CN110437198B - 倍半萜类化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了3种倍半萜类化合物，包括两个对映异构体(+)‑gracilistone C(1a)和(‑)‑gracilistone C(1b)及一个具有新骨架类型的降倍半萜gracilistone C(2)。所述3种倍半萜类化合物从五加科植物细柱五加中提取分离得到，具有显著抗炎活性，对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞释放一氧化氮(NO)具有显著的抑制作用，可以作为具有抗炎作用的新药成分或先导化合物。
Figure DDA0002175345040000011

Description

倍半萜类化合物及其应用
技术领域
本发明药物化学技术领域，涉及天然活性成分的提取分离技术，具体涉及从五加皮中提取分离出3种结构新颖的倍半萜类化合物，以及这3种化合物在预防或治疗炎症疾病方面的应用
背景技术
炎症反应作为免疫的一部分是人体最基本的生理过程之一，它在各个方面影响着人体健康。现代医学研究表明，炎症与心脏病、某些形式的癌症、糖尿病、骨关节炎等密切相关。目前，临床上使用的抗炎药物主要为非甾体抗炎药和皮质类固醇药，其他药物如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、抗组胺药和激素替代疗法也可用来治疗和控制与炎症相关的一些疾病。虽然这些抗炎药物及治疗方法能一定程度减轻和缓解炎症反应，但严重的胃肠道不良反应、免疫系统抑制等副作用限制了其进一步应用。
中药在炎症治疗中，往往具有多效、可双向调节等特点，以及不良反应较少、来源较丰富等优势，越来越受到人们的重视，寻找和开发具有抗炎作用的中药及其有效成分逐步发展成为现代医学的研究热点之一。
五加皮为五加科植物细柱五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith的干燥根皮，2015版中国药典记载其具有祛风除湿，强筋壮骨之功效，主治风湿痹病，筋骨痿软，临床常用于风湿性关节炎的治疗。近30年来，国内外针对五加皮的化学成分研究表明，其主要含有贝壳杉烷型二萜；迄今，自五加皮中已分离鉴定出近40个此类化合物，五加皮中的倍半萜类成分还未见报道。
发明内容
本专利申请的发明人团队对五加皮化学成分及药理作用进行了系统深入的研究，首次从五加皮的提取物中分离、鉴定出3个具有新颖结构的倍半萜类化合物。本发明的目的之一在于提供3种结构新颖的倍半萜类化合物，包括两个对映异构体(+)-gracilistone C(1a)和(-)-gracilistone C(1b)及一个具有新骨架类型的降倍半萜gracilistone C(2)。所述3种倍半萜类化合物的具体化学结构如下。
Figure BDA0002175345020000021
化合物(+)-gracilistone C(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)，从中药五加皮中经提取、分离、纯化得到，迄今，现有资料无(+)-gracilistone C(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)的相关报道。
关于所述五加皮提取物的制备方法，本发明对五加皮提取物的制备方法并不做特别的限定，可以选用水浸提、有机溶剂浸提、超临界二氧化碳提取或是其它常规的方式。有机溶剂浸提可以作为获取所述五加皮提取物的优选方式之一，其操作过程大致如下：粉碎干燥后的五加皮，用有机溶剂浸提所得粉碎物，回收浸提液中的有机溶剂，得到所述五加皮提取物的浓缩液(浸膏)。本发明所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一种或是其混合物，或其它可以获得所述五加皮提取物的有机溶剂。在另外的实施方式中，也可采取有机溶剂热回流提取的方式，一般提取3次，合并提取物。所选用的有机溶剂可以为醇类(比如甲醇、乙醇等)、酮类(比如丙酮等)、醚类(比如乙醚等)。为详细阐述本发明的上述目的，本发明给出一种以中药五加皮为原料提取制备所述3种倍半萜类化合物的优选方法，但不应以此优选方法来限定本发明。
称取干燥的五加皮15kg，粉碎后用70％丙酮室温下浸泡3次(80L/次)，每次浸泡72h。合并浸泡液，减压浓缩至浸膏(所述五加皮提取物)，之后将该浸膏混悬于适量水中(5L)，依次用等量乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次后，得乙酸乙酯部分(Fr.A)和正丁醇部分(Fr.B)。将乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，TLC检查并合并相同流分后得到5个组分Fr.A-1～Fr.A-5。Fr.A-4经MCI GEL CHP-20P，用30％甲醇、70％甲醇和甲醇梯度洗脱，得到3个组分(Frs.A-4-1～A-4-3)。Fr.A-4-1经Sephadex LH-20柱色谱，用二氯甲烷-甲醇50:50洗脱得到4个组分Frs.A-4-1-1～A-4-1-4。Fr.A-4-1-2经半制备HPLC，乙腈-水(15:85)为流动相，得化合物1和2，化合物1进一步经手性柱(CHIRALPAK AD-H)拆分得到一对对映体1a和1b。
本发明的另一目的是探究所述(+)-gracilistone C(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)的生物活性。本发明请求保护所述倍半萜类化合物在预防或治疗炎症疾病方面的应用。
经本专利申请发明人团队的严谨研究发现，所述3种倍半萜类化合物具有显著抗炎活性，对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞释放一氧化氮(NO)具有显著的抑制作用，可以作为具有抗炎作用的新药成分或先导化合物。
还有，本发明提供一种药物组合物。这种药物组合物包含所述(+)-gracilistoneC(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)的至少一种。所述药物组合物至少可以用于预防或治疗炎症疾病方面，具体地，用于抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞释放一氧化氮。例如，所述药物组合物可以是治疗某种疾病的药物，除包含所述(+)-gracilistone C(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)的至少一种(或称为活性成分)，还应有药学上可接受的赋形剂或载体，并制成适宜的供药剂型，比如颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸、栓剂、胶囊剂、胶囊缓释剂、缓释片剂、混悬剂或注射液等制剂形式。药学上可接受的赋形剂或载体，或称为药物制剂上用的辅料，如水、硬脂酸镁、滑石、淀粉、有机酸、葡聚糖或类脂质等，适于口、肠、胃肠外或局部施用的药物辅料。
本发明至少具有下述的有益效果或优点。
本发明首次从细柱五加的干燥根皮中分离得到两个对映异构体(+)-gracilistone C(1a)和(-)-gracilistone C(1b)及一个具有新骨架类型的降倍半萜gracilistone C(2)。体外抗炎活性测试结果表明，所述三种倍半萜类化合物均显示较好的抑制脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞产生NO的作用，其IC50分别为7.67±0.58、6.79±1.51和2.55±0.36μM，活性结果显著优于阳性对照药L-NAME(IC50为58.45±6.46μM)，可以作为具有抗炎作用的新药成分或先导化合物。
附图说明
图1是本发明所述化合物1的1H-NMR谱图。
图2是本发明所述化合物1的13C-NMR谱图。
图3是本发明所述化合物1的HSQC谱图。
图4是本发明所述化合物1的HMBC谱图。
图5是本发明所述化合物1的COSY谱图。
图6是本发明所述化合物1的ROESY谱图。
图7是本发明所述化合物1的HR-ESI-MS谱图。
图8是本发明所述化合物2的1H-NMR谱图。
图9是本发明所述化合物2的13C-NMR谱图。
图10是本发明所述化合物2的HSQC谱图。
图11是本发明所述化合物2的HMBC谱图。
图12是本发明所述化合物2的ROESY谱图。
图13是本发明所述化合物2的COSY谱图。
图14是本发明所述化合物2的HR-ESI-MS谱图。
以下将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
具体实施方式
所述(+)-gracilistone C(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)的结构鉴定。化合物1和2的1H-NMR和13C-NMR数据见表1。化合物1和2的测定谱图分别见图1-14。
高分辨质谱用IT-TOF-LC-MS(Shimadzu，Kyoto，Japan)质谱仪测定；核磁共振谱用BruckerAvance III-600型超导核磁共振仪(Bruker，Bremerhaven，Germany)测定，TMS(四甲基硅烷)作内标；旋光通过Jascomodel 1020旋光仪(Horiba，Tokyo，Japan)测定；ECD谱由圆二色光谱仪(Chirascan，Applied Photophysics Ltd，UK)测定。
化合物1，无色方晶，分子式C15H24O4，HRESIMS(+)m/z为291.1567[M+Na]+。
化合物1的晶体数据：C15H24O4(M＝268.34g/mol),空间群P-1,
Figure BDA0002175345020000041
Figure BDA0002175345020000042
α＝82.846(3)°,β＝86.058(3)°,γ＝88.035(3)°,
Figure BDA0002175345020000043
Figure BDA0002175345020000044
Z＝2,T＝153.02K,μ(CuKα)＝0.740mm-1,Dcalc＝1.278g/cm3,26540reflections measured(9.316°≤2Θ≤137.354°),2535unique(Rint＝0.0589,Rsigma＝0.0407)which were used in all calculations.The final R1was 0.0418(I>2σ(I))andwR2was 0.1205(all data)。
化合物1a:
Figure BDA0002175345020000045
+33.2(c 0.07,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε):202(3.24),217(3.03),283(2.01)。
化合物1b:
Figure BDA0002175345020000046
-37.0(c 0.08,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε):202(3.11),217(2.90),286(1.80)。
化合物2，油状物，分子式C14H20O4，HRESIMS(+)m/z为253.1414[M+H]+。
化合物2:[α]26D120.7(c 0.05,MeOH)。
表1，化合物1和2的1H-NMR和13C-NMR数据
Figure BDA0002175345020000051
所述(+)-gracilistone C(1a)、(-)-gracilistone C(1b)和gracilistone C(2)的活性测定。活性测试结果见表2。
对数生长期的RAW264.7细胞，于RPMI 1640培养液中培养，测试前将其密度调整为2.5×105个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置于细胞培养箱中培养24h，实验设置正常对照组(不加LPS和样品)、LPS组(终浓度为1μg/mL)、LPS+待测化合物组(各样品终浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.12μM)、LPS+阳性对照组(L-NAME)，每组3个复孔。
以Griess法检测细胞上清液中亚硝酸盐(NO2 -)的量，间接反映NO的生成量：取50μL细胞培养液，加入等量Griess试剂，混匀并培养10min后，于540nm处测吸光度(A)值，同时以NaNO2系列浓度制作标准曲线计算细胞上清中亚硝酸盐的含量。
表2，化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO抑制活性测试结果
Figure BDA0002175345020000061
从表2可以看出，化合物1a、1b和2均具有较好的抑制脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞产生NO的作用，其IC50分别为7.67±0.58、6.79±1.51和2.55±0.36μM，活性结果显著优于阳性对照药L-NAME(IC50为58.45±6.46μM)，表明化合物1a、1b和2具有较好的抗炎活性，可用于制备预防或治疗炎症疾病的药物。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (6)

1.倍半萜类化合物，其特征在于，具有下述结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述倍半萜类化合物在制备预防或治疗炎症疾病药物方面的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述倍半萜类化合物用于抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞释放一氧化氮。
4.一种药物组合物，其有效成分包含权利要求1所述倍半萜类化合物的至少一种。
5.权利要求4所述药物组合物在制备预防或治疗炎症疾病药物方面的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述药物组合物用于抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞释放一氧化氮。
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