CN113185562B - 暗绿蒿素a-p及其药物组合物与其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结构式(I)所示16个新的愈创木烷倍半萜，暗绿蒿素A‑P(1‑16)及其制备方法和应用，含暗绿蒿素A‑P(1‑16)的药物组合物及其应用，涉及药物技术领域。暗绿蒿素A‑P(1‑16)对人肝癌细胞株HepG2和Huh7具有显著的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。

Description

暗绿蒿素A-P及其药物组合物与其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及暗绿蒿素A-P(1-16),及其制备方法和应用，含暗绿蒿素A-P(1-16)的药物组合物及其应用。
背景技术：
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其临床特点是发病隐匿、进程快，恶性度高，且预后差，导致肝癌的死亡率高居全球所有癌症的第二位。肝癌是一个全球性的健康问题，国际癌症研究机构(IARC)最新资料表明，2018年全球肝癌新发人数超过84万，因肝癌导致的死亡人数约为78万。其中，约50％的肝癌新发病例发生在我国。当前，多种因素已被证实是肝癌发病的危险因素，主要包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、酒精和黄曲霉毒素等。HCC给全球造成了极为沉重的疾病负担，但不同地区发病模式差异较大。就全球而言，肝癌主要集中于非洲东部和东南亚各国。不发达地区肝癌的发病率与死亡率远远高出发达地区，且男性发病率与死亡率普遍高于女性。因此，肝癌的预防和治疗已经成为全球极为关注的问题。
天然产物结构多样，具有多种生物活性，毒性低，特别是一些化合物在抗肿瘤方面显示了独特的优势。从天然产物中寻找新颖的活性分子是新药开发的重要途径。肝癌对人类健康构成严重威胁，死亡率高。多数直到中晚期才发现，因此存活率非常低。化学治疗是肝癌的重要治疗手段，但其表现出严重的心脏和肾脏毒性。而天然产物具有独特的结构和低毒性，国内外越来越多地学者关注从天然产物中找寻抗肝癌活性成分。诸多药用植物中含有抗癌活性先导化合物，紫杉醇是从太平洋紫杉(Taxus brevifolia)树皮中提取分离出来的，由于其具有较好的抗癌活性和独特的抗癌机理，使其成为最具代表性的抗癌药物之一；喜树碱是从珙桐科落叶植物喜树的种子或根皮中提出的一种生物碱，对多种动物肿瘤有抑制作用，与常用抗肿瘤药无交叉耐药性，与甘草酸单胺盐合用，能降低毒性而不降低疗效。因此，基于天然产物寻找新型、高效、低毒的抗肝癌药物具有重要意义。目前临床上用于治疗肝癌患者的药物有七个：索拉非尼(sorafenib)、瑞格菲尼(regorafenib)、乐伐替尼(lenvatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、纳武单抗(nivolumab)、帕姆单抗(pembrolizumab)、雷莫卢单抗(ramucirumab)，但也会出现恶心、头痛、呕吐、食欲减退等副作用。
蒿属(Artemisia L.)隶属于菊科(Asteraceae)，为多年生草本植物，全世界380余种，我国有186种，44变种，特有种82种，遍布全国各地，尤其是西北、华北、东北及西南省区最多。该属植物一些种为中医药及民间常用药材，如黄花蒿(A.annua)、艾(A.argyi)、茵陈(A.capillaris)以及奇蒿(A.anomala)等，黄花蒿又叫青蒿，全草入药，具有清热凉血，退虚热，解暑、抗疟等功效；茵陈作为传统中药，具有清热利湿、利胆退黄等功效，临床上广泛用于治疗黄疸，肝炎等疾病；艾以叶入药，习称艾叶，艾叶具有散寒止痛，温经止血的功效，奇蒿俗称南刘寄奴，具有清热、解读、消炎、止痛等功效。青蒿素是从黄花蒿中得到的具有过氧桥的新型倍半萜内酯类化合物，其不仅具有较好的抗疟活性，还具有较好的抗肿瘤活性；阿格拉宾为愈创木烷倍半萜，是该属植物中另一个亮点分子，具有较好的抗癌活性。该属植物因其广泛的药用，新颖、多样的次生代谢产物及多种多样的生物活性，越来越受到国内外学者的广泛关注。
暗绿蒿(Artemisia atrovirens)为菊科蒿属多年生草本植物，其在《中国菊科药用植物化学成分及开发利用》中收录为具有医疗价值的药用植物，广泛分布于我国陕西、甘肃、安徽、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、广西以及云贵川等地。
在本发明的前期工作中发现，暗绿蒿干燥地上部分的90％乙醇提取物对HepG 2和Huh7两株肝癌细胞具有一定的细胞毒活性，进一步从中分离得到16个对两株肝癌细胞株具有细胞毒活性的愈创木烷倍半萜类化合物，暗绿蒿素A-P(1-16)。迄今，现有技术中无暗绿蒿素A-P(1-16)的报道，也没有其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有其药物组合物在制备或治疗肝癌药物中的应用报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的式(I)所示的暗绿蒿素A-P(1-16)，及其制备方法和应用，药物组合物及其应用，该类化合物对肝癌细胞株具有明显的细胞毒活性，能够用于制备抗肝癌药物中。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一系列愈创木烷倍半萜类化合物，暗绿蒿素A-P(1-16)，具有如下式(I)所示结构：
本发明提供了上述化合物1-16的制备方法，取暗绿蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚(10:90,30:70,50:50,v/v)以及丙酮进行梯度洗脱得到4个流分Fr.1-Fr.4；Fr.1经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,2:98至30:70,v/v)得到4个组分Fr.1-1-Fr.1-4；Fr.1-3经中压MCI CHP20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.1-3-1-Fr.1-3-4；Fr.1-3-2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,30:70,v/v)得到3个组分Fr.1-3-2-1-Fr.1-3-2-3；Fr.1-3-2-2经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)得到得到化合物6和混合物，该混合物经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80,v/v)，再通过半制备HPLC(水-甲醇,49:51)纯化，得到化合物9。Fr.1-3-3经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,3:97至5:95,v/v)得到4个组分Fr.1-3-3-1～Fr.1-3-3-4；Fr.1-3-3-2再次经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,3:97至5:95,v/v)得到3个组分Fr.1-3-3-2a～Fr.1-3-3-2c；Fr.1-3-3-2b经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，通过制备HPLC(水-甲醇,30:70)纯化，得到化合物8。Fr.1-3-3-3经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，再通过制备HPLC(水-乙腈,38:62)纯化得到化合物2,3,4和5。Fr.2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,40:60,100:0,v/v)得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4；Fr.2-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.2-2-1～Fr.2-2-4；Fr.2-2-2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,20:80至50:50)得到4个流分Fr.2-2-2-1～Fr.2-2-2-4；Fr.2-2-2-1经中压MCI CHP20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个组分Fr.2-2-2-1a-1d；Fr.2-2-2-1a经硅胶柱层析(丙酮-氯仿,5:95至10:90)得到化合物13和混合物，该混合物再经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇)，并通过制备HPLC(水-乙腈,62:28)纯化，得到化合物14，15和16。Fr.2-2-2-1b经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)得到两个亚流分Fr.2-2-2-1b-1-Fr.2-2-2-1b-2，Fr.2-2-2-1b-1通过制备HPLC(水-乙腈,66:34)纯化，得到化合物11和12。Fr.2-2-2-3经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80,v/v)得到化合物7。Fr.2-2-2-4经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,30:70至50:50,v/v)得到3个组分Fr.2-2-2-4a-Fr.2-2-2-4c；Fr.2-2-2-4c先经硅胶柱层析(丙酮-氯仿,5:95)，再经半制备HPLC(水-甲醇,64:36)纯化，得到化合物10。Fr.4经硅胶柱层析(甲醇-氯仿,5:95,10:90,20:80,30:70,40:60,v/v)得到5个组分Fr.4-1-Fr.4-5；Fr.4-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(90:10,70:30,50:50,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.4-2-1～Fr.4-2-4；Fr.4-2-2经重结晶(甲醇-氯仿,50:50)得到化合物1。
本发明提供了上述化合物1-16在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
本发明同时还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的式(I)化合物1-16的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。
并此，还提供了所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
当所述化合物1-16中的至少一种用于制备抗肝癌药物时，本发明优选将所述化合物1-16直接使用，或以药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物1-16中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1-16中的至少一种与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝癌药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1-16中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
附图说明：
图1为本发明化合物1-16的结构示意图；
图2为本发明化合物1的X-单晶衍射结构示意图；
图3为本发明化合物14的X-单晶衍射结构示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明倍半萜类化合物，暗绿蒿素A-P(1-16)及其制备方法、结构鉴定、药理作用，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
化合物1-16的制备：
取暗绿蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚(10:90,30:70,50:50,v/v)以及丙酮进行梯度洗脱得到4个流分Fr.1-Fr.4；Fr.1经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,2:98至30:70,v/v)得到4个组分Fr.1-1-Fr.1-4；Fr.1-3经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.1-3-1-Fr.1-3-4；Fr.1-3-2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,30:70,v/v)得到3个组分Fr.1-3-2-1-Fr.1-3-2-3；Fr.1-3-2-2经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)得到得到化合物6和混合物，该混合物经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80,v/v)，再通过半制备HPLC(水-甲醇,49:51)纯化，得到化合物9。Fr.1-3-3经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,3:97至5:95,v/v)得到4个组分Fr.1-3-3-1～Fr.1-3-3-4；Fr.1-3-3-2再次经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,3:97至5:95,v/v)得到3个组分Fr.1-3-3-2a～Fr.1-3-3-2c；Fr.1-3-3-2b经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，通过制备HPLC(水-甲醇,30:70)纯化，得到化合物8。Fr.1-3-3-3经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)，再通过制备HPLC(水-乙腈,38:62)纯化得到化合物2,3,4和5。Fr.2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,10:90,20:80,40:60,100:0,v/v)得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4；Fr.2-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.2-2-1～Fr.2-2-4；Fr.2-2-2经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,20:80至50:50)得到4个流分Fr.2-2-2-1～Fr.2-2-2-4；Fr.2-2-2-1经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇(50:50,30:70,10:90,0:100)梯度洗脱，得到4个组分Fr.2-2-2-1a-1d；Fr.2-2-2-1a经硅胶柱层析(丙酮-氯仿,5:95至10:90)得到化合物13和混合物，该混合物再经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇)，并通过制备HPLC(水-乙腈,62:28)纯化，得到化合物14，15和16。Fr.2-2-2-1b经Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)得到两个亚流分Fr.2-2-2-1b-1-Fr.2-2-2-1b-2，Fr.2-2-2-1b-1通过制备HPLC(水-乙腈,66:34)纯化，得到化合物11和12。Fr.2-2-2-3经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,20:80,v/v)得到化合物7。Fr.2-2-2-4经硅胶柱层析(丙酮-石油醚,30:70至50:50,v/v)得到3个组分Fr.2-2-2-4a-Fr.2-2-2-4c；Fr.2-2-2-4c先经硅胶柱层析(丙酮-氯仿,5:95)，再经半制备HPLC(水-甲醇,64:36)纯化，得到化合物10。Fr.4经硅胶柱层析(甲醇-氯仿,5:95,10:90,20:80,30:70,40:60,v/v)得到5个组分Fr.4-1-Fr.4-5；Fr.4-2经中压MCI CHP20P柱层析，用水-甲醇(90:10,70:30,50:50,0:100)梯度洗脱，得到4个流分Fr.4-2-1～Fr.4-2-4；Fr.4-2-2经重结晶(甲醇-氯仿,50:50)得到化合物1。
化合物1-16的结构数据：
核磁共振图谱使用Avance III 600(Bruker,Switzerland)，DRX-500(Bruker,Bremerhaven,Germany)和Avance III HD 400(Bruker,Bremerhaven,Germany)超导核磁共振仪测定，TMS(四甲基硅烷)作为内标。高分辨质谱分析采用岛津LC-MS-IT-TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定。红外光谱(IR)经KBr压片方法，通过NICOLET iS10型红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific,Madison,USA)测定。ECD谱采用Chirascan型仪器(Applied Photophysics,Surrey,UK)测定。旋光经Autopol VI旋光仪(Rudolph ResearchAnalytical,Hackettstown,USA)测定。熔点用X-4B显微熔点仪来测定，该熔点仪购自上海精密科学仪器有限公司。薄层层析硅胶板HSGF254是烟台江友硅胶开发有限公司产品；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；柱层析葡聚糖凝胶LH-20购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司。高效液相色谱仪为岛津公司生产，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，使用的色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)。色谱纯乙腈购自迈瑞达公司，去离子通道水通过MingCheTM-D 24UV Merk Millipore系统纯化而得。中压液相(Dr Flash-Ⅱ)为上海利穗公司产品，MCI柱日本三菱公司，型号为CHP-20P(75～150μm)。分析纯甲醇和乙腈购自天津大茂化学试剂厂。显色剂为10％H2SO4-EtOH溶液。
暗绿蒿素A(1)
分子式：C21H30O9
分子量：426.17
性状：单斜晶体
熔点：203～204℃
旋光：(c 0.11,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值449.1772[M+Na]+,计算值449.1782[M+Na]+。
IR(KBr)νmax:3397,1779,1650,1392,1181,1078,1057,1028cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):202(–0.44),230(+0.02)nm。
晶体数据：C21H30O9·CH3OH,M＝458.49, α＝90°,β＝90.219(5)°,γ＝90°,T＝100(2)K,晶格尺寸P21,Z＝2,μ(Cu Kα)＝0.909mm-1,晶体数据采用D8 QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为8609次,其中观测到3289次(Rint＝0.0329),I>2σ(I),R1＝0.0416,wR(F2)＝0.1049,F2＝1.149,Flack parameter＝0.08(6)。化合物1的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC1999130。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。化合物1的X-单晶衍射结构见图2。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1。
暗绿蒿素B(2)
分子式：C20H28O5
分子量：348.20
性状：无色胶体固体
旋光：(c 0.12,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值349.2000[M+H]+,计算值349.2010[M+H]+。
IRνmax:1766,1724,1651,1460,1377,1222,1000cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):203(–0.47),243(+0.06)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素C(3)
分子式：C20H26O5
分子量：347.18
性状：无色胶体固体
旋光：(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值347.1838[M+H]+,计算值347.1853[M+H]+。
IR(KBr)νmax:1778,1717,1648,1314,1230,1181,1170,1151cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):203(–0.09),244(+0.02)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素D(4)
分子式：C20H26O5
分子量：347.18
性状：无色胶体固体
旋光：(c 0.09,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值347.1838[M+H]+,计算值347.1853[M+H]+。
IR(KBr)νmax:1775,1739,1661,1398,1379,1256,1236cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(+0.25),242(–0.01)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素E(5)
分子式：C20H24O5
分子量：344.16
性状：无色胶体固体
旋光：(c 0.15,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值345.1694[M+H]+,计算值345.1696[M+H]+。
IRνmax:1775,1713,1649,1381,1263,1186,1138cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):204(+0.31),218(+0.62)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素F(6)
分子式：C16H22O4
分子量：279.15
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.06,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值279.1590[M+H]+,计算值279.1591[M+H]+。
IRνmax:1772,1650,1338,1212,1185,1170,1155cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):202(–0.49),232(+0.01)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素G(7)
分子式：C19H25NO4
分子量：331.18
性状：无色胶体固体
旋光：(c 0.32,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值332.1860[M+H]+,计算值332.1856[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3436,1772,1673,1464,1328,1207,1189cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε)195(+0.24),203(–0.24),227(+0.15)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素H(8)
分子式：C20H26O4
分子量：330.19
性状：无色胶体固体
旋光：(c 0.08,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值331.1912[M+H]+,计算值331.1904[M+H]+。
IRνmax:1783,1669,1632,1414,1277,1178,1052cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(+0.24),247(–0.09)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
暗绿蒿素I(9)
分子式：C16H22O4
分子量：278.14
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.14,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值301.1440[M+Na]+,计算值301.1410[M+Na]+。
IRνmax:3429,1771,1633,1352,1179,1127,1099cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(+0.07),215(–0.02),282(–0.03),353(+0.01)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和4。
暗绿蒿素J(10)
分子式：C15H18O5
分子量：278.10
性状：无色胶状固体
旋光：(c 0.06,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值277.1089[M-H]–,计算值277.1081[M-H]–。
IRνmax:3435,1771,1709,1651,1403,1327,1023cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(+0.24),213(–0.40),240(+0.61),325(–0.14)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
暗绿蒿素K(11)
分子式：C15H20O3
分子量：248.14
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.05,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值249.1496[M+H]+,计算值249.1485[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3507,1754,1649,1454,1333,1235,1018cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(–0.48),199(–0.62),242(+0.01)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
暗绿蒿素L(12)
分子式：C15H20O3
分子量：248.14
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.09,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值249.1486[M+H]+,计算值249.1485[M+H]+。
IR(KBr)νmax:3523,1750,1709,1636,1459,1306,1218,1006cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(–3.48),199(–4.26),227(+0.24)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
暗绿蒿素M(13)
分子式：C15H22O3
分子量：250.14
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.15,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值273.1460[M+Na]+,计算值273.1461[M+Na]+。
IR(KBr)νmax:3417,1636,1441,1283,1063,905cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(–1.22),201(–1.82),228(+0.05)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
暗绿蒿素N(14)
分子式：C15H22O3
分子量：250.14
性状：单斜晶体
熔点：152～153℃
旋光：(c 0.08,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值273.1461[M+Na]+,计算值273.1461[M+Na]+。
IR(KBr)νmax:3493,3258,1644,1443,1278,1092,1025,919cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):198(+4.68),227(+0.01)nm。
晶体数据：C15H22O3,M＝250.32, α＝90°,β＝91.1810(10)°,γ＝90°,T＝100.(2)K,晶格尺寸P1211,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.668mm-1,晶体数据采用D8 QUEST型晶体衍射仪(铜靶)进行测定，总衍射次数为27602次,其中观测到5333次(Rint＝0.0330),I>2σ(I),R1＝0.0628,wR(F2)＝0.1797,F2＝1.061,Flack parameter＝0.06(4)。化合物14的晶体参数已存入剑桥晶体数据中心，提取号：CDCC 2049392。网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk。化合物14的X-单晶衍射结构见图3。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
暗绿蒿素O(15)
分子式：C15H24O3
分子量：252.16
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.06,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值275.1610[M+Na]+,计算值275.1618[M+Na]+。
IR(KBr)νmax:3386,1638,1452,1406,1227,1060,907cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):195(–1.45),201(–2.34),234(+0.01)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
暗绿蒿素P(16)
分子式：C15H22O4
分子量：266.14
性状：白色无定型粉末
旋光：(c 0.32,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值289.1423[M+Na]+,计算值289.1410[M+Na]+。
IR(KBr)νmax:3431,1639,1441,1407,1232,1101,1073cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):197(+0.33),210(0.00),220(+0.02)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
表1.化合物1的1H NMR和13C NMR数据(500MHz/125MHz,pyridine-d5,δin ppm,JinHz)
实施例2：
化合物1-16对两株肝癌细胞株的细胞毒活性。
1.材料和方法
1.1材料
HepG2细胞株由中国科学院昆明植物研究所活性筛选中心赠予，Huh7细胞株购自上海纪宁生物科技有限公司；培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)购自Thermo Fisher Scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,FBS)购自LifeTechnologies(NY,USA)；RPMI-1640购自ThermoFisher Biochemical Products(北京，中国)。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
1).取对数期生长的肝癌细胞，弃去旧培养基，用PBS清洗两遍，弃去PBS；
2).用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
3)用含10％FBS的DMEM完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μL细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至1×104/mL，接种在96孔板上，每孔加入100μL细胞悬液，在37℃，5％CO2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
4).吸去培养基，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔，培养箱中继续孵育48h；
5).吸去培养基，加入配好的MTT溶液(1mg/mL)，每孔加入100μL，培养箱中孵育4h；
6).吸去MTT溶液，加入DMSO，每孔加入100μL，培养箱中孵育10min；
7).使用酶标仪在490nm波长下测量吸光度值，通过公式：抑制率＝(阴性－实验组)/(阴性－空白组)×100％计算细胞抑制率，并用统计软件GraphPad prism 5计算IC50，实验重复3次。
2.结果
化合物1–16对两株肝癌细胞(HepG2和Huh7)的细胞毒活性筛选结果如表6所示。在浓度为200.0μg/ml时，所有化合物对HepG2细胞的细胞毒活性的抑制率均大于50％，6个化合物(2,3,5,8,10和15)对Huh7细胞的细胞毒活性的抑制率大于50％；在浓度为100.0μg/ml时，9个化合物(2–6,8,10,12和15)对HepG2细胞的细胞毒活性的抑制率大于50％，4个化合物(3,5,8和15)对Huh7细胞的细胞毒活性的抑制率大于50％。
表6.化合物1–16对两株肝癌细胞的细胞毒活性结果(初筛)
注：以索拉菲尼(sorafenib)为阳性对照，其对HepG2的IC50为12.2μM；对Huh7的IC50为8.5μM.
随后，本发明对浓度为100.0μg/ml时，抑制率大于50％的化合物进行了剂量依赖关系测定，结果如表7所示。对于HepG2细胞,化合物3具有较强的细胞毒活性，其IC50值为8.0μM,较阳性药物索拉非尼更优；化合物5亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值为16.0μM，与阳性药物索拉非尼相当。
对于Huh7细胞,化合物3具有一定的细胞毒活性，其IC50值为18.2μM,几乎与阳性药物索拉非尼相当；化合物5,8,10和15亦具有一定的细胞毒活性，其IC50值分别为32.2,40.7,68.5和63.5μM。
表7.化合物3,5,8,10和15对两株肝癌细胞的细胞毒活性结果
a数值表示为IC50±SD.
3.结论
实验结果显示，5个化合物具有一定的细胞毒活性，化合物3和5不仅对HepG2细胞表现出较好的细胞毒活性，而且对Huh7细胞株也表现出较强的细胞毒活性，其IC50值分别为8.0和16.0μM(HepG2),18.2和32.2μM(Huh7)；此外，化合物8,10和15对两株肝癌细胞也具有一定的细胞毒活性，其IC50值分别为34.7,56.8和53.2μM(HepG2),40.7,68.5和63.5μM(Huh7)。以上结果表明暗绿蒿中分离得到的化合物1-16可作为药物用于治疗肝癌相关的疾病。
制剂实施例1-16：
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物1-16中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/mL。
2.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，用DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将实施例1制备的化合物1-16中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一类暗绿蒿素类化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的暗绿蒿素类化合物，对肝癌细胞具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.如下结构式所示的化合物暗绿蒿素A-E(化合物1-5)、暗绿蒿素G(化合物7)，
2.权利要求1所述的结构式所示的化合物1-5、7的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：取暗绿蒿干燥地上部分粉碎，用10倍量的90％乙醇冷浸提取两次，合并乙醇提取液并减压浓缩至无醇味，得到乙醇提取物，将提取物分散于水中，用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取部分，乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱层析，用丙酮-石油醚体积比为10:90,30:70,50:50,以及丙酮进行梯度洗脱得到4个流分Fr.1-Fr.4；Fr.1经硅胶柱层析，乙酸乙酯-石油醚2:98至30:70,v/v得到4个组分Fr.1-1-Fr.1-4；Fr.1-3经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇50:50,30:70,10:90,0:100梯度洗脱，得到4个流分Fr.1-3-1-Fr.1-3-4；Fr.1-3-3经乙酸乙酯-石油醚3:97至5:95,v/v硅胶柱层析，得到4个组分Fr.1-3-3-1～Fr.1-3-3-4；Fr.1-3-3-3经甲醇-氯仿50:50Sephadex LH-20凝胶柱层析，再通过制备HPLC，水-乙腈38:62纯化得到化合物2,3,4和5；Fr.2经硅胶柱层析，乙酸乙酯-石油醚10:90,20:80,40:60,100:0,v/v得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4；Fr.2-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇50:50,30:70,10:90,0:100梯度洗脱，得到4个流分Fr.2-2-1～Fr.2-2-4；Fr.2-2-2经硅胶柱层析，乙酸乙酯-石油醚20:80至50:50得到4个流分Fr.2-2-2-1～Fr.2-2-2-4；Fr.2-2-2-3经硅胶柱层析，丙酮-石油醚20:80,v/v得到化合物7；Fr.4经硅胶柱层析，甲醇-氯仿,5:95,10:90,20:80,30:70,40:60,v/v得到5个组分Fr.4-1-Fr.4-5；Fr.4-2经中压MCI CHP 20P柱层析，用水-甲醇90:10,70:30,50:50,0:100梯度洗脱，得到4个流分Fr.4-2-1～Fr.4-2-4；Fr.4-2-2经重结晶，甲醇-氯仿50:50得到化合物1。
3.权利要求1所述的结构式所示的化合物1-5、7在制备抗肝癌药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的结构式所示的化合物1-5、7的至少一种和药学上可接受的载体。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
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