CN113943350A - 一种环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、药物及其应用 - Google Patents

一种环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、药物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、药物及其应用，涉及医药技术领域。本发明了一种环肽化合物或其药学上可接受的盐，所述环肽化合物具有式I所示的结构。本发明提供的环肽化合物对α‑葡萄糖苷酶的抑制活性高，在制备抗糖尿病药物中具有良好的应用前景。与有机合成法制备环肽化合物相比，本发明以真菌Alternaria sp.PfuH1作为生物源制备原料，有机溶剂消耗少，生产成本低，安全环保，操作简单，适宜规模化生产。

Description

一种环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应 用、药物及其应用
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一种环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、药物及其应用。
背景技术
糖尿病是严重威胁人类健康的慢性病之一，其发病率仅次于心脑血管疾病、癌症而居第3位，糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷和/或其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。目前，糖尿病发病率快速上升，已成为对人类健康的重大威胁。根据不同的发病机制，糖尿病分为4种类型：I型糖尿病、II型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病。其中II型糖尿病为主要的发病类型，在我国II型糖尿病人数占我国糖尿病患者人数的95％以上。
对于糖尿病患者，特别是Ⅱ型病人，餐后高血糖对机体的危害远远超过空腹高血糖。食物中的糖类化合物多以多糖和二糖形式存在。在体内多糖及二糖须经多种酶降解成单糖后才能被人体吸收，α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、α-半乳糖酶(乳糖酶)是降解多糖及二糖的常见酶。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的作用来减少糖类的降解，延缓糖类的吸收，从而有效地降低糖尿病人餐后血糖浓度峰值，达到控制血糖的目的。在葡萄糖耐量缺损的Ⅱ型糖尿病早期的治疗中葡萄糖苷酶抑制剂作为我国糖尿病治疗的一线药物，能够延缓单糖吸收，降低餐后高血糖，对防止糖毒作用十分重要。
目前，临床上治疗非胰岛素依赖型糖尿病的典型药物包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等；治疗胰岛素依赖型糖尿病的典型药物包括人胰岛素、速效胰岛素制剂、长效胰岛素类似物等。上述药物虽然具有良好调控血糖水平的效果，但小分子药物阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等在体内代谢复杂，常会造成毒副作用，如腹痛，腹鸣，胀气等；此外，有限的小分子化合物难以与一些具有挑战性的潜力靶点相结合，使得新靶点的早期研究受阻。大分子药物人胰岛素、速效胰岛素制剂、长效胰岛素类似物等制造复杂，均一性和稳定性较差，同时因药物递送问题，给药途径多为静脉给药，使其开发和应用受到很大限制。而肽类药物介于大分子和小分子药物之间，兼具两者优点，一方面肽类药物合成前体，多为人体内常见的氨基酸，同时因相对分子质量较小，具有优良的均一性和稳定性。肽类分为链状线性肽药物和环肽，其中环肽作为构象受限的肽类，结构上较链状线性肽更为刚性，具有独特的优良性质：(1)环肽结构约束了潜在的构象，减少熵效应的自由能损失，有更佳的结合亲和力和靶标选择性，环肽分子还具有较大尺寸结构，与大分子靶点接触面大，对于小分子无法有效靶向的结合位点，也能发生较多的相互作用；(2)环肽分子有更优的代谢稳定性和膜通透性。不同于线性肽，环肽凭借引入多种修饰手段可增加肽类药物的代谢稳定性，包括血浆的蛋白酶水解稳定性、肝脏代谢稳定性；(3)环肽分子刚性较强，更易透过细胞膜，进入细胞内发挥效用。因此，从天然产物中寻找可以作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的环肽类药物值得人们开发研究。
目前，处于临床研究约有40个环肽药物，已上市的环肽类药物多为抗菌肽或激素类似物，包括催产素(oxytocin)、万古霉素(van-comycin)、环孢菌素(cyclosporine)、anidulafungin、lanreotide和linaclotide等。上述药物均来源于天然产物及其衍生物，适应症为感染性疾病或肿瘤。然而，上述环肽药物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性普遍较低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、药物及其应用。本发明提供得环肽化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种环肽化合物或其药学上可接受的盐，所述环肽化合物具有式I所示的结构：
Figure BDA0003334237120000031
优选的，所述药学上可接受的盐包括钠盐或钾盐。
本发明提供了上述技术方案所述环肽化合物的制备方法，包括以下步骤：
将真菌Alternaria sp.PfuH1进行扩繁，得到种子液；
将所述种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵，得液体发酵产物；
将所述液体发酵产物进行有机溶剂浸提，得到浸提物；
将所述浸提物进行分离纯化，得具有式I所示结构的环肽化合物。
优选的，所述扩繁包括：将真菌Alternaria sp.PfuH1接种于孟加拉红培养基中第一扩繁培养，得到第一扩繁种子液；
将所述第一扩繁种子液接种于PDB培养基中第二扩繁培养；
所述孟加拉红培养基的组成包括：蛋白胨4～6g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、硫酸镁0.3～0.6g/L、琼脂14～18g/L、孟加拉红0.02～0.04g/L、氯霉素0.08～0.12g/L和水；所述孟加拉红培养基的pH值为7～7.4；
所述第一扩繁培养的温度为25～37℃，时间为3～4天；
所述第二扩繁培养的温度为25～37℃，时间为3～5天。
优选的，所述发酵培养基包括PDB培养基或真菌二号培养基；
所述PDB培养基的制备方法包括以下步骤：将去皮马铃薯置于水中煮沸，固液分离，得到液体组分；将所述液体组分、葡萄糖和水混合，得到PDB培养基；
所述去皮马铃薯和煮沸用水的质量比为180～220：540～660，所述煮沸的时间为30～90min；
所述PDB培养基中葡萄糖的浓度为18～22g/L；
所述真菌二号培养基的组成包括：酵母膏2.5～3.5g/L、玉米膏1～1.5g/L、麦芽糖18～22g/L、味精10～15g/L、KH2PO40.3～0.7g/L、葡萄糖8～15g/L和MgSO4.7H2O 0.2～0.5g/L、甘露醇18～22g/L和水。
优选的，所述液体发酵的温度为25～37℃，时间为28～35天。
优选的，所述有机溶剂浸提用有机溶剂包括乙酸乙酯和/或乙醇。
本发明提供了一种药物，包括上述技术方案所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐或上述技术方案所述制备方法得到的环肽化合物。
优选的，所述环肽化合物在药物中的含量为45～70wt％。
本发明还提供了上述技术方案所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐、上述技术方案所述制备方法得到的环肽化合物或上述技术方案所述的药物在制备抗糖尿病药物中的应用。
本发明提供了一种环肽化合物或其药学上可接受的盐，所述环肽化合物具有式I所示的结构。本发明提供的环肽化合物具有较大尺寸结构、更佳的结合亲和力以及更强的靶标选择性，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高，在制备抗糖尿病药物中具有良好的应用前景。如实施例测试结果所示，本发明提供的环肽化合物的IC50值为39.38μmol/L。
本发明提供了上述技术方案所述环肽化合物的制备方法。与有机合成法制备环肽化合物相比，本发明以真菌Alternaria sp.PfuH1作为生物源制备原料，有机溶剂消耗少，生产成本低，安全环保，操作简单，适宜规模化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的环肽化合物的1H-NMR谱图(DMSO-d6,500MHz)；
图2为实施例1制备的环肽化合物的13C-NMR谱图(DMSO-d6,126MHz)；
图3为实施例1制备的环肽化合物的DEPT谱图；
图4为实施例1制备的环肽化合物的HSQC谱图；
图5为实施例1制备的环肽化合物的HMBC谱图；
图6为实施例1制备的环肽化合物的1H-1H COSY谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种环肽化合物或其药学上可接受的盐，所述环肽化合物具有式I所示的结构：
Figure BDA0003334237120000051
在本发明中，所述药学上可接受的盐优选包括钠盐或钾盐；所述环肽化合物的成盐位置优选为酰胺基团。
本发明提供了上述技术方案所述环肽化合物的制备方法，包括以下步骤：
将真菌Alternaria sp.PfuH1进行扩繁，得到种子液；
将所述种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵，得液体发酵产物；
将所述液体发酵产物进行有机溶剂浸提，得到发酵产物浸提物；
将所述发酵产物浸提物进行分离纯化，得具有式I所示结构的环肽化合物。
本发明将真菌Alternaria sp.PfuH1进行扩繁，得到种子液。
在本发明中，所述真菌Alternaria sp.PfuH1已在文献“Biphenyl metabolitesfromthe patchouli endophytic fungusAlternaria sp.PfuH1”(参见：Fdka C,Tfya B,Qyma C,et al.Biphenyl metabolites from the patchouli endophyticfungusAlternaria sp.PfuH1[J].Fitoterapia,2020,146.)中公开，所述真菌Alternariasp.PfuH1为从海南大学园艺学院实验基地(N20.056729，E110.328729)健康广藿香(南香)的花分离获得的一株内生真菌。申请人承诺自申请日起20年内向公众发放所述真菌Alternaria sp.PfuH1。
在本发明中，所述扩繁包括：将真菌Alternaria sp.PfuH1接种于孟加拉红培养基中第一扩繁培养，得到第一扩繁种子液；
将所述第一扩繁种子液接种于PDB培养基中第二扩繁培养。
本发明将真菌Alternaria sp.PfuH1接种于孟加拉红培养基中第一扩繁培养，得到第一扩繁种子液。在本发明中，所述孟加拉红培养基的组成包括：蛋白胨优选为4～6g/L，更优选为4.5～5.5g/L，进一步优选为5g/L；葡萄糖优选为8～12g/L，更优选为9～11g/L，进一步优选为10g/L；磷酸二氢钾0.8～1.2g/L，更优选为0.9～1.1g/L，进一步优选为1g/L；硫酸镁优选为0.3～0.6g/L，更优选为0.35～0.55g/L，进一步优选为0.4～0.5g/L；琼脂优选为14～18g/L，更优选为15～17g/L，进一步优选为16g/L；孟加拉红优选为0.02～0.04g/L，更优选为0.025～0.035g/L，进一步优选为0.03g/L；氯霉素优选为0.08～0.12g/L，更优选为0.09～0.11g/L，进一步优选为0.1g/L；所述孟加拉红培养基的溶剂优选为水；所述孟加拉红培养基的pH值为7～7.4，更优选为7.1～7.3，进一步优选为7.2。在本发明中，所述孟加拉红培养基的制备方法优选包括以下步骤：将蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、孟加拉红、氯霉素和水混合后调节pH值至7～7.4，得到孟加拉红培养基。在本本发明中，所述混合优选为先将除水外的组分溶解于温水中，然后加入剩余的水混合均匀；所述温水的温度优选为70～80℃，更优选为75℃；本发明对于所述温水的用量没有特殊限定，能够将蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、孟加拉红和氯霉素溶解即可。在本发明中，所述调节pH值至7～7.4采用的pH值调节剂优选包括NaOH溶液或HCl溶液；本发明对于所述NaOH溶液和HCl溶液的浓度没有特殊限定，能够将pH值调节至7～7.4即可。在本发明中，所述孟加拉红培养基在使用前优选进行灭菌处理，所述灭菌处理的温度优选为121～123℃，更优选为121～122℃；所述灭菌的时间优选为20～30min，更优选为25min。
在本发明中，所述第一扩繁培养的温度优选为25～37℃，更优选为30～35℃；所述第一扩繁培养的时间优选为3～4天，更优选为3.5天；本发明对于所述真菌Alternariasp.PfuH1的接种量没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的接种量即可。
得到第一扩繁种子液后，本发明将所述第一扩繁种子液接种于PDB培养基中第二扩繁培养。在本发明中，所述PDB培养基的制备方法，优选包括以下步骤：将马铃薯置于水中煮沸，固液分离，得到液体组分；将所述液体组分、葡萄糖和水混合，得到PDB培养基。在本发明中，所述马铃薯在试用前优选进行去皮后粉碎，本发明对于所述粉碎的方式没有特殊限定，具体如切碎；所述粉碎后马铃薯块优选为边长为1～1.5cm的立方体。在本发明中，所述去皮马铃薯和煮沸用水的质量比优选为180～220：540～660，更优选为190～210：570～630，进一步优选为200：600。在本发明中，所述煮沸的时间优选为30～90min，更优选为40～80min，进一步优选为50～60min。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如纱布过滤。在本发明中，所述PDB培养基中葡萄糖的浓度优选为18～22g/L，更优选为19～21g/L，进一步优选为20g/L。在本发明中，所述PDB培养基在使用前优选进行灭菌处理，所述灭菌处理的温度优选为121～123℃，更优选为121～122℃；所述灭菌的时间优选为20～30min，更优选为25min。
在本发明中，所述第二扩繁培养的温度优选为25～37℃，更优选为30～35℃；所述第二扩繁培养的时间优选为28～35天，更优选为30～32天，本发明对于第一扩繁种子液的接种量没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的接种量即可。
得到种子液后，本发明将所述种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵，得液体发酵产物。
在本发明中，所述发酵培养基优选包括PDB培养基或真菌二号培养基。在本发明中，所述PDB培养基优选与前述第二扩繁培养用PDB培养基相同，在此不再赘述。在本发明中，所述真菌二号培养基的组成优选包括：酵母膏优选为2.5～3.5g/L，更优选为2.8～3.2g/L，进一步优选为3～3.1g/L；玉米膏优选为1～1.5g/L，更优选为1.1～1.4g/L，进一步优选为1.2～1.3g/L；麦芽糖优选为18～22g/L，更优选为19～21g/L，进一步优选为20～20.5g/L；味精优选为10～15g/L，更优选为11～14g/L，进一步优选为12～13g/L；KH2PO4优选为0.3～0.7g/L，更优选为0.4～0.6g/L，进一步优选为0.5～0.6g/L；葡萄糖优选为8～15g/L，更优选为10～13g/L，进一步优选为11～12g/L；MgSO4.7H2O优选为0.2～0.5g/L，更优选为0.3～0.4g/L，进一步优选为0.35～0.4g/L；甘露醇优选为18～22g/L，更优选为19～21g/L，进一步优选为20～20.5g/L；所述真菌二号培养基的溶剂优选为水。
在本发明中，所述液体发酵的温度优选为25～37℃，更优选为30～35℃；所述液体发酵的时间优选为28～35天，更优选为30～32天；所述液体发酵优选在摇床中进行，所述摇床的振荡速度优选为120～180rpm，更优选为140～150rpm。
得液体发酵产物后，本发明将所述液体发酵产物进行有机溶剂浸提，得到发酵产物浸提物。
在本发明中，所述有机溶剂浸提用有机溶剂优选包括乙酸乙酯和/或乙醇；所述有机溶剂浸提的温度优选为室温，所述有机溶剂浸提的次数优选为2～3次；所述液体发酵产物与单次有机溶剂浸提用有机溶剂的体积之比优选为1：0.8～1.2，更优选为1：1。
所述有机溶剂浸提后，本发明优选还包括将所述有机溶剂浸提后的浸提液浓缩，得到发酵产物浸提物。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压浓缩；本发明对于所述减压浓缩的条件没有特殊限定，能够浓缩至无有机溶剂残留即可。
得到发酵产物浸提物后，本发明将所述发酵产物浸提物进行分离纯化，得具有式I所示结构的环肽化合物。
本发明对于所述分离纯化的方式没有特殊限定，能够得到式I所示结构的环肽化合物即可，具体如正相硅胶柱色谱分离、反相C18柱色谱分离和高效液相(HPLC)色谱分离中的一种或几种。
在本发明中，所述正相硅胶柱色谱分离优选包括减压硅胶柱色谱分离或加压硅胶柱色谱分离；所述正相硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂优选包括低极性-高极性溶剂，所述低极性-高极性溶剂中低极性溶剂和高极性溶剂的体积比优选为10:1～0:1；所述低极性溶剂包括石油醚或氯仿，所述高极性溶剂优选包括乙酸乙酯或甲醇；所述洗脱剂更优选包括石油醚-乙酸乙酯混合溶剂或氯仿-甲醇混合溶剂；所述洗脱方式优选为梯度洗脱；在本发明的实施例中，所述梯度洗脱依次采用的体积比为8：1、6：1、4：1、2：1、1：1和0：1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂或体积比为10：1、8：1、6：1、4：1、2：1、1：1、1：2和0：1的氯仿-甲醇混合溶剂进行。
在本发明中，所述反相C18柱色谱分离优选为加压洗脱反相ODS色谱柱分离，所述反相C18柱色谱分离采用的洗脱剂优选包括包括低极性-高极性溶剂，所述低极性-高极性溶剂中低极性溶剂和高极性溶剂的体积比优选为0:1～1:0；所述低极性溶剂优选包括甲醇或乙腈，所述高极性溶剂优选包括水；所述洗脱剂更优选包括甲醇-水混合溶剂或乙腈-水混合溶剂；所述洗脱方式优选为梯度洗脱；在本发明的实施例中，所述梯度洗脱依次采用的体积比为1：9、1：4、3：7、2：3、1：1、3：2、7：3、4：1、9：1和1：0的甲醇-水混合溶剂或体积比为3：7、2：3、1：1、3：2、7：3、4：1、9：1和1：0的乙腈-水腈混合溶剂进行。
在本发明中，所述HPLC色谱分离的条件优选包括：半制备高效液相色谱仪(SUM-MITP680A，戴安，美国)，Sinochrom ODS-AP液相色谱柱(4.6×250mm,5μm)波长250～285nm，流动相为：乙腈-水溶剂，乙腈的体积分数优选为50～70％，或者甲醇-水溶剂，甲醇的体积分数优选为65～85％，流速为1～4mL/min。
在本发明的实施例中，所述发酵产物浸提物进行分离纯化，得具有式I所示结构的环肽化合物，具体包括：将发酵产物浸提物进行正相硅胶柱色谱分离，经HPLC检测得到5个组分，依次编号为组分Fr1、组分Fr2、组分Fr3、组分Fr4和组分Fr5；将所述组分Fr4进行第一Rp-C18柱色谱分离，经HPLC检测得到4个组分，依次编号为组分Fr4.1、组分Fr4.2、组分Fr4.3和组分Fr4.4；将所述组分Fr4.4进行第二Rp-C18柱色谱分离，得到组分Fr4.4.5；将所述组分Fr4.4.5进行HPLC色谱分离，得到具有式I所示结构的环肽化合物。在本发明中，所述正相硅胶柱色谱分离优选为减压正相硅胶柱色谱分离；所述正相硅胶柱色谱分离的洗脱方式优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱采用的洗脱剂优选为低极性溶剂-高极性溶剂；所述低极性溶剂和高极性溶剂的体积比为8～0：1，具体的，所述梯度洗脱依次采用体积比为8：1、6：1、4：1、2：1、1：1和0：1的低极性溶剂-高极性溶剂进行；所述低极性溶剂优选包括石油醚和氯仿；所述高极性溶剂优选包括乙酸乙酯、甲醇和水。在本发明中，所述第一Rp-C18柱色谱分离的洗脱方式优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱采用的洗脱剂优选包括醇-水溶剂；所述醇-水溶剂中醇的体积分数优选为10～100％；所述醇优选包括甲醇和/或乙醇；具体的，所述梯度洗脱依次采用体积分数为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的醇-水溶剂进行。在本发明中，所述第二Rp-C18柱色谱分离的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的洗脱剂优选包括醇-水溶剂；所述醇-水溶剂中醇的体积分数优选为30～100％；所述醇优选包括甲醇和/或乙醇；具体的，所述梯度洗脱依次采用体积分数为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的醇-水溶剂进行，所述组分Fr4.4.5优选为采用体积分数为80％的醇-水溶剂洗脱得到的组分。在本发明中，所述HPLC色谱分离采用的流动相优选为乙腈-水溶剂，所述乙腈-水溶剂中乙腈的体积分数优选为50～70％，更优选为60％；所述流动相的流速优选为1～4mL/min，更优选为4mL/min；所述HPLC色谱分离优选为半制备HPLC色谱分离；所述半制备HPLC色谱分离优选采用半制备高效液相色谱仪(SUM-MITP680A，戴安，美国)进行。
本发明提供了一种药物，包括上述技术方案所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐或上述技术方案所述制备方法得到的环肽化合物。
在本发明中，所述药物中环肽化合物的含量优选为45～70wt％，更优选为55～65wt％。
在本发明中，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料优选包括淀粉、糊精和乳糖中的一种或几种。
在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、颗粒剂或胶囊剂。
在本发明中，所述药物的给药方式优选包括口服。
本发明提供了上述技术方案所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐、上述技术方案所述制备方法得到的环肽化合物或上述技术方案所述的药物在制备抗糖尿病药物中的应用。在本发明中，所述抗糖尿病药物优选为抗II型糖尿病药物。
下面结合实施例对本发明提供的环肽化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、药物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
真菌Alternaria sp.PfuH1采自海南大学园艺学院实验基地(N20.056729，E110.328729)健康广藿香(南香)花部分离获得的一株内生真菌，其分离纯化步骤如下：
采取健康新鲜的海南广藿香花，依次进行双蒸水冲洗干净、浓度为2.6wt％次氯酸钠水溶液浸泡80s、无菌水冲洗4次、体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡75s和无菌水冲洗4次，得到预处理广藿香花和无菌水洗液(最后一次无菌水冲洗得到的洗液)；
用消毒手术刀将花纵切，将得到的组织块分别置于灭菌的孟加拉红培养基平板上，然后用移液枪吸取20μL无菌水洗液滴入孟加拉红培养基中，并在实验过程中放入空白对照，置于25℃恒温箱中培养6天。根据菌落形态、颜色差异和长出时间不同，用接种针挑取各平板上菌落边缘米粒大小的琼脂块，转移至新鲜孟加拉红培养基上进行再培养，重复再培养操作至获得纯菌落，得到真菌Alternaria sp.PfuH1；所述真菌Alternaria sp.PfuH1置于装有80％甘油的试管中保存于-4℃冰箱中。其中，孟加拉红培养基的组成为：蛋白胨5g/L；葡萄糖10g/L；磷酸二氢钾1g/L；硫酸镁0.5g/L；琼脂16g/L；孟加拉红0.03g/L；氯霉素0.1g/L；溶剂为水；pH值为7.2，灭菌温度为121℃，时间为25min。
根据真菌Alternaria sp.PfuH1形态学特征、菌株ITS序列比对(GenBankaccession No.MK559619)和文献(Fdka C,Tfya B,Qyma C,et al.Biphenyl metabolitesfrom the patchouli endophytic fungus Alternaria sp.PfuH1[J].Fitoterapia,2020,146.)，鉴定该菌株与Alternaria sp具有99.9％的同源性，鉴定该菌株为Alternaria sp，命名为真菌Alternaria sp PfuH1。真菌Alternaria sp.PfuH1现保藏于海南大学园艺学院药用植物研究实验室。
实施例2
本实施例所用培养基：
灭菌孟加拉红培养基：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂16g、孟加拉红0.03g、氯霉素0.1g和水1000mL，pH值＝7.2±0.2，121℃条件下灭菌25min。
灭菌PDB培养基：将200g去皮马铃薯切碎成丁后加600mL水煮沸55min，以纱布滤去残渣，在所得滤液中加水补足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，在121℃条件下灭菌25min。
所述的具有式I所示结构的环肽化合物是采用下述方法制备得到的：
将真菌Alternaria sp.PfuH1接种在灭菌孟加拉红培养基上在28℃条件下第一扩繁培养三天，然后接种于装有150mL灭菌PDB培养基的500mL无菌三角瓶中，在180r/min摇床、25℃条件下第二扩繁培养3天，得到种子液。
将所述种子液接种于装有300mL灭菌PDB培养基的1000mL三角瓶中，共发酵50L，在室温条件下静置液体发酵32天，得到液体发酵产物。
将所述液体发酵产物用等体积乙酸乙酯萃取3次，将得到萃取液合并后减压浓缩至恒重，得到41.8g发酵产物浸提物。
将所述发酵产物浸提物进行减压硅胶柱色谱进行分离，依次采用体积比为8：1、6：1、4：1、2：1、1：1和0：1的石油醚-乙酸乙酯溶剂进行梯度洗脱，经HPLC分析得到五个组分，依次编号为依次编号为组分Fr1、组分Fr2、组分Fr3、组分Fr4和组分Fr5；将所述组分Fr4进行Rp-C18硅胶柱色谱分离，以MeOH体积分数为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的MeOH-H2O溶剂进行梯度洗脱，经HPLC分析得到四个亚级组分依次编号为组分Fr4.1、组分Fr4.2、组分Fr4.3和组分Fr4.4；通过CC在Rp-C18柱上以MeOH体积分数依次为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的MeCN-H2O溶剂洗脱分离Fr.4.4，其中，MeOH体积分数为80％的MeCN-H2O溶剂得到的洗脱组分为组分Fr4.4.5；对所述组分Fr4.4.5进行半制备HPLC色谱分离，得到具有式I所示结构的环肽化合物(褐色油状物)；其中，半制备HPLC色谱分离的条件：采用半制备高效液相色谱仪(SUM-MITP680A，戴安，美国)，检测波长为275nm，流动相为乙腈-水溶剂(乙腈体积分数为60％)，流动相流速为4mL/min，保留时间为13min。
具有式I所示结构的环肽化合物的结构表征：HR-ESI-MS[M+Na]+m/z 955.4102(理论值为955.4108)，表明环肽化合物的分子式为C52H60N4O12，不饱和度为25。
本实施例制备的具有式I所示结构的环肽化合物的HR-ESI-MS谱图如图1所示；1H-NMR谱(DMSO-d6,500MHz)如图1和表1所示；13C-NMR谱(DMSO-d6,126MHz)如图2和表1所示；的DEPT谱图如图3所示；HSQC谱图如图4所示；HMBC谱图如图5所示；1H-1H COSY谱图如图6所示。
表1具有式I所示结构的环肽化合物的1H NMR和13C NMR数据(500,126MHz,DMSO-d6,TMS)
Figure BDA0003334237120000131
Figure BDA0003334237120000141
由图1～6和表1可知，13C-NMR、DEPT和HSQC谱图显示了13个碳信号，包括1个肽键(δC 165.6)、1个酯基(δC 167.1)、1个苯基(δC 135.5,129.7,128.9,128.8,128.2,127.6)、1个sp3亚甲基、2个sp3次甲基、3个季碳和2个甲基。1H-1H COSY谱中相关信号以及HMBC谱中H-11与C-12、C-10、C-13和C-9，H-12与C-13，H-12与C-13，H-10与C-13，H-7与C-8和C-1，H-2与C-1、C-8和C-7，H-3与C-2和C-4，H-6与C-5和C-4的相关信号证实了本发明制备得到具有式I所示结构的环肽化合物。具有式I所示结构的环肽化合物命名为：cyclo[2-hydroxy-propionyl-N-methyl-phenylalanyl-2-hydroxy-propionyl-N-methyl-phenylalanyl-2-hydroxy-propionyl-N-methyl-phenylalanyl-2-hydroxy-propionyl-N-methyl-phenylalanyl]。
测试例
采用PNPG法(Nilubon JA；Megh R B；JunK.J.Food Chem,2007,103(4):1319-1323)测定实施例1制备的具有式I所示结构的环肽化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
实验组：将环肽化合物用DMSO溶解配制成浓度为5mg/mL的待测化合物溶液。取70μL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)于96孔板中，再分别加入20μLα-葡萄糖苷酶溶液(2U/mL)和10μL待测化合物溶液，在37℃条件下温育15min后加入20μL浓度为2.5mmol/L的PNPG溶液，在37℃条件下放置30min后加入80μL浓度为0.2mol/L的Na2CO3水溶液终止反应，总体积为200μL，充分混匀后于405nm处用酶标仪检测各孔吸光度。背景对照组：10μL待测样品溶液+100μL PBS溶液溶解的0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液+40μL的0.1mol/L的PBS溶液。
阴性对照组：10μL DMSO溶液+100μL PBS溶液溶解的0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液+40μL的2.5mmol/LPNPG溶液。
空白对照组：10μL DMSO溶液+100μL PBS溶液溶解的0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液+40μL的0.1mol/L的PBS溶液。
将各组实验重复3次，按照式(1)计算化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，计算其IC50值。
抑制率＝[(B-B0)-(A-A0)]/(B-B0) 式(1)；
式(1)中，A为实验组平均吸光度，A0为背景对照组平均吸光度，B为阴性对照组平均吸光度，B0为空白对照组平均吸光度。
测试结果：具有式I所示结构的环肽化合物IC50值为39.38μmol/L，说明本发明提供的环肽化合物具有强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种环肽化合物或其药学上可接受的盐，所述环肽化合物具有式I所示的结构：
Figure FDA0003334237110000011
2.权利要求1所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括钠盐或钾盐。
3.权利要求1所述环肽化合物的制备方法，包括以下步骤：
将真菌Alternaria sp.PfuH1进行扩繁，得到种子液；
将所述种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵，得液体发酵产物；
将所述液体发酵产物进行有机溶剂浸提，得到浸提物；
将所述浸提物进行分离纯化，得具有式I所示结构的环肽化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述扩繁包括：将真菌Alternariasp.PfuH1接种于孟加拉红培养基中第一扩繁培养，得到第一扩繁种子液；
将所述第一扩繁种子液接种于PDB培养基中第二扩繁培养；
所述孟加拉红培养基的组成包括：蛋白胨4～6g/L、葡萄糖8～12g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、硫酸镁0.3～0.6g/L、琼脂14～18g/L、孟加拉红0.02～0.04g/L、氯霉素0.08～0.12g/L和水；所述孟加拉红培养基的pH值为7～7.4；
所述第一扩繁培养的温度为25～37℃，时间为3～4天；
所述第二扩繁培养的温度为25～37℃，时间为3～5天。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括PDB培养基或真菌二号培养基；
所述PDB培养基的制备方法包括以下步骤：将去皮马铃薯置于水中煮沸，固液分离，得到液体组分；将所述液体组分、葡萄糖和水混合，得到PDB培养基；
所述去皮马铃薯和煮沸用水的质量比为180～220：540～660，所述煮沸的时间为30～90min；
所述PDB培养基中葡萄糖的浓度为18～22g/L；
所述真菌二号培养基的组成包括：酵母膏2.5～3.5g/L、玉米膏1～1.5g/L、麦芽糖18～22g/L、味精10～15g/L、KH2PO4 0.3～0.7g/L、葡萄糖8～15g/L和MgSO4.7H2O 0.2～0.5g/L、甘露醇18～22g/L和水。
6.根据权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于，所述液体发酵的温度为25～37℃，时间为28～35天。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂浸提用有机溶剂包括乙酸乙酯和/或乙醇。
8.一种药物，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2～8任一项所述制备方法得到的环肽化合物。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述环肽化合物在药物中的含量为45～70wt％。
10.根据权利要求1～2任一项所述的环肽化合物或其药学上可接受的盐、权利要求2～7任一项所述制备方法得到的环肽化合物或权利要求8～9任一项所述的药物在制备抗糖尿病药物中的应用。
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