizmu Gloeoporus dichrous Breš. ST001714, DSM 13784, spôsobu ich prípravy, ich použitia ako liečiv, liečiva s obsahom derivátov caloporozidu, a tiež mikroorganizmu Gloeoporus dichrous Breš. ST001714, DSM 13784.

Doterajší stav techniky

Caloporozid je prvý raz opísaný v roku 1994 ako inhibítor fosfolipázy C (W. Weber a kol., J. Antibiotics, 47, 1188 až 1194). V tom istom roku sa izolovali dva ďalšie podobné sekundárne metabolity (R. Shan a kol., Nat. Prod. Lett., 4, 171 až 178). Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) (ďalej) podľa predloženého vynálezu sa od týchto opísaných látok líšia svojou štruktúrou.

Rakovina je väčšinou smrteľne prebiehajúce ochorenie človeka a zvierat, ktoré je zapríčinené nekontrolovaným rastom telu vlastných buniek. Rakovina je označenie pre tvorbu zhubných nádorov (malignómov), neoplazmatov (nádorov, respektíve karcinómov) alebo pre malígne zvrhnutie, ako aj poruchy dozrievania bielych krviniek (leukémiu, rakovinu krvi). Rakovinové alebo nádorové bunky vznikajú premenou buniek telu vlastných. Zhubnosť rakovinovej bunky sa vyznačuje autonómiou rastu, to znamená schopnosťou infiltrovateľne, nespútané a bez začlenenia do stavebného plánu orgánu rásť, pričom sú porušované tkanivá. Istým príznakom malignity je tvorba nádoru vzdialených kolónií (metastáz) hematogénnym alebo lymfogénnym rozšírením nádorových buniek. Rakovina patrí k najčastejším príčinám úmrtí ľudí, a preto existuje veľká potreba spôsobov a prostriedkov na liečenie alebo ošetrovanie malígnych zvrhnutí.

Možnosti terapie malígnych nádorov zahŕňajú okrem, pokiaľ možno radikálnych, operatívnych odstránení nádorov, rádiologickú terapiu rôntgenovými lúčmi, lúčmi α, β, γ, imunoterapiu a chemoterapiu. Imunoterapia je v súčasnosti použiteľná len v obmedzenej miere. Pod chemoterapiou nádorov sa rozumie podávanie bunkových jedov (cytostatík) na ošetrovanie nádorov a nádorových buniek, ktoré zostali po lokálnom chirurgickom ošetrení alebo ožiarení. Tieto látky špecificky zasahujú určité procesy bunkového delenia, takže tkanivá s vysokým podielom deliacich sa buniek, ako je rýchlo rastúce nádorové tkanivo, reagujú citlivejšie. Použiť je možné alkylované zlúčeniny, ako napr. cyklofosfamid (The Merck Index, 12. vydanie, str. 463), antimetabolity, ako metotrexát (The Merck Index, 12. vydanie, str. 1025), alkaloidy, ako vincristín (The Merck Index, 12. vydanie, str. 1704) a antibiotiká, ako daunomycín (The Merck Index, 12. vydanie, str. 479), ako aj adriamycín (The Merck Index, 12. vydanie, str. 581 až 582). Všetky tieto činidlá však majú kvôli masívnym vedľajším účinkom veľkú nevýhodu, takže smrť pacientov je len odďaľovaná, ale nie odvrátená. Okrem toho sa pri zvrhlých (rakovinových) bunkách vyskytuje rezistencia proti použitému prostriedku. Potom súčasné liečivá už nepôsobia cytostaticky, ale vďaka vedľajším účinkom toxicky. Navyše sa ukázalo, že účinnosť kombinovaného, respektíve postupného, použitia cytostatík je vyššia ako pri jedinom cytostatiku (monoterapie), a je preto možné, že sa významné vedľajšie účinky pri polychemoterapii nesčítajú. Z týchto všetkých dôvodov sú nové chemoterapeutiká naliehavo potrebné, a preto celosvetovo hľadané.

Cyklín-dependentné kinázy (CDK = kinázy závislé od cyklínu) hrajú ústrednú úlohu pri regulácii bunkového cyklu. Katalyzujú fosforylačné reakcie a uvádzajú tak do chodu reakčnú kaskádu, ktorá v bunkovom cykle podnecuje prechod z G1 fázy (rastová fáza 1) do S fázy (syntetická fáza). Cyklín-dependentné kinázy preto predstavujú dobrý terapeutický cieľ na ošetrovanie rakoviny a iných ochorení s patologickou poruchou bunkovej proliferácie. Užitočnými liečivami na ošetrovanie pacientov s rakovinou by boli nízkomolekuláme inhibitory regulujúce bunkový cyklus a zabraňujúce nekontrolovanému bunkovému deleniu.

Podstata vynálezu

Teraz sa prekvapujúco zistilo, že kmeň mikroorganizmu Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, dokáže produkovať vysoko účinné nové cytostatiká, ktoré inhibujú cyklín-dependentné kinázy vo veľmi nízkych koncentráciách.

Podstatou vynálezu sú preto účinné látky (deriváty caloporozidu) produkované kmeňom Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, ako aj ich fyziologicky prijateľné soli, estery a zrejmé chemické ekvivalenty.

Predložený vynález sa v súlade s tým týka zlúčenín všeobecného vzorca (I)

v ktorom

R¹, R² a R³ nezávisle jeden od druhého znamenajú atóm vodíka alebo acylovú skupinu obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov, výhodne 2 až 6 atómov, obzvlášť 2 atómy; a R⁴ znamená atóm vodíka alebo skupinu -C(O)(CH₂)_nCOOH, kde n znamená 1 až 7, výhodne 1 až 3, obzvlášť výhodne 1 alebo 2;

s tou výhradou, že R¹, R², R³ a R⁴ neznamenajú všetky atóm vodíka;

ako aj ich fyziologicky prijateľných solí.

Acylové skupiny zlúčenín všeobecného vzorca (I) môžu byť priame alebo rozvetvené, nasýtené alebo raz alebo dvakrát nenasýtené.

Acylovou skupinou obsahujúcou 2 uhlíkové atómy sa myslí napríklad acetylová skupina.

Príklady nasýtených nerozvetvených acylových skupín sú zvyšky kyseliny octovej (C = 2), kyseliny propiónovej (C = 3), kyseliny maslovej (C = 4), kyseliny Valérovej (C = 5), kyseliny kaprónovej (C = 6), kyseliny enantovej (C = 7), kyseliny kaprylovej (C = 8), kyseliny pelargónovej (C = 9) a kyseliny kaprálovej (C = 10).

Príklady raz nenasýtených nerozvetvených acylových skupín sú zvyšky kyseliny akrylovej (C = 3), kyseliny krotónovej (C = 4) alebo kyseliny vinyloctovej (C = 4).

Príkladom dvojnásobne nenasýtenej nerozvetvenej acylovej skupiny je zvyšok kyseliny sorbovej (C = 6).

Caloporozidy sú slabo účinné antibiotiká, ktoré pozostávajú z kyseliny salicylovej a disacharidu. Obidve štruktúrne jednotky sú zviazané prostredníctvom alkylového reťazca. Cukrovou časťou zlúčeniny všeobecného vzorca môže byť disacharid pozostávajúci vždy z D-pyranózy aldohexózy (ako napr. D-glukopyranózy alebo D-galaktopyranózy) a -ónovej kyseliny aldohexózy (napr. kyseliny D-glukónovej). Výhodnou cukrovou časťou je kyselina D-manopyranozyl-D-manónová, ktorá je nesubstituovaná alebo je substituovaná substituentmi R², R³ a/alebo R⁴, ako sú definované skôr.

Vynález sa ďalej týka

a) zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ znamená acetylovú skupinu; R² = R³ = R⁴ = atóm vodíka (= caloporozid B: sumárny vzorec: C₃₈H₆₂O|₆, molekulová hmotnosť 774,9), ako aj jej fyziologicky prijateľnej soli;

b) zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ = R³ = acetylová skupina; R² = atóm vodíka; R⁴ = malonylová skupina (= caloporozid C: sumárny vzorec: C₄₃H₆₆O₂₀, molekulová hmotnosť 902,99), ako aj jej fyziologicky prijateľnej soli;

c) zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ = R² = atóm vodíka; R³ = acetylová skupina; R⁴ = malonylová skupina (= caloporozid D: sumárny vzorec: C₄]H₆₄0i9, molekulová hmotnosť 806,96), ako aj jej fyziologicky prijateľnej soli;

d) zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ = R³ = atóm vodíka; R² = acetylová skupina; R⁴ = malonylová skupina (= caloporozid E: sumárny vzorec: C₄iH₆₄Oi₉, molekulová hmotnosť 806,96), ako aj jej fyziologicky prijateľnej soli;

e) zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom R¹ = R² = R⁴ = atóm vodíka; R³ = acetylová skupina (= caloporozid F: sumárny vzorec: C₃₈H₆₂O₁₆, molekulová hmotnosť 774,9), ako aj jej fyziologicky prijateľnej soli.

Centrá chirality môžu byť v zlúčeninách všeobecného vzorca (I), ak nie je uvedené inak, v konfigurácii R- alebo S-. Vynález sa týka tak opticky čistých zlúčenín, ako i zmesí stereoizomérov, ako aj zmesí enantiomérov a zmesí diastereomérov.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) je možné podľa vynálezu získať fermentáciou pomocou mikroorganizmu Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, alebo jedným z jeho variantov alebo mutácií za vhodných podmienok v kultivačnom médiu, pokiaľ sa v kultivačnom médiu nehromadí jeden alebo viac derivátov caloporozidu všeobecného vzorca (I). Následnou izoláciou zlúčenín a prípadne konverziou na chemické ekvivalenty, ako aj ich fyziologicky prijateľné soli, sa získajú deriváty caloporozidu.

Predložený vynález sa v súlade s tým ďalej týka spôsobu prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kto rý sa vyznačuje tým, že sa fermentuje mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, alebo jeden z jeho variantov alebo mutácií za vhodných podmienok v kultivačnom médiu, pokiaľ sa v kultivačnom médiu nehromadí jedna alebo viac výsledných zlúčenín a následne sa zlúčeniny izolujú a prípadne sa prevedú na chemické ekvivalenty a/alebo fyziologicky prijateľné soli.

Výhodne sa kmeň ST 001714, DSM 13784, jeho mutácia a/alebo varianty fermentuje v živnom roztoku alebo pevnom médiu (označovanom tiež ako kultivačné médium) so zdrojmi uhlíka a dusíka, ako aj obvyklými anorganickými soľami, pokiaľ sa v kultivačnom médiu nehromadia zlúčeniny podľa vynálezu, následne sa zlúčeniny izolujú z kultivačného média a prípadne sa rozdelia na jednotlivé aktívne zložky.

Spôsob podľa vynálezu je možné použiť na fermentáciu v laboratórnom meradle (v rozsahu mililitrov až litrov) a v priemyselnom meradle (v kubických metroch).

Kmeň Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714 sa rozmnožil v predkultúre. Izolát sa uložil dňa 14. decembra 1999 za podmienok budapeštianskej zmluvy u Deutsche Sammlung von Mikroorganismen u Zellkulturen GmbH (Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr), Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig, Nemecko, pod číslom DSM 13784.

Mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714 , DSM 13784 má biele mycélium a purpurovo sfarbené spóry. Vyskytuje sa na organizme Betula, môže však napádať tiež iných hostiteľov, napríklad Alnus, Salix, Populus, Ulmus, Prunus.

Namiesto kmeňa Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, je možné tiež použiť jeho mutácie a varianty, ktoré syntetizujú jednu alebo viac zlúčenín podľa vynálezu. Tieto mutácie je možné vytvárať známymi spôsobmi, pomocou fyzikálnych prostriedkov, napríklad ožarovania, ako napríklad pomocou ultrafialového alebo rôntgenového žiarenia, alebo chemických mutagénov, ako je napríklad etylmetánsulfonát (EMS); 2-hydroxy-4-metoxybenzofenón (MOD) alebo N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidín (MNNG).

Vyhľadávanie mutácií a variantov, ktoré syntetizujú zlúčeniny podľa vynálezu, prebieha podľa nasledujúcej schémy:

lyofilizácia doskových kultúr;

- extrakcia lyofilizátov organickým rozpúšťadlom;

- extrakcia zlúčeniny z kultivačného fíltrátu s pevnými fázami;

- analýza pomocou HPLC, DC alebo pomocou testov biologickej účinnosti.

Ďalej opisované podmienky fermentácie platia pre mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, uložený izolát DSM 13784, ako aj jeho mutácie a varianty.

V živnom roztoku, ktorý obsahuje zdroj uhlíka a zdroj dusíka, ako aj obvyklé anorganické soli, produkuje mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, deriváty caloporozidu.

Ako výhodné zdroje uhlíka sú na fermentáciu vhodné asimilovateľné uhľovodíky a cukrové alkoholy, ako je glukóza, laktóza, sacharóza alebo D-manitol, ako aj prirodzené produkty obsahujúce uhlovodany, ako je napríklad sladový výťažok. Ako živiny obsahujúce dusík prichádzajú do úvahy: aminokyseliny, peptidy a proteíny, ako aj ich degradačné produkty, ako sú kazeín, peptóny alebo tryptóny, ďalej mäsové extrakty, kvasnicové extrakty, mleté semená, napríklad kukurice, pšenice, bôbov, sóje alebo bavlníka, destilačné rezíduá z produkcie alkoholu, mäsové múčky alebo kvasnicové extrakty, tiež však amóniové soli a nitráty, najmä však tiež synteticky, respektíve biosynteticky, získané peptidy. Anorganickými soľami, ktoré môže živný roztok obsahovať, sú napríklad chloridy, uhličitany, sírany alebo fosforečnany alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, železa, zinku, kobaltu a mangánu.

Tvorba zlúčenín podľa vynálezu prebieha obzvlášť dobre v živnom roztoku, ktorý obsahuje asi 0,05 až 5 %, výhodne 1 až 2 % sladového výťažku, 0,05 až 3 %, výhodne 0,05 až 1 % kvasnicového extraktu a 0,2 až 5 %, výhodne 0,5 až 2 % glukózy, 0,5 až 3 %, výhodne 0,5 až 3 % práškovej celulózy a stopy síranu amónneho. Údaje v percentách sú vždy vztiahnuté na hmotnosť celého živného roztoku.

V tomto živnom roztoku mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, vytvára zmes derivátov caloporozidu. Podľa zloženia živného roztoku sa môže kvantitatívny podiel jedného alebo viacerých derivátov caloporozidu podľa vynálezu líšiť. Okrem toho sa môže pomocou zloženia média riadiť syntéza jednotlivých derivátov caloporozidu, takže jeden derivát caloporozidu nie je mikroorganizmom vytváraný vôbec, respektíve je vytváraný v množstve pod hranicou detegovateľnosti.

Kultivácia mikroorganizmu prebieha aeróbne, to znamená napríklad ponorená za pretrepávania alebo miešania v pretrepávacích bankách alebo fermentoroch, prípadne za zavádzania vzduchu alebo kyslíka, alebo na pevnom médiu. Je možné ju uskutočňovať v teplotnom rozsahu asi od 18 do 35°C, výhodne asi pri 20 až 30°C, najmä pri 25 až 30°C. Hodnota pH by sa mala pohybovať v rozsahu 5 a 8, výhodne v rozsahu 5,5 a 6,5. Mikroorganizmus sa za týchto podmienok všeobecne kultivuje počas 24 až 720 hodín, výhodne 288 až 576 hodín.

Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v niekoľkých stupňoch, to znamená na začiatku sa v kvapalnom živnom médiu vytvorí jedna alebo viac predkultúr, tie sa potom preočkujú do vlastného produkčného média, to znamená hlavnej kultivácie, napríklad v objemovom pomere 1 : 10. Predkultúra sa napríklad získa preočkovaním mycélia do živného roztoku a jeho ponechaním rásť počas asi 36 až 120 hodín, výhodne 48 až 72 ho dm. Mycélium je možné napríklad získať ponechaním kmeňa rásť počas 3 až 40 dní, výhodne 10 až 30 dní, na pevnej alebo kvapalnej živnej pôde, napríklad sladokvasnicovom agare alebo zemiakodextrózovom agare.

Priebeh fermentácie je možné sledovať podľa hodnôt pH kultúry alebo objemu mycélia, ako aj pomocou chromatografických metód, ako je napr. kvapalinová chromatografia s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HPLC), alebo testovaním biologickej aktivity.

Ďalej opisovaný spôsob izolácie slúži na vyčistenie derivátov caloporozidu podľa vynálezu.

Izolácia, respektíve čistenie, derivátu caloporozidu podľa vynálezu z kultivačného média sa uskutočňuje známymi spôsobmi s ohľadom na chemické, fyzikálne a biologické vlastnosti prirodzenej látky. Na testovanie koncentrácie príslušného derivátu caloporozidu v kultivačnom médiu alebo v jednotlivých stupňoch izolácie je možné použiť HPLC, pričom sa množstvo vytvorenej látky vhodne porovnáva s kalibračným roztokom.

Na izoláciu zlúčenín podľa vynálezu sa kultivačný bujón alebo kultúra s pevným médiom lyofilizuje, následne sa deriváty caloporozidu extrahujú z lyofilizátu vhodným, s vodou miešateľným, organickým rozpúšťadlom. Fáza organického rozpúšťadla obsahuje prirodzené látky podľa vynálezu, prípadne sa koncentruje vo vákuu a ďalej čistí.

Ďalšie čistenie jednej alebo viacerých zlúčenín podľa vynálezu sa uskutočňuje pomocou chromatografie na vhodných materiáloch, výhodne napr. na molekulových sitách, na silikagéli, oxide hlinitom, ionomeničoch alebo adsorbčných živiciach, respektívne na reverzných fázach (RP). Pomocou tejto chromatografie sa deriváty caloporozidu rozdelia. Chromatografia derivátov caloporozidu prebieha s pufŕovanými vodnými roztokmi alebo zmesou vodných a organických roztokov.

Zmesami vodných alebo organických roztokov sa myslia všetky s vodou miešateľné rozpúšťadlá, výhodne metanol, propanol a acetonitril, v koncentrácii 5 až 80 % rozpúšťadla, výhodne 20 až 50 % rozpúšťadla alebo tiež všetky pufrované vodné roztoky, ktoré sú miešateľné s organickými rozpúšťadlami.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa môžu vyskytovať tak v mycéliu, ako aj v kultivačnom filtráte, ale hlavné množstvo sa obvykle nachádza v biomase (mycéliu). Preto je vhodné separovať posledne menované od predtým menovaného pomocou filtrácie alebo odstreďovania. Filtrát sa extrahuje rozpúšťadlom nemiešajúcim sa s vodou, ako je 1-butanol, etylacetát, chloroform alebo podobne. Mycélium sa vhodne extrahuje metanolom alebo acetónom, ale je možné tiež použiť skôr uvedené rozpúšťadlá nemiešajúce sa s vodou. Použiteľnými puframi sú rovnaké pufry, ako sú uvedené skôr.

Rozdelenie derivátov caloporozidu na základe ich rozdielnej polarity sa uskutočňuje pomocou chromatografie s reverznou fázou, napríklad na MCI® (adsorbčná živica od Mitsubishi, Japonsko) alebo Amberlite XAD® (TOSOHAAS), na ďalších hydrofóbnych materiáloch, ako napríklad na fázach RP-8 alebo RP-18. Okrem toho je možné rozdelenie uskutočňovať pomocou chromatografie s normálnou fázou, napríklad na silikagéli, oxide hlinitom a podobne.

Chromatografia derivátov caloporozidu sa uskutočňuje pomocou pufrovaných alebo okyslených vodných roztokov alebo zmesí vodných roztokov s alkoholmi alebo inými, s vodou miešateľnými, organickými rozpúšťadlami. Ako organické rozpúšťadlá sa výhodne používajú propanol a acetonitril.

Pufŕovanými alebo okyslenými vodnými roztokmi sa rozumie napr. voda, fosfátový pufer, amóniumacetát, citrátový pufer v koncentrácii od 0 do 0,5 M, ako aj kyselina mravčia, kyselina octová, kyselina trifluóroctová alebo všetky obchodne dostupné, odborníkovi známe kyseliny, výhodne v koncentrácii od 0 do 1 %. Ako pufŕovaný vodný roztok je obzvlášť výhodný 0,1 % amóniumacetát.

Chromatografia prebieha s gradientom, ktorý začína 100 % vody a končí 100 % rozpúšťadla, výhodný je lineárny gradient od 20 do 100 % propanolu alebo acetonitrilu.

Alternatívne je možné uskutočňovať tiež gélovú chromatografiu alebo chromatografiu na hydrofóbnych fázach.

Gélová chromatografia sa uskutočňuje na polyakrylamidových alebo zmesových polymémych géloch, ako napríklad Biogel-P 2® (Biorad) alebo Fractogel TSK HW 40® (Merck, Nemecko, alebo Toso Haas, USA).

Poradie skôr uvedených chromatografii je zameniteľné.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú v pevnom stave a v roztokoch s hodnotami pH v rozsahu 3 a 8, obzvlášť 5 a 7, stabilné a je možné ich preto spracovať do podoby bežných galenických prípravkov.

Jedna alebo viac zlúčenín zo zlúčenín podľa vynálezu je vhodná, vďaka svojim cenným farmakologickým vlastnostiam, na použitie v ľudskom alebo veterinárskom lekárstve ako liečivo.

Predložený vynález sa tak týka použitia zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľnej soli na prípravu cytostatika na ošetrovanie nádorových ochorení.

Predložený vynález sa ďalej týka všetkých zrejmých chemických ekvivalentov zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu. Týmito ekvivalentmi sú zlúčeniny, ktoré vykazujú nepatrný chemický rozdiel, teda majú rovnaké účinky alebo sa za miernych podmienok premieňajú na zlúčeniny podľa vynálezu. K uvedeným ekvivalentom patria napríklad tiež soli, redukčné produkty, estery, étery, acetály alebo amidy zlúčenín podľa vynálezu, ako aj ekvivalenty, ktoré môže odborník pripraviť štandardnými spôsobmi, okrem toho všet ky optické antipódy, diastereoméry a všetky stereoméme formy.

Fyziologicky prijateľnými soľami zlúčenín všeobecného vzorca (I) sa myslia tak organické, ako aj anorganické soli, ako sú opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydanie, str. 1418 (1985)). Vďaka fyzikálnej a chemickej stabilite a rozpustnosti sú pri kyslých skupinách výhodné, okrem iného, sodné, draselné, vápenaté a amónne soli; pri zásaditých skupinách sú výhodné, okrem iného, soli kyseliny chlorovodíkovej, kyseliny sírovej, kyseliny fosforečnej alebo karboxylových kyselín alebo sulfónových kyselín, ako napr. kyseliny octovej, kyseliny citrónovej, kyseliny benzoovej, kyseliny maleínovej, kyseliny fumarovej, kyseliny vínnej a kyseliny μ-toluénsulfónovej.

Estery, étery a acetály je možné pripraviť spôsobmi opísanými v literatúre, napr. v Advanced Organic Synthesis, 4. vydanie, J. March, John Wiley & Sons, 1992 alebo Protective Groups in Organic Synthesis, 3. vydanie, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, John Wiley & Sons, 1999.

Karboxylovú skupinu je možné redukovať na alkohol napríklad pomocou LiAlH₄.

Zo zlúčenín všeobecného vzorca (I) je možné predovšetkým odštiepiť glykozidovú časť pomocou alkalickej hydrolýzy (W. Weber a kol., J. Antibiotics, 47, 1188 až 1194). Následne je možné pomocou glykozylácie (napr. Kônigs-Knorrova reakcia) zaviesť ľubovoľný cukrový zvyšok. Príslušné metódy sú opísané v literatúre, napr. v Carbohydrate Chemistry, J.F. Kennedy, Oxford University Press, 1988.

Mechanizmus účinku derivátov caloporozidu je neznámy, ale významný účinok je možné preukázať.

Na preukázanie inhibítorov CDK sa používajú testy, pri ktorých sa stanovuje miera fosforylácie špecifického peptidového substrátu pomocou cyklín-dependentných kináz. Cyklín-dependentné kinázy sa aktivujú pomocou väzby na príslušný cyklín. [y-P]-fosfát sa pomocou enzýmu prenesie z [γ-Ρ]-ΑΤΡ na peptidový substrát. Test sa uskutočňuje na 96-jamkových mikrotitračných doskách. Stanovuje sa rádioaktivita [y-P]-fosfátov prenesených na substrát.

Hodnoty IC50 pre deriváty caloporozidu udáva tabuľka 1; sú to koncentrácie, ktoré inaktivujú CDK-4 na 50 %.

Tabuľka 1

caloporozid B	1,5 pmol
caloporozid C	3,1 pmol
caloporozid D	1,8 pmol
caloporozid E	1,8 pmol
caloporozid F	1,5 pmol

Predložený vynález sa ďalej týka liečiva s obsahom aspoň jednej zlúčeniny podľa vynálezu.

Jednu alebo viac zlúčenín z derivátov caloporozidu podľa vynálezu je možné v zásade podávať samotné. Výhodné je použitie v zmesi s vhodnými pomocnými látkami alebo nosnými materiálmi. Ako nosný materiál je možné pri liečivách použiť bežné a farmakologicky prijateľné nosné materiály a/alebo pomocné látky.

Liečivá podľa vynálezu je možné všeobecne podávať orálne alebo parenterálne, ale rektálna aplikácia je v zásade tiež možná. Vhodnými pevnými alebo kvapalnými galenickými prípravkami sú napríklad granulát, prášok, tablety, dražé, (mikro)kapsuly, čapíky, sirup, emulzie, suspenzie, aerosól, kvapky alebo injikovateľné roztoky v podobe ampúl, ako aj preparáty s protrahovaným uvoľňovaním účinnej látky, pri ktorých príprave nachádzajú využitie bežné nosné látky a prísady a/alebo pomocné látky, ako sú nadúvadlo, spojivo, poťahové činidlo, napučiavacie činidlo, glidant alebo lubrikant, ochuťovadlá, sladidlo alebo solubilizačné činidlo. Ako často používané nosné alebo pomocné látky je možné menovať napríklad uhličitan horečnatý, oxid titaničitý, laktózu, manitol a ďalšie cukry, mastenec, mliečny proteín, želatína, Škroby, vitamíny, celulóza a jej deriváty, živočíšne a rastlinné oleje, polyetylénglykol a rozpúšťadlá, ako sterilná voda, alkoholy, glycerín a viacnasýtené alkoholy.

Prípadne môžu byť dávkové jednotky na orálne podávanie mikroenkapsulované na oddialenie alebo predĺženie uvoľňovania po dlhší čas, ako napríklad potiahnutím alebo vložením účinnej látky v podobe častíc do vhodného polyméru, vosku a podobne.

Výhodne sa farmaceutické preparáty pripravujú a podávajú v podobe dávkových jednotiek, pričom každá jednotka obsahuje ako účinnú zložku určitú dávku jednej alebo viacerých zlúčenín z derivátov caloporozidu podľa vynálezu. Pri použití pevných dávkových foriem, ako sú tablety, kapsuly a čapíky, môže táto dávka predstavovať až asi 500 mg, výhodne však asi 0,1 až 200 mg, a pri injekčných roztokoch v podobe ampúl až asi 200 mg, výhodne však asi 0,5 až 100 mg, na deň.

Podávané denné dávky závisia od telesnej hmotnosti, veku, pohlavia a stavu cicavca. Podľa podmienok je však možné použiť tiež vyššie alebo nižšie denné dávky. Podávanie dennej dávky je možné uskutočňovať prostredníctvom jedného podania v podobe jedinej dávkovej jednotky alebo viac menších dávkových jednotiek, ale tiež prostredníctvom viacnásobného podania rozdelených dávok v určitých intervaloch.

Liečivá podľa vynálezu je možné pripravovať tak, že sa jedna alebo viac zlúčenín podľa vynálezu s bežnými nosnými látkami, ako aj prípadne prísadami a/alebo pomocnými látkami, vpraví do vhodnej dávkovej formy.

Nasledujúce príklady uskutočnenia vynálezu majú slúžiť na ďalšie dokreslenie predloženého vynálezu. Percentuálne údaje sa vzťahujú na hmotnosť. Zmesové pomery pri kvapalinách sa vzťahujú na objem, ak nie je uvedené inak.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava glycerínovej kultúry Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784

100 ml živného roztoku (sladový výťažok 2,0 %, kvasnicový extrakt 0,2 %, glukóza 1,0 %, (NH₄)₂HPO₄0,05 %, pH 6,0) v sterilnej Erlenmeyerovej banke s objemom 300 ml sa naočkuje kmeňom Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784 a inkubuje sa pri 25 °C a 140 rpm (otáčkach za minútu) na rotačnej trepačke počas 7 dní. Následne sa 1,5 ml tejto kultúry zriedi 2,5 ml 80 % glycerínu a uchováva pri -135 °C.

Príklad 2

Príprava predkultúry Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784 v Erlenmeyerovej banke ml živného roztoku (sladový výťažok 2,0 %, kvasnicový extrakt 0,2 %, glukóza 1,0 %, (NH₄)₂HPO₄0,05 %, pH 6,0) v sterilnej Erlenmeyerovej banke s objemom 100 ml sa naočkuje kmeňom Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784 a inkubuje sa pri 25 °C a 140 rpm (otáčkach za minútu) na rotačnej trepačke počas 4 dni. Práve 2 ml tejto predkultúry sa následne naočkujú dosky pri príprave hlavnej kultúry.

Príklad 3

Príprava hlavnej kultúry Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784 na doskách s pevným médiom

Sterilné dosky s rozmermi 25 x 25 cm (Nunc) sa zalejú 200 ml nasledujúceho živného roztoku: 20 g/1 sladového výťažku, 2 g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 glukózy a 0,5 g/1 (NH₄)₂HPO₄, pH 6,0. Tieto dosky sa vždy naočkujú 2 ml predkultúry. Maximálna produkcia jednej alebo viacerých zlúčenín podľa vynálezu sa dosiahne asi po 480 hodinách.

Príklad 4

Produkcia derivátov caloporozidu

Pripraví sa 50 kusov dosiek s rozmermi 25 x 25 cm a naočkujú sa predkultúrou: Živné médium:

g/1 sladového výťažku, g/1 kvasnicového extraktu, g/1 glukózy,

0,5 g/1 (NH₄)₂HPO₄, pH 6,0 (pred sterilizáciou). Inkubačný čas: 480 hodín. Inkubačná teplota: 25°C.

Príklad 5

Izolácia caloporozidovej zmesi z doskových kultivácií Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784

Po dokončení fermentácie Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784 sa doskové kultivácie získané v príklade 3 lyofilizujú a lyofílizát sa extrahuje 5 1 metanolu. Účinnú látku obsahujúci metanolový roztok sa filtráciou zbaví rezídua a koncentruje vo vákuu. Koncentrát sa zriedi vodou a nanesie sa na pripravený 1,01 stĺpec MCI GEL, CHP20P. Elúcia sa uskutočňuje s gradientom od vody po 100 % acetonitril. Prietok stĺpcom (25 ml/min.) sa odoberá po frakciách (každá 25 ml) a frakcie obsahujúce deriváty caloporozidu (od 40 % do 100 % acetonitrilu) sa zhromažďujú. Koncentráciou vo vákuu a následnou lyofilizáciou sa získa 8,5 g žltohnedého prášku.

Príklad 6

Predbežné delenie derivátov caloporozidu pomocou RP18 chromatografie

0,5 g produktu získaného v príklade 4 sa nanesie na stĺpec Nucleosil® 100-7 C18 HD (veľkosť: 40 mm x x 250 mm). Eluuje sa gradientom od 20 % acetonitrilu (+ voda s 0,1 % prídavkom amóniumacetátu) po 100 % acetonitril za rýchlosti prietoku 35 ml/min. Výtok zo stĺpca sa odoberá po frakciách (35 ml). Deriváty caloporozidu sa prevažne nachádzajú vo frakciách 39 až 68. Zhromažďujú sa, vo vákuu sa odstráni rozpúšťadlo a následne sa lyofilizujú. Pritom sa získa caloporozid B (22,4 mg) a F (10,5 mg) už s čistotou > 95 %. Caloporozid C (frakcia 41; 43,4 mg), D (frakcia 43 až 45; 76,2 mg) a E (frakcia 43 až 45; 76,2 mg) sa získajú s čistotou asi 70 % a preto sa ešte ďalej chromatograficky čistia.

Príklad 7

Čistenie caloporozidu C, D a E mg v príklade 5 izolovaného a upraveného caloporozidu C sa nanesie na stĺpec LUNA® 5 μ C 18(2) (veľkosť: 10 mm x 250 mm) a chromatografuje sa gradientom od 25 do 35 % acetonitrilu v 0,1 % amóniumacetát/voda. Rýchlosť prietoku elučného média predstavuje 6,5 ml/min., veľkosť frakcií 6,5 ml. Vo frakciách 35 až 42 sa nachádza caloporozid C. Lyofilizáciou uvedených frakcií sa získa caloporozid C (7,5 mg) s čistotou > 95 %.

mg v príklade 5 izolovanej a upravenej zmesi caloporozidu D a E sa nanesie na stĺpec LUNA® 5 μ C18(2) (veľkosť: 10 mm x 250 mm) a chromatografuje sa gradientom od 30 do 40 % acetonitrilu v 0,1 % amóniumacetát/voda. Rýchlosť prietoku elučného média predstavuje 6,5 ml/min., veľkosť frakcií 6,5 ml. Vo frakciách 18 a 19 sa nachádza caloporozid D, vo frakciách 20 až 21 caloporozid E. Lyofilizáciou uvedených frakcií sa získa caloporozid D (7,0 mg) a caloporozid E (6,0 mg) s čistotou > 95 %.

Fyzikálno-chemické, ako aj spektroskopické vlastnosti zlúčenín podľa vynálezu je možné nasledovne zhrnúť:

caloporozid B: Sumárny vzorec: Molekulová hmotnosť: UV maxima: ‘H- a ¹³C-NMR:

C3₈H₆₂O₁₆

774,9

208, 244,310 pozri tabuľka 2

FAB hmotnostné spektrum s vysokou rozlišovacou schopnosťou ukazuje intenzívne MH⁺ pri

775,4120, v dobrej zhode s vypočítanou hmotou (pre C₃₈H₆₂0i₆, monoizotop) 775,4116. caloporozid C:

Sumárny vzorec: C43H₆₆O₂₀

Molekulová hmotnosť: 902,99

UV maxima: 208,244,310 'H- a ¹³C-NMR: pozri tabuľka 3

FAB hmotnostné spektrum s vysokou rozlišovacou schopnosťou ukazuje intenzívne MH⁺ pri 903,4264, v dobrej zhode s vypočítanou hmotou (pre C₃6H₇₁O₂₅, monoizotop) 903,4284.

caloporozid D:

Sumárny vzorec: CíiH^Ois

Molekulová hmotnosť: 890,96

UV maxima: 208,244,310 'H- a ¹³C-NMR; pozri tabuľka 4

FAB hmotnostné spektrum s vysokou rozlišovacou schopnosťou ukazuje intenzívne M+Na⁺ pri 883,3942, v dobrej zhode s vypočítanou hmotou (pre C^H^OigNa, monoizotop) 883,3939. caloporozid E:

Sumárny vzorec:

Molekulová hmotnosť: 890,96

U V maxima: 208,244,310 *H- a ¹³C-NMR: pozri tabuľka 4

FAB hmotnostné spektrum s vysokou rozlišovacou schopnosťou ukazuje intenzívne M+Na⁺ pri 883,3942, v dobrej zhode s vypočítanou hmotou (pre C^H^OigNa, monoizotop) 883,3939. caloporozid F:

Sumárny vzorec: C3₈H₆₂O₁₆

Molekulová hmotnosť: 774,9

UV maxima: 208,244,310 ‘H- a ⁱ³C-NMR: pozri tabuľka 5

FAB hmotnostné spektrum s vysokou rozlišovacou schopnosťou ukazuje intenzívne M+H⁺ pri 775,4128, v dobrej zhode s vypočítanou hmotou (pre C3₈H₆₂O₁₆, monoizotop) 775,4116.

m/z m/z m/z m/z m/z

Tabuľka 2 'H- a ¹³C-chemické posuny caloporozidu B v metanole-d₄ a DMSO-d_f, pri 300 K

	DMSO	MeOD	DMSO	MeOH
1	-	-	171,24	a)
2	-	-	a)	a)
3	-	-	162,22	163,57
4	6,68	6,77	115,28	116,81
5	7,17	7,25	-131,6	b
6	6,57	6,67	121,02	-123,0
7	-	-	137,90	139,57
8	a)	a)	a)	a)
9	a)	a)	a)	a)
10-20	1,30-1,20	1,32-1,27	29,01-28,69	30,76-30,47
21	1,30	1,38/1,32	24,81	26,52
22	1,54/1,45	1,65/1,52	35,31	37,00
23	4,81	4,95	70,04	73,09
24	1,15	1,24	19,69	20,22
ľ	-	-	173,43	175,35
2'	3,95	4,13	70,89	72,97
3'	3,95	4,17	70,04	71,59
4'	3,54	3,82	67,96	69,80
5'	3,65	3,86	78,94	80,12
6'	3,74/3,44	3,90/3,69	62,11	63,25
1	4,53	4,71	100,27	101,34
2	3,74	3,95	70,37	72,46
3	3,22	3,44	73,67	75,30
4	3,21	3,49	67,54	69,00
5	3,04	3,22	77,15	78,23
6	3,72/3,31	3,88/3,63	61,80	63,25
Ac-C'	-	a)	-	a)
Ac-Me	a)	a)	a)	a)

^a) Pre tieto protóny/atómy uhlíka nebol v MeOD, respektíve DMSO, pozorovaný žiadny signál (agregácia)

Tabuľka 3 'H- a ¹³C-chemické posuny caloporozidu C v metanole-d₄ pri 300 K

	*H	*0
1	-	175,90
2	-	116,73
3	-	163,67
3-Ac-Me	a)	a)
3-Ac-C'	-	a)
4	6,73	116,73
5	7,16	-132,6^b)
6	6,55	123,53
7	-	139,51
8	2,49	43,06
9	1,53	24,75
10-20	1,36-1,26	30,78-30,62
21	1,38/1,33	26,54
22	1,65/1,52	37,02
23	4,95	73,04
24	1,24	20,22
ľ	-	175,17
2'	4,17	72,82
3'	4,08	71,60

	’H	¹³C
4'	3,71	69,79
5'	4,07	76,38
6'	4,60/4,14	66,43
7'	-	170,55
8'	3,27 ^c)	-44,8
9'	-	173,12
1	4,93	99,40
2	5,33	73,40
3	3,72	73,40
4	3,42	69,34
5	3,34	78,19
6	3,89/3,62	63,11
2-Ac-Me	2,11	21,17
2-Ac-C'	-	172,56

^a) Pre tieto jadrá sa nepozoroval žiadny signál (silné rozšírenie signálu).

^b) Rozšírenie signálu.

^c) Signál pre protóny v polohe 8' sa pozoroval len v čerstvom roztoku (rýchlejšia výmena oproti deutériu).

Tabuľka 4 'H- a ¹³C-chemické posuny caloporozidu D a E v metanole-d₄ pri 300 K

	'H caloporozid D	^I3C caloporozid D	'H caloporozid E	^I3C caloporozid E
1	-	-	176,28	176,28
2	-	-	120,37	120,37
3	-	-	162,12	162,12
4	6,61	6,61	114,91	114,91
5	7,06	7,06	131,53	131,53
6	6,58	6,58	122,23	122,23
7	-	-	147,22	147,22
8	3,04	3,04	36,31	36,31
9	1,55	1,55	33,35	33,35
10-20	1,36-1,25	1,36-1,25	31,07-30,61	31,07-30,61
21	1,38/1,32	1,38/1,32	26,53	26,53
22	1,65/1,53	1,65/1,53	37,01	37,01
23	4,95	4,95	73,13 ^a)	73,07 ^a)
24	1,24	1,24	20,23	20,23
ľ	-	-	175,18	175,40
2'	4,17	4,15	72,80	72,80
3'	4,08	4,15	71,61	71,53
4'	3,71	3,85	69,78	69,27
5'	4,07	4,08	76,40	77,07
6'	4,58/4,14	4,59/4,24	66,35	65,43
7'	-	-	-170,4	-170,4
8'	3,28	3,28	-45,0	-45,0
9'	-	-	-173,0	-173,0
1	4,93	4,84	99,40	100,20
2	5,33	4,03	73,41	70,27
3	3,72	4,78	73,39	77,44
4”	3,42	3,71	69,32	66,35
5	3,34	3,38	78,35	78,00
6”	3,91/3,62	3,89/3,65	63,09	62,96
2/3-Ac-Me	2,11	2,00	21,18	20,98
2/3-Ac-C'	-	-	172,59	172,36

^a) Tieto signály nebolo možné jednoznačne priradiť.

Tabuľka 5 'H- a ¹³C-chemické posuny caloporozidu F v metanole-d₄ pri 300 K

	Ή	¹³C
1	-	174,95
2	-	117,32
3	-	162,18
4	6,68	115,42
5	7,17	133,17
6	6,67	122,65
7	-	146,91
8	2,93	36,57
9	1,56	33,27
10-20	1,36-1,25	30,93-30,62
21	1,35	26,53
22	1,65/1,53	37,02
23	4,95	73,05
24	1,24	20,23
ľ	-	175,15
2'	4,17	72,98
3'	4,09	71,73
4'	3,71	69,88
5'	3,85	79,59
6'	3,90/3,61	63,57
1	4,88	99,76
2	5,37	73,52
3	3,63	73,56
4	3,46	69,27
5	3,28	78,33
6	3,91/3,63	63,06
Ac-C'	-	173,03
Ac-Me	2,13	21,21

Príklad 8

Bioanalýza CDK-4 inhibítorov

S cieľom stanoviť hodnoty IC₅₍₎ sa z prirodzených látok podľa vynálezu pripravili zásobné roztoky s koncentráciou 10 mmol. Na 384-jamkové dosky FlashPlates sa pri izbovej teplote v priebehu 2 hodín nanieslo 50 μΐ (50 pg/jamka) biotinylovaného peptidového substrátu a následne sa 3x premyli PBS pufrom. Pre reakciu sa na dosky napipetovalo 30 μΐ pufrom zriedeného roztoku derivátu caloporozidu a 20 μΐ vopred namiešaného roztoku ATP/cyklinDl/CDK4 (výsledná koncentrácia: 1 pCi 33Ρ-γ-ΑΤΡ, 2 pmol ATP a 1 pg enzýmovej zmesi). Po 2 hodinách reakčného času pri 37 °C sa dosky 3x premyli 80 μΐ 3 % kyseliny fosforečnej a následne 30 sekúnd merali v počítači MicroBeta. Stanovenie percentuálnej inhibície sa uskutočnilo pomocou matematických rovníc. Na stanovenie hodnôt IC₅₀ sa testovalo 10 koncentrácií čerstvo zriedeného DMSO roztoku zlúčenín podľa vynálezu.

Claims

1. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) (I), v ktorom

R¹, R² a R³ nezávisle jeden od druhého znamenajú atóm vodíka alebo acylovú skupinu obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov; a

R⁴ znamená atóm vodíka alebo skupinu -C(O)(CH₂)_nCOOH, kde n znamená 1 až 7;

s tou výhradou, že R¹, R², R³ a R⁴ neznamenajú všetky atóm vodíka;

ako aj ich fyziologicky prijateľné soli.

2. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, kde

R¹, R² a R³ nezávisle jeden od druhého znamenajú atóm vodíka alebo acetylovú skupinu; a

R⁴ znamená atóm vodíka alebo malonylovú skupinu, to znamená n = 1;

ako aj jej fyziologicky prijateľné soli.

3. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2, kde

R¹ znamená acetylovú skupinu; a

R², R³ a R⁴ znamenajú atóm vodíka;

ako aj jej fyziologicky prijateľné soli.

4. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2, kde

R¹ a R³ znamenajú acetylovú skupinu;

R² znamená atóm vodíka; a

R⁴ znamená malonylovú skupinu;

ako aj jej fyziologicky prijateľné soli.

5. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2, kde

R¹ a R² znamenajú atóm vodíka;

R³ znamená acetylovú skupinu; a

R⁴ znamená malonylovú skupinu;

ako aj jej fyziologicky prijateľné soli.

6. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2, kde

R¹ a R³ znamenajú atóm vodíka;

R² znamená acetylovú skupinu; a

R⁴ znamená malonylovú skupinu; ako aj jej fyziologicky prijateľné soli.

7. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 alebo 2, kde

R¹, R² a R⁴ znamenajú atóm vodíka; a

R³ znamená acetylovú skupinu;

ako aj jej fyziologicky prijateľné soli.

8. Spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľnej soli podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že sa fermentuje mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784, respektíve jeden z jeho variantov alebo mutácií, vo vhodných podmienkach, izoluje sa jeden alebo viac derivátov caloporozidu a prípadne sa tieto prevedú na fyziologicky prijateľné soli.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa fermentácia uskutočňuje za aeróbnych podmienok, pri teplote v rozsahu 18 a 35 °C a pri pH v rozsahu 5 a 8.

10. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľná soľ podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 7 na použitie ako liečivo.

11. Zlúčenina všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľná soľ podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 7 na použitie ako inhibítor cyklín-dependentnej kinázy.

12. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľnej soli podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 7 na prípravu liečiv na ošetrovanie rakoviny alebo iných ochorení s patologickou poruchou bunkovej proliferácie.

13. Liečivo, vyznačujúce sa tým, že obsahuje aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľnú soľ podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 7.

14. Spôsob prípravy liečiva podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že sa aspoň jedna zlúčenina všeobecného vzorca (I) alebo jej fyziologicky prijateľná soľ podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 7 s vhodnými pomocnými a/alebo nosnými látkami vpraví do formy vhodnej na podávanie.

15. Mikroorganizmus Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Breš. ST 001714, DSM 13784.