CN117209462B - 白莲蒿内酯a-u及其药物组合物和其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供白莲蒿内酯A‒U（artemisac rolides A‒U，1‒21）及其药物组合物和其制备方法与应用，属于药物技术领域。本发明的结构式（I）所示21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A‒U（artemisacrolides A‒U，1‒21），对人肝癌细胞株HepG2、Huh7和SK‑Hep‑1具有抑制作用，能够与可药用载体组成药物组合物，可用于制备抗肝癌药物。
Description
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)，及其制备方法和应用，以及以化合物1–21为有效成分的药物组合物，以及化合物1–21及其药物组合物在制备抗肝癌的药物中的应用。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)作为最常见的恶性癌症之一，已成为全球癌症相关死亡的第四大原因，每年导致约78万例死亡和84万例新发病例。乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒和非酒精性脂肪肝是导致HCC的主要风险因素。由于发病率的上升，HCC患者尤其是晚期患者迫切需要有效的治疗药物，一些药物治疗方法正在被研究。最近，5个包括索拉非尼、伦瓦替尼、瑞戈非尼、卡博赞替尼和多纳非尼在内的酪氨酸激酶抑制剂，以及3个单克隆抗体药物(尼沃鲁单抗、彭博利珠单抗和拉穆齐鲁单抗)已用于临床治疗晚期HCC患者。然而，由于结构类型和目标相对简单以及不良反应，这些药物仍然不能满足临床的医疗需求。因此，迫切需要开发安全有效的治疗HCC的药物。结构和生物多样性的天然产物是寻找新型抗肝癌药物的一个主要来源。迄今为止，一系列的天然产品正在进行针对肝脏相关疾病的临床评估。其中，阿可拉定是从淫羊藿属中分离得到的淫羊藿苷经酶解得到的异五烯基取代的黄酮衍生物，是一个多靶点免疫调节小分子。它是我国第一个批准用于治疗HCC的创新中药。
蒿属植物是常用的民间和传统的草药，用于治疗各种疾病。植物化学研究表明，倍半萜类化合物是蒿属植物主要的和特征的化学成分，尤其是愈创木、桉叶烷和吉玛烷倍半萜内酯。其中一些化合物具有抗肿瘤、抗疟疾、抗炎、免疫调节、抗溃疡、抗寄生虫、抗菌等多种生物活性。
白莲蒿(Artemisia sacrorum)又名万年蒿、铁杆蒿，除高寒地区外，几乎遍布全中国，资源丰富。白莲蒿的药用部位一般为其地上部分，也可为全草，可作“茵陈”代用品，具有清热解毒，凉血止血的功效，民间用其治疗急慢性肝炎、小儿惊风、阴虚潮热。临床上，白莲蒿可用于治疗胃痛，脑刺痛，肿胀，水痘和脓肿等多种疾病。现代药理学研究表明，白莲蒿具有利胆保肝、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性。化学成分研究发现，白莲蒿中除了挥发性成分外，分离得到非挥发性成分主要有倍半萜、二萜、有机酸、香豆素、黄酮、多糖等，其中萜类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗癌、抗HIV等多种生物特性。继续研究发现，白莲蒿乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部分对三株肝癌细胞HepG2、Huh7和K-Hep-1具有抑制作用，当浓度为200μg/mg时，其抑制率分别为65.5％,28.1％,84.6％,and 93.5％,82.0％,89.0％。为了阐明白莲蒿的抗肝癌活性成分，本发明从白莲蒿的活性流分中分离得到了21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)。迄今为止，现有技术中无白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)的报道，也没有其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有该类化合物和其药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值如式(I)所示的白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)及其制备方法、药物组合物及其应用。本发明从白莲蒿中分离鉴定了21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)。该类化合物对人肝癌细胞株HepG2、Huh7和SK-Hep-1具有抑制作用，能够用于制备抗肝癌药物。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)，结构如下式(I)所示：
本发明另外提供了制备式I所示的化合物1–21的方法，将干燥的白莲蒿地上部分17.0kg，粉碎，用3倍量的90％乙醇室温提取两次，合并提取液减压浓缩后，将得到的提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分500g。乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，用丙酮-石油醚体积比2:98、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到7个流分Frs.B-1～B-7。24g Fr.B-3过硅胶柱层析，以5:95,10:90,20:80,40:60的丙酮-石油醚洗脱得到5个亚流分Fr.B-3a～Fr.B-3e。5.5g Fr.B-3b经过Sephadex LH-20柱层析，以MeOH洗脱得到Fr.B-3b-1和Fr.B-3b-2。3.7g Fr.B-3b-1经过Rp-C18柱层析，以50:50、60:40、70:30和80:20的MeOH-H2O洗脱，再经硅胶柱层析，以10:90,20:80的乙酸乙酯-氯仿后，使用半制备HPLC，在Agilent XDB-C18柱以40:60的乙腈-水纯化，得到化合物1(3mg)、2(8mg)、5(147mg)和6(82mg)。900mg Fr.B-3b-2经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱以62:48的MeOH-H2O纯化得到了化合物3(240mg)。22g Fr.B-5过硅胶柱层析，以2:98、5:95和10:90的MeOH-CHCl3洗脱得到6个亚流分Fr.B-5a～Fr.B-5f。5.17g Fr.B-5c过Rp-C18柱层析，用甲40:60、50:50、60:40和100:0的醇-水洗脱得到了6个亚流分Frs.B-5c-1～B-5c-6。1.4g Fr.B-5c-2经过硅胶柱层析，以14:86的丙酮-石油醚洗脱得到Fr.B-5c-2a和Fr.B-5c-2b。900mg Fr.B-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用50:50的MeOH-CHCl3洗脱后，经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以44:56甲醇-水纯化得到化合物18(300mg)和20(13mg)。340mg Fr.B-5c-2b经过Sephadex LH-20柱层析，用MeOH-CHCl3(50:50)洗脱后，经制备薄层层析，以6:94的MeOH-CHCl3纯化得到化合物17(54mg)、19(11mg)和21(2mg)。5.2g Fr.B-5d经过Rp-C18柱层析，用40:60、50:50、60:40和100:0的甲醇-水洗脱得到了8个亚流分Frs.B-5d-1～B-5d-8。700mgFr.B-5d-3经过反相Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理后，再使用半制备HPLC纯化在Agilent XDB-C18柱上以45:55的MeOH-H2O洗脱得到化合物15(4mg)、16(8mg)、7(13mg)和8(20mg)。470mg Fr.B-5d-4使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物9(54mg)、10(166mg)和11(15mg)。1.7g Fr.B-5f经过硅胶柱层析，以10:90和20:80的乙酸乙酯-石油醚洗脱后，再用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物4(250mg)。130g Fr.B-6经MCI gel CHP 20P柱层析，用40:60、50:50、60:40、80:20和100:0的甲醇-水洗脱得到了5个流分Frs.B-6a-B-6e。12g Fr.B-6c经过硅胶柱层析，以1:99、2:98和5:95的MeOH-CHCl3洗脱得到了流分Frs.B-6c-1-B-6c-6。1.7g Fr.B-6c-4经过反相Rp-C18柱层析，以35:65的乙腈-水处理后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以52:48的甲醇-水纯化得到化合物12(25mg)、13(17mg)和14(17mg)。
本发明提供了式I所示的化合物1–21在制备抗肝癌药物中的应用，本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
本发明同时提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括式(I)所示的化合物1–21中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。
并此，还提供了所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。并同时提供了所述的药物组合物的制备方法：采用上述制备化合物的方法制备得到本发明化合物1–21，然后加入可药用载体。
当所述化合物1–21中的至少一种用于制备抗肝癌药物时，本发明优选将所述化合物1–21直接使用，或以药物组合物的形式使用
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物1–21中的至少一种和药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体优选为固体、半固体或液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1–21中的至少一种与药学上可接受的载体混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用，对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝癌药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1–21中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.本发明提供了21个新化合物-高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)。
2.本发明提供了制备新化合物1–21的新的方法，该方法原料易得，易于操作，适于工业化生成。
3.本发明提供了新化合物1–21作为有效成分的药物组合物，为新的抗肝癌药物提供了具有较好药用作用的新的药物。
4.本发明的化合物1–21对三株肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1具有抑制活性。其中，化合物1-21对HepG2细胞具有抑制作用，其IC50在21.9至71.2μM之间。化合物2、5和18对Huh7细胞具有明显的抑制作用，其IC50值分别为8.2、9.0和9.6μM，优于阳性索拉非尼(IC50值为12.6μM)；化合物1、3、6、15、17和19具有与索拉非尼相当的抑制作用，其IC50值分别为13.7、14.2、11.4、12.8、13.8和14.3μM。化合物1-3、5、6、10和18对SK-Hep-1细胞抑制活性与阳性索拉非尼(IC50值为18.8μM)相当，其IC50值分别为13.5、16.9、19.2、17.3、18.8、16.5和16.4μM。以上结果表明白莲蒿中分离得到的化合物1–21可作为药物用于治疗肝癌相关的疾病。
附图说明：
图1为本发明化合物1–21的结构式示意图；
图2为是化合物1的X-ray单晶结构示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明白莲蒿内酯A-U(artemisacrolides A-U，1-21)制备方法、结构鉴定、药理作用，以及本发明的制备方法及药物组成，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，白莲蒿内酯A-U(artemisacrolidesA-U，1-21)的制备：
将干燥的白莲蒿地上部分17.0kg，粉碎，用3倍量的90％乙醇室温提取两次，合并提取液减压浓缩后，将得到的提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分500g。乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，用丙酮-石油醚体积比2:98、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到7个流分Frs.B-1～B-7。24g Fr.B-3过硅胶柱层析，以5:95,10:90,20:80,40:60的丙酮-石油醚洗脱得到5个亚流分Fr.B-3a～Fr.B-3e。5.5g Fr.B-3b经过Sephadex LH-20柱层析，以MeOH洗脱得到Fr.B-3b-1和Fr.B-3b-2。3.7g Fr.B-3b-1经过Rp-C18柱层析，以50:50、60:40、70:30和80:20的MeOH-H2O洗脱，再经硅胶柱层析，以10:90,20:80的乙酸乙酯-氯仿后，使用半制备HPLC，在Agilent XDB-C18柱以40:60的乙腈-水纯化，得到化合物1(3mg)、2(8mg)、5(147mg)和6(82mg)。900mg Fr.B-3b-2经半制备HPLC在AgilentXDB-C18柱以62:48的MeOH-H2O纯化得到了化合物3(240mg)。22g Fr.B-5过硅胶柱层析，以2:98、5:95和10:90的MeOH-CHCl3洗脱得到6个亚流分Fr.B-5a～Fr.B-5f。5.17g Fr.B-5c过Rp-C18柱层析，用甲40:60、50:50、60:40和100:0的醇-水洗脱得到了6个亚流分Frs.B-5c-1～B-5c-6。1.4g Fr.B-5c-2经过硅胶柱层析，以14:86的丙酮-石油醚洗脱得到Fr.B-5c-2a和Fr.B-5c-2b。900mg Fr.B-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用50:50的MeOH-CHCl3洗脱后，经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以44:56甲醇-水纯化得到化合物18(300mg)和20(13mg)。340mg Fr.B-5c-2b经过Sephadex LH-20柱层析，用MeOH-CHCl3(50:50)洗脱后，经制备薄层层析，以6:94的MeOH-CHCl3纯化得到化合物17(54mg)、19(11mg)和21(2mg)。5.2gFr.B-5d经过Rp-C18柱层析，用40:60、50:50、60:40和100:0的甲醇-水洗脱得到了8个亚流分Frs.B-5d-1～B-5d-8。700mg Fr.B-5d-3经过反相Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理后，再使用半制备HPLC纯化在Agilent XDB-C18柱上以45:55的MeOH-H2O洗脱得到化合物15(4mg)、16(8mg)、7(13mg)和8(20mg)。470mg Fr.B-5d-4使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物9(54mg)、10(166mg)和11(15mg)。1.7g Fr.B-5f经过硅胶柱层析，以10:90和20:80的乙酸乙酯-石油醚洗脱后，再用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物4(250mg)。130gFr.B-6经MCI gel CHP 20P柱层析，用40:60、50:50、60:40、80:20和100:0的甲醇-水洗脱得到了5个流分Frs.B-6a-B-6e。12g Fr.B-6c经过硅胶柱层析，以1:99、2:98和5:95的MeOH-CHCl3洗脱得到了流分Frs.B-6c-1-B-6c-6。1.7g Fr.B-6c-4经过反相Rp-C18柱层析，以35:65的乙腈-水处理后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以52:48的甲醇-水纯化得到化合物12(25mg)、13(17mg)和14(17mg)。
化合物1-21的结构数据：
旋光由Autopol VI旋光仪(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,USA)测定；红外光谱(IR)采用KBr压片法，由Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪(Hercules,California,USA)测定；紫外光谱由UV-2401PC型紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；ECD谱由Applied Photophysics圆二色谱仪(Agilent,Santa Clara,United States)测定；核磁共振谱(1D和2D NMR)用Avance III-600型超导核磁共振仪(Bruker,Bremerhaven,Germany)测定，以氘代氯仿作为溶剂；高分辨质谱(HRESIMS)用岛津LCMS-IT-TOF型质谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；薄层层析硅胶板HSGF254是烟台江友硅胶开发有限公司产品；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；高效液相色谱仪为岛津公司生产，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，使用的色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)；色谱纯乙腈购自迈瑞达公司；MCI gel CHP20P(75～150μm)购自Mitsubishi Chemical Corporation(Tokyo,Japan)；显色剂为10％ H2SO4-EtOH溶液。
白莲蒿内酯A(Artemisacrolide A，1)
分子式：C19H22O5
分子量：330
性状：正交晶系；
HRESIMS m/z 375.1449[M+HCOO]-(calcd.for C20H23O7,375.1449)；
IR(KBr)νmax:3433,1768,1718,1634,1451,1382,1292,1276,1153,1008,961cm–1；
ECD(c 0.11,MeOH)λmax(Δε):198(-25.66),216(+12.76)nm；
(c 0.10,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
Crystal data for compound 1:C19H22O5,M＝330.36, α＝90°,β＝90°,γ＝90°,T＝150.(2)K,space group P212121,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.742mm-1,14853measured reflections,3212independent reflections(Rint＝0.0524).The finalR1 values were 0.0283(I>2σ(I)).The final wR(F2)values were 0.0728(I>2σ(I)).Thefinal R1 values were 0.0297(all data).The final wR(F2)values were 0.0739(alldata).The goodness of fit on F2 was 1.042.Flack parameter＝0.07(7).
白莲蒿内酯B(Artemisacrolide B，2)
分子式：C19H24O5
分子量：332
性状：无色油状物；
HRESIMS m/z:377.1585[M+HCOOH]-(calcd.for C20H25O7,377.1606)；
IR(KBr)νmax:3435,1768,1736,1631,1467,1384,1275,1246,1189,1150,1006,958cm–1；ECD(c 0.13,MeOH)λmax(Δε):199(-23.43),217(+0.75)nm；
(c 0.10,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯C(Artemisacrolide C，3)
分子式：C20H24O5
分子量：344
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 389.1604[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O7,389.1606)；
IR(KBr)νmax:3440,1770,1707,1648,1443,1383,1346,1261,1136,1071,1006,961cm–1；ECD(c 0.17,MeOH)λmax(Δε):199(-16.70),221(+7.46)nm；
(c 0.26,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯D(Artemisacrolide D，4)
分子式：C20H24O5
分子量：344
性状：无色油状物；
HRESIMS m/z 389.1580[M+HCOOH]-((calcd.for C21H25O7,389.1606)；
IR(KBr)νmax:3442,1770,1714,1646,1445,1382,1229,1144,1036,959cm–1；ECD(c0.14,MeOH)λmax(Δε):198(-15.01),222(+7.13)nm；
(c 0.23,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯E(Artemisacrolide E，5)
分子式：C20H24O5
分子量：344
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 389.1592[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O7,389.1606)；
IR(KBr)νmax:3440,1770,1708,1647,1446,1383,1265,1138,1077,964cm–1；ECD(c0.14,MeOH)λmax(Δε):197(+20.38),227(+1.55)nm；
(c 0.14,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯F(Artemisacrolide F，6)
分子式：C20H24O5
分子量：344
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 389.1624[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O7,389.1606)；
IR(KBr)νmax:3436,1768,1715,1643,1454,1383,1263,1234,1148,1082,964cm–1；ECD(c 0.13,MeOH)λmax(Δε):196(+24.36),237(+1.00)nm；
(c 0.09,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯G(Artemisacrolide G，7)
分子式：C19H22O6
分子量：346
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 391.1405[M+HCOOH]-(calcd.for C20H23O8,391.1398)；
IR(KBr)νmax:3436,1756,1718,1633,1452,1381,1298,1161,1108,962cm–1；
ECD(c 0.15,MeOH)λmax(Δε):201(-3.29),216(+7.02),251(+0.72)nm；
(c 0.06,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯H(Artemisacrolide H，8)
分子式：C19H24O6
分子量：348
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 393.1532[M+HCOOH]-(calcd.for C20H25O8,393.1555)；
IR(KBr)νmax:3435,1740,1633,1468,1454,1385,1270,1158,1108,1034,961cm–1；ECD(c 025,MeOH)λmax(Δε):204(-3.86),214(-0.14),246(+0.48)nm；
(c 0.10,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
白莲蒿内酯I(Artemisacrolide I，9)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 405.1568[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3438,1754,1709,1646,1446,1383,1268,1137,1108,1030,927cm–1；ECD(c 0.18,MeOH)λmax(Δε):203(-6.43),223(+6.21),242(+1.61)nm；
(c 0.10,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
白莲蒿内酯J(Artemisacrolide J，10)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 405.1547[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3440,1764,1717,1645,1455,1383,1359,1264,1232,1153,1108,1040,961cm-1；
ECD(c 0.26,MeOH)λmax(Δε):205(-6.77),245(+1.31)nm；
(c 0.10,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
白莲蒿内酯K(Artemisacrolide K，11)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 405.1540[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3438,1754,1718,1646,1446,1380,1272,1227,1148,1108,962cm–1；
ECD(c 0.16,MeOH)λmax(Δε):208(-6.72),247(+0.66)nm；
(c 0.15,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
白莲蒿内酯L(Artemisacrolide L，12)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 405.1546[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3428,1767,1711,1648,1146,1384,1268,1134,1075,1040,961cm–1；ECD(c 0.18,MeOH)λmax(Δε):208(-0.63),223(+7.71)nm；
(c 0.07,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
白莲蒿内酯M(Artemisacrolide M，13)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z 405.1562[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3426,1766,1718,1636,1455,1384,1261,1232,1151,1042,960cm–1；ECD(c 0.18,MeOH)λmax(Δε):213(-4.67),241(+2.14)nm；
(c 0.15,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
白莲蒿内酯N(Artemisacrolide N，14)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:405.1539[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3430,1765,1720,1645,1447,1383,1271,1226,1144,107,1040,962cm–1；ECD(c 0.15,MeOH)λmax(Δε):215(-5.54),247(+1.35)nm；
(c 0.05,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
白莲蒿内酯O(Artemisacrolide O，15)
分子式：C19H22O6
分子量：346
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:391.1392[M+HCOOH]-(calcd.for C20H23O8,391.1398)；
IR(KBr)νmax:3432,1752,1716,1632,1452,1384,1277,1162,1081,1022,962cm–1；
ECD(c 0.12,MeOH)λmax(Δε):211(+25.73)nm；
(c 0.05,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
白莲蒿内酯P(Artemisacrolide P，16)
分子式：C19H24O6
分子量：348
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:393.1559[M+HCOOH]-(calcd.for C20H25O8,393.1555)；
IR(KBr)νmax:3437,1754,1736,1630,1468,1453,1385,1276,1255,1157,1116,1022,996cm-1；
ECD(c 0.16,MeOH)λmax(Δε):210(+14.3)nm；
(c 0.08,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
白莲蒿内酯Q(Artemisacrolide Q，17)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:405.1545[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3439,1755,1704,1648,1449,1384,1349,1264,1135,1075,1020,994cm–1；
ECD(c 0.15,MeOH)λmax(Δε):219(+19.31)nm；
(c 0.15,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
白莲蒿内酯R(Artemisacrolide R，18)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:405.1557[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3435,1756,1710,1644,1454,1384,1358,1258,1231,1155,1082,1022,959cm-1；
ECD(c 0.16,MeOH)λmax(Δε):213(+14.06)nm；
(c 0.13,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
白莲蒿内酯S(Artemisacrolide S，19)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:405.1549[M+H]+(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3437,1755,1714,1643,1448,1383,1356,1276,1228,1144,1075,967cm–1；
ECD(c 0.11,MeOH)λmax(Δε):216(+32.49)nm；
(c 0.05,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
白莲蒿内酯T(Artemisacrolide T，20)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:405.1557[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3433,1767,1709,1645,1444,1383,1260,1134,1030,1013,964cm–1；ECD(c 0.15,MeOH)λmax(Δε):222(+8.77),233(+9.51)nm；
(c 0.07,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
白莲蒿内酯U(Artemisacrolide U，21)
分子式：C20H24O6
分子量：360
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:405.1542[M+HCOOH]-(calcd.for C21H25O8,405.1555)；
IR(KBr)νmax:3434,1767,1718,1642,1446,1382,1273,1226,1141,1077,1028cm–1；ECD(c 0.14,MeOH)λmax(Δε):218(-0.36),240(+9.74)nm；
(c 0.10,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
表5 1H NMR data(600MHz,CD3OD,J in Hz,δin ppm)for compounds 17-21
实施例2：
化合物1–21对三株肝癌细胞株的抑制活性。
1.材料和方法
1.1材料
HepG2细胞株由中国科学院昆明植物研究所活性筛选中心赠予，SK-Hep-1和Huh7细胞株购自上海纪宁生物科技有限公司；培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)购自Thermo Fisher Scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,FBS)购自Life Technologies(NY,USA)；RPMI-1640购自ThermoFisher Biochemical Products(北京，中国)。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
1).取对数期生长的肝癌细胞，弃去旧培养基，用PBS清洗两遍，弃去PBS；
2).用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
3)用含10％ FBS的DMEM完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μL细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至1×104/mL，接种在96孔板上，每孔加入100μL细胞悬液，在37℃，5％ CO2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
4).吸去培养基，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔，培养箱中继续孵育48h；
5).吸去培养基，加入配好的MTT溶液(1mg/mL)，每孔加入100μL，培养箱中孵育4h；
6).吸去MTT溶液，加入DMSO，每孔加入100μL，培养箱中孵育10min；
7).使用酶标仪在490nm波长下测量吸光度值，通过公式抑制率＝(阴性－实验组)/(阴性－空白组)×100％计算细胞抑制率，并用统计软件GraphPad prism 5计算IC50，实验重复3次。
2.结果
对所有化合物进行了抗肝癌活性评价，结果如表6所示，其中21个愈创木烷倍半萜内酯(1-21)对HepG2细胞具有抑制作用，其IC50在21.9至71.2μM之间。化合物2、5和18对Huh7细胞具有明显的抑制作用，其IC50值分别为8.2、9.0和9.6μM，优于阳性索拉非尼(IC50值为12.6μM)；化合物1、3、6、15、17和19具有与索拉非尼相当的抑制作用，其IC50值分别为13.7、14.2、11.4、12.8、13.8和14.3μM；化合物7-11、16和20对Huh7细胞具有抑制活性，其IC50值为15.3至39.4μM之间；化合物22和23的活性较弱。对于SK-Hep-1细胞，化合物1-3、5、6、10和18抑制活性与阳性索拉非尼(IC50值为18.8μM)相当，其IC50值分别为13.5、16.9、19.2、17.3、18.8、16.5和16.4μM；化合物7-9、11、15-17、19和20对SK-Hep-1细胞具有一定的抑制作用，其IC50值在30.1-39.9μM；化合物22和23的活性较弱。
根据上述分析结果发现，C-8被取代的愈创木烷倍半萜内酯(1-21)对Huh7和SK-Hep-1细胞的抑制作用明显优于HepG2细胞，说明这些化合物对Huh7和SK-Hep-1细胞的抑制作用较为敏感。
表6化合物1-21抗肝癌活性评价
3.结论
抗肝癌活性筛选结果表明，化合物1-21对HepG2细胞具有抑制作用，其IC50在21.9至71.2μM之间。化合物2、5和18对Huh7细胞具有明显的抑制作用，其IC50值分别为8.2、9.0和9.6μM，优于阳性索拉非尼(IC50值为12.6μM)；化合物1、3、6、15、17和19具有与索拉非尼相当的抑制作用，其IC50值分别为13.7、14.2、11.4、12.8、13.8和14.3μM。化合物1-3、5、6、10和18对SK-Hep-1细胞抑制活性与阳性索拉非尼(IC50值为18.8μM)相当，其IC50值分别为13.5、16.9、19.2、17.3、18.8、16.5和16.4μM。以上结果表明白莲蒿中分离得到的化合物1-21可作为药物用于治疗肝癌相关的疾病。
制剂实施例
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物1–21中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将本发明化合物1–21中的至少一种，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/mL。
2.将本发明化合物1–21中的至少一种，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将本发明化合物1–21中的至少一种，按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将本发明化合物1–21中的至少一种，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将本发明化合物1–21中的至少一种，按常规口服液制法制成口服液。
6.将本发明化合物1–21中的至少一种，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将本发明化合物1–21中的至少一种，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一种白莲蒿中化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的21个高度氧化的愈创木倍半萜内酯，这些化合物对肝癌细胞具有不同程度的抑制作用，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.如下结构式(I)所示的白莲蒿内酯化合物1-21，
2.权利要求1所述的结构式(I)所示的白莲蒿内酯化合物1-21的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
将干燥的白莲蒿地上部分，粉碎，用3倍量的90％乙醇室温提取两次，合并提取液减压浓缩后，将得到的提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，用丙酮-石油醚体积比2:98、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到7个流分Frs.B-1～B-7；Fr.B-3过硅胶柱层析，以5:95,10:90,20:80,40:60的丙酮-石油醚洗脱得到5个亚流分Fr.B-3a～Fr.B-3e；Fr.B-3b经过Sephadex LH-20柱层析，以MeOH洗脱得到Fr.B-3b-1和Fr.B-3b-2；Fr.B-3b-1经过Rp-C18柱层析，以50:50、60:40、70:30和80:20的MeOH-H2O洗脱，再经硅胶柱层析，以10:90,20:80的乙酸乙酯-氯仿，使用半制备HPLC，在Agilent XDB-C18柱以40:60的乙腈-水纯化，得到化合物1、2、5和6；Fr.B-3b-2经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱以62:48的MeOH-H2O纯化得到了化合物3；Fr.B-5过硅胶柱层析，以2:98、5:95和10:90的MeOH-CHCl3洗脱得到6个亚流分Fr.B-5a～Fr.B-5f；Fr.B-5c过Rp-C18柱层析，用甲40:60、50:50、60:40和100:0的醇-水洗脱得到了6个亚流分Frs.B-5c-1～B-5c-6；Fr.B-5c-2经过硅胶柱层析，以14:86的丙酮-石油醚洗脱得到Fr.B-5c-2a和Fr.B-5c-2b；Fr.B-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用50:50的MeOH-CHCl3洗脱后，经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以44:56甲醇-水纯化得到化合物18和20；Fr.B-5c-2b经过Sephadex LH-20柱层析，用50:50的MeOH-CHCl3洗脱后，经制备薄层层析，以6:94的MeOH-CHCl3纯化得到化合物17、19和21；Fr.B-5d经过Rp-C18柱层析，用40:60、50:50、60:40和100:0的甲醇-水洗脱得到了8个亚流分Frs.B-5d-1～B-5d-8；Fr.B-5d-3经过反相Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理后，再使用半制备HPLC纯化在Agilent XDB-C18柱上以45:55的MeOH-H2O洗脱得到化合物15、16、7和8；Fr.B-5d-4使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物9、10和11；Fr.B-5f经过硅胶柱层析，以10:90和20:80的乙酸乙酯-石油醚洗脱后，再用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物4；Fr.B-6经MCI gel CHP 20P柱层析，用40:60、50:50、60:40、80:20和100:0的甲醇-水洗脱得到了5个流分Frs.B-6a-B-6e；Fr.B-6c经过硅胶柱层析，以1:99、2:98和5:95的MeOH-CHCl3洗脱得到了流分Frs.B-6c-1-B-6c-6；Fr.B-6c-4经过反相Rp-C18柱层析，以35:65的乙腈-水处理后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以52:48的甲醇-水纯化得到化合物12、13和14。
3.权利要求1所述的结构式(I)所示的白莲蒿内酯化合物1-21在制备抗肝癌药物中的应用。
4.包括权利要求1所述的结构式(I)所示的白莲蒿内酯化合物1-21的至少一种和药学上可接受的载体的药物组合物。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
6.权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
将干燥的白莲蒿地上部分，粉碎，用3倍量的90％乙醇室温提取两次，合并提取液减压浓缩后，将得到的提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，用丙酮-石油醚体积比2:98、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到7个流分Frs.B-1～B-7；Fr.B-3过硅胶柱层析，以5:95,10:90,20:80,40:60的丙酮-石油醚洗脱得到5个亚流分Fr.B-3a～Fr.B-3e；Fr.B-3b经过Sephadex LH-20柱层析，以MeOH洗脱得到Fr.B-3b-1和Fr.B-3b-2；Fr.B-3b-1经过Rp-C18柱层析，以50:50、60:40、70:30和80:20的MeOH-H2O洗脱，再经硅胶柱层析，以10:90,20:80的乙酸乙酯-氯仿，使用半制备HPLC，在Agilent XDB-C18柱以40:60的乙腈-水纯化，得到化合物1、2、5和6；Fr.B-3b-2经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱以62:48的MeOH-H2O纯化得到了化合物3；Fr.B-5过硅胶柱层析，以2:98、5:95和10:90的MeOH-CHCl3洗脱得到6个亚流分Fr.B-5a～Fr.B-5f；Fr.B-5c过Rp-C18柱层析，用甲40:60、50:50、60:40和100:0的醇-水洗脱得到了6个亚流分Frs.B-5c-1～B-5c-6；Fr.B-5c-2经过硅胶柱层析，以14:86的丙酮-石油醚洗脱得到Fr.B-5c-2a和Fr.B-5c-2b；Fr.B-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用50:50的MeOH-CHCl3洗脱后，经半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以44:56甲醇-水纯化得到化合物18和20；Fr.B-5c-2b经过Sephadex LH-20柱层析，用50:50的MeOH-CHCl3洗脱后，经制备薄层层析，以6:94的MeOH-CHCl3纯化得到化合物17、19和21；Fr.B-5d经过Rp-C18柱层析，用40:60、50:50、60:40和100:0的甲醇-水洗脱得到了8个亚流分Frs.B-5d-1～B-5d-8；Fr.B-5d-3经过反相Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理后，再使用半制备HPLC纯化在Agilent XDB-C18柱上以45:55的MeOH-H2O洗脱得到化合物15、16、7和8；Fr.B-5d-4使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物9、10和11；Fr.B-5f经过硅胶柱层析，以10:90和20:80的乙酸乙酯-石油醚洗脱后，再用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以30:70的乙腈-水纯化得到化合物4；Fr.B-6经MCI gel CHP 20P柱层析，用40:60、50:50、60:40、80:20和100:0的甲醇-水洗脱得到了5个流分Frs.B-6a-B-6e；Fr.B-6c经过硅胶柱层析，以1:99、2:98和5:95的MeOH-CHCl3洗脱得到了流分Frs.B-6c-1-B-6c-6；Fr.B-6c-4经过反相Rp-C18柱层析，以35:65的乙腈-水处理后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱上以52:48的甲醇-水纯化得到化合物12、13和14，然后取化合物1-21中的其中一种或其任意组合，加入可药用载体。
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