CN111635380B - 野艾蒿中倍半萜及其药物组合物与其制备方法和应用 - Google Patents

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CN111635380B CN202010551064.6A CN202010551064A CN111635380B CN 111635380 B CN111635380 B CN 111635380B CN 202010551064 A CN202010551064 A CN 202010551064A CN 111635380 B CN111635380 B CN 111635380B
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Abstract

本发明提供结构式(I)所示13个新的倍半萜，artemilavanolides C‑F(1‑4)、artemlavandulolides A‑G(5‑11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)，及其制备方法和应用、药物组合物及其应用，涉及药物技术领域。化合物1‑13对人肝星状细胞(HSC‑LX2)具有明显的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝纤维化药物。

Description

野艾蒿中倍半萜及其药物组合物与其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及倍半萜artemilavanolides C-F(1-4)、artemlavandulolides A-G(5-11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)，及其制备方法和应用、药物组合物及其应用。
背景技术：
肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的必经阶段，其病因包括病毒性肝炎、酒精过度摄入、化学毒物或药物、寄生虫感染、遗传和代谢疾病等。当人体的肝细胞发生损伤时，会触发机体的一系列修复反应，具体表现为肌成纤维细胞激活和再生、细胞外基质大量产生和沉积，该进程如若得不到抑制或逆转则可能加速肝硬化的发展过程，严重影响人体的生存质量。目前以单一控制病因或中药治疗对抗肝纤维化的发生，而并无确切的化学药物进入临床使用。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肌成纤维细胞的主要来源。正常肝脏中，HSC增殖很慢，其通过调节细胞外基质的合成和降解而维持其动态平衡。当肝脏受到外界致病因子的持续刺激时，一系列复杂机制被启动，最终结果导致HSC由静息型转化为激活型，并分泌TGF-β、PDGF等各种促纤维因子，产生大量无序堆积的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，促进纤维化的发生和发展。因而，HSC是抗肝纤维化治疗的一个潜在靶点，当前许多抗肝纤维化在研药物通过抑制HSC的增殖及纤维形成能力、促进HSC的凋亡等途径以期达到治疗目的。本研究旨在基于人肝星状细胞(hepatic stellatecells line LX2,HSC-LX2)筛选模型，从天然产物中寻找新的抗肝纤维化活性成分。
野艾蒿(Artemisia lavandulaefoliaDC.)隶属菊科蒿属植物，为多年生草本，对生长环境要求不严，多生于低或中海拔地区，在中国、日本、朝鲜、蒙古及苏联(西伯利平东部及远东地区)均有分布。该种植物在民间常作为“艾(Artemisia argyi)”的代用品，具有散寒祛湿、温经止血、安胎等功效，此外，其嫩苗还可作为野菜使用。在本发明前期的工作中发现，前期研究发现野艾蒿乙醇提取物具有显著的HSC-LX2细胞毒活性(浓度为400μg/mL时其抑制率达94.1％)，活性导向分离得到13个新的倍半萜，artemilavanolides C-F(1-4)、artemlavandulolides A-G(5-11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)。迄今为止，现有技术无化合物1-13的报道，也没有化合物1-13及其药物组合物作为抗肝纤维化药物的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的倍半萜，artemilavanolides C-F(1-4)、artemlavandulolides A-G(5-11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)，及其制备方法和应用、药物组合物及其应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
结构式(I)所示的artemilavanolides C-F(1-4)、artemlavandulolides A-G(5-11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)：
Figure BDA0002542547740000021
本发明提供了上述化合物1-13的制备方法，野艾蒿的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏。浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩的到乙酸乙酯萃取部分。然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚(0:100,5:95,10:90,20:80,40:60和100:0)为洗脱剂梯度洗脱得到Fr.A-Fr.F六个流分。流分Fr.C经过硅胶柱层析(丙酮-石油醚，5:95,10:90和20:80)得到三个流分Fr.C1-Fr.C3。流分Fr.C1经MCI gel CHP 20P柱层析(水-甲醇，10:90和0:100)和半制备HPLC(水-乙腈,30:70)得到化合物13(12mg)。流分Fr.C2经MCI gel CHP 20P柱层析(水-甲醇，50:50,30:70,10:90和100:0)、反复硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,5:95,10:90和20:80)和半制备HPLC(水-乙腈，50:50)得到化合物7(7mg),9(13mg),11(69mg)和12(25mg)。流分Fr.C3经MCI gel CHP 20P柱层析(水-甲醇,30:70,10:90和0:100)、SephadexLH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)后，再经半制备HPLC(水-乙腈,56:44)得到化合物5(11mg)，经半制备HPLC(水-乙腈,69:31)得到化合物6(27mg)和8(12mg)。流分Fr.D经MCIgel CHP 20P柱层析(水-甲醇，40:60、60:40、80:20和100:0)得到4个流分Fr.D1-Fr.D4。Fr.D1经硅胶柱层析(甲醇-氯仿，10:90)后，再经过半制备HPLC(水-乙腈,75:25)得到化合物1(17mg)和3(7mg)，经半制备HPLC(水-乙腈,85:15)得到化合物2(3mg)和4(2mg)。Fr.D4经硅胶柱层析(乙酸乙酯-氯仿,5:95)和半制HPLC(水-乙腈,56:44)得到化合物10(11mg)。
本发明提供了上述技术方案所述化合物1-13在制备抗肝纤维化药物的应用。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述化合物中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明提供了一系列倍半萜类化合物，artemilavanolides C-F(1-4)、artemlavandulolides A-G(5-11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)，这些化合物对HSC-LX2细胞具有明显的细胞毒作用，能够用于制备抗肝纤维化药物中。
本发明提供了所述化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
当所述化合物1-13中的至少一种用于制备抗肝纤维化药物时，本发明优选将所述化合物1-13直接使用，或以药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物包括上述技术方案所述化合物中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1-13中的至少一种与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供的药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝纤维化药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1-13中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
附图说明：
图1为本发明化合物1-13的结构式。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明倍半萜类化合物，artemilavanolides C-F(1-4)、artemlavandulolidesA-G(5-11)、artemlavanin B(12)和artemlavanin A(13)及其制备方法、结构鉴定、药理作用，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
化合物1-13的制备：
野艾蒿的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏。浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩的到乙酸乙酯萃取部分。然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚(0:100,5:95,10:90,20:80,40:60和100:0)为洗脱剂梯度洗脱得到Fr.A-Fr.F六个流分。流分Fr.C经过硅胶柱层析(丙酮-石油醚，5:95,10:90和20:80)得到三个流分Fr.C1-Fr.C3。流分Fr.C1经MCI gelCHP 20P柱层析(水-甲醇，10:90和0:100)和半制备HPLC(水-乙腈,30:70)得到化合物13(12mg)。流分Fr.C2经MCI gel CHP 20P柱层析(水-甲醇，50:50,30:70,10:90和100:0)、反复硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚,5:95,10:90和20:80)和半制备HPLC(水-乙腈，50:50)得到化合物7(7mg),9(13mg),11(69mg)和12(25mg)。流分Fr.C3经MCI gel CHP 20P柱层析(水-甲醇,30:70,10:90和0:100)、Sephadex LH-20凝胶柱层析(甲醇-氯仿,50:50)后，再经半制备HPLC(水-乙腈,56:44)得到化合物5(11mg)，经半制备HPLC(水-乙腈,69:31)得到化合物6(27mg)和8(12mg)。流分Fr.D经MCI gel CHP 20P柱层析(水-甲醇，40:60、60:40、80:20和100:0)得到4个流分Fr.D1-Fr.D4。Fr.D1经硅胶柱层析(甲醇-氯仿，10:90)后，再经过半制备HPLC(水-乙腈,75:25)得到化合物1(17mg)和3(7mg)，经半制备HPLC(水-乙腈,85:15)得到化合物2(3mg)和4(2mg)。Fr.D4经硅胶柱层析(乙酸乙酯-氯仿,5:95)和半制HPLC(水-乙腈,56:44)得到化合物10(11mg)。
化合物1-13的结构数据：
熔点采用
Figure BDA0002542547740000052
X-4B显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)测定；比旋光度由Autopol VI旋光仪(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,USA)测定；红外光谱采用ATR衰减全反射-金刚石晶体(ATR ITX-DIAMOND)方法，通过NICOLET iS10型红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific,Madison,USA)测定；紫外光谱由UV-2401PC型紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；ECD谱由Applied Photophysics圆二色谱仪(AppliedPhotophysics,Surrey,UK)测定；核磁共振谱使用Avance III 600(Bruker,Bremerhaven,Germany)超导核磁共振仪测定，使用TMS(四甲基硅烷)作为内标；高分辨质谱采用岛津LC-MS-IT-TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)，安捷伦UPLC/Q-TOF和G6230质谱仪(AgilentTechnologies,Santa Clara,USA)测定；薄层层析硅胶板HSGF254购自烟台江友硅胶开发有限公司；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；柱层析葡聚糖凝胶LH-20购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；高效液相色谱仪购自岛津公司，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)；色谱纯乙腈购自迈瑞达公司，去离子通道水通过MingCheTM-D24UV Merk Millipore系统纯化而得；中压液相(Dr Flash-Ⅱ)为上海利穗公司产品，MCI柱日本三菱公司，型号为CHP-20P(75～150μm)；分析纯甲醇和乙腈购自天津大茂化学试剂厂；显色剂为10％H2SO4-EtOH溶液。
Figure BDA0002542547740000051
Artemilavanolide C(1)
分子式：C15H20O5
分子量：280
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000063
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值281.1375[M+H]+,计算值281.1384[M+H]+。
IR vmax:1782,1719,1692,1658,1279,1229,1151,1100cm–1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):200(–22.6),234(+23.0)nm。
1HNMR和13CNMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0002542547740000061
Artemilavanolide D(2)
分子式：C15H20O6
分子量：296
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000064
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值297.1334[M+H]+,计算值297.1333[M+H]+。
IR vmax:3419,1782,1724,1713,1666,1240,1152,1064cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):199(–2.7),233(+2.7)nm。
1HNMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0002542547740000062
Artemilavanolide E(3)
分子式：C15H18O5
分子量：278
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000073
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值279.1227[M+H]+,计算值279.1227[M+H]+。
IR vmax:1780,1750,1710,1696,1628,1227,1145,1093cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):203(–14.1),235(+13.4)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0002542547740000071
Artemilavanolide F(4)
分子式：C15H18O6
分子量：294
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000074
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值295.1161[M+H]+,计算值295.1176[M+H]+。
IR vmax:3452,1783,1698,1627,1254,1148,1098cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):203(–9.7),235(+9.5)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和3。
Figure BDA0002542547740000072
Artemlavandulolide A(5)
分子式：C19H28O5
分子量：336
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000075
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值337.2010[M+H]+,计算值337.2010[M+H]+。
IR vmax:3484,1775,1728,1262,1224,1159,1120cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000081
Artemlavandulolide B(6)
分子式：C20H28O5
分子量：348
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000083
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值349.2008[M+H]+,计算值337.2010[M+H]+。
IR vmax:3467,1775,1703,1650,1266,1225,1143,1120cm–1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000082
Artemlavandulolide C(7)
分子式：C20H28O5
分子量：348
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000084
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值349.2016[M+H]+,计算值337.2010[M+H]+。
IR vmax:3488,1775,1707,1647,1260,1232,1157,1119cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000091
Artemlavandulolide D(8)
分子式：C20H28O5
分子量：348
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000093
(c 0.11,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值349.2009[M+H]+,计算值337.2010[M+H]+。
IR vmax:3469,1775,1709,1646,1272,1228,1148,1119cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000092
Artemlavandulolide E(9)
分子式：C20H30O5
分子量：350
性状：无色针晶
熔点：145.5–146.0℃
旋光：
Figure BDA0002542547740000103
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值351.2171[M+H]+,计算值351.2166[M+H]+。
IR vmax:3484,1776,1729,1294,1224,1187,1119cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000101
Artemlavandulolide F(10)
分子式：C17H24O5
分子量：308
性状：无色针晶
熔点：128.4–129.8℃
旋光：
Figure BDA0002542547740000104
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(-)m/z:实验值353.1594[M+HCOO]–,计算值353.1606[M+HCOO]–。
IR vmax:3458,1772,1735,1245,1228,1039cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000102
Artemlavandulolide G(11)
分子式：C17H20O5
分子量：304
性状：无色针晶
熔点：155.0–156.2℃
旋光：
Figure BDA0002542547740000105
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值305.1392[M+H]+,计算值305.1384[M+H]+。
IR vmax:1770,1748,1671,1639,1237,1054,1035cm-1。
UV(甲醇)λmax(logε):316(3.45)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和3。
Figure BDA0002542547740000111
Artemlavanin B(12)
分子式：C16H26O3
分子量：266
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000113
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值289.1754[M+Na]+,计算值289.1774[M+Na]+。
IR vmax:3455,1713,1625,1241,1218cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表4。
Figure BDA0002542547740000112
Artemlavanin A(13)
分子式：C15H18O2
分子量：230
性状：无色油状物
旋光：
Figure BDA0002542547740000114
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值231.1383[M+H]+,计算值231.1380[M+H]+。
IR vmax:1752,1488,1454,1189cm-1。
UV(甲醇)λmax(logε):220(3.91)nm。
ECD(甲醇)λmax(Δε):205(+43.2)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表4。
表1.化合物1-4的1H-NMR数据(600MHz,CD3OD,δin ppm,J in Hz)
Figure BDA0002542547740000121
表2.化合物5-11的1H-NMR数据(600MHz,CDCl3,δin ppm,J in Hz)
Figure BDA0002542547740000122
Figure BDA0002542547740000131
表4.化合物12和13的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据(δin ppm,J in Hz)
Figure BDA0002542547740000141
实施例2：
化合物1-13对HSC-LX2的细胞毒活性。
1.材料和方法
1.1材料
人肝星状细胞系(hepatic stellate cells line LX2,HSC-LX2)购自上海纪宁生物科技有限公司；RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Gibco BRL(NY,USA)；MTT购自广州赛国生物科技有限公司。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
采用MTT法测定样品对HSC-LX2细胞的毒活性。HSC-LX2细胞于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。取对数期生长的细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，24h后将其维持液替换为含不同浓度供试样品的培养基，同时设置只加维持液的细胞对照组，并以水飞蓟宾做阳性药物对照。培养48h后，弃掉培养液并加入100μL MTT溶液(浓度为1mg/mL)；置于37℃恒温箱孵育4h，弃掉MTT溶液并加入100μL DMSO溶解甲躜晶体；最后，在490nm处用酶标仪检测每孔吸光度值。HSC-LX2细胞抑制率计算公式为抑制率(％)＝[A(空白)–A(样品)]/A(空白)×100％。其半数抑制浓度(50％inhibitory concentration,IC50)利用Graphpad Prism 5软件计算。
2.结果
对分离得到的所有化合物评价了其体外的HSC-LX2细胞毒活性(表5)。当测试浓度为400μM时，化合物5-9和12-13对HSC-LX2细胞的抑制率超过了50％。量效关系研究表明化合物6和9的IC50值为109.3和114.0μM，比阳性药物水飞蓟宾(IC50,161.5μM)活性更优；化合物5,7,8,12和13的IC50值在194.3到267.7μM之间。
表5.化合物1-13的HSC-LX2细胞毒活性
Figure BDA0002542547740000151
Figure BDA0002542547740000161
a抑制率为浓度为400μM时的测试结果；b抑制率和IC50均从三次独立的实验中得到。
3.结论
实验结果显示，化合物6和9对HSC-LX2细胞的IC50值分别为109.3和114.0μM，比阳性药物水飞蓟宾(IC50,161.5μM)活性更优；化合物5,7,8,12和13也表现出不同程度的细胞毒活性。以上结果表明野艾蒿中化合物1-13可作为药物用于肝纤维化相关的疾病。
制剂实施例1-7：
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物1-13中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5-5mg/mL。
2.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，用DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将实施例1制备的化合物1-13中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一种野艾蒿中化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的13种新的倍半萜类化合物，对人肝星状细胞HSC-LX2具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝纤维化药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.如下结构式所示的倍半萜化合物12，其为：artemlavanin B(12)，
Figure FDA0003551663370000011
2.权利要求1所述的倍半萜化合物12的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：野艾蒿的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，以0:100,5:95,10:90,20:80,40:60和100:0比例进行梯度洗脱，得到Fr.A-Fr.F六个流分；流分Fr.C经过硅胶柱层析，以丙酮-石油醚5:95,10:90和20:80进行洗脱，得到三个流分Fr.C1-Fr.C3；流分Fr.C2经MCI gel CHP 20P柱层析，以水-甲醇50:50,30:70,10:90和100:0进行洗脱、反复硅胶柱层析，以乙酸乙酯-石油醚5:95,10:90和20:80和半制备HPLC，水-乙腈50:50进行洗脱，得到化合物12。
3.如下结构式所示的倍半萜化合物5-9，12，13在制备抗肝纤维化药物中的应用，
Figure FDA0003551663370000012
Figure FDA0003551663370000021
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的化合物12和药学上可接受的载体。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
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