CN115073403B - 三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法及其应用，有效解决从酒茱萸中发现结构新颖的化合物，并实现新化合物在开发抗心衰药物中的应用问题，该化合物分别是compound 1：(R)‑5‑((2´‑hydroxy‑4´‑methoxy‑4´‑oxobutanoyl)oxy)methyl‑2‑furancarboxylic acid，分子式为C11H12O8，不饱和度为6；compound 2：(R)‑5‑((3´‑hydroxy‑4´‑methoxy‑4´‑oxobutanoyl)oxy)methyl‑2‑furancarboxylic acid，分子式为C11H12O8，不饱和度为6；compound 3：5‑((3´‑carboxypropanoyl)oxy)methyl‑2‑furancarboxylic acid，分子式为C10H10O7，不饱和度为6。本发明一类从酒茱萸中提取的具有抗心衰活性的新化合物，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高达98%以上，该化合物可有效用于制备抗心衰的药物，开拓了酒茱萸的新用途和药用价值，经济和社会效益巨大。

Description

三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法及其应用。
背景技术
酒茱萸是山茱萸(Cornus Officinalis)为山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属(Cornus)植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉的炮制品，采用酒炖或酒蒸的方法生产(总则0213)。山茱萸单用治疗心衰疗效显著，《医学衷中参西录》记载山茱萸治疗心衰的案例：“患者，急性左心衰，大汗淋漓，脉疾数(心率160次/分)，用120g山茱萸，急煎服，1小时后，汗收脉静。”与人参等药材合用防治冠心病亦具有显著的临床疗效。酒茱萸是主要临床用药形式，广泛的运用于我国的传统经典名方中，如六味地黄丸、杞菊地黄丸等。但目前关于山茱萸的化学成分研究多以生品为主，对酒萸肉化学成分的研究甚少。山茱萸现有的研究状况不能完全服务于中医临床，也不能为酒萸肉在中药制剂、配方颗粒等产品中的应用给予相应的理论支撑。因此，本研究结合我国传统的入药习惯，在薄层色谱法和高效液相色谱法的指导下，采用各种柱色谱分离技术，定向的富集、分离单体成分，运用各种波谱学方法，对酒茱萸水提物进行了系统的化学成分研究。
现代研究表明，慢性炎症是一个主要的心血管风险因素，促炎在高频信号分子开始恶性循环改变线粒体功能和干扰钙稳态,因此影响心肌收缩性。特殊的抗炎治疗代表了一种新颖的方法预防和减缓高频进展。因此本研究基于分离得到的新型抗炎活性成分研究其防治心衰的作用，获得具有显著防治心衰活性的结构新颖的化合物，为酒茱萸在中医临床治疗心衰通过疗效确切的潜在药物，至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法及其应用，有效解决从酒茱萸中发现结构新颖的化合物，并实现新化合物在开发抗心衰药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案：三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物，分别是化合物1：(R)-5-[(2'-羟基-4'-甲氧基-4'-氧代丁酰基)烷氧基]甲基-2-糠酸((R)-5-((2′-hydroxy-4′-methoxy-4′-oxobutanoyl)oxy)methyl-2-furancarboxylic acid)，分子式为C11H12O8，不饱和度为6；化合物2：(R)-5-[(3'-羟基-4'-甲氧基-4'-氧代丁酰基)烷氧基]甲基-2-糠酸((R)-5-((3′-hydroxy-4′-methoxy-4′-oxobutanoyl)oxy)methyl-2-furancarboxylic acid)，分子式为C11H12O8，不饱和度为6；化合物3：5-[(3'-羧基丙酰基)烷氧基]甲基-2-糠酸(5-((3′-carboxypropanoyl)oxy)methyl-2-furancarboxylic acid)，分子式为C10H10O7，不饱和度为6；分子结构式分别为：
其制备方法是，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加6～10倍重量体积的水或体积浓度30％乙醇水溶液，100℃加热回流提取2～5次，每次提取1～3h，合并提取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.18-1.2g/mL的浸膏(1.8～2.5Kg)；
(2)浸膏加水2.0～4.0L分散成悬浮液，每次用2～4L乙酸乙酯萃取3～6次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.28-1.3g/mL的乙酸乙酯浸膏(200～380g)；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝6～10cm，柱高H＝16～20cm，用体积比100:0、100:2、100:10二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3～6个柱体积(1个柱体积为500～1500mL)，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B(30～48g)；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝6～8cm，柱高H＝12～15cm，用体积比10:90、20:80、30:70甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱5～10个柱体积(1个柱体积为340～800mL)，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3(4～6g)；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝1.5～2.5cm，柱高H＝120～150cm，用甲醇进行洗脱，流速0.5～1.0mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4(150～210mg)；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱(10mm×250mm，5μm，苏州纳谱分析技术有限公司)，色谱条件18％～20％ CH3CN/H2O，流速3～3.5mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝24～49min，得化合物1(20～40mg)，收集保留时间tR＝26～52min，得化合物2(21～43mg)，收集保留时间tR＝27～55min，得化合物3(25～44mg)。
本发明经鉴定，是一类从酒茱萸中提取的具有抗心衰活性的新化合物，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高达98％以上，该化合物可有效用于制备抗心衰的药物，开拓了酒茱萸的新用途和药用价值，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明化合物1～化合物3分子结构式图。
图2为本发明化合物1～化合物3关键的HMBC及1H-1H COSY相关图。
图3为本发明化合物1～化合物3的ECD相关图。
图4为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加10倍重量体积的水，100℃加热回流提取5次，每次提取3h，合并提取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.2g/mL的浸膏(2.5Kg)；
(2)浸膏加水4L分散成悬浮液，每次用4L乙酸乙酯萃取4次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.3g/mL的乙酸乙酯浸膏(380g)；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝10cm，柱高H＝20cm，用体积比100:0二氯甲烷-甲醇洗脱3个柱体积、100:2二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积、100:10二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积(1个柱体积为1500mL)，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B(48g)；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝8cm，柱高H＝15cm，用体积比10:90甲醇-水洗脱2个柱体积、20:80甲醇-水洗脱3个柱体积、30:70甲醇-水洗脱3个柱体积(1个柱体积为800mL)，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3(6g)；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝2.5cm，柱高H＝150cm，用甲醇进行洗脱，流速0.5mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4(210mg)；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱(10mm×250mm，5μm，苏州纳谱分析技术有限公司)，色谱条件20％ CH3CN/H2O，流速3mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝24min，得化合物1(39.6mg)，收集保留时间tR＝26min，得化合物2(39.3mg)，收集保留时间tR＝27min，得化合物3(43.1mg)。
实施例2
本发明三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加6倍重量体积的水，100℃加热回流提取3次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.18g/mL的浸膏(1.8Kg)；
(2)浸膏加水2L分散成悬浮液，每次用2L乙酸乙酯萃取3次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.28g/mL的乙酸乙酯浸膏(213g)；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝6cm，柱高H＝16cm，用体积比100:0二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积、100:2二氯甲烷-甲醇洗脱6个柱体积、100:10二氯甲烷-甲醇洗脱6个柱体积(1个柱体积为500mL)，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B(30.5g)；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝6cm，柱高H＝12cm，用体积比10:90甲醇-水洗脱5个柱体积、20:80甲醇-水洗脱6个柱体积、30:70甲醇-水洗脱6个柱体积(1个柱体积为340mL)，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3(4g)；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝1.5cm，柱高H＝120cm，用甲醇进行洗脱，流速1mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4(150mg)；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱(10mm×250mm，5μm，苏州纳谱分析技术有限公司)，色谱条件20％ CH3CN/H2O，流速3mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝49min，得化合物1(20.2mg)，收集保留时间tR＝52min，得化合物2(20.6mg)，收集保留时间tR＝55min，得化合物3(25.3mg)。
实施例3
本发明三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加8倍重量体积、体积浓度30％乙醇，100℃加热回流提取4次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.2g/mL的浸膏(2Kg)；
(2)浸膏加水3L分散成悬浮液，每次用3L乙酸乙酯萃取3次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.3g/mL的乙酸乙酯浸膏(235g)；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝8cm，柱高H＝18cm，用体积比100:0二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积、100:2二氯甲烷-甲醇洗脱5个柱体积、100:10二氯甲烷-甲醇洗脱5个柱体积(1个柱体积为900mL)，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B(32.3g)；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝6cm，柱高H＝15cm，用体积比10:90甲醇-水洗脱5个柱体积、20:80甲醇-水洗脱8个柱体积、30:70甲醇-水洗脱8个柱体积(1个柱体积为430mL)，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3(4.5g)；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝1.5cm，柱高H＝120cm，用甲醇进行洗脱，流速1mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4(173mg)；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱(10mm×250mm，5μm，苏州纳谱分析技术有限公司)，色谱条件19％ CH3CN/H2O，流速3mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝37min，得化合物1(26.1mg)，收集保留时间tR＝42min，得化合物2(25.6mg)，收集保留时间tR＝46min，得化合物3(30.5mg)。
实施例4
本发明三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加8倍重量体积的水，100℃加热回流提取3次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.2g/mL的浸膏(2.2Kg)；
(2)浸膏加水3.5L分散成悬浮液，每次用3.5L乙酸乙酯萃取3次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.3g/mL的乙酸乙酯浸膏(350g)；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝8cm，柱高H＝20cm，用体积比100:0二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积、100:2二氯甲烷-甲醇洗脱6个柱体积、100:10二氯甲烷-甲醇洗脱6个柱体积(1个柱体积为1000mL)，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B(44.6g)；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝8cm，柱高H＝14cm，用体积比10:90甲醇-水洗脱5个柱体积、20:80甲醇-水洗脱7个柱体积、30:70甲醇-水洗脱7个柱体积(1个柱体积为700mL)，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3(5.6g)；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝2cm，柱高H＝120cm，用甲醇进行洗脱，流速1mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4(185mg)；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱(10mm×250mm，5μm，苏州纳谱分析技术有限公司)，色谱条件20％ CH3CN/H2O，流速3mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝24min，得化合物1(33.4mg)，收集保留时间tR＝26min，得化合物2(34.5mg)，收集保留时间tR＝27min，得化合物3(36.6mg)。
要指出的是，上述实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，以对该从酒茱萸中提取具有抗心衰活性的化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的，而不是用于限定本发明的保护范围，凡是在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内。
本发明原料丰富，制备方法易操作，所制备的化合物为三个从酒茱萸中提取具有抗心衰作用的5-羟甲基-2-糠酸(Sumiki's acid)酯化衍生化合物，开拓了酒茱萸的新用途，所得产品可有效用于制备抗心衰药物，实现5-羟甲基-2-糠酸(Sumiki's acid)酯化衍生化合物在制备抗心衰药物中的应用，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
一、仪器和材料
Thermo EVO 220spectrometer紫外光谱仪(Thermo,Waltham,MA,美国)；
Bruker AVⅢ500-NMR核磁共振仪(Bruker,Billerica,德国)；
Thermo UPLC-Oribtrap-Exploris120高分辨质谱仪(Thermo,Waltham,MA,美国)；
安东帕MCP 5100旋光仪(Anton Paar,Graz,Austria)；
清博华LC 52型半制备高效液相色谱仪(QBH,中国)；
HPLC-5C18C制备柱(10×250mm,5um；Suzhou,Co.,Ltd.,中国)；
COSMOSIL CHiRAL 5C柱(10ID×250mm,Nacalai Tesque,Inc.,日本)；
柱层析硅胶(100-200目,200-300目,青岛海洋化工有限公司)；D101型大孔树脂(上海摩速科学器材有限公司)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(瑞典pharmacia公司)；Toyopearl HW-40柱层析(TOSOH，日本)；
所用试剂均为分析纯或色谱纯；
氘代试剂：MeOD(Cambridge Isotope Laboratories,USA)；
RAW264.7细胞株来源于中国科学院(上海)细胞库；
LPS从美国Sigma Aldrich购买；
DMEM培养液和胎牛血清和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；
3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma-Aldrich公司；
二氧化碳培养箱(美国赛默飞公司，型号3111)；
酶标仪(美国赛默飞公司，型号MULTISKAN FC)；
台式高速冷冻离心机(索福ST-21，美国产)；
AdventurerTM电子天平(奥豪斯国际贸易上海有限公司)；
洁净工作台，北京昌平长城空气净化设备工程公司；
96孔板购于美国Corning公司。
二、结构鉴定
化合物1(compound 1)：黄色油状，纯度98.5％，易溶于甲醇等有机溶剂，遇香草醛-浓硫酸加热显青色。HRESIMS准分子离子峰[M+H]+为273.0597(C11H13O8计算值为273.0604)，确定分子式为C11H12O8，不饱和度为6，结构式为：
旋光度(c＝0.05，甲醇)。紫外光谱在249nm处有最大吸收；红外光谱提示有结构中存在羟基(3372cm-1)，羰基(1656cm-1)。1H-NMR谱和13C-NMR谱数据显示化合物存在一个亚甲基[δH 2.81(1H,dd,J＝15.9,4.9Hz,H-3'a),2.73(1H,dd,J＝15.9,4.9Hz,H-3'b)；δC39.8(C-3')]；一个甲氧基[δH 3.65(3H,s,H-5')；δC 52.3(C-5')]；一个连氧亚甲基[δH 4.54(1H,dd,J＝7.2,4.9Hz,H-2')；δC 68.6(C-2')]；两个烯烃质子信号[δH 7.07(1H,d,J＝3.4Hz,H-3),6.59(1H,d,J＝3.4Hz,H-4)；δC 118.2(C-3),113.4(C-4)]；一个sp2杂化的连氧季碳δC 153.6(C-5)，两个酯羰基碳信号[δC 173.9(C-1'),172.4(C-4')]。详细信息见表1。NMR数据显示化合物1与methyl succinyl Sumiki's acid相似，不同之处在于少了一个亚甲基，多了一个连氧次甲基[δH4.54(1H,dd,J＝7.2,4.9Hz,H-2')；δC 68.6(C-2')]。且1H-1H-COSY谱显示H-2'与H-3'相关，HMBC谱显示H-2'与C-1'和C-3'相关；H-3'与C-2'、C-4'、C-1'相关，H-5'与C-4'、C-3'，因此推测化合物1的C-2'位有羟基取代。结合1H-1H-COSY谱和HMBC谱，可以看出H-3与H-4相关，H-3与C-4、C-2、C-5相关；H-4与C-3、C-5、C-2关；H-6与C-4、C-5、C-1′相关；H-2′与C-1′、C-3′、C-4′相关。结合1D和2D NMR确定了化合物1的平面结构。
化合物1的绝对构型是由实测ECD谱和计算ECD谱确定的。ECD光谱在216nm处表现出正cotton效应，248nm处表现出负cotton效应。计算曲线与实验曲线吻合良好(见图3)，表明化合物1的绝对构型为2′R。
化合物2(compound 2)：无色油状，纯度98.6％，易溶于甲醇等有机溶剂，遇香草醛-浓硫酸加热显青色。HRESIMS准分子离子峰[M+H]+m/z 273.0597(C11H13O8计算值为273.0604)，确定分子式为C11H12O8，不饱和度为6，结构式为：
与化合物1相同，旋光度(c＝0.05，甲醇)，UV光谱中在248nm处有最大吸收，红外光谱显示，结构存在1个羟基基团(3317cm-1)，一个羰基(1656cm-1)。通过将化合物2的质谱和NMR数据与化合物1对比发现，化合物2和化合物1的结构相似，不同之处在于化合物1的羟基取代在C-2'位，而化合物2的羟基取代在C-3'位[δH 2.85(1H,dd,J＝16.0,4.9Hz,H-2'a),2.76(1H,dd,J＝16.0,7.2Hz,H-2'b),4.52(1H,dd,J＝7.2,4.9Hz,H-3')；δC39.9(C-2'),68.5(C-3')]。这一推断由1H-1H-COSY谱和HMBC谱数据证实，1H-1H-COSY谱显示H-2'与H-3'相关，HMBC谱显示H-2'与C-1'、C-3'、C-4'，H-3'与C-2'、C-4'、C-1'，H-5'与C-4'、C-3'。结合其他1H-1H-COSY谱和HMBC谱相关(见图2)，最终确定化合物2的结果如图1所示。
化合物2的绝对构型是由实测ECD谱和计算ECD谱确定的。ECD光谱在215nm处表现出正的cotton效应，279nm处表现出负cotton效应。计算曲线与实验曲线吻合良好，但有轻微的峰移(见图3)，表明化合物2的绝对构型为3'R。
化合物3(compound 3)：白色无定型粉末，纯度99.2％，易溶于甲醇等有机溶剂，遇香草醛-浓硫酸加热显青色。在HRESIMS中准分子离子峰[M+H]+为273.0597(C10H11O7计算值为273.0604)，确定分子式为C10H10O7，不饱和度为6，结构式为：
UV光谱中在249nm处有最大吸收，红外光谱显示，化合物3结构存在一个羰基(1656cm-1)。通过将化合物3的质谱和NMR数据与化合物1对比，发现不同之处在于化合物1的C-2'位有羟基取代，而化合物3的C-2'和C-3'位为亚甲基[δH 2.63(2H,dd,J＝4.7,1.5Hz,H-2'/3'),2.61(2H,dd,J＝4.6,1.5Hz,H-2'/3'；δC 29.8(C-2'/3'),29.6(C-2'/3')]；并且化合物1在C-4'位有甲氧基取代，而化合物3的C-4'位为羟基取代。1H-1H-COSY谱显示H-2'与H-3'相关，H-3与H-4相关；HMBC谱显示H-2'与C-1'、C-3'、C-4'相关；H-3'与C-2'、C-4'、C-1'相关；H-3与C-2、C-4、C-5相关；H-4与C-2、C-3、C-5相关；H-7与C-2、C-3、C-4、C-1'相关。(见图2)。最终确定化合物3的结果如图1所示。化合物3命名为5-((3'-carboxypropanoyl)oxy)methyl-2-furancarboxylic acid。
上述所得化合物经测定，鉴定为从酒茱萸中提取的三个Sumiki's acid酯化衍生新化合物：化合物1～化合物3。体外抗炎活性和体内抗心衰实验研究结果表明，这一类新化合物均具有抗炎活性和防治心衰的作用。有关具体测定和实验资料如下：
表1.化合物1-3的1H-and 13C-NMR数据(500and 125MHzδin ppm，MeOD)
三、活性试验
1、体外抗炎实验
采用Griess法测定脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞产生NO水平，评价化合物1-3的抗炎活性。与模型组相比，化合物1-3能显著降低NO的释放量(P<0.01)，不呈浓度依赖性，表明其具有抗炎活性。
化合物1-3的抗炎实验方法：将RAW264.7细胞培养于DMEM完全培养基(含10％新生牛血清)中，置37℃、5％ CO2培养箱内培养。选择对数生长期细胞用于实验。
取对数生长期的RAW264.7细胞，用完全培养基配成1×105个/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔加入100μL的细胞悬液，置37℃、5％ CO2培养箱内培养。24h后，弃去孔内上清液，分别加入100μL浓度为100、50、25、12.5、6.25、0mM，化合物1-3的完全培养基；即给药组和空白组，每组设置3个复孔，置37℃，含5％ CO2培养箱内培养。24小时后，每孔加入CCK-8 10μL，用酶标仪在490nm处测定各孔OD值。并计算细胞存活率，细胞存活率＝(A测/A空)×100％。公式中：A测为药物组OD值-空白组OD值：A空为对照组OD值-空白组OD值。每组重复3次独立实验。化合物1，2在浓度6.25-100μM时与空白组比较对RAW264.7细胞均无细胞毒活性，细胞活力均在100％以上。因此，选择25，50，100μM作为后续试验的浓度梯度。
将处于对数生长期的细胞接种于24孔板(2×105个细胞/孔)，37℃、5％CO2环境的培养箱中培养12h后加入不同质量浓度的待测样品(最终质量浓度分别为25、50μM)，温孵培养1h后加人1μg/mL LPS。同时设空白对照组(培养基)、模型(LPS+培养基)组、阳性药组(地塞米松+培养基)和药物作用组。继续温孵培养24h。每组重复3次独立实验。将上清液(100mL)与等体积格氏试剂混合，用酶联免疫检检测仪测定混合物在560nm处的OD值，计算NO抑制率，结果见表2。
表2化合物1-3对LPS诱导的RAW264.7细胞NO水平影响(n＝3)
由表2可知，模型组NO的释放量显著高于空白对照组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，各浓度处理均能显著降低NO的释放量(P<0.01)，且呈浓度依赖性。由表2可以看出，化合物1-3能够较好地抑制炎症因子NO的生成，其中化合物1-3均具有较好的抗炎效果，具有防治心衰作用。
2、体内试验
试验方法：40只SD大鼠，雄性，体质量(220±20)g，动物由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，实验动物许可证号：SYXK(鲁)20210005。适应性喂养1周，随机分为5组：假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(I/R组)、高剂量给药组、低剂量给药组、维拉帕米(Ver)1mg/kg组，每组8只。除假手术组外，其他组均通过夹闭左冠状动脉前降支30min复制心肌缺血再灌注大鼠模型，夹闭左冠状动脉前降支后心电图ST段弓背抬高、T波高耸，30min后恢复血流再灌注后ST段抬高降低、T波降低，即可判定为造模成功。各组均于造模前10min腹腔注射给药高、低剂量(100mg/kg、50mg/kg)，假手术组和模型组给予0.9％氯化钠溶液。再灌注2h后，麻醉后颈椎脱臼处死，开胸后取左冠状动脉前降支血流供应区的左心室组织，2mm厚度切片，置浓度2％的NBT溶液、恒温37℃避光孵育1h(正常区呈紫黑色)，通过图像分析系统计算心肌梗死体积。苏木精-尹红(HE)染色法观察心肌组织病理学改变并行损伤评分。
与假手术组比较，模型组心肌梗死体积百分比显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，给药各剂量组和Ver 1mg/kg组心肌梗死体积百分比显著降低(P＜0.01)；假手术组大鼠左心室心肌纤维排列整齐有序、心肌细胞形态结构正常，未见异常；模型组呈现心肌纤维紊乱无序，可见部分心肌纤维断裂，心肌细胞数量减少，胞核固缩、深染、偏移，可见炎性细胞浸润；较模型组，给药各剂量组和Ver 1mg/kg组左心室心肌组织病理学改变呈不同程度减轻，炎性细胞浸润较少。假手术组心肌梗死面积(0.00±0.00)、损伤评分(0.37±0.15)；模型组心肌梗死面积(24.32±3.21)、损伤评分(6.52±1.30)；高剂量心肌梗死面积(13.17±2.10)、损伤评分(3.30±0.57)；低剂量心肌梗死面积(7.10±1.78)、损伤评分(4.65±0.90)；Ver 1mg/kg组心肌梗死面积(10.37±1.58)、损伤评分(3.82±1.43)。
综上所述，本发明原料丰富，制备方法易操作，所得产品质量好，纯度高达98％以上，试验表明，化合物1-3作为抗心衰先导化合物，有效用于制备抗心衰的药物，开拓了酒茱萸的药用价值和商业价值，具有巨大的开发应用前景，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物，分别是化合物1：(R)-5-[(2'-羟基-4'-甲氧基-4'-氧代丁酰基)烷氧基]甲基-2-糠酸，分子式为C11H12O8，不饱和度为6；化合物2：(R)-5-[(3'-羟基-4'-甲氧基-4'-氧代丁酰基)烷氧基]甲基-2-糠酸，分子式为C11H12O8，不饱和度为6；化合物3：5-[(3'-羧基丙酰基)烷氧基]甲基-2-糠酸，分子式为C10H10O7，不饱和度为6；分子结构式分别为：
2.权利要求1所述的三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加6～10倍重量体积的水或体积浓度30％乙醇水溶液，100℃加热回流提取2～5次，每次提取1～3h，合并提取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.18-1.2g/mL的浸膏；
(2)浸膏加水2.0～4.0L分散成悬浮液，每次用2～4L乙酸乙酯萃取3～6次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到室温下相对密度1.28-1.3g/mL的乙酸乙酯浸膏；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝6～10cm，柱高H＝16～20cm，用体积比100:0、100:2、100:10二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3～6个柱体积，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝6～8cm，柱高H＝12～15cm，用体积比10:90、20:80、30:70甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱5～10个柱体积，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝1.5～2.5cm，柱高H＝120～150cm，用甲醇进行洗脱，流速0.5～1.0mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱，色谱条件18％～20％CH3CN/H2O，流速3～3.5mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝24～49min，得化合物1，收集保留时间tR＝26～52min，得化合物2，收集保留时间tR＝27～55min，得化合物3。
3.根据权利要求2所述的三个从酒茱萸中分离得到具有防治心衰作用的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的酒萸肉10Kg，每次加10倍重量体积的水，100℃加热回流提取5次，每次提取3h，合并提取液，减压浓缩，得相当于含生药量1.2g/mL的浸膏；
(2)浸膏加水4L分散成悬浮液，每次用4L乙酸乙酯萃取4次，每次萃取待静置分层完全，进行下一次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得相当于含生药量1.3g/mL的乙酸乙酯浸膏；
(3)乙酸乙酯浸膏经200～300目硅胶柱色谱，直径d＝10cm，柱高H＝20cm，用体积比100:0二氯甲烷-甲醇洗脱3个柱体积、100:2二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积、100:10二氯甲烷-甲醇洗脱4个柱体积，收集100:10洗脱液，减压浓缩回收洗脱液，采用薄层色谱法检识，得馏分Fr.B；
(4)馏分Fr.B经Toyopearl HW-40柱层析，直径d＝8cm，柱高H＝15cm，用体积比10:90甲醇-水洗脱2个柱体积、20:80甲醇-水洗脱3个柱体积、30:70甲醇-水洗脱3个柱体积，收集30:70洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得到馏分Fr.B3；
(5)馏分Fr.B3经Sephadex LH-20柱层析，直径r＝2.5cm，柱高H＝150cm，用甲醇进行洗脱，流速0.5mL/min，薄层色谱法检识，收集相同流分，得到馏分Fr.B3-4；
(6)采用半制备HPLC，使用纳谱分析半制备柱，色谱条件20％CH3CN/H2O，流速3mL/min，对馏分Fr.B3-4进行制备纯化，收集保留时间tR＝24min，得化合物1，收集保留时间tR＝26min，得化合物2，收集保留时间tR＝27min，得化合物3。
4.权利要求1所述化合物1、化合物2、化合物3在制备抗心衰药物中的应用。
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