CN111285909A - 光学活性双环醇葡萄糖苷及其制备方法和防治肝病的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可用于医药的光学活性(P)‑及(M)‑双环醇‑9‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其制备方法和用途。双环醇和尿苷二磷酸葡萄糖二钠盐在糖基转移酶催化下一步合成光学活性(P)‑及(M)‑双环醇‑9‑O‑β‑D‑葡萄糖苷，按照本发明制备的双环醇‑9‑O‑β‑D‑葡萄糖苷可用于肝病的防治。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷化合物与其制备方法，以及其在防治肝病中的应用。
背景技术
双环醇由中国医学科学院药物研究所
等科学家领导研发的具有自主知识产权的国家一类新药，用于治疗慢性肝炎所致的氨基转移酶升高，疗效显著。2001年在中国上市，商品名百赛诺，并于2004年、2016年分别在乌克兰及俄罗斯上市。研究成果《国家一类抗肝炎新药双环醇的研究》获得2007年度国家科技进步奖二等奖。
慢性病毒性肝炎是严重危害我国人民健康的常见传染病，急需安全、有效的治疗新药。中国医学科学院药物研究所双环醇研究组在国家“七五”、“八五”和“九五”三个攻关项目基金支持下，历时15年成功研制出新一代具有我国自主知识产权的抗肝炎新药双环醇。该药化学结构新颖、抗肝炎疗效好、毒副作用小，且合成工艺适于工业生产，所用原料均为国产，生产成本低，无污染。该药已获得美国、欧盟、日本、韩国等15个国家和台湾地区的物质发明专利。
双环醇化学名为：4,4'-二甲氧基-5,6,5',6'-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2'-甲氧羰基联苯，分子式为C19H18O9，分子量为390.34，结构式如下：
但双环醇的水溶解性差，其口服生物利用度也较低(吕昭云，张颖，李强，等.一种以双环醇为活性成分的药物组合物及其制剂[P].中国专利:CN 102058577 A,2011-05-18)。同时，目前药用的双环醇是消旋体，左旋体和右旋体药理活性及副作用均不明确。因此，通过结构优化获得水溶性强、光学纯的双环醇衍生物，将有利于改善其药效、明确其药理活性和副作用，使用药更加安全。其中糖基化修饰是解决上述问题的有效方法。
就糖基化而言，目前有化学法及酶法两种方法。化学法主要有氟代糖法、硫苷法、相转移催化法等，这些方法尽管各有令人称道之处，但无一不涉及到复杂的保护策略，从收率、立体及位置选择性的角度考察，尚无一种十分有效、具广泛适应性的方法。再者，化学合成中还涉及到有毒的试剂，不仅污染环境，其残留还会带来药物的毒性。因此，天然产物的高效、绿色化学法糖基化仍是当今有机/药物化学领域面临的难题。
较之化学法，生物合成法即酶法糖基化大多由糖基转移酶催化完成，因其拥有高选择性，有可能实现高效糖基化，而且环境友好，越来越受到世界范围内有机/药物化学家的青睐。
在对现有文献的分析中，目前有利用化学法对双环醇进行糖基化的报道，但仍具有上述化学法的种种不足，造成光学活性双环醇糖苷类衍生物难以获得、产率低以及环境不友好等技术难题。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷化合物，其结构新颖；本发明的又一个目的是提供其制备方法；本发明的第三个目的是其在防治肝病中的应用。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一类新颖光学活性(P)-及(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷化合物(I和II)，其结构新颖，未有文献和专利报道该类化合物，其结构如下：
上述一类新颖光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷化合物(I和II)的制备方法，其特征包括：
1.重组糖基转移酶OleDLoki的制备：将来源于Streptomyces antibioticus的糖基转移酶基因OleD的突变体OleDLoki(Gantt R.W.；Peltier-Pain P.；Singh S.；Zhou M.；Thorson J.S.Broadening the scope of glycosyltransferase-catalyzed sugarnucleotide synthesis.Proceedings of the National Academy of Sciences,2013,201220220.)构建于pET28a表达载体并转化至大肠杆菌表达宿主中。OleDLoki与6×His·tag融合表达，利用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow resin(GE Healthcare公司)亲和层析柱对重组糖基转移酶OleDLoki分离纯化，制备获得OleDLoki纯酶。
2.光学活性双环醇-9-O-葡萄糖苷酶法制备：将OleDLoki纯酶液、双环醇和尿苷二磷酸葡萄糖二钠盐(UDPG)混匀，于一定温度下进行反应，停止反应后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后用高效液相色谱进行分离纯化，获得光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和II。
3.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷的结构鉴定:利用HRESIMS、1H NMR、13CNMR、HSQC、1H-1H COSY和HMBC以及CD等波谱技术对产物双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和II进行了结构鉴定，分别为(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)，为一对轴手性光学异构体。
4.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷水溶性测试：通过HPLC测定双环醇和(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷1和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷2的水饱和溶液的峰面积，再通过标准曲线计算得到25℃时其在水中的溶解度，双环醇在水中的溶解度为0.016mg/mL，其中(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷1在水中的溶解度为2.76mg/mL，(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷2在水中的溶解度为3.27mg/mL。两个光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷在水中的溶解度分别是双环醇的173倍、205倍。上述结果表明双环醇的糖基化显著增加了其水溶性。
上述一类新颖光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷化合物(I和II)的在防治肝病中的应用，其特征包括：
利用三个体外肝细胞损伤模型、一个体外肝细胞脂肪变性模型和两个体内肝损伤模型，对光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷化合物(I和II)及双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷在肝脏病治疗中的作用进行了评价。
1.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对APAP引起的体外肝细胞损伤的保护作用：在对乙酰氨基酚(APAP)诱导的体外肝细胞损伤模型中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I(0.5,1.0,5.0,10.0,20.0μM)、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(0.5,1.0,5.0,10.0μM)在对人肝细胞无毒浓度下，对APAP引起的体外肝细胞损伤均有显著保护作用，能显著提高细胞存活率，活性优于10μM双环醇，与谷胱甘肽活性相当或优于谷胱甘肽。
2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对TPL引起的体外肝细胞损伤的保护作用：在雷公藤甲素(TPL)诱导的体外肝细胞损伤模型中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II对TPL引起的体外肝细胞损伤均有明显的改善作用，其中，双环醇-9-O-葡萄糖苷I(0.5μM、10μM、20μM)及双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(0.5μM、10μM、20μM)组细胞存活率与模型组比较具有统计学差异。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II在0.5-20μM浓度范围内，对TPL引起的体外人肝细胞损伤保护活性均优于25μM双环醇。
3.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对H2O2引起的体外肝细胞损伤的保护作用：在过氧化氢(H2O2)诱导的体外肝细胞损伤模型，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II各剂量组对H2O2引起的体外细胞肝损伤均显示明显的改善作用，其中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(1.0μM、5.0μM、20.0μM)组与模型组比较，具有统计学差异，1.0μM双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II组活性优于阳性药双环醇。
4.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积的降低作用：在油酸诱导的肝细胞脂肪变性模型中，油红染色结果显示，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II各剂量组对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积均有明显降低作用，其中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I(0.5μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM)、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(0.5μM、1.0μM、10.0μM、20.0μM)组的OD值与模型组比较均具有统计学差异，降脂效果显著。同时，检测肝细胞内甘油三酯含量，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II在0.5-20.0μM浓度范围内对油酸引起肝细胞内甘油三酯升高均具有一定的降低作用，活性多优于阳性对照药非诺贝特。
5.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4引起的小鼠急性肝损伤的保护作用：在CCl4诱导的小鼠急性中毒性肝损伤模型中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(1.2，2.5，5.0mg/kg)静脉注射给药，对CCl4引起的急性肝损伤具有显著保护作用，能降低血清ALT、AST及LDH含量，改善肝组织病理损伤。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(2.5mg/kg)静脉给药对CCl4诱导的小鼠急性中毒性肝损伤保护作用优于双环醇(200mg/kg)灌胃给药。
6.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对ConA引起的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用：在ConA引起的小鼠急性免疫性肝损伤模型中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷在1.2-10.0mg/kg剂量范围内对Con A引起的小鼠肝损伤均具有一定的保护活性，能降低血清ALT、AST、LDH含量，显著改善肝组织病理改变，肝细胞变性和坏死明显减轻。其中，10mg/kg双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷静脉给药对AST、LDH的降低活性优于阳性对照药双环醇(200mg/kg)灌胃给药。
本发明具有以下技术优势：
1.本发明的具光学活性(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II为新结构化合物，未见报道；
2.本发明的具光学活性(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II的制备方法新颖，未见文献报道，具有反应步骤少、转化率高、方法环境友好的优势；
3.本发明的具光学活性(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II的水溶性较双环醇显著增强；
4.本发明的具光学活性(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II对APAP、TPL及H2O2引起的体外肝细胞损伤均有显著保护作用；
5.本发明的具光学活性(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积均有明显降低作用；
6.本发明的双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4诱导的小鼠急性中毒性肝损伤及ConA引起的小鼠急性免疫性肝损伤具有显著保护作用，能降低血清ALT、AST及LDH含量，改善肝组织病理损伤。
附图说明
图1.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的1H NMR谱图(CDCl3,600MHz)
图2.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的13C NMR谱图(CDCl3,150MHz)
图3.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的HSQC谱图(CDCl3,600MHz)
图4.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的1H-1H COSY谱图(CDCl3,600MHz)
图5.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的HMBC谱图(CDCl3,600MHz)
图6.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的HRESIMS谱图
图7.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的1H NMR谱图(CDCl3,600MHz)
图8.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的13C NMR谱图(CDCl3,150MHz)
图9.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的HSQC谱图(CDCl3,600MHz)
图10.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的1H-1H COSY谱图(CDCl3,600MHz)图11.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的HMBC谱图(CDCl3,600MHz)
图12.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的HRESIMS谱图(CDCl3,600MHz)
图13.(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I)的CD谱图及结构
图14.(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II)的CD谱图及结构
图15.反应液的HPLC谱图
图16.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4引起的小鼠急性肝损伤肝脏组织病理H.E.染色代表性图片(GB：双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷)
图17.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对ConA引起的小鼠急性免疫性肝损伤肝脏组织病理H.E.染色代表性图片(GB：双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷)
具体实施方式
为进一步理解本发明，下面的实施例仅用来进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。
一、光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷酶法制备、结构鉴定及水溶性测定
实施例1.重组糖基转移酶的制备
将来源于Streptomyces antibioticus的糖基转移酶基因OleD的突变体OleDLoki构建于表达载体pET28a中，将重组质粒pET28a-OleDLoki导入大肠杆菌BL21中，PCR筛选阳性转化子，并送测序鉴定阅读框的正确性。
将正确的阳性转化子接种于含卡那霉素(pET-28a载体携带抗性)的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h；2)、将活化后的种子液再次以100:1的比例接种于LB(卡那霉素+)培养基中，选用250mL三角瓶，每瓶装液量50mL(放大实验选用500mL三角瓶，每瓶装液量200mL)；3)、37℃，200rpm培养至OD600≈0.6，于每瓶培养物中加入终浓度为0.1mM的IPTG；18℃，200rpm条件下诱导目的蛋白表达；4)、诱导培养16h后收集菌体，6,000×g离心5min，弃上清，菌体用ddH2O洗1–2次，洗净培养基，获得重组菌体。
目的基因OleDLoki与6×His·tag融合表达，故利用Ni SepharoseTM 6 Fast Flowresin(GE Healthcare公司)亲和层析柱对重组糖基转移酶OleDLoki分离纯化，具体步骤如下：
向收集的重组菌体中加入3mL/g binding buffer(20mM磷酸缓冲液，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.2)，涡旋重悬沉淀；将离心管置于冰水混合物中超声破碎15min(130w,3s/3s)，4℃，15,000×g离心30min，上清即为粗提液。将蛋白粗提液用0.45μm滤膜过滤，以1mL/min的流速上样于用10倍柱体积binding buffer平衡后的Ni SepharoseTM 6 Fast Flowresin亲和层析柱中。
上样结束后，以10倍柱体积binding buffer洗脱非特异性结合的杂蛋白，流速1mL/min。分别配制不同咪唑浓度的洗脱缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，咪唑浓度梯度如下：50mM、100mM、200mM、300mM，最后用elution buffer(20mM磷酸缓冲液，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.2)洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，对流份进行SDS-PAGE检测。
将含有目的蛋白的高纯度流份于超滤离心管中(规格30kDa，Millipore)进行超滤、浓缩、脱盐。OleDLoki纯酶经脱盐后保存于desalting buffer(50mM Tris-HCl，1mM DTT，1％甘油，50mM NaCl)中。
实施例2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷酶法制备及结构鉴定
培养重组大肠杆菌2.0L，通过实施例1所述的方法纯化获得纯酶液16mL,加入双环醇DMSO溶液2.56mL(共50.0mg,0.128mM)和UDPG(156mg,0.256mM)轻轻混匀，于30℃下反应48h。取100μL反应液进行HPLC-MS分析，结果表明，产物I和II的转化率分别为26.5％、24.2％，总转化率50.7％(HPLC图见附图15)，MS分析结果表明产物为双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷。双环醇及其糖苷化产物的HPLC分析条件是：Agilent 1200 series高效液相仪，Shiseido HPLC反相分析C18柱，流速1.0mL/min，流动相是甲醇和0.1％甲酸水体系，进样20μL，梯度洗脱条件：10-60％MeOH(0-30min),60-80％(30-35min),80-100％(35-40min),100-100％(40-45min)，检测波长280nm。
反应液用三倍体积的乙酸乙酯(60mL)萃取4次，浓缩乙酸乙酯萃取液至4.0mL，通过半制备高效液相纯化得到双环醇-9-O-葡萄糖苷I(tR＝25.1min)质量15.5mg，双环醇-9-O-葡萄糖苷II(tR＝26.9min)质量15.5mg，产率为43.8％。利用HRESIMS、1D NMR、2D NMR及CD等波谱技术鉴定产物I和II结构分别为(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷和(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷，为一对轴手性光学异构体，均为新化合物，其理化性质及波谱数据如下：
(P)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I):透明固体；[α]25 D-87.3(c 0.50,CHCl3)；CD(MeOH)λmax(Δε)226.5(+10.99),250.5(-8.97),276.0(+0.83),294.5(-2.12)nm；HRESIMSm/z 575.1353[M+Na]+calcd for 575.1371C25H28O14Na；1H NMR(CDCl3,600MHz):δ＝7.33(1H,s,-CH-),6.71(1H,s,-CH-),6.04(1H,s,-CH2-),5.96(1H,s,-CH2-),5.90(2H,s,-CH2-),4.62(1H,d,J＝10.9Hz,-CH2-),4.32(1H,d,J＝10.9Hz,-CH2-),4.20(1H,d,J＝6.2Hz,Glc-H1),3.97(3H,s,-CH3),3.95(3H,s,-CH3),3.74(2H,m,Glc-H),3.65(3H,s,-CH3),3.52(1H,m,Glc-H),3.42(1H,m,Glc-H),3.19(2H,m,Glc-H)；13C NMR(CDCl3,150MHz):δ＝167.1,147.6,146.9,143.1,142.9,138.6,134.7,129.6,124.2,111.6,110.7,110.2,109.3,102.6,101.9,101.3,76.4,75.5,73.6,69.9,69.1,61.9,56.8,56.8,52.5.
(M)-双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(II):透明固体；[α]25 D+22.0(c 0.44,CHCl3)；CD(MeOH)λmax(Δε)206.3(+15.82),231.0(-15.06),256.0(+8.76),293.5(+4.02)nm；HRESIMSm/z 575.1351[M+Na]+calcd for 575.1371C25H28O14Na.1H NMR(CDCl3,600MHz):δ＝7.27(1H,s,-CH-),6.70(1H,s,-CH-),6.03(1H,s,-CH2-),6.00(1H,s,-CH2-),5.94(2H,s,-CH2-),4.58(1H,d,J＝10.9Hz,-CH2-),4.24(1H,d,J＝10.9Hz,-CH2-),4.15(1H,d,J＝7.4Hz,Glc-H1),3.97(3H,s,-CH3),3.96(3H,s,-CH3),3.75(2H,m,Glc-H),3.65(3H,s,-CH3),3.49(1H,m,Glc-H),3.42(1H,m,Glc-H),3.22(2H,m,Glc-H)；13C NMR(CDCl3,150MHz):δ＝168.1,147.8,147.0,143.3,143.1,138.4,134.8,129.3,125.3,111.2,110.6,110.2,109.6,102.6,102.0,101.6,76.4,75.4,73.7,70.3,69.4,62.3,56.9,56.7,52.6.
二、药理学实验
实验例1.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对APAP引起的体外肝细胞损伤的保护作用
1.细胞培养
人肝癌HepG2细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)中生长，培养条件为37℃、5％CO2，饱和湿度。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA液消化传代。
2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对HepG2细胞的细胞毒性
采用MTT方法。HepG2细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入0.5-20μM双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II，同时设溶剂对照组，每个浓度设3个平行孔。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II作用细胞48h后，弃去培养液，每孔加入100μL MTT(0.5mg/mL)液，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO 150μL，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药细胞OD平均值/溶剂对照细胞OD平均值)×100％。
3.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对乙酰氨基酚引起体外肝细胞损伤的保护作用
采用MTT方法。HepG2细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II及对乙酰氨基酚(APAP，终浓度8mM)，同时设阳性对照药双环醇组、阳性对照药谷胱甘肽组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞48h。弃去培养液，每孔加入100μL MTT(0.5mg/mL)液，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入150μLDMSO，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药组OD平均值/溶剂对照组OD平均值)×100％。
4.统计学分析
数据以均数平均值±标准差
表示。组间比较用t检验，以p<0.05表示有显著性差异。
5实验结果
0.5-20μM光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II作用于HepG2细胞48h的细胞存活率见表1，如表所示，0.5-20μM光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II作用HepG2细胞48h，对HepG2细胞无明显毒性，选择此浓度用于后续实验。
光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对APAP体外损伤肝细胞的保护作用见表2。8mM APAP作用肝细胞24h，能引起肝细胞显著损伤，OD值与空白对照组比较显著降低，肝细胞存活率仅为空白对照组的39.49％。光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I(0.5,1.0,5.0,10.0,20.0μM)、双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(0.5,1.0,5.0,10.0μM)在对人肝细胞无毒浓度下，对APAP引起的体外肝细胞损伤均有显著保护作用，能显著提高细胞存活率，与模型组比较均有统计学差异，活性优于双环醇(10μM)，与谷胱甘肽活性相当或优于谷胱甘肽。
表1.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II作用HepG2细胞48小时的存活率(n＝3)
表2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对APAP体外损伤肝细胞的保护作用(n＝3)
***P＜0.001，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001与模型组比较
实验例2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对TPL引起的体外肝细胞损伤的保护作用
1.细胞培养
同实验例1。
2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对雷公藤甲素引起体外肝细胞损伤的保护作用
采用MTT方法。HepG2细胞5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II及雷公藤甲素(TPL，终浓度180nM)，同时设阳性对照药双环醇组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞24h。每孔加入100μL MTT(0.5mg/mL)液，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入150μL DMSO，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药组OD平均值/溶剂对照组OD平均值)×100％。
3.统计学分析
同实验例1。
4.实验结果
结果见表3，180nM TPL作用肝细胞24h，引起肝细胞显著损伤，细胞存活率仅为对照组的53.76％。光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对TPL引起的体外肝细胞损伤均有明显的改善作用，其中，光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I(0.5μM、10.0μM、20.0μΜ)及光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(5.0μM、10.0μM、20.0μΜ)组细胞存活率与模型组比较具有统计学差异。光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II在所有浓度下，对TPL引起的体外人肝细胞损伤保护活性均优于双环醇。
表3.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对雷公藤甲素体外肝细胞损伤的保护作用(n＝3-4)
***P＜0.001，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较。
实验例3.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对过氧化氢引起体外肝细胞损伤的保护作用
1.细胞培养
同实验例1。
2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对过氧化氢引起体外肝细胞损伤的保护作用
采用MTT方法。HepG2细胞1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II及过氧化氢(H2O2，终浓度160μM)，同时设阳性对照药双环醇组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞24h。每孔加入100μL MTT(0.5mg/mL)液，培养4h，弃去MTT液，每孔加入150μL DMSO，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝(给药组OD平均值/溶剂对照组OD平均值)×100％。
3.统计学分析
同实验例1。
4.实验结果
结果见表4，160μM过氧化氢(H2O2)作用人肝细胞24h，对肝细胞造成显著损伤，细胞存活率为59.24％。光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II各剂量组对H2O2引起的体外细胞肝损伤均有一定的改善作用，其中，光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷II(1.0μM、5.0μM、20.0Μm)组与模型组比较，具有统计学差异，且在浓度为1.0μM时活性优于阳性药双环醇。阳性对照药双环醇对H2O2引起的体外肝细胞损伤具有明显的改善作用，与模型组比较有统计学差异。
表4.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对H2O2引起体外肝细胞损伤的保护作用(n＝3-4)
***P＜0.001，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较。
实验例4.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积的降低作用
1.细胞培养
同实验例1。
2.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积的降低作用
采用油红染色方法。HepG2细胞5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II及油酸(OA，终浓度240μM)，同时设阳性对照药非诺贝特组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞24h。弃细胞上清液，每孔加入100μL PBS清洗三次，并加入100μL 4％多聚甲醛固定40min，弃掉，同法清洗三次，每孔加入100μL油红染液(0.5％油红：双蒸水＝3：2)，避光静置1h，弃去染液，同法清洗三次，每孔加入50μL异丙醇，混和振荡器振荡，于酶标仪520nm波长处测定吸光度值。
采用测定甘油三酯(TG)的方法。HepG2细胞2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II及油酸(OA，终浓度240μM)，同时设阳性对照药非诺贝特组、溶剂空白对照组及模型组。继续作用细胞24h。弃细胞上清液，于冰上收集细胞，按照组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒说明测定细胞内TG的含量，并利用BCA法定蛋白，计算每毫克蛋白的TG含量。
3.统计学分析
同实验例1。
4.实验结果
油红染色结果见表5，240μM油酸作用人肝细胞24h，肝细胞脂质堆积显著提高，与空白对照组比较有极显著差异。光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II各剂量组对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积均有明显降低作用，其中，光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I(0.5μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM)、II(0.5μM、1.0μM、10.0μM、20.0μM)组，OD值与模型组比较均具有统计学差异，降脂效果显著。阳性对照药非诺贝特对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积具有明显的改善作用，与模型组比较有统计学差异。
表5.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对油酸引起的体外肝细胞脂质堆积的降低作用(n＝3-4)
***P＜0.001，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与模型组比较。
TG结果见表6，240μM油酸作用人肝细胞24h，肝细胞内甘油三酯含量显著提高，与空白对照组比较有统计学差异。光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II各剂量组对油酸引起肝细胞内甘油三酯升高均具有一定的降低作用，其中，除光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I浓度为5.0μM、10.0μM外，其它各组活性均优于阳性对照药非诺贝特，但因标准差较大，与模型组均无统计学差异。
表6.光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷I、II对油酸诱导体外肝细胞脂质堆积的降甘油三酯作用(n＝3-4)
**P＜0.01，与空白对照组比较。
实验例5.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4引起的小鼠急性肝损伤的保护作用
1.CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型建立及给药方法
SPF级雄性ICR小鼠(20～22g)，适应环境后随机分为7组，空白对照组，CCl4模型组，双环醇200mg/kg组，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷(I、II的混合物，实施例8和实施例9同)1.2mg/kg组、2.5mg/kg组、5mg/kg组和10mg/kg组，每组6-8只。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷各剂量组于造模前一天的下午，当天的上、下午各尾静脉注射给药1次，双环醇200mg/kg组于造模前一天的下午，当天的上、下午各灌胃给药1次，空白对照组及模型组动物尾静脉注射同等剂量的生理盐水。于末次给药后2h，除空白对照组，各组小鼠腹腔注射0.15％CCl4花生油溶液一次。给药量均为10mL/kg。小鼠禁食不禁水16h后，处死动物。
2.生化指标测定
小鼠摘眼球取血，血液样本室温静置2h，4000rmp离心10min，分离血清，全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、LDH含量。
3.肝脏病理检测
取相同部位肝大叶标本，经4％多聚甲醛固定，常规脱水透明、石蜡包埋、切片后，进行H.E.染色，光镜检查肝脏病理状态并照相。
4.统计学分析
同实验例1。
5.实验结果
5.1双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清生化指标的影响
分组及动物的初始体重、终末体重见表7，在目前的实验方案和给药剂量下，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷未显示明显毒性，动物体重无明显降低。血清ALT、AST、LDH含量结果见表8。结果显示，CCl4能引起小鼠明显的急性肝损伤，血清ALT、AST含量较空白对照组显著升高。双环醇-9-O-葡萄糖苷各剂量组对CCl4引起血清ALT、AST、LDH升高均有一定降低活性，其中双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷2.5mg/kg组能显著降低血清中ALT、AST、LDH含量，与模型组比较有统计学差异，其降低活性优于阳性对照药双环醇；双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷1.2mg/kg组能显著降低血清中ALT、LDH含量，与模型组比较有统计学差异，对AST含量也有降低趋势，其降低活性优于阳性对照药双环醇；双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷5mg/kg组能显著降低血清中LDH含量，对ALT、AST含量也有降低趋势，但与模型组比较无统计学差异。阳性对照药双环醇对ALT含量有降低趋势。
表7.CCl4急性肝损伤模型分组及动物初始体重、终末体重情况(n＝6-8)。
表8.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4引起小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST、LDH含量的影响(n＝6-8)。
*P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较；#P＜0.05，与模型组比较。
5.2双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察
各组动物肝脏有代表性的病理图见图16，空白对照组动物肝小叶结构完整，肝细胞索排列规则，结构清晰，肝细胞未见变性和坏死。CCl4模型组动物肝细胞呈凋亡样坏死，局部有炎细胞浸润，肝细胞固缩、胞浆深，细胞间隙增大。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷各剂量组对CCl4引起肝脏组织病理学改变均有一定程度的改善作用，肝细胞变性和坏死减轻。阳性对照药双环醇对CCl4引起的肝脏病理损伤亦均有明显的改善作用。
实验例6.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对ConA引起的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用
1.Con A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤模型建立及给药方法
SPF级雄性ICR小鼠(20～22g)，适应环境后随机分为7组，空白对照组，Con A模型组，双环醇200mg/kg组，双环醇-9-O-葡萄糖苷1.2mg/kg组、2.5mg/kg组、5mg/kg组和10mg/kg组，每组8-10只。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷各剂量组于造模前一天的下午，当天的上、下午各尾静脉注射给药一次，双环醇200mg/kg组于造模前一天的下午，当天的上、下午各灌胃给药一次，空白对照组及模型组动物尾静脉注射同等剂量的生理盐水。于末次给药后2h，除空白对照组，各组小鼠尾静脉注射20mg/kg Con A一次，给药剂量10ml/kg。小鼠禁食不禁水16h后，处死动物。
2.生化指标测定
同实验例5。
3.肝脏病理检测
同实验例5。
4.统计学分析
同实验例1。
5.实验结果
5.1双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对Con A诱导的急性免疫性肝损伤小鼠血清肝功能指标的影响
分组及动物的初始体重、终末体重见表9，在目前的实验方案和给药剂量下，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷未显示明显毒性，动物体重无明显降低。血清ALT、AST、LDH含量结果见表10。结果显示，Con A能引起小鼠急性肝损伤，血清ALT、AST含量较空白对照组显著升高。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷各剂量组对Con A引起血清ALT、AST、LDH升高均有一定降低活性，其中，双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷10mg/kg组能够显著降低血清中ALT、AST、LDH含量，与模型组比较有统计学差异，其对AST、LDH的降低活性优于阳性对照药双环醇；双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷1.2mg/kg组能显著降低血清中ALT、AST含量，双环醇-9-O-葡萄糖苷5mg/kg组能显著降低ALT含量，与模型组比较有统计学差异。阳性对照药双环醇显著降低Con A引起的血清ALT、AST的升高，对LDH含量仅有降低趋势。
表9.Con A急性肝损伤模型分组及动物初始体重、终末体重情况(n＝8-10)。
表10.双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对Con A引起小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST、LDH含量的影响(n＝8-10)。
***P＜0.001，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与模型组比较。
5.2双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷对ConA引起的急性肝损伤小鼠肝脏病理组织学观察
各组动物肝脏有代表性的病理图见图17，空白对照组动物肝小叶结构完整，肝细胞索排列规则，结构清晰，肝细胞未见变性和坏死。ConA模型组动物肝细胞呈凋亡样坏死，局部有炎细胞浸润，肝细胞固缩、胞浆深、红染，细胞间隙增大。双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷各剂量组对ConA引起肝脏组织病理学改变均有一定程度的改善作用，肝细胞变性和坏死减轻。阳性对照药双环醇对ConA引起的肝脏病理损伤亦均有明显的改善作用。
Claims (5)
1.一种化合物或其药学上可接受的盐,其特征在于，所属的化合物选自如下式I或式II所示的光学活性双环醇-9-O-β-D-葡萄糖苷类化合物；
2.一种如权利要求1所示的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，双环醇或光学活性的双环醇与尿苷二磷酸葡萄糖二钠盐在糖基转移酶催化作用下反应一步合成具有式I或式II的化合物。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的如权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或混悬剂。
5.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐和权利要求3～4任一项所述的组合物在制备防治肝病药物中的应用。
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| CN107488162A (zh) * | 2015-10-19 | 2017-12-19 | 中国医学科学院药物研究所 | 一类双环醇类衍生物及其制备和应用 |
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2018
- 2018-12-06 CN CN201811483811.6A patent/CN111285909A/zh active Pending
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